JP5828177B2 - 細菌または真菌の抗菌薬感受性の検査方法およびそれに用いるシステム - Google Patents
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Description
第1の形態のマイクロデバイスは、例えば、前記複数の流路が、それぞれ、異なる前記導入口および異なる前記観察エリアを有する形態である。
全体の大きさ
幅(図1Aにおいて矢印X方向の長さ):例えば、30〜40mm
長さ(図1Aにおいて矢印Y方向の長さ):例えば、30〜40mm
厚み(図1Aにおいて矢印Z方向の長さ):例えば、1〜3mm
上基板10、
厚み:例えば、0.8〜2.8mm
凹部の深さ:例えば、10〜25μm
前記導入口
直径:例えば、0.75〜1.5mmで、好ましくは、0.75mm
前記導入流路
長さ:例えば、10〜15mm
前記観察エリア
長さ:例えば、1〜5mm
前記排出流路
長さ:例えば、10〜15mm
前記排気部
直径:例えば、0.75〜1.5mm
下基板20
厚み:例えば、0.12〜0.17mm
第2の形態のマイクロデバイスは、例えば、複数の流路が、同一の前記導入口を有し、それぞれ異なる観察エリアを有する形態である。前記マイクロデバイスは、特に示さない限り、前記第1の形態の説明を援用できる。
全体の大きさ
幅(図2Aにおいて矢印X方向の長さ):例えば、30〜40mm
長さ(図2Aにおいて矢印Y方向の長さ):例えば、30〜40mm
厚み(図2Aにおいて矢印Z方向の長さ):例えば、1〜3mm
上基板60
厚み:例えば、0.8〜2.8mm
凹部の深さ:例えば、17μm
前記導入口
直径:例えば、0.75mm
前記導入流路
長さ:例えば、50mm
前記第1導入流路:例えば、2mm
前記第2導入流路:例えば、3〜5cm
前記観察エリア
長さ:例えば、8mm
前記排出流路
長さ:例えば、2〜5mm
前記排気部
直径:例えば、1.5mm
第3の形態のマイクロデバイスは、前述の第2の形態と同様に、例えば、複数の流路が、同一の前記導入口を有し、それぞれ異なる観察エリアを有する形態である。前記マイクロデバイスは、特に示さない限り、前記第1の形態および前記第2の形態の説明を援用できる。
全体の大きさ
幅(図10Aにおいて矢印X方向の長さ):例えば、30〜40mm
長さ(図10Aにおいて矢印Y方向の長さ):例えば、30〜40mm
厚み(図10Aにおいて矢印Z方向の長さ):例えば、1〜4mm
上基板60
厚み:例えば、0.8〜3mm
凹部の深さ:例えば、50μm(導入口部分:例えば、300μm)
前記導入口
直径:例えば、1mm
前記導入流路
長さ:例えば、25〜35mm
前記第1導入流路
長さ:例えば、2mm
前記第2導入流路
長さ:例えば、23〜33cm
幅 :例えば、200μm
前記観察エリア
長さ:例えば、4mm
幅 :例えば、100μm
前記排出流路
長さ:例えば、2〜3mm
幅 :例えば、500μm
前記排気部
直径:例えば、1.5mm
(1)マイクロデバイス
図1に示すマイクロデバイス1を以下に示すようにして作製した。マイクロデバイス1の上基板10は、PDMS製、下基板20は、ガラス製とした。マイクロデバイス1の大きさは、以下の通りとした。
全体長さ(Y方向):30mm
全体幅(X方向):40mm
全体厚み(Z方向):2〜3mm
上基板の凹部の深さ:17μm
導入口の直径:0.75mm
導入流路の長さ:10〜15mm
導入流路の幅:0.1mm
観察エリアの長さ:2〜5mm
観察エリアの各流路の幅:0.1mm
排出流路の長さ:10〜13mm
排出流路の幅:0.1mm
排気部の直径:1mm
上基板の貫通孔の直径:0.75mm
1) 40mm×50mmのカバーガラス(No.5、厚み1mm、Matsunami Glass Ind., Ltd.,)、または、シリコンウェハー(3inch、Ferrotec Co.,)に、コーティング剤(商品名オムニコート、MicroChem)を、4000rpm、10秒でスピンコートし、180℃で1分焼成。
2) フォトレジスト(SU8−25、MicroChem)を、2000rpm、30秒でスピンコート。膜厚は、16〜17μm。
3) 65℃、3分および95℃、7分でプリベーク。
4) マスクアライナー(商品名、ES20、Nanomeric Technology Inc.,)で、11秒間、マイクロパターンを露光。
5) 露光後、65℃、1分および95℃、3分で、ベーク。
6) SU8−Developer(商品名、マイクケム社)で、2分現像。
7) 固く焼き付けるため、180℃、30分でハードベーク。
8) 後述するPDMSが剥がれやすいように、0.84wt%のCytop809ME(商品名、Asahi Glass Co., Ltd.,)を、4000rpmでスピンコートし、180℃で1時間処理。
1) ポリジメチルシロキサン(PDMS)(商品名Silpot 184、Dow Corning Toray Co., Ltd.,)と重合触媒とを、重量比10:1で混合し、30分脱気。
2) モールドにディップし、100℃、30分で焼き固める。
1) 固めたPDMS基材を剥がす。予めエタノールで洗浄したカバーガラス(No.1、厚み0.12〜0.17mm、Matsunami Glass Ind., Ltd.,)とともに、前記PDMSを、リアクティブイオンエッチング装置(商品名RIE−10NR、Samco)に入れる。
2) 前記カバーガラスと前記PDMS基材を、酸素流量100standard cubic/分(sccm)、圧力50Pa、RF power 30Wの条件の酸素プラズマに、20秒さらす。
3) 前記カバーガラスと前記PDMS基材とを、プラズマ処理した面で張り合わせ、ボンディングを行う。
4) 前記ボンディングした積層体に、パンチャー(商品名BP−15F、Kai Industries Co., Ltd.,)で、導入口および空気口となる貫通孔をあける。
以下に示す3種類の抗菌薬を、下記濃度となるようにリン酸緩衝生理食塩水(PBS、10mmol/L、pH7.2−7.4)に混合し、抗菌薬液を調製した。
アミカシンAmikacin(商品名AMK、Sigma)
640、320、160、80μg/mL
シプロフロキサシンCiprofloxacin(商品名CPFX、東京化成工業株式会社)
80、40、20、10μg/mL
イミペネムImipenem/シラスタチンcilastatin(商品名IPM、萬有製薬株式会社)
320、160、80、40μg/mL(IPM濃度)
Mueller−Hinton Agar (Becton, Dickinson and Company)プレートを用いて、緑膿菌を、37℃で24時間、前培養した。コロニーを、Mueller−Hinton brothに懸濁し、MacFarland=0.5(OD600=0.132)に調製した。緑膿菌は、多剤耐性株#2株および#5株(BMLより入手)、S1株(感受性株、BMLより入手)を、それぞれ使用した。
前記(2)の抗菌薬液と前記(3)の培養液とを、体積比1:9で混合し、混合液1μLを、それぞれ、マイクロデバイス1の各導入口に注入した。また、コントロールとして、前記抗菌薬液に代えて、滅菌水と前記培養液とを、体積比1:9で混合し、混合液1μLを、マイクロデバイス1の導入口に注入した。そして、シャーレにマイクロデバイス1を入れ、さらに、密閉容器に前記シャーレを入れた。なお、前記シャーレおよび前記密閉容器には、それぞれ、水を含ませたキムワイプを入れた。前記密閉容器を37℃のインキュベーターに入れ、3時間インキュベートした。前記密閉容器および前記シャーレ内の相対湿度は、97%であった。
前記密閉容器からマイクロデバイス1を取り出し、顕微鏡により、観察エリアについて、コントロールに対する菌量の増減および形態変化を確認し、MIC(最少発育阻止濃度)を決定した。
(1)マイクロデバイス
図2に示すマイクロデバイスを、前記実施例1と同様にして作製した。マイクロデバイスの上基板は、PDMS製、下基板は、ガラス製とした。マイクロデバイス2の大きさは、以下の通りとした。
全体長さ(Y方向):40mm
全体幅(X方向):30mm
全体厚み(Z方向):2mm
上基板60の凹部の深さ:17μm
導入口の直径:0.75mm
導入部の直径:3mm
導入流路の長さ:30〜40mm
第1導入流路:1〜2mm
第2導入流路:28〜39mm
導入流路の幅:0.3〜0.5mm
観察エリアの長さ:8mm
観察エリアの幅:0.5mm
排出流路の長さ:2〜4mm
排出流路の幅:0.5mm
排気部の直径:1.5mm
前記実施例1と同様にして調製した被検菌液約10μLを、共通の導入口に注入した以外は、前記実施例1と同様にして、インキュベートおよび判定を行った。
65種類の緑膿菌株について、前記実施例2と同様にして、AMK、CPFXおよびIPMで処理を行い、多剤耐性(3剤耐性)、2剤耐性、1剤耐性および感受性(3剤感受性)の分類を行った。また、同じ65種類の緑膿菌株について、前記実施例1に記載した標準法により、同様に耐性および感受性の分類を行った。これらの結果を、図6に示す。図6は、65種類の緑膿菌株のうち、耐性および感受性の株数を示すグラフである。図6に示すように、本実施例のマイクロデバイス法により、標準法と同様の分類結果が得られた。この結果から、本発明のマイクロデバイス法によれば、長時間を要する標準法と比較して格段に短い時間(3時間)で、耐性および感受性の判断を行えることがわかった。
10、60、90 上基板
20、70、100 下基板
11’、21’、31’、41’、51’、61’、91’ 導入口
11、21、31、41、51、61、91 導入部
12、22、32、42、52、62、92 導入流路
13、23、33、43、53、63、93 観察エリア
14、24、34、44、54、64、94 排出流路
15、25、35、45、55、65、95 排気部
15’、25’、35’、45’、55’、65’、95’ 空気口
7 測定部
700 顕微鏡
701 CCDカメラ
702 配置部
703 温度制御部
71 マイクロデバイス
8 画像処理部
80 CPU
81 記憶部
82 出力部
Claims (11)
- 複数の流路を有するマイクロデバイスを使用し、
前記マイクロデバイスの前記複数の流路内で、抗菌薬と被検菌液との混合液をインキュベートする工程、および、
前記マイクロデバイスの前記複数の流路の各観察エリアにおける、前記被検菌液由来の細菌または真菌を、顕微鏡により検出する検出工程を含み、
前記マイクロデバイスにおいて、
前記複数の流路に、予め、抗菌薬が配置され、
前記複数の流路は、同一の導入口を有し、
各流路は、前記同一の導入口、前記観察エリア、および排気部を、この順序で有し、
前記複数の流路の各観察エリアが全て、顕微鏡の視野内に収まるように、収束して並列に配列されており、
前記複数の流路は、それぞれ、前記観察エリアにおける流路幅および長さが同じであり、
前記各流路において、前記観察エリアの排気部側端から前記排気部までの流路の長さが、前記観察エリアの同一の導入口側端から前記同一の導入口までの流路の長さより短く、
インキュベート工程前またはインキュベート工程において、前記マイクロデバイスの前記同一の導入口から前記複数の流路に、前記被検菌液を導入することを特徴とする、細菌または真菌の抗菌薬感受性の検査方法。 - 前記各流路に配置された抗菌薬が、複数種の抗菌薬および複数濃度の抗菌薬の少なくとも一方である、請求項1記載の検査方法。
- 前記各流路において、前記観察エリアの排気部側端から前記排気部まで流路の長さが、同じである、請求項1または2記載の検査方法。
- 前記各流路において、前記観察エリアの流路幅が、前記観察エリアの同一の導入口側端から前記同一の導入口までの流路および前記観察エリアの排気部側端から前記排気部までの流路の流路幅より小さい、請求項1から3のいずれか一項に記載の検査方法。
- 前記抗菌薬は、前記排気部から前記流路に配置した、請求項1から4のいずれか一項に記載の検査方法。
- 前記複数の流路において、1つの流路が、前記抗菌薬を配置しないコントロールの流路である、請求項1から5のいずれか一項に記載の検査方法。
- 前記検出工程において、前記被検菌液由来の細菌または真菌について、前記コントロールの流路の観察エリアにおける数および形態の少なくとも一方と、前記抗菌薬が配置された流路の観察エリアにおける数および形態の少なくとも一方とを観察する、請求項6記載の検査方法。
- 前記検出工程において、前記被検菌液由来の細菌または真菌について、
前記観察エリアにおける、数および形態の少なくとも一方を観察する、請求項1から5のいずれか一項に記載の検査方法。 - 前記流路の深さが、10〜25μmである、請求項1から8のいずれか一項に記載の検査方法。
- 前記インキュベート工程の前後に、前記検出工程を行う、請求項1から9のいずれか一項に記載の検査方法。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載の検査方法により細菌または真菌の抗菌薬感受性を検査するための検査システムであって、
被検菌液と抗菌薬との混合液を複数の流路に有するマイクロデバイスをインキュベートすることにより前記複数の流路内の混合液をインキュベートするインキュベート手段、
前記マイクロデバイスの前記複数の流路の各観察エリアの顕微鏡観察による画像を取得する画像取得手段、
前記画像における細菌または真菌の数および形態の少なくとも一方の情報を取得する情報取得手段、および、
前記情報に基づいて、前記被検菌液由来の細菌または真菌の抗菌薬感受性を決定する決定手段を有し、
前記マイクロデバイスにおいて、
前記複数の流路に、予め、前記抗菌薬が配置され、
前記複数の流路は、同一の導入口を有し、
各流路は、前記同一の導入口、前記観察エリア、および排気部を、この順序で有し、
前記複数の流路の各観察エリアが全て、顕微鏡の視野内に収まるように、収束して並列に配置されており、
前記複数の流路は、それぞれ、前記観察エリアにおける流路幅および長さが同じであり、
各流路において、前記観察エリアの排気部側端から前記排気部までの流路の長さが、前記観察エリアの同一の導入口側端から前記同一の導入口までの流路より短いことを特徴とする、検査システム。
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