JP6266017B2 - 画像の微生物コロニーを区別する方法 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１２年１２月２０日出願の米国特許仮出願第６１／７３９，７８６号の優先権を主張するものであり、その開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。

生物学的安全性は、現代社会において重要な懸案事項である。食物又は他の材料内の生物学的汚染の検査は、食品の開発者及び販売者にとって重要なものとなってきており、しばしば必須の要求事項となってきている。生物学的検査は、例えば、医療患者から取り出された血液サンプル、実験用目的のために開発された実験サンプル及び他のタイプの生物学的サンプルなどの実験サンプル内の細菌又は他の病原体を同定するためにも使用される。生物学的検査を改善するために、並びに生物学的検査プロセスを効率化し、規格化するために、様々な技法及び装置を利用することができる。

幅広い種類の培養器が開発されてきた。一例として、培養器は、ミネソタ州セントポール（St. Paul）の３Ｍ社（3M Company）（以下、「３Ｍ」とする）によって開発されている。具体的に、培養器は、３Ｍにより商品名ペトリフィルム（PETRIFILM）プレートで販売されている。培養器は、例えば、好気性細菌、大腸菌、コリフォーム、腸内細菌、酵母、かび、黄色ブドウ球菌、リステリア、カンピロバクター菌等を含む、一般に食物汚染に関連する微生物の急速な増殖及び検出を容易にするために利用され得る。ペトリフィルム（PETRIFILM）プレート又は他の増殖培地の使用は、食物サンプルの細菌検査を簡略化することができる。

（食物検査の場合には）是正措置が実施できるように、又は（医療用の使用の場合には）正しい診断ができるように、培養器を使用して細菌の存在を測定又は同定することができる。他の用途において、培養器は、例えば、実験目的で、実験室サンプル内の微生物を急速に増殖させるために使用されてもよい。

生物学的スキャニングユニットは、微生物コロニーをスキャン及び／又は計算するために使用される装置を指す。例えば、食物サンプル又は実験室サンプルは、培養器上に配置され得、次いで、プレートは、インキュベーションチャンバに挿入され得る。インキュベーション後、培養器は、細菌増殖の自動検出及び測定のための生物学的スキャニングユニット内に配置され得る。このように、生物学的スキャニングユニットは、培養器中の微生物コロニーの検出及び測定を自動化し、それにより人的エラーを低減することによって、生物学的試験プロセスを改善する。

概して、本開示は、スキャンされた画像中の物体を識別するための技術に関する。具体的には、この技術は、各種類の微生物が反応し得る２つの指示化合物を含む培養培地中に存在する、２つの微生物コロニーの種類を区別するために使用される。加えて、この技術は更に、培養器のスキャンされた画像中の各微生物の種類の数を計数するために使用されてもよい。コロニーを計数するために、培養培地を含有する培養器は、スキャニングユニットに挿入される。培養器の挿入後、スキャニングユニットは、培養器の画像を生成する。次いで、微生物コロニーの数は、スキャニングユニット内で、あるいはデスクトップコンピュータ、ワークステーションなどの外部コンピュータ装置によって実施される、画像処理及び解析ルーチンを使用して、計数又は別様に決定され得る。本発明に従って、コロニーの種類を識別する方法が記載される。本方法は、スキャンされた画像中の微生物コロニーの自動計数の既存の方法よりも精度を改善するために使用され得る。

一態様では、本開示は、方法を提供する。この方法は、撮像装置を使用して、薄膜培養器の第１の画像を生成するステップであって、培養器は、透明フィルムカバーシートを有する前面と、半透明基板を有する背面とを有する、ステップと；撮像装置を使用して、薄膜培養器の第２の画像を生成するステップであって、第２の画像が、培養器の背面に照明を提供しながら生成される、ステップと；第１及び第２の画像を解析して、各画像中の微生物コロニーを同定するステップと；第１の画像を解析して、培養器中の特定の位置におけるコロニーのサイズパラメータの第１の値を計算するステップと；第２の画像を解析して、培養器中の特定の位置におけるサイズパラメータの第２の値を計算するステップと；第１の値を第２の値と比較するステップと、を含んでもよい。第１の画像は、培養器の前面に照明を提供しながら生成される。培養器は、第１及び第２の指示化合物を含み、第１の指示化合物は、微生物によって、第１の色を有する第１の生成物に変換され、第２の指示化合物は、微生物によって、第２の色を形成する水拡散性の第２の生成物に変換される。

上記の実施形態のいずれかにおいて、第１の画像は、背面照明に対する前面照明の第１の比で、培養器を照射しながら生成され得、第２の画像は、第１の比よりも低い、背面照明に対する前面照明の第２の比で、培養器を照射しながら生成され得る。いくつかの実施形態では、第１の比は、１：１を超えてもよい。いくつかの実施形態では、第１の比は、約１００％：０％であってもよい。いくつかの実施形態では、第２の比は、約０％：１００％であってもよい。

上記の実施形態のいずれかにおいて、方法は更に、第１又は第２の画像を使用して、培養器中の微生物コロニーの数を計数するステップを含み得る。上記の実施形態のいずれかにおいて、方法は更に、第１及び第２の画像を使用して、培養器中の第１の種類のコロニーの数を計数し、第２の種類のコロニーの数を計数するステップを含み得る。いくつかの実施形態では、第１の種類のコロニーは、第１の指示薬を第１の生成物に変換することができる。いくつかの実施形態では、第２の種類のコロニーは、第２の指示薬を第２の生成物に変換する。

上記の実施形態のいずれかにおいて、第１の指示化合物は、テトラゾリウム色素を含んでもよい。上記の実施形態のいずれかにおいて、第２の指示化合物は、インドリル基を含む発色酵素基質を含んでもよい。上記の実施形態のいずれかにおいて、サイズパラメータは、観察されたコロニー直径であってもよい。いくつかの実施形態では、コロニー直径は、コロニー最小直径であってもよい。

別の態様では、本開示は、プロセッサによって実行されるとき、プロセッサを備える培養プレートスキャニングシステムに、薄膜培養器の第１の画像を得ることであって、第１の画像が、背面照明に対する前面照明の第１の比で、培養器を照射しながら生成される、薄膜培養器の第１の画像を得ることと；薄膜培養器の第２の画像を得ることであって、第２の画像が、第１の比よりも低い、背面照明に対する前面照明の第２の比で、培養器を照射しながら生成される、薄膜培養器の第２の画像を得ることと；第１及び第２の画像を解析して、各画像中の微生物コロニーを同定することと；第１の画像を解析して、培養器中の特定の位置におけるコロニーのサイズパラメータの第１の値を計算することと；第２の画像を解析して、培養器中の特定の位置におけるサイズパラメータの第２の値を計算することと；第１の値を第２の値と比較することと、をさせることができる、コンピュータ可読命令を含む、コンピュータ可読媒体を提供する。いずれの実施形態においても、コンピュータ可読媒体は更に、プロセッサで実行されるとき、システムに、第１又は第２の画像を使用させて、培養器中の微生物コロニーの数を計数させる、コンピュータ可読命令を含むことができる。いずれの実施形態においても、コンピュータ可読媒体は更に、システムに、第１及び第２の画像を使用させて、培養器中の第１の種類のコロニーの数を計数させ、第２の種類のコロニーの数を計数させる、コンピュータ可読命令を含むことができる。

本発明の様々な態様は、多くの利点をもたらすことができる。例えば、本開示の方法は、培養器上の微生物コロニーの自動計数の精度を改善し得る。具体的には、本明細書に記載されるルールは、一般的に生じる問題に対処し得、それらの問題は、そうでなければ増殖プレート上の病原体の自動計数の精度を損なう可能性がある。

これらの実施形態及び他の実施形態の更なる詳細を、添付の図面及び以下の説明文に記載する。他の特徴、目的、及び利点は、説明文及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかとなろう。

スキャニング装置によって生成される画像の画像解析を実施する外部コンピュータに連結したスキャニング装置を備える、例示的なシステムの斜視図である。 図１に示されるシステムに対応し得る、生物学的スキャニングシステムのブロック図である。 微生物培養器の自動解析のプロセスを示すフロー図である。 本開示に従った、微生物培養器を解析する方法の一実施形態のブロック図である。 本開示に従った、微生物コロニーの種類を識別するための計数ルールのフロー図である。 その中で２つの種類の微生物コロニーが増殖する薄膜培養器の一部分の白黒画像であり、画像は、培養器の背面のみを照射しながら得た。 図６の画像の一部分の詳細図である。 図６の薄膜培養器の一部分の白黒画像であり、画像は、培養器の前面のみを照射しながら得た。 図７の画像の一部分の詳細図である。 図６Ａのラインスキャン中のピクセルの赤色、緑色、及び青色成分のそれぞれの相対明度のグラフである。 図７Ａのラインスキャン中のピクセルの赤色、緑色、及び青色成分のそれぞれの相対明度のグラフである。

微生物の検出及び計数は、多くの異なる分野において普遍的な問題である。微生物は、ほとんどすべての食物中、水中、空気中、並びにヒトが接触する多くの表面及び物質上に発生する。そのような微生物は多くの場合有害であり、したがって測定及び制御されなければならない。

物質（例えば、食物、水、環境残留物）中の微生物の存在を検出するために広く使用されている方法は、培養器中に、好適に調製された試験される物質のサンプルを配置すること、及び微生物をコロニーに増殖させることである。そのような培地中で培養されるとき、コロニーは肉眼で見えるようになり、計数することができる。それぞれの目に見えるコロニーは、１つの元の微生物に対応する。本開示の方法は、微生物コロニーを増殖及び計数するためのそのような培養器を使用して実施される。典型的には、培養器は、個々のコロニーの分離を維持するために、水性栄養培地及びマトリクス（例えば、寒天、グアーガム、又はペクチン等のゲル化剤）を含む。多くの培養器は更に、本明細書に考察される指示化合物を含む。微生物コロニーを増殖及び計数するための培養器としては、例えば、寒天ペトリ皿、及び商品名ペトリフィルム（PETRIFILM）で３Ｍ社によって販売されている薄膜培養器が挙げられる。ペトリフィルム薄膜培養器は、例えば、米国特許第５，３６４，７６６号、同第５，６０１，９９８号、及び同第５，６８１，７１２号を含む多くの出版物に開示されており、それら全ての全体は参照により本明細書に組み込まれる。

典型的な寒天培養培地及びペトリフィルムプレート中で使用される培養培地を含む多くの培養培地は、微生物の存在を示すための指示化合物を含む。指示化合物としては、例えば、ｐＨ指示薬、発色酵素基質、及びレドックス指示薬が挙げられる。指示化合物は、直接又は間接的に生成物に変換されるとき、典型的には、微生物コロニー及び／又はコロニー周囲の培養培地に色の変化を与える。色の変化は、多くの場合、培養培地中の微生物コロニーの存在を検出するのをより容易にし（例えば、コロニーと培養培地との間の色対比を改善する）、色の変化はまた、特定の指示化合物と反応する特定のコロニーを、その指示化合物と反応しない別の微生物コロニーと区別する働きもし得る。

微生物を増殖及び区別する多くの種類の培養培地は、２つ以上の指示化合物を含む。例えば、ペトリフィルム大腸菌カウントプレート中の培養培地は、水性緩衝液及び／又はサンプルで水和したとき、レドックス指示薬（塩化トリフェニルテトラゾリウム、以下「ＴＴＣ」）及び発色酵素基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、以下「Ｘ−ｇｌｕｃ」）を含有する。ＴＴＣは、微生物細胞と反応して、グラム陰性選択的増殖培地中で増殖する任意の細菌コロニーの細胞集団を染色する帯赤色のホルマザンを形成する。対照的に、Ｘ−ｇｌｕｃは、選択的増殖培地中で増殖することが可能であることに加えて、β−Ｄ−グルクロニダーゼ酵素活性を有する細菌（例えば、β−Ｄ−グルクロニダーゼ酵素活性を有する大腸菌菌株）のみと反応する。Ｘ−ｇｌｕｃの加水分解は、インディゴ色素の形成を引き起こし、それによりコロニーの細胞集団が青色に染色され、β−Ｄ−グルクロニダーゼ酵素活性を有するコロニーの周囲にブルーハロ（すなわち、指示薬の拡散領域）を形成する。

本開示の方法は、微生物細胞が指示化合物と反応して実質的に同色である生成物を形成する場合でさえ、複数の指示化合物のうちの１つ以上と微生物コロニーとのの反応に基づいて該微生物コロニーを識別するために使用され得ることが想到される。これは、指示化合物のうちの１つの生成物が、微生物コロニーの細胞集団と関連したままであり、別の指示化合物の生成物が、コロニーの細胞集団の周囲の培養培地中に拡散する場合に可能である。

本開示の方法において、当該技術分野においてよく知られている手順に従って、サンプルが調製され、培養器に接種され、インキュベートされる。サンプル調製は任意に、培養器中の栄養培地の中（例えば、注入平板）又は上（例えば、表面平板）にサンプルを導入する前に、サンプルから非微生物の破片を低減又は除去するために、希釈、酵素消化、濾過、及び／又は沈殿を含んでもよい。

サンプル中に存在する疑いがある微生物の増殖に好適な温度での十分なインキュベーション期間後、画像システムを使用して培養器中の微生物コロニーの画像を撮り、種々の画像解析スキームを適用して、微生物コロニーを検出及び計数することができる。培養器中の微生物コロニーを計数及び／又は区別するために使用される画像システムの例は、国際公開第ＷＯ ９８／５９３１４号、並びに米国特許第７，２９８，８８５号、同第８，０９４，９１６号、及び同第７，４９６，２２５号において見ることができ、それらの全体は、参照により本明細書に組み込まれる。培養器中の微生物コロニーを検出及び／又は測定するための画像解析スキームの例は、米国特許第６，０５８，２０９号及び同第６，２４３，４８６号において見ることができ、それらの全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、培養器中の微生物コロニーを計数するための技術に関する。この技術は、培養器中の微生物コロニーの自動計数の精度を改善するために使用される。本明細書に開示される計数ルールは、典型的には、コンピュータ実行可能なソフトウェア命令として記憶され、生物学的スキャニングシステム中のプロセッサによって実行される。あるいは、ルールは、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、又は当該技術分野において既知の種々のハードウェアコンポーネント等のハードウェアに実装されてもよい。本明細書に記載される種々のルールは、スキャンされる増殖培地に応じて、個々に又は他の計数ルールとの任意の組み合わせで適用されてもよい。いずれの場合においても、本明細書に記載されるルーを適用することによって、培養器上の微生物コロニーの自動計数の精度が改善され得る。

いずれの実施形態においても、本開示の方法は、培養器中の微生物コロニーを検出及び計数するためのシステムを採用する。培養器中の微生物コロニーを検出及び計数するためのシステムは、例えば、国際特許公開第ＷＯ ９６／１８７２０号、同第ＷＯ ９６／１８１６７号、同第ＷＯ ２００５／０６２７４４号に記載されており、それら全ての全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

図１は、培養器中の微生物コロニーを検出及び計数するためのシステム２０の一実施形態の斜視図を示す。システム２０は、スキャナによって生成される画像の画像解析を実施する外部コンピュータ２２に連結されているスキャナ２１を含む。外部コンピュータ２２は、例えば、培養器２４の画像解析のためにプログラムされたマイクロプロセッサを含んでもよい。外部コンピュータ２２は、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、ハンドヘルドコンピュータ、ワークステーション、タブレット型パーソナルコンピュータ装置、モバイル装置等を含み得る。例えば、スキャナ２１によって生成される培養器２４の画像の画像解析を容易にするために、ソフトウェアプログラムが、外部コンピュータ２２上に搭載され得る。

スキャナ２１は、インターフェース２５を介して外部コンピュータ２２に連結されている。インターフェース２５は、例えば、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）インターフェース、ユニバーサルシリアルバス２（ＵＳＢ２）インターフェース、ＩＥＥＥ １３９４ファイヤーワイヤーインターフェース、スモールコンピュータシステムインターフェース（ＳＣＳＩ）、アドバンステクノロジーアタッチメント（ＡＴＡ）インターフェース、シリアルＡＴＡインターフェース、ペリフェラルコンポーネントインターコネクト（ＰＣＩ）インターフェース、従来のシリアル又はパラレルインターフェース、無線接続等を含み得る。

培養器２４は、任意に、培養器２４を識別するために使用されるバーコード又は他の種類の識別マーク等のしるし２９を含んでもよい。ＲＦＩＤタグ、光学的に検出可能な二次元コード等もまた、しるしとして使用され得る。いずれの場合においても、しるし２９は、培養器２４上で増殖及び試験される微生物の種類を識別してもよい。スキャナ２１は、培養器２４をスキャナ２１内の第１の位置に引き寄せ、しるし２９の画像を生成し、次いで、培養器２４を第２の位置に引き寄せ、増殖範囲２７の画像を生成するように設計され得る。このようにして、培養器のしるし２９及び増殖範囲２７の画像が、システム２０によって生成され得る。あるいは、単一の画像が、しるし２９及び増殖範囲２７の両方を捉えてもよい。どちらの場合にも、しるし２９のスキャニングは、１つ以上の所望の計数ルールが自動で適用され得るように、使用されるプレートの種類の識別を容易にすることができる。

一例として、培養器２４は、商品名ペトリフィルムプレートで３Ｍによって販売されている薄膜培養器を含み得る。培養器２４は、例えば、好気性細菌、大腸菌、コリフォーム、腸内細菌、酵母、かび、黄色ブドウ球菌、リステリア、カンピロバクター菌等を含む、一般に食物汚染に関連する微生物の急速な増殖及び検出を容易にするために利用され得る。培養器は、概して、生物学的増殖並びに細菌の検出及び測定に一般に使用される増殖培地の１つの種類を含む。しかしながら、本発明はまた、様々な他の種類の増殖培地で適用されてもよい。

いずれの実施形態においても、薄膜培養器は、透明フィルムカバーシートを含む前面を有することができ、背面は、例えば、ペトリフィルム大腸菌／コリフォームカウントプレート、ペトリフィルムコリフォームカウントプレート、及びペトリフィルム腸内細菌カウントプレート等の半透明基板を備える。理論によって束縛されないが、半透明フィルムと透明フィルムとの間に配置される、比較的薄い（例えば、約１〜２ｍｍ厚の）培養培地の組み合わせは、本開示に従ってコロニーを区別するのに有益である光学的条件を提供すると考えられる。

培養器上の微生物コロニーの自動計数の精度を改善するために、本開示の方法の種々の態様は、画像処理中に適用され得るルールを確立する。換言すれば、以下により詳細に記載されるルールは、システム２０で実行されるコロニー計数アルゴリズムの一部を形成し得る。ルールは、スキャンされる増殖培地の種類及び直面し得る問題に応じて、個々に、又は他の画像解析ルール（参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ ２００５／０６２７４４号に記載される計数ルール）との任意の組み合わせで使用されてもよい。計数ルールのうちの１つ以上を適用することで、薄膜培養器等の増殖培地上の微生物コロニーの自動計数の精度を改善することによって、システム２０等の生物学的スキャニングシステムを改善することができる。

図２は、システム２０（図１）に対応し得る、生物学的スキャニングシステム３０のブロック図である。システム３０は、増殖培地の１つ以上の画像を生成し、その画像をプロセッサ３４に提供する撮像装置３２を含む。プロセッサ３４は、メモリ３６に連結される。メモリ３６は、撮像装置３２によって生成される画像の画像解析を促進する、種々のプロセッサで実行可能なソフトウェア命令を記憶する。具体的には、メモリ３６は、培養器上の微生物コロニーの自動計数の精度を改善するために、画像解析中に適用される１つ以上の計数ルール３７を記憶する。出力装置３８は、プロセッサ３４によって決定される結果を受信し、その結果をユーザに提供する。

一例として、撮像装置３２は、培養器の１つ以上の画像を生成するために、二次元モノクロカメラを備えてもよい。培養器の前面及び背面を照射するために、種々の照明器（図示せず）が使用されてもよい。例えば、照明器は、１つ以上の色で培養器を照射することができ、培養器の１つ以上の画像が、撮像装置３２によって生成され得る。加えて、制御装置（図示せず）は、培養器の各画像に対して、背面照明に対する前面照明の比を制御することができる。任意に複数の照明色を用いて、薄膜培養器を撮像するために使用され得る前面及び背面照明を提供する、撮像装置の限定されない例は、米国特許第８，０９４，９１６号に記載され、その全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

一実施形態では、第１の画像は、培養器の前面を照射する照明器からの１００％の照明、及び培養器の背面を照射する照明器からの０％の照明を使用して得ることができ、第２の画像は、培養器の前面を照射する照明器からの０％の照明、及び培養器の背面を照射する照明器からの１００％の照明を使用して得ることができる。別の実施形態では、例えば、第１の画像は、培養器の前面を照射する照明器からの８０％の照明、及び培養器の背面を照射する照明器からの２０％の照明を使用して得ることができ、第２の画像は、培養器の前面を照射する照明器からの２０％の照明、及び培養器の背面を照射する照明器からの８０％の照明を使用して得ることができる。背面照明に対する前面照明の比は、培養器中の特定の種類の栄養培地に対して最適なコントラストを提供するように選択され得る。

方法のいずれの実施形態において、第１の画像は、背面照明に対する前面照明の第１の比（例えば、１００％：０％）で、培養器を照射しながら生成され、第２の画像は、第１の比よりも低い、背面照明に対する前面照明の第２の比（例えば、０％：１００％）で、培養器を照射しながら生成される。いずれの実施形態においても、第１の比は、１：１を超えてもよい。いずれの実施形態においても、第２の比は、１：１未満であってもよい。

本明細書で使用される場合、「第１の画像」は、培養器が主にプレートの前面から照明を受けながら得られる画像を指し、本明細書で使用される場合、「第２の画像」は、培養器が主にプレートの背面から照明を受けながら得られる画像を指すことに留意されたい。画像を得るための暗黙に定義される時間的順序は、用語「第１の画像」及び「第２の画像」の使用によって表されない。結果的に、培養器の第１の画像は、培養器の第２の画像の前又は後に得られ得る。加えて、画像のうちの一方（例えば、第１の画像又は第２の画像のそれぞれ）は、もう一方の画像（例えば、第２の画像又は第１の画像のそれぞれ）を得た直後に、撮像培養器によって得られる必要はない。画像取得の介在間隔中に生じる有意な生物学的変化（例えば、増殖若しくは酵素活性）又は物理的変化（例えば、脱水）の可能性を防ぐために、第１及び第２の画像が時間的に十分に近接して得られることが推奨される。したがって、好ましい実施形態では、第１の画像は、第２の画像が得られる時間から約３０秒以内に得られる。

当業者は、撮像装置が培養器の前面に面して位置付けられ、照明器もまた、照明が培養器の前面に向けられるように位置付けられるシステムにおいて、撮像装置によって生成される画像が、培養器及びその内容物から反射される光を実質的に含むことを認識するであろう。加えて、当業者は、撮像装置が培養器の前面に面して位置付けられ、照明器もまた、照明が培養器の背面に向けられるように位置付けられるシステムにおいて、撮像装置によって生成される画像が、培養器及びその内容物によって透過及び／又は屈折される光を実質的に含むことも認識するであろう。

画像は、プロセッサ３４に提供され、更にはメモリ３６に記憶されてもよい。いずれの場合においても、画像は、培養器上の細菌数を決定するために、計数ルール３７を適用することによって解析される。撮像装置３２の解像度は、１センチメートル当たり約１５５ピクセルであってもよい。その場合、画像中の１センチメートルの線は、１５５ピクセル長である。

プロセッサ３４は、メモリ３６に記憶されているソフトウェアを実行する、汎用マイクロプロセッサを含み得る。あるいは、プロセッサ３４は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）又は他の特別に設計されたプロセッサを含み得る。いずれの場合においても、プロセッサ３４は、種々の計数ルール３７を実行して、培養器上の微生物コロニーの自動計数の精度を改善する。

メモリ３６は、プロセッサ３４によって適用されるプロセッサで実行可能なソフトウェア命令を記憶する、コンピュータ可読媒体の一例である。一例として、メモリ３６は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、不揮発性ランダムアクセスメモリ（ＮＶＲＡＭ）、電気的消去可能なプログラミング可能読み取り専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）、フラッシュメモリ等を含み得る。以下に記載されるような計数ルール３７は、メモリ３６に記憶され、画像解析に使用されるより大型のソフトウェアプログラムの一部を形成してもよい。

出力装置３８は、典型的には、ユーザに結果を通信するために使用される表示画面を備える。しかしながら、出力装置３８はまた、プリンタ等の他の種類の装置を備えてもよい。出力装置３８は、表示部（図示せず）等、スキャニングユニットの一部を形成してもよく、又は外部コンピュータ２２（図１）の表示画面等、スキャニングユニットの外部にあってもよい。

図３は、自動培養器解析のプロセスを示すフロー図である。図３に示されるように、プロセッサ３４は、培養器の１つ以上の画像を受信する（ステップ４１）。プロセッサ３４は、培養器上の微生物コロニーを計数するために、メモリ３６から種々のソフトウェアルーチンを呼び出す（ステップ４２）。例えば、細菌コロニーは、栄養培地中で１つ以上の指示化合物と反応した（すなわち、直接または間接的に）後、それらが生成する特徴的な色に従って同定されてもよい。コロニー認識の他の態様は、以下に考察される。プロセッサ３４によって実行されるソフトウェアは、コロニーがインキュベーション中に増殖した増殖範囲の色変化に基づき、培養器上の増殖範囲の同定、及び細菌コロニーの自動計数を可能にすることができる。

本発明に従って、プロセッサ３４は、１つ以上のルールを適用して、増殖培地上の微生物コロニーの計数の精度を改善する（ステップ４３）。解析される培養器の種類に応じて、ルールが個々に適用されてもよく、又はルールの種々の組み合わせが使用されてもよい。ルールは、メモリ３６から個々に呼び出されてもよく、又はより大型の画像解析ソフトウェアプログラムのサブルーチンを形成してもよい。ルールは、個々に適用されてもよく、又はルールの種々のセットが適用されてもよい。ルールのセットが使用される場合、ルールが適用される順序は、スキャンされるプレートの種類に基づき選択されてもよい。ルール適用の選択された順序は、最終結果に影響を及ぼし得る。ルールの種々のサブセットもまた、任意の順序で適用され得、ルールのサブセットに対して選択された順序もまた、最終結果に影響を及ぼし得る。

図４は、本開示に従った方法１００の一実施形態を示す。方法は、培養器の前面を照射しながら第１の画像を得るステップ５１と、培養器の背面を照射しながら第２の画像を得るステップ５２とを含む。培養器の前面及び背面は、本明細書に開示される撮像システムで照射され得る。方法１００は更に、第１及び第２の画像を解析して、各画像中の微生物コロニーを同定するステップ５３を含む。

第１及び第２の画像は、少なくとも１つの色合いで画像中の物体を定義するように得られる。したがって、第１及び第２の画像を解析して、各画像中の微生物コロニーを同定するステップは、当該技術分野においてよく知られている画像解析法に従って、画像中の物体をコロニーとして同定することを含むことができる。例えば、Ｗｅｉｓｓは、物体サイズ、視認性、色、表面性質、及び形状を含む１つ以上の基準に基づいて画像中の微生物コロニーを同定するための技術を記載している（全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２４３，４８６号）。上述のように、ＴＴＣを含む指示化合物と反応する微生物コロニーを検出するための方法は、赤の色合いを検出するように構成され得、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド含む指示化合物と反応する微生物コロニーを検出するための方法は、青の色合いを検出するように構成され得る。

この方法の好ましい実施形態では、インドリル基を含む発色酵素基質である第２の指示薬を有する薄膜培養器は、背面から照射され、画像は、画像の近似彩度をもたらす照明強度及び積分時間（すなわち、暴露時間）で撮られる。この好ましい実施形態の条件下で、微生物コロニーの細胞集団によって画定される画像中の範囲は、コロニー周囲の着色された生成物（すなわち、発色酵素基質による）の領域よりも有意に暗いように見え得る（すなわち、光をあまり透過させない）。これは、コロニー周囲の着色された生成物（すなわち、酵素反応による）の比較的大きい着色された領域からの、比較的小さい微生物コロニーの区別を容易にする。例えば、撮像プロセッサは、これらの条件下で、それらの領域の色の明度の差（例えば、存在する場合、コロニーの画像と、コロニー周囲の着色された領域の画像との間の輝度の差）に基づき、コロニー周囲の着色された生成物の縁部から、コロニー集団の縁部を容易に区別することができる。

第１及び第２の画像を解析して、各画像中の微生物コロニーを同定するステップは更に、画像中で検出された任意のコロニーの位置を同定するステップを含む。位置は、各画像中に同時に存在するコロニーと関連した、測定可能なパラメータを同定及び比較するために使用される。位置は、各画像中のＸ−Ｙ座標によって同定され得る。従って、好ましい実施形態では、第１の画像が得られた後であるが、第２の画像が得られる前に、培養器を移動させるか、又は別様に取り扱うことなく、第１及び第２の画像の両方が得られる。あるいは、第１及び第２の画像中に同時に存在するコロニーを決定するために、適切に画像を配向するために、登録標識（例えば、ペトリフィルムプレートの２つ以上の角、又は任意の培養器上に作製される登録マーク）が使用され得る。

第１の画像及び第２の画像を解析して同時に存在するコロニーを同定した後、第１及び第２の画像を解析して、各同時に存在するコロニーのサイズパラメータに関連した値を計算する。サイズパラメータは、例えば、平均コロニー直径、最小コロニー直径、最大コロニー直径、又はコロニー面積であってもよい。したがって、第１のサイズパラメータ値は、第１の画像中の特定のコロニーに対して計算され（図４、ステップ５４）、第２のサイズパラメータ値は、第２の画像中の対応する、同時に存在するコロニーに対して計算される（図４、ステップ５５）。

方法１００は更に、第１のサイズパラメータ値を第２のサイズパラメータ値と比較するステップ（５６）を含む。所与のコロニーの第１の画像から計算される第１のサイズパラメータ値は、所与のコロニーの第２の画像から計算される第２のサイズパラメータ値の所定範囲内にあり（例えば、８０％〜１２０％、９０％〜１１０％、又は９５％〜１０５％）、コロニーは、第１のグループに属するコロニーとして計数される（例えば、グループ「Ａ」：考えられる非大腸菌微生物）。この場合、グループ「Ａ」微生物は、非拡散性生成物を生成する第１の指示化合物（例えば、ＴＴＣ）と反応するが、拡散性生成物を生成する第２の指示化合物（例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド）とは反応しない。

反対に、所与のコロニーの第１の画像から計算される第１のサイズパラメータ値が、所与のコロニーの第２の画像から計算される第２のサイズパラメータ値よりも大きい（例えば、第２のサイズパラメータ値より少なくとも２０％大きい、少なくとも５０％大きい、又は少なくとも１００％大きい）場合、コロニーは、第２のグループに属するコロニーとして計算される（例えば、グループ「Ｂ」：考えられる大腸菌微生物）。この場合、グループ「Ｂ」微生物は、非拡散性生成物を生成する第１の指示化合物（例えば、ＴＴＣ）と反応し、第２の指示化合物（例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド）と反応して拡散性生成物を生成し、第２のサイズパラメータ値よりも大きい第１のサイズパラメータ値をもたらす。

図５は、本開示に従った、コロニーを複数のコロニーの種類に区別するためのルールを示すフロー図である。図２に示されるように、プロセッサ３４は、第１の画像及び第２の画像中のコロニーの位置を同定及びマッピングするために、メモリ３６中に記憶されたソフトウェアを呼び出す（ステップ６１）。具体的には、プロセッサ３４は、第１の画像中で同定されるコロニーが、第２の画像中で同定されるコロニーと同じ位置に位置するかどうかを決定する（ステップ６２）。第１及び第２の画像中に同時に存在するコロニーが見られる場合、プロセッサ３４は、同時に存在するコロニーのサイズパラメータ値を計算し、それらの値を比較して、それらコロニーが異なるかどうかを決定する（ステップ６３）。値が異なっていない（例えば、上述のように所定範囲内である）場合、培養器中のコロニーは、第１のタイプ（ステップ６４に示されるように、「タイプＡ」）として計数される。値が異なる（例えば、第１の画像の値が第２の画像の値よりも小さい）場合、培養器中のコロニーは、第２のタイプ（ステップ６５に示されるように、「タイプＢ」）として計数される。一例として、タイプ「Ａ」コロニーは、ペトリフィルム大腸菌／コリフォームカウントプレート中でＴＴＣとは反応し得るが、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドとは反応しない場合があり、したがって、非大腸菌コロニーと同定される。反対に、タイプ「Ｂ」コロニーは、ペトリフィルム大腸菌／コリフォームカウントプレート中でＴＴＣ、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドと反応し得、したがって、大腸菌コロニーと同定される。

画像を解析するステップは、ＲＧＢ（赤色／緑色／青色）画像処理アルゴリズムを含むことができる。あるいは、又は加えて、画像を解析するステップは、ＨＳＩ（色相、彩度、及び明度）、ＨＳＬ（色相、彩度、及び輝度）、ＨＳＶ（色相、彩度、及び値）アルゴリズム、又はこれらの組み合わせを含むことができる。

図６は、その中で２つの種類の微生物コロニーが増殖する薄膜培養器の一部分の白黒画像を示す。画像は、実施例１に記載されるように、培養器の背面のみを照射しながら得た。増殖範囲内には、２つの異なるタイプ「Ａ」及び「Ｂ」のそれぞれのコロニーを含む、複数の微生物コロニーが存在する。タイプ「Ａ」に属するコロニーは、細菌コロニーの細胞集団と反応しかつそれを染色する、第１の指示化合物と反応する。タイプ「Ｂ」に属するコロニーは、第１の化合物と相互作用し、加えて、微生物コロニー及び／又はコロニー周囲の培養培地に色変化を与える第２の指示化合物とも反応する。タイプＡ（第１のコロニー７４）及びタイプＢ（第２のコロニー７５）に属する代表的なコロニーの直径は、実施例１に記載される技術に従って決定した。データ（以下の表１に列挙される）は、背面照射画像中の第１のコロニー７４の直径が、２２ピクセルであり、背面照射画像中の第２のコロニー７５の直径が、１５ピクセルであることを示す。したがって、図６は、この種類の照明（すなわち、背面照明）を用いて、両方のタイプ（Ａ及びＢ）に属する代表的なコロニーのサイズパラメータ（すなわち、コロニー直径）が、ほぼ同一の大きさを有し得ることを示す。また、図６Ａに示されるのは、少なくとも１つの微生物コロニーを含む増殖範囲の一部分のラインスキャンのパス９１である。

図７は、図６に示される薄膜培養器の同じ部分の白黒画像を示す。画像は、実施例１に記載されるように、培養器の前面のみを照射しながら得た。第１のコロニー７４及びタ第２のコロニー７５の直径は、実施例１に記載される技術に従って決定した。データは、前面照射画像中の第１のコロニー７４の直径が、２２ピクセルであり、前面照射画像中の第２のコロニー７５の直径が、４５ピクセルであることを示す。従って、図７は、この種類の照明（すなわち、前面照明）を用いて、両方のタイプ（Ａ及びＢ）に属する代表的なコロニーのサイズパラメータ（すなわち、コロニー直径）が、異なる大きさ（例えば、実質的に異なる大きさ）を有し得ることを示す。また、図７Ａに示されるのは、少なくとも１つの微生物コロニーを含む増殖範囲の一部分のラインスキャンのパス９２である。パス９２は、図６Ａのパス９１と同一のピクセルに対応する。

背面照明画像中のコロニーの存在及び位置を同定するために、かつ前面照明画像中の微生物コロニーの存在及び位置を同定するために、画像解析アルゴリズムは、多くの場合、デジタル画像中のピクセルをライン毎に解析し、第１のピクセル又は第１のピクセル群の色相及び／又は色の明度を、第１のピクセルに近接した第２のピクセル、又は第１のピクセル群に近接した第２のピクセル群の色相及び／又は色の明度と比較する。この種の比較は、アルゴリズムが、画像中の微生物コロニー又は他の物体の縁部を示し得る色及び／又は明度を認識することを可能にする。図８は、図６Ａの背面照明画像中のパス９１に沿ったピクセルから得られる、赤色、緑色、及び青色に対する透過したピクセル明度のグラフを示す。２つの負のピークのそれぞれ（「１」及び「２」のそれぞれ）は、それぞれのコロニーの中心が、増殖培地の近接背景よりも暗いことを示し、それにより、２つの異なるコロニーの存在を明確に示す。図９は、図７Ａの前面照明画像中のパス９２に沿ったピクセルから得られる、赤色、緑色、及び青色に対する反射した色の明度のグラフを示す。図９は、コロニー中心を含むピクセルと、コロニーに隣接した増殖培地を含むピクセルとの間のピクセル明度の差がより小さいことを示す。

微生物コロニーを区別するための計数ルールを用いたスキャニングシステムの使用を記載してきた。計数ルールは、培養器上の微生物コロニーの自動計数の精度を改善するために、スキャニングシステム中で使用され得る。

技術は、ソフトウェアで実装されるものとして記載されてきた。その場合、コンピュータ可読媒体は、上記のルールのうちの１つ以上を具現化する、プロセッサ実行可能命令を記憶する。例えば、コンピュータ可読媒体は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、不揮発性ランダムアクセスメモリ（ＮＶＲＡＭ）、電気的消去可能なプログラミング可能読み取り専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）、フラッシュメモリ等の非一時的コンピュータ可読媒体を含み得る。コンピュータ可読媒体はまた、ソフトウェアを顧客に提供するために使用されるＣＤ−ＲＯＭ等の不揮発性メモリを含み得る。また、コンピュータ可読媒体は、例えば、インターネット等のネットワーク上でソフトウェアを提供するための電磁搬送波を含み得る。

しかしながら、同一の技術が、ハードウェアで実装されてもよい。例示的なハードウェア実装としては、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、特別に設計されたハードウェアコンポーネント、又はこれらの任意の組み合わせ内での実装が挙げられる。加えて、本明細書に記載される技術のうちの１つ以上は、ハードウェア、ソフトウェア、又はファームウェアで部分的に実行されてもよい。

実施形態
実施形態Ａは、方法であって、
撮像装置を使用して、薄膜培養器の第１の画像を生成するステップであって、培養器が、透明フィルムカバーシートを有する前面と、半透明基板を有する背面とを有し、
第１の画像が、培養器の前面に照明を提供しながら生成され、
培養器が、第１及び第２の指示化合物を含み、
第１の指示化合物が、微生物によって、第１の色を有する第１の生成物に変換され、
第２の指示化合物が、微生物によって、第２の色を形成する水拡散性の第２の生成物に変換される、ステップと、
撮像装置を使用して、薄膜培養器の第２の画像を生成するステップであって、第２の画像が、培養器の背面に照明を提供しながら生成される、ステップと、
第１及び第２の画像を解析して、各画像中の微生物コロニーを同定するステップと、
第１の画像を解析して、培養器中の特定の位置におけるコロニーのサイズパラメータの第１の値を計算するステップと、
第２の画像を解析して、培養器中の特定の位置におけるサイズパラメータの第２の値を計算するステップと、
第１の値を第２の値と比較するステップと、を含む、方法である。

実施形態Ｂは、第１の画像が、背面照明に対する前面照明の第１の比で、培養器を照射しながら生成され、第２の画像が、第１の比よりも低い、背面照明に対する前面照明の第２の比で、培養器を照射しながら生成される、実施形態Ａに記載の方法である。

実施形態Ｃは、第１の比が１：１を超える、実施形態Ｂに記載の方法である。

実施形態Ｄは、第１の比が約１００％：０％である、実施形態Ｂに記載の方法である。

実施形態Ｅは、第２の比が約０％：１００％である、実施形態Ｂ〜Ｄのいずれか一つに記載の方法である。

実施形態Ｆは、第１又は第２の画像を使用して、培養器中の微生物コロニーの数を計数するステップを更に含む、実施形態Ａ〜Ｅのいずれか一つに記載の方法である。

実施形態Ｇは、第１及び第２の画像を使用して、培養器中の第１の種類のコロニーの数を計数し、第２の種類のコロニーの数を計数するステップを更に含む、実施形態Ａ〜Ｆのいずれか一つに記載の方法である。

実施形態Ｈは、第１の種類のコロニーが、第１の指示薬を第１の生成物に変換する、実施形態Ｇに記載の方法である。

実施形態Ｉは、第２の種類のコロニーが、第２の指示薬を第２の生成物に変換する、実施形態Ｇ又はＨに記載の方法である。

実施形態Ｊは、第１の指示化合物がテトラゾリウム色素を含む、実施形態Ａ〜Ｉのいずれか一つに記載の方法である。

実施形態Ｋは、第２の指示化合物が、インドリル基を含む発色酵素基質を含む、実施形態Ａ〜Ｊのいずれか一つに記載の方法である。

実施形態Ｌは、サイズパラメータが、観察されたコロニー直径である、実施形態Ａ〜Ｋのいずれか一つに記載の方法である。

実施形態Ｍは、コロニー直径が、コロニー最小直径である、実施形態Ｌに記載の方法である。

実施形態Ｎは、コンピュータ可読媒体であって、プロセッサによって実行されるとき、プロセッサを備える培養プレートスキャニングシステムに、
薄膜培養器の第１の画像を得ることであって、第１の画像が、背面照明に対する前面照明の第１の比で、培養器を照射しながら生成される、薄膜培養器の第１の画像を得ることと、
薄膜培養器の第２の画像を得ることであって、第２の画像が、第１の比よりも低い、背面照明に対する前面照明の第２の比で、培養器を照射しながら生成される、薄膜培養器の第２の画像を得ることと、
第１及び第２の画像を解析して、各画像中の微生物コロニーを同定することと、
第１の画像を解析して、培養器中の特定の位置におけるコロニーのサイズパラメータの第１の値を計算することと、
第２の画像を解析して、培養器中の特定の位置におけるサイズパラメータの第２の値を計算することと、
第１の値を第２の値と比較することと、をさせる、コンピュータ可読命令を含む、コンピュータ可読媒体である。

実施形態Ｏは、プロセッサで実行されるとき、システムに、第１又は第２の画像を使用させて、培養器中の微生物コロニーの数を計数させる、コンピュータ可読命令を更に含む、実施形態Ｎのコンピュータ可読媒体である。

実施形態Ｐは、プロセッサで実行されるとき、システムに、第１及び第２の画像を使用させて、培養器中の第１の種類のコロニーの数を計数させ、第２の種類のコロニーの数を計数させる、コンピュータ可読命令を更に含む、実施形態Ｎのコンピュータ可読媒体である。

実施形態Ｑは、方法であって、
撮像装置を使用して、培養器の第１の画像を生成するステップであって、培養器が、前面と、前面と反対側の背面とを有し、
第１の画像が、培養器の前面に照明を提供しながら生成され、
培養器が、第１及び第２の指示化合物を含み、
第１の指示化合物が、微生物によって、第１の色を有する第１の生成物に変換され、
第２の指示化合物が、微生物によって、第２の色を形成する水拡散性の第２の生成物に変換される、ステップと、
撮像装置を使用して、薄膜培養器の第２の画像を生成するステップであって、第２の画像が、培養器の背面に照明を提供しながら生成される、ステップと、
第１及び第２の画像を解析して、各画像中の微生物コロニーを同定するステップと、
第１の画像を解析して、培養器中の特定の位置におけるコロニーのサイズパラメータの第１の値を計算するステップと、
第２の画像を解析して、培養器中の特定の位置におけるサイズパラメータの第２の値を計算するステップと、
第１の値を第２の値と比較するステップと、を含む、方法である。

実施形態Ｒは、第１の画像が、背面照明に対する前面照明の第１の比で、培養器を照射しながら生成され、第２の画像が、第１の比よりも低い、背面照明に対する前面照明の第２の比で、培養器を照射しながら生成される、実施形態Ｑに記載の方法である。

実施形態Ｓは、第１の比が約１００％：０％である、実施形態Ｒに記載の方法である。

実施形態Ｔは、第２の比が約０％：１００％である、実施形態Ｒ又は実施形態Ｓに記載の方法である。

実施形態Ｕは、第１及び第２の画像が生成されている間に、光学ディフューザが培養器の背面に近接して配置されている、実施形態Ｑ〜Ｔのいずれか一つに記載の方法である。

実施形態Ｖは、第１又は第２の画像を使用して、培養器中の微生物コロニーの数を計数するステップを更に含む、実施形態Ｑ〜Ｕのいずれか一つに記載の方法である。

実施形態Ｗは、第１及び第２の画像を使用して、培養器中の第１の種類のコロニーの数を計数し、第２の種類のコロニーの数を計数するステップを更に含む、実施形態Ｑ〜Ｖのいずれか一つに記載の方法である。

実施形態Ｘは、第１の種類のコロニーが、第１の指示薬を第１の生成物に変換する、実施形態Ｗに記載の方法である。

実施形態Ｙは、第２の種類のコロニーが、第２の指示薬を第２の生成物に変換する、実施形態Ｗ又Ｘに記載の方法である。

実施形態Ｚは、第１の指示化合物がテトラゾリウム色素を含む、実施形態Ｑ〜Ｙのいずれか一つに記載の方法である。

実施形態ＡＡは、第２の指示化合物が、インドリル基を含む発色酵素基質を含む、実施形態Ｑ〜Ｚのいずれか一つに記載の方法である。

実施形態ＢＢは、第１の比が約１００％：０％であり、第２の比が約０％：１００％である、実施形態Ｑ〜ＡＡのいずれか一つに記載の方法である。

実施形態ＣＣは、サイズパラメータがコロニー直径である、実施形態Ｑ〜ＢＢのいずれか一つに記載の方法である。

実施形態ＤＤは、コロニー直径が、コロニー最小直径である、実施形態ＣＣの方法である。

大腸菌コロニーを検出するための方法
Ｈａｒｄｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（カリフォルニア州サンタマリア）から、トリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ、カタログ番号Ｋ８９）を得た。Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ（ミネソタ州セントクラウド）から、微生物菌株大腸菌（ＡＴＣＣ ２５９２２）、大腸菌（３Ｍ−ＦＲ４）、サルモネラ・エンテリカ（ＡＴＣＣ ５１８１２）、及びエンテロバクター・アムニゲナス（ＡＴＣＣ ５１８９８）を得た。一晩ＴＳＢ培養物を各微生物菌株について調製した。薄膜培養器（３Ｍペトリフィルム大腸菌／コリフォームカウント（ＥＣ）プレート）及びバターフィールドリン酸緩衝液の両方を、３Ｍ社（ミネソタ州セントポール）から得た。

各株の終夜培養物をバターフィールドリン酸緩衝液中に約２５コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬとなるように希釈した希釈物を調製した。透明フィルムカバーシートを持ち上げ、コーティングされた底部フィルムの中心に１ｍＬの希釈サンプルをピペットでのせ、カバーシートを再配置することによって、３Ｍペトリフィルムプレートを接種した。製造業者（３Ｍ）によって提供された散布装置を使用して、サンプルを、所望の表面積（約２０ｃｍ^２）に均一に散布した。接種されたプレートを３５℃で２４時間インキュベートした。

培養器撮像システムを使用して、ペトリフィルム培養プレート上のコロニーを撮像及び同定した。撮像システムは、培養プレートの配置のためのプラットフォームとして機能する、中央に位置するガラスプラテン（ホワイトフラッシュオパールガラス）を含有した。発光ダイオードの２つの別々のセット（各セットは、２つの赤色ＬＥＤ、２つの緑色ＬＥＤ、及び２つの青色ＬＥＤを含有する）を使用して、培養プレートの前面を照射した。一方のセットは、培養プレートの左側の上（縦寸法に対して）に配置し、もう一方のセットは、右側の上（培養プレートの縦寸法に対して）に配置した。培養器上に位置付けられたＬＥＤからの光を、培養器から離れる方向で、かつ光拡散反射表面に向かって方向付け、この光拡散反射表面は、実質的に均一な照明パターンを培養プレートの前面上に方向付けた。同様に、発光ダイオードの２つの別々のセット（各セットは、２つの赤色ＬＥＤ、２つの緑色ＬＥＤ、及び２つの青色ＬＥＤを含有する）を使用して、培養プレートの背面を照射した。一方のセットは、培養プレートの左側の下（縦寸法に対して）に配置し、もう一方のセットは、右側の下（培養プレートの縦寸法に対して）に配置した。培養器の下に位置付けられたＬＥＤからの光を、培養器から離れる方向に光拡散反射表面に向けて方向付け、この光拡散反射表面は、実質的に均一な照明パターンを（上記の）ガラスプラテンの背面上に方向付け、均一な照明パターンを培養プレートの背面上にもたらした。

培養プレートの画像を撮るために、プラットフォーム上に、ＡｐｔｉｎａモデルＭＴ９Ｐ０３１ ＣＭＯＳ撮像センサ（Ａｐｔｉｎａ Ｉｍａｇｉｎｇ、カリフォルニア州サンノゼ）を直角に位置付けた。培養プレートがセンサの焦点面内に位置付けられるように、撮像センサ及びプラットフォームを調節した。培養プレートの前面（透明フィルム面）が撮像センサに面するように、培養プレートをプラットフォーム上で配向した。室内灯から撮像装置を隔離するために、黒色カバーを使用した。取得した画像中で、画像ピクセルの全てのヒストグラム中の約１０％未満のピクセルが飽和するように、画像露出を選択した。培養プレートの前面からの照明のみを使用して第１の画像を撮り、培養プレートの背面からの照明のみを使用して第２の画像を撮った。培養プレートをプラットフォーム上の全く同じ位置に維持しながら、両方の画像を撮った（すなわち、両方の画像を取得するまで、プレートをプラットフォームから移動させなかった）。これは、対応するＸ−Ｙ座標位置を一致させることによって、２つの画像中に同時に存在するコロニーの同定を可能にした。

ＩｍａｇｅＰｒｏ Ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、メリーランド州ロックビル）を使用して、２つの画像をコロニーの種類に関して解析した。各画像に関し、コロニー直径を測定することによって、個々のコロニーのサイズを決定した。撮像プログラムは、疑わしいコロニーの画像の最長寸法を組み込むピクセルのラインに沿って観察された赤色、緑色、及び青色ピクセル強度の変化について解析した。コロニー画像の周縁を示すために、かつコロニー直径を測定するために、局所背景に対する強度の変化を画定したピクセル位置を使用した（コロニーの周縁を示すピクセル点の間に位置するピクセルの数として、直径距離を報告した）。次いで、コロニーの種類を決定するために、２つの画像中に同時に存在するコロニーの直径測定値を比較した。培養プレート上の３つの代表的なコロニーに対する結果は、表１に示される。１及び２に指定されたコロニーはそれぞれ、図６及び７のそれぞれのコロニー７４及びコロニー７５に対応する。

^＊コロニー３及びコロニー４は両方とも、単一の拡散性ブルーハロ（すなわち、コロニーを包囲する発色指示薬の生成物の拡散領域拡散）によって包囲された。したがって、コロニー３及びコロニー４は、前面照射画像を使用して、単一の大型コロニーのように見えた。しかしながら、背面照射画像は、青色の領域がプレート中で一緒に混合した、２つの別々のコロニーが実際にはあることを明らかにした。
^＊＊背面照射画像を使用して測定したコロニー直径と比較した、前面照射画像を使用して測定したコロニー直径との間の差に基づき、コロニーの種類を決定した。

いずれの場合においても、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な修正がなされてもよい。例えば、所望の実施に応じて、本明細書に記載されるルールのうちの１つ以上が、他のルールと共に、又は他のルールなしで使用されてもよく、ルールの種々のサブセットが任意の順序で適用されてもよい。これら及び他の実施形態は以下の「特許請求の範囲」に含まれる。

Claims (2)

1. 撮像装置を使用して、薄膜培養器の第１の画像を生成するステップであって、前記薄膜培養器が、透明フィルムカバーシートを有する前面と、半透明基板を有する背面とを有し、
   前記第１の画像が、前記薄膜培養器の前記前面に照明を提供しながら生成され、
   前記薄膜培養器が、第１の指示化合物及び第２の指示化合物を含み、
   前記第１の指示化合物が、微生物によって、第１の色を有する第１の生成物に変換され、
   前記第２の指示化合物が、微生物によって、第２の色を形成する水拡散性の第２の生成物に変換される、ステップと、
   前記撮像装置を使用して、前記薄膜培養器の第２の画像を生成するステップであって、前記第２の画像が、前記薄膜培養器の前記背面に照明を提供しながら生成される、ステップと、
   前記第１の画像及び前記第２の画像を解析して、各画像中の微生物コロニーを同定するステップと、
   前記第１の画像を解析して、前記薄膜培養器中の特定の位置におけるコロニーのサイズパラメータの第１の値を計算するステップと、
   前記第２の画像を解析して、前記薄膜培養器中の前記特定の位置における前記サイズパラメータの第２の値を計算するステップと、
   前記第１の値を前記第２の値と比較するステップと、を含み、
   前記第１の画像が、背面照明に対する前面照明の第１の比で、前記薄膜培養器を照射しながら生成され、
   前記第２の画像が、前記第１の比よりも低い背面照明に対する前面照明の第２の比で、前記薄膜培養器を照射しながら生成される、方法。
2. コンピュータ可読媒体であって、プロセッサによって実行されるとき、前記プロセッサを備える培養プレートスキャニングシステムに、
   薄膜培養器の第１の画像を得ることであり、前記第１の画像が、背面照明に対する前面照明の第１の比で、前記薄膜培養器を照射しながら生成される、薄膜培養器の第１の画像を得ることと、
   前記薄膜培養器の第２の画像を得ることであり、前記第２の画像が、前記第１の比よりも低い背面照明に対する前面照明の第２の比で、前記薄膜培養器を照射しながら生成される、前記薄膜培養器の第２の画像を得ることと、
   前記第１の画像及び前記第２の画像を解析して、各画像中の微生物コロニーを同定することと、
   前記第１の画像を解析して、前記薄膜培養器中の特定の位置におけるコロニーのサイズパラメータの第１の値を計算することと、
   前記第２の画像を解析して、前記薄膜培養器中の前記特定の位置における前記サイズパラメータの第２の値を計算することと、
   前記第１の値を前記第２の値と比較することと、をさせる、コンピュータ可読命令を含む、コンピュータ可読媒体。

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