CN105209595B - 微流体多孔型细胞培养测试装置 - Google Patents

微流体多孔型细胞培养测试装置 Download PDF

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Abstract

提供了一种微流体多孔型细胞培养测试装置，其中所述多孔型细胞培养测试装置具有多个对齐的微流体孔单元的阵列结构，且所述微流体孔单元包含注入第一流体的注入部、适于在其中收容第二流体的收容部、第一流体流动通过其中的微流体通道和适于促进第一流体的进入的空气排出部。

Description

微流体多孔型细胞培养测试装置
技术领域
本公开内容大体上涉及微流体多孔型细胞培养测试装置。
背景技术
通常，通过下述步骤观察细胞对药物的响应：将细胞放入多孔板、注入液体形式的药物并使用光学测定系统监视细胞的时间依赖性变化以获得统计结果。Kirby-Bauer(KB)测试是已知的固体介质中的抗生素易感性测试方法，其中细菌散布在琼脂培养基上，在其上放置吸附有抗生素的纸，并观察细菌生长。在液体培养基中微稀释测试的情况下，已经开发了许多自动化系统，例如VITEK2、Microscan和Phoenix，以用于抗生素易感性测试。此类系统可通过下述过程用于抗生素易感性测试：将抗生素放在微米尺寸的孔中，向孔中与液体培养基一起注射细菌，通过浊度统计学上监视并确定细菌生长。
当使用常规系统测试细胞对不同药物的响应时，将细胞放入液体或固体培养基中，将药物与液体培养基混合，或者将吸附有药物的纸盘放置在固体培养基上以使细胞对药物响应，通过浊度(吸光度)测定而确定细胞生长对药物的响应。但是，此类方式依赖于统计学有效数据的采集而不是依赖于单个细胞的变化，需要长时间温育(通常16～24小时)，因为需要使至少预定数量的细胞(通常约1,000,000个细胞/ml)生长以获得统计学结果。在该情况下，不可能监视存在的单个细胞针对药物的变化以及实时监视运动的单个细胞。此外，需要大量时间和劳动来测试大量的药物，因为各个药物是分别注射的。用于在固体培养基中抗生素易感性测试的KB测试基本上要求大量的琼脂培养基板来测试数十种抗生素的易感性，这是因可以放置在固体培养基上的药物的数量受限导致的。VITEK是一种开发用于最小化测试时间的自动化系统，也要求约12小时的相对长时间，因为细菌浊度要增加至预定水平。此外，由于用于常规测试方法的环境不同于体内环境，测试结果和体内出现的现象之间可能存在很多实质性差异(Gregory G.Anderson等，(2003),“IntracellularBacterial Biofilm-Like Pods in Urinary Tract Infections”,Science 301,105；Gallo等，(2011),“Demonstration of Bacillus cereus in Orthopaedic-Implant-Related Infection with Use of a Multi-Primer Polymerase Chain Reaction-MassSpectrometric Assay.”,J Bone Joint Surg Am,93)。
因此，需要开发一种用于抗生素易感性测试的相对于常规技术精确且快速的技术。
发明内容
本发明的一个方面提供一种微流体多孔型细胞培养测试装置，其具有多个对齐的微流体孔单元的阵列结构，每个微流体孔单元包含第一流体穿过其进入的入口、适于在其中收容第二流体的收容室、第一流体流动经过其中的微流体通道和适于促进第一流体的进入的空气出口，其中所述微流体通道与所述入口和所述空气出口连通从而使所述第一流体能流入并填充所述微流体通道，其中所述收容室设计为孔的形式以便保持进入的第二流体，并且在其中所述收容室的下方侧面部与所述微流体通道的侧面部连通之处形成毛细管阀，从而使所述第一流体和所述第二流体彼此相遇而形成界面。
根据一个实施方式，所述微流体孔单元的尺寸与市售多孔板的各个孔的尺寸一致。
根据一个实施方式，各个孔布置成1×1、1×2、1×4、2×4、4×6、12×8、24×16或48×32的矩阵。
根据一个实施方式，所述微流体通道布置成围绕所述收容室以使所述微流体孔单元具有四边形结构。
根据一个实施方式，所述毛细管阀具有预定厚度和宽度以防止所述第一流体进入所述收容室。
本发明的另一方面提供一种使用微流体多孔型细胞培养测试装置的细胞分析方法，所述微流体多孔型细胞培养测试装置具有多个对齐的微流体孔单元的阵列结构。每个微流体孔单元包含让含胶凝剂液体介质和生物试剂的混合溶液穿过其进入的入口、适于在其中收容生理活性物质的收容室、与所述入口连通并且所述液体介质流动经过其中的微流体通道以及所述微流体通道的下方侧面部通过其与所述收容室的侧面部连通的毛细管阀。所述细胞分析方法包括下述步骤：(a)向所述入口引入所述含胶凝剂液体介质和所述生物试剂的混合溶液，以在微流体通道中填充所述混合溶液，并使所述混合溶液胶凝而形成固体薄膜；(b)将所述生理活性物质供应至所述收容室中，并使所述生理活性物质通过所述毛细管阀扩散至所述固体薄膜中；和(c)在单个细胞基础上，观察在所述混合溶液和所述生理活性物质彼此相遇的界面处发生的生物试剂的变化。
根据一个实施方式，步骤(a)可以包括：(a-1)将含有所述生物试剂的溶液引入所述入口以填充所述微流体通道的一部分，和(a-2)进一步将所述含胶凝剂液体介质引入所述入口以使所述液体介质形成层流并且填充所述微流体通道，从而在所述微流体通道的上壁表面和下壁表面上形成所述生物试剂的单层。
根据一个实施方式，所述细胞分析方法还包括步骤(d)：在单个细胞基础上观察所述生物试剂对所述生理活性物质的响应，以确定所述生理活性物质的最小抑制浓度(MIC)或最小生物膜清除浓度(MBEC)。
附图说明
图1和2说明本发明的一个实施方式的微流体多孔型细胞培养测试装置。
图3是微流体孔单元的截面图。
图4是显示使用具有96孔芯片设计的细胞培养测试装置的成像步骤的示意图。
图5显示使用根据本发明的一个实施方式的细胞培养测试装置来进行抗生素易感性测试的步骤。
图6显示证明青霉素抗生素针对粪肠球菌(E.faecalis)菌株的MIC值可以使用MAC芯片快速地确定的试验结果的图像。
图7显示示出响应于抗生素的生物膜的形状的图像，其使用根据本发明的一个实施方式的MAC芯片进行研究。
图8显示在琼脂糖与革兰氏阴性细菌的溶液混合的状态下，在不同浓度的β-内酰胺抗生素的存在下革兰氏阴性细菌物种在琼脂糖中的生长。
图9是解释图8中所示现象的详解图。
图10显示在β-内酰胺抗生素的存在下在大肠杆菌(E.coli)菌株中图9所解释的现象的发生。
图11显示将原料引入微流体通道中以获得细菌单层的图像的步骤。
图12显示示出在细菌形成单层的状态下在不同浓度的抗生素的存在下细菌物种的生长的图像。
图13显示示出在小于MIC和大于MIC的不同浓度的作为β-内酰胺抗生素的氨曲南(aztreonam)的存在下铜绿色假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的生长的图像。
图14和15是显示不使用抗生素时的两种细菌菌株和对抗生素具有抗性的两种细菌菌株的生长的光学显微镜图像，揭示了可以测定所述细菌菌株的双重感染。
图16是显示使用根据本发明的一个实施方式的细胞培养测试装置对哺乳动物细胞进行3D培养的图。
图17显示使用MAC芯片通过单个细胞形态分析(SCMA)测定的4种临床菌株物种的MIC值。
具体实施方式
以下将参照附图详细描述本发明的实施方式。但是，本发明不限于本文提出的实施方式并且可以以许多不同形式体现。相反，提供这些实施例是为了使本文充分完整，并且全面传递本发明的范围。在附图中，为了清晰可能会放大要素的尺寸，例如宽度和厚度。完全从观察者的角度解释附图。会理解的是，当提到要素“在另一要素上”时，其可以直接在其他要素上，或者其间还可以存在一个或多个中间要素。本领域技术人员会意识到可以进行许多改进和变化而无需背离本发明的主旨。整个附图中，使用相同的附图标记来实质上指定相同的要素。
另一方面，本文所用术语应该如下理解。术语“第一”、“第二”等仅用于将一个要素与另一个要素区分开，权利要求的范围不应该受这些术语限制。例如，可以将第一要素称为第二要素，并且类似地，可以将第二要素称为第一要素。
如本文所用，单数形式的“一种”、“一个”和“所述”包括复数的指代物，除非上下文明确地指出例外。还应该进一步理解的是术语“包括”、“包含”、“具有”和/或“含有”当用于本说明书时，规定了指定特征、整数、步骤、操作、要素和/或组分的存在，但不排除存在或添加一种或多种其他特征、整数、步骤、操作、要素和/或组分。本文所述的方法的各步骤可以以不同于所明确描述的顺序进行。换言之，各步骤可以与所述相同的顺序或者以相反的顺序进行。
图1和2说明本发明的一个实施方式的微流体多孔型细胞培养测试装置。具体而言，图1和2分别是微流体多孔型细胞培养测试装置的顶部透视图和底部透视图。
参见图1，如从顶部所见，细胞培养测试装置100具有朝外开口的入口120、收容室130和空气出口150。由于该结构，可以将第一流体和第二流体引入细胞培养测试装置100。参见图2，如从底部所见，与顶部结构不同，细胞培养测试装置100具有与外部封闭的结构。由于该结构，可以将第一流体和第二流体收容在细胞培养测试装置100中。
参见图1和2，微流体多孔型细胞培养测试装置100具有多个对齐的微流体孔单元110的阵列结构。每个微流体孔单元110包含使第一流体穿过其进入的入口120、适于在其中收容第二流体的收容室130、第一流体流动通过其中的微流体通道140和适于促进第一流体的进入的空气出口150。对齐的微流体孔单元110的尺寸可以与市售多孔板的孔的尺寸整体上一致。优选的是，微流体孔单元110的中心与市售多孔板的孔的中心匹配。
多孔板是在化学、生化和/或生物检验中用于处理和分析许多样品的标准工具。多孔板可以采用许多形式、尺寸和形状。通常而言，多孔板可以制造成具有标准尺寸和形状，并且具有标准孔排列。标准排列的孔包括见于例如96孔板(12×8孔阵列)、384孔板(24×16孔阵列)和1536孔板(48×32孔阵列)的那些。具有其他孔排列的多孔板可商购获得。
由于细胞培养测试装置100具有与市售多孔板的尺寸相似的尺寸，其可以容易地与市售多孔板相互替换用于各种常规生物分析技术。
第一流体和第二流体各自包含80重量％以上的水或90重量％以上的水作为分散介质或溶剂。例如，第一流体可以是含胶凝剂液体介质和生物试剂的混合溶液。第二流体是可以是含有生理活性物质的水性溶液。第一流体透过形成在细胞培养测试装置100的顶部中的朝外开口的入口120进入。类似地，第二流体透过细胞培养测试装置100的收容室130的上部开口进入。可使用特定的泵或通过移液将第二流体引入。
每个收容室130设计为孔的形式，所述孔具有其尺寸足以保持进入的第二流体的空间。孔的体积不特别限制，只要其足以长期观察第二流体进入后的反应即可。孔的体积优选为100μl～2000μl。
每个微流体通道140与入口120和空气出口150连通，以使第一流体流入并填充微流体通道140。例如，微流体通道140可以具有数百μm至数mm的宽度和数百μm的深度(或厚度)。使用这些尺寸，容易进行随后的成像，并且第一流体可以通过毛细作用填充微流体通道140。在其中第一流体为包含胶凝剂的液体介质的情况下，第一流体可以在经过预定时间后胶凝，导致形成填充微流体通道140的固体薄膜。
收容室130的下方侧面部与微流体通道140的侧面部连通，以使第一流体和所述第二流体彼此相遇而形成界面。
优选的是，细胞培养测试装置100的主体由透明材料制成，从而能够容易地观察细胞培养测试装置100中发生的现象。透明材料优选是聚合物树脂，例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯或聚碳酸酯。细胞培养测试装置100可以通过将聚合物树脂注射成型而制造。
图3是微流体孔单元的截面图。参见图3，微流体孔单元110整体上具有接近四边形的结构，其尺寸与市售多孔板的各孔的尺寸相似。例如，微流体孔单元110具有正方形结构。微流体通道140围绕收容室130并且尽可能地延伸。该结构增加了进入的第一流体的量。由于该优点，容易操作样品。微流体通道140在一端闭合，但是与空气出口150连通，以使通过入口120进入的第一流体流入并容易填充微流体通道140。第一流体可以是含有诸如琼脂糖等胶凝剂的液体介质。第一流体可以包括生物试剂，例如细菌菌株。毛细管阀160形成在微流体通道140与收容室130连通之处。当第一流体通过毛细作用填充微流体通道140时，毛细管阀160的存在允许在第一流体和第二流体之间形成界面，同时防止第一流体进入收容室130。即，控制毛细管阀160的厚度和宽度，以便维持毛细作用。毛细管阀160通常厚度为100μm～500μm，宽度为500μm～2mm。在该范围内，防止第一流体溢流入收容室130，并且可以填充微流体通道140。形成在微流体通道140的一端的空气出口150与微流体通道140的上壁连通，并且暴露至空气。利用该布置，第一流体填充微流体通道140，存在于微流体通道140中的空气通过空气出口150释放到空气中。
图4是显示使用具有96孔芯片设计的细胞培养测试装置的成像步骤的示意图。在一些实施方式中，将作为第一流体的琼脂糖溶液引入微流体通道中。出于该原因，根据本发明实施方式的细胞培养测试装置也可以被称为“微流体琼脂糖通道(MAC)芯片”。
参见图4，将含有细菌的琼脂糖溶液通过细胞培养测试装置的入口引入，并填充微流体通道。然后琼脂糖溶液胶凝。其后，通过收容室将抗生素溶液引入。此时，胶凝的琼脂糖和抗生素溶液在微流体通道和收容室的结合处形成界面。接下来，抗生素穿过该界面，扩散到胶凝的琼脂糖，并且遇到细菌。由于胶凝的琼脂糖整体上形成固体薄膜，细菌固定在薄膜上。该固定允许通过成像系统基于单个细胞观察细菌的反应性。以下将提供进一步的细节。
图5显示使用根据本发明的一个实施方式的细胞培养测试装置来进行抗生素易感性测试的步骤。
首先，将含有胶凝剂的液体介质与生物试剂混合以制备混合溶液。
液体介质的含水量为约95％以上。由于胶凝剂的存在，液体介质可以固化。作为胶凝剂，可以例举琼脂、琼脂糖、凝胶、藻酸盐/酯、胶原蛋白或纤维蛋白。优选是用琼脂或琼脂糖。例如，琼脂可以以在液体介质中0.5重量％～4重量％的量使用。液体介质通常不需要营养物质。但是，在一些情况下，液体介质可以包括营养物质。
适用于本发明的生物试剂的实例包括病毒、细菌、真菌、藻类、原生动物、寄生病原体、人类和哺乳动物细胞以及生物膜。生物试剂可以在液体或固体介质中生长，并且其生长可以受外源生理活性物质的种类和浓度影响。混合溶液中生物试剂的密度为约102细胞/ml～1010细胞/ml，优选104细胞/ml～1010细胞/ml，更优选105细胞/ml～109细胞/ml。如果生物试剂的密度低于以上规定的下限，可能难以察觉生物试剂的位置。同时，如果生物试剂的密度低于以上规定的上限，可能难以察觉生物试剂的个体状态。
接下来，通过入口引入预定量(例如10μl～12μl)的混合溶液。接下来，含细菌的琼脂糖沿着通道移动。当通道填充有混合溶液时，空气从通道通过空气出口逸出，这促进混合溶液引入到通道中。
将混合溶液胶凝化以形成其中固定有生物试剂的固体薄膜。当将液体介质冷却至较低温度时，该介质胶凝化，结果生物试剂的移动减缓。该固定有利于连续观察运动的生物试剂。
细胞培养测试装置优选由用于光学成像的透明材料制成。液体介质可以施涂到细胞培养测试装置的每个微流体通道，并在其中胶凝化，从而形成固体薄膜。液体介质通过入口提供，并且在微流体通道中进行胶凝化。固体薄膜的厚度可以根据微流体通道的深度确定。微流体通道的深度可以为1μm～5mm、1μm～3mm、1μm～2mm、1μm～1.5mm、1μm～1mm、1μm～800μm、1μm～500μm、1μm～100μm、10μm～3mm、100μm～500μm、10μm～1mm、100μm～1mm、200μm～1mm、500μm～1mm或100μm～500μm。微流体通道的深度优选为100μm～500μm。
当考虑成像区域的尺寸时，微流体通道的深度可以为100μm～5mm、300μm～5mm、500μm～3mm或1mm～3mm。微流体通道的宽度优选为1mm～3mm。
对于微流体通道的形状和长度没有特别限制。优选的是，将最大可能量的含胶凝剂液体介质和生物试剂的混合溶液引入微流体通道中同时保持微流体通道的尺寸和宽度。这有利于精确控制与抗生素的反应。优选的是，各个微流体孔单元具有与市售多孔板的各个孔的尺寸一致的尺寸，并且，微流体通道围绕收容室以使其尽可能延伸。
固体薄膜的厚度和宽度根据微流体通道的深度和宽度确定。本文所用术语“薄膜”是指厚度足以固定所述生物试剂并且在单个细胞基础上观察所述生物试剂的薄层。薄膜的厚度可以为1μm～5mm、1μm～3mm、1μm～2mm、1μm～1.5mm、1μm～1mm、1μm～800μm、1μm～500μm、1μm～100μm、10μm～3mm、100μm～500μm、10μm～1mm、100μm～1mm、200μm～1mm或500μm～1mm，但不特别限于该范围。固体薄膜的厚度可以相当于固体薄膜的在与固体薄膜的待观察侧垂直的方向上的一侧的尺寸。当固体薄膜的厚度在以上定义的范围时，可以在单个细胞基础观察所述薄膜。
接下来，将所述生理活性物质通过收容室的开口引入至所述收容室中，并使其扩散至所述固体薄膜中。生理活性物质可以包括选自下述物质：诸如抗生素、抗癌剂和免疫抑制剂等药物、营养物质、细胞分泌物、信号转导剂、病毒、细胞、微RNA、蛋白质、抗原、抗体和DNA。期望的是收容室足够大而收容足量的生理活性物质。例如，收容室的尺寸可以为直径约3mm～约15mm，高度为约3mm～约15mm。利用这些尺寸，可以在一次注射原料后容易地观察原料的反应，同时长时间维持反应。
接下来，观察生物试剂对生理活性物质的响应。将生物试剂固定并在固体薄膜中二维分布，结果，可以在单个细胞基础上进行观察。单个细胞的生长上的变化通常可以在数十分钟(正常30分钟)内观察到。因此，使用根据本发明的细胞培养测试装置，与使用常规细胞培养测试装置相比，允许精确且快速地鉴定生理活性物质对生物试剂的影响。例如，可以在3～4小时内完成对细菌细胞的生理活性测试。此处，此类快速生理活性测试法被称为“单个细胞形态分析(SCMA)”。利用该MAC系统允许在各种抗生素的存在下通过时间推移成像观察单个细胞形态的变化。
可以使用光学测定系统以用于观察。光学测定系统可以包括成像系统，例如CCD或CMOS照相机。光学测定系统可以可以包括聚焦和光成像所需的光学单元或装置，例如透镜、照明器和光导。光学测定系统可以包括用于处理和分析成像系统观察到的图像数据的图像处理系统。光学测定系统在快速地记录和分析在测试过程中生物试剂的生长的变化以获得测试结果。由微流体通道和收容室之间的界面附近获得成像区域。成像区域的尺寸可以为约300μm×300μm～约500μm×500μm。微流体通道的宽度至少大于成像区域的宽度。
因此，使用基于生物试剂的固定和生理活性物质的扩散的根据本发明的培养测试装置可以极大地减少药物测试所需的药物和细胞的量，并能够快速地追踪单个细胞的生长的变化从而与现有技术相比在最快2小时(正常3小时至4小时内)获得关于药物的测试结果。这是迄今为止最快的测试速度。
图6显示证明青霉素抗生素针对粪肠球菌(E.faecalis)菌株的MIC值可以使用MAC芯片快速地确定的试验结果的图像。对于该实验，将粪肠球菌用液体琼脂糖匀质化并注入到芯片中。琼脂糖在室温胶凝化。其后，将作为抗生素的液体青霉素注入孔空间。然后将芯片在37℃在温育器温育，4小时温育后观察结果。
使用0.5μg/ml～8μg/ml的各种浓度的抗生素获得的易感性测试结果示于图6中。可以在4小时内获得青霉素(2μg/ml)的MIC。与之相反，根据微稀释测试(MDT)，耗费了长得多的时间(18小时)来获得青霉素的MIC。
使用微流体通道可以减少生物试剂和生理活性物质的所需量，能够以减少的成本进行生理活性测试。与使用微流体通道系统有关的另一优点是可以同时观察单个生物试剂对各种种类和浓度的生理活性物质的响应。
MAC芯片对于生物膜检验以及抗生素易感性测试非常有用。生物膜见于被微生物感染的区域或微生物附着的区域。生物膜是指构成粘性微生物复合物的膜，其由被聚合物基质包围的微生物形成。生物膜的形成可以极大影响人类健康。生物膜引起多种感染、中耳炎、牙周炎和其他感染性疾病。存在于生物膜中的细菌对抗生素的抗性比悬浮细菌的抗性强至少1,000倍。已经使用流式细胞系统和基于孔的系统来研究生物膜。但是，这些检验系统需要数天的长时间使生物膜形成。与使用所述检验系统有关的其他困难是需要将生物膜染色和使用共聚焦显微镜以用于观察。需要进一步的试验来测定最小抑制浓度(MIC)或最小生物膜清除浓度(MBEC)。此类系统的尺寸非常大，并且难以清楚地显示生物膜形成阶段以及呈现体内生物膜形成。
因此，需要适合于研究生物膜形成和生物膜与抗生素的反应性的有效系统。考虑该需要，根据本发明的一个实施方式的MAC芯片证明是常规系统的优良替代方式。
图7显示示出响应于抗生素的生物膜的形状的图像，其使用根据本发明的一个实施方式的MAC芯片进行研究。对于该实验，将粪肠球菌用液体琼脂糖匀质化并注入到芯片中。琼脂糖在室温胶凝化。其后，将作为抗生素的液体青霉素注入MAC芯片的收容室中。然后将芯片在37℃在温育器温育，4小时温育后观察结果。细菌被周围的琼脂糖固定。在该状态下，细菌连续地分裂而形成细菌群，其构成生物膜。
在大于MIC的浓度时在特定抗生素的存在下一些细菌物种生长成丝状。该丝状生长不能清楚地与看上去类似生长的细菌分裂区分开。因此，难以确定MIC。
图8显示在琼脂糖与革兰氏阴性细菌的溶液混合的状态下，在不同浓度的β-内酰胺抗生素的存在下革兰氏阴性细菌物种在琼脂糖中的生长。从图8可以看出细菌甚至在大于MIC的浓度时仍然生长。但是，在MDT结果中，观察到细菌生长在0.06μg/ml时被抑制。
图9是解释图8中所示现象的详解图。在该试验中，在细菌与琼脂糖混合的状态下将抗生素注入。调节抗生素以具有小于或大于MIC的浓度。结果显示在大于MIC(图9底部)时细菌的丝状生长和在小于MIC(图9顶部)时细菌的分裂生长(其看似丝状生长)。图10显示在β-内酰胺抗生素的存在下在大肠杆菌(E.coli)菌株中图9所揭示的现象的发生。在小于MIC时细菌的分裂生长不能与在大于MIC时细菌的丝状生长区分开，造成难以确定MIC。因此，在成像区域中细菌的单层形成使得能够进行更精确的观察。
根据本发明的一个实施方式，提供可以借以观察单个聚焦单层的抗生素易感性测试方法。
通常而言，当将细菌与含琼脂糖液体介质的均匀混合溶液引入各个微流体通道时，一些数量的细菌随机地存在于通道的底部而形成单层。作为原料的细菌和含琼脂糖液体介质的连续引入至各个微流体通道被认为是形成更好的单层的一个优选途径。
图11显示将原料引入微流体通道中以获得细菌单层的图像的步骤。参见图11，首先，将细菌培养液通过细胞培养测试装置的入口引入微流体通道中。此时，优选的是微流体通道的预定空间保持未充满，并且仅一部分的通道填充有培养液。例如，约三分之一体积的通道填充有培养液，然后进一步将含琼脂糖液体介质引入微流体通道中。含琼脂糖液体介质的快速引入形成液体介质的层状流动，使细菌在通道的壁表面上(当考虑通道的宽度和深度时主要是通道的上下壁表面)聚集。因此，细菌可以实质上以在细胞壁上的单层的形式分布。
图12显示示出在细菌形成单层的状态下在不同浓度的抗生素的存在下细菌物种的生长的图像。细菌在小于MIC的浓度(对照和0.06μg/mL)时分裂，而在大于MIC的浓度(0.5μg/mL)时仅以丝状形式生长。从这些观察可以确定MIC。图13显示示出在小于MIC的浓度(对照和0.06μg/mL)和大于MIC的浓度(0.25和0.5μg/mL)的作为β-内酰胺抗生素的氨曲南的存在下铜绿色假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的生长的图像。细菌在小于MIC时分裂而以丝状形式而生长，而在大于MIC时仅以丝状形式生长。可以通过观察在单层图像中的细菌分裂而确定MIC。
根据本发明，可以通过单个聚焦单层成像和3D成像而观察细胞。即，当将细菌细胞和作为胶凝剂的琼脂糖的混合物引入各通道时，可以在MAC芯片的底板和琼脂糖之间的界面处观察到单层形式的细胞，并且可以在3D培养后在其他部分观察。
同时，通过一个入口连续地添加细菌细胞和胶凝剂(琼脂糖)引起形成细菌的单层，其可以通过单聚焦成像观察。
此外，使用根据本发明的细胞培养测试装置能够通过成像观察双重感染。
图14和15是显示不使用抗生素时的两种细菌菌株和对抗生素具有抗性的两种细菌菌株的生长的光学显微镜图像，揭示了可以测定被细菌菌株的双重感染。
试验条件如下：
*菌株
-大肠杆菌ATCC 25922(杆状菌株)
-粪肠球菌ATCC 29212(球形菌株)
*抗生素
-庆大霉素(浓度：32μg/mL)
MIC处在两种菌株的易感范围内
-红霉素(浓度：8μg/mL)
仅对粪肠球菌ATCC 29212易感
-对照
*温育时间：3h
*菌株浓度
-McFarland 0.25
*琼脂糖浓度：2％
*使用100×倍透镜进行观察
细菌的形状在0小时图像中难以辨别，并且不能监视，直到经过4小时后细菌分裂至一定程度。此时，确认了杆状细菌和球形细菌的共存。还可以确认是否发生被细菌双重感染。
图16是显示使用根据本发明的一个实施方式的细胞培养测试装置对哺乳动物细胞进行3D培养的图。对于该试验，将哺乳动物细胞和ECM(胶原蛋白、基质胶、纤维蛋白、琼脂糖等)的混合物引入通道中。ECM胶凝后，注入培养基或药物。结果，细胞由于培养基供应的营养物质而生成。作为选择，细胞被药物杀死。在此类环境下，细菌以三维(即以3D培养)方式生长。
图17显示使用MAC芯片通过单个细胞形态分析(SCMA)测定的4种临床菌株物种的MIC值。从Seung-ok Lee教授(韩国天主教大学仁川St.Mary医院诊断医学科)处获得来自约40个患者的4种菌株，包括大肠杆菌、粪肠球菌、铜绿色假单胞菌和金黄色葡萄球菌(S.aureus)。对于显微镜使用60×物镜(对于大肠杆菌为40×透镜)。在Mc＝0.5时，将各个菌株与琼脂糖混合。观察到在底部形成单层。MIC值可以使用MAC芯片在4小时内获得。参见图17，使用MAC芯片测定的MIC值很好地符合通过临床和实验室标准协会(CLSI)定义的MIC范围(即，品质控制范围)。因此，可以认为使用MAC芯片进行的单个细胞形态分析是非常快速精确的AST检验。
虽然已经参照附图和实施方式详细地描述本发明，本领域技术人员会意识到可以对实施方式进行各种改变和修改而无需背离如所附权利要求公开的本发明的主旨。

Claims (12)

1.一种微流体多孔型细胞培养测试装置，其具有多个对齐的微流体孔单元的阵列结构，每个微流体孔单元包含第一流体穿过其进入的入口、适于在其中收容第二流体的收容室、第一流体流动经过其中的微流体通道和适于促进第一流体的进入的空气出口，其中所述微流体通道与所述入口和所述空气出口连通从而使所述第一流体能流入并填充所述微流体通道，其中所述收容室设计为孔的形式以便保持进入的第二流体，并且在其中所述收容室的下方侧面部与所述微流体通道的侧面部连通之处形成毛细管阀，从而使所述第一流体和所述第二流体彼此相遇而形成界面。
2.如权利要求1所述的多孔型细胞培养测试装置，其中所述孔布置成1×1、1×2、1×4、2×4、4×6、12×8、24×16或48×32的矩阵。
3.如权利要求1所述的多孔型细胞培养测试装置，其中所述微流体通道布置成围绕所述收容室以使所述微流体孔单元具有四边形结构。
4.如权利要求1所述的多孔型细胞培养测试装置，其中所述毛细管阀具有预定厚度和宽度以防止所述第一流体进入所述收容室。
5.如权利要求4所述的多孔型细胞培养测试装置，其中所述毛细管阀的厚度由所述微流体通道的厚度所限定。
6.如权利要求4所述的多孔型细胞培养测试装置，其中所述毛细管阀的厚度为100μm～500μm，宽度为500μm～2mm。
7.如权利要求1所述的多孔型细胞培养测试装置，其中所述空气出口形成在所述微流体通道的一端，与所述微流体通道的上壁连通，并暴露至空气。
8.如权利要求1所述的多孔型细胞培养测试装置，其中所述第一流体是含胶凝剂液体介质和生物试剂的混合溶液，并且所述第二流体是含有生理活性物质的溶液，所述生物试剂包括病毒、细菌、真菌、藻类、原生动物、寄生病原体、哺乳动物细胞或生物膜，所述生物膜是由微生物群体形成的膜。
9.如权利要求1所述的多孔型细胞培养测试装置，其中所述细胞培养测试装置的主体由透明材料制成。
10.一种使用微流体多孔型细胞培养测试装置的细胞分析方法，所述微流体多孔型细胞培养测试装置具有多个对齐的微流体孔单元的阵列结构，每个微流体孔单元包含让含胶凝剂液体介质和生物试剂的混合溶液穿过其进入的入口、适于在其中收容生理活性物质的收容室、与所述入口连通并且所述液体介质流动经过其中的微流体通道以及所述微流体通道的下方侧面部通过其与所述收容室的侧面部连通的毛细管阀，所述方法包括下述步骤：
(a)向所述入口引入所述含胶凝剂液体介质和所述生物试剂的混合溶液，以在所述微流体通道中填充所述混合溶液，并使所述混合溶液胶凝而形成固体薄膜；
(b)将所述生理活性物质供应至所述收容室中，并使所述生理活性物质通过所述毛细管阀扩散至所述固体薄膜中；和
(c)在单个细胞基础上，观察在所述混合溶液和所述生理活性物质彼此相遇的界面处发生的生物试剂的变化，
其中，所述生物试剂包括病毒、细菌、真菌、藻类、原生动物、寄生病原体、哺乳动物细胞或生物膜，所述生物膜是由微生物群体形成的膜。
11.如权利要求10所述的细胞分析方法，其中步骤(a)包括：
(a-1)将含有所述生物试剂的溶液引入所述入口以填充所述微流体通道的一部分，和
(a-2)进一步将所述含胶凝剂液体介质引入所述入口以使所述液体介质形成层流并且填充所述微流体通道，从而在所述微流体通道的上壁表面和下壁表面上形成所述生物试剂的单层。
12.如权利要求10所述的细胞分析方法，其中所述方法还包括步骤(d)：在单个细胞基础上观察所述生物试剂对所述生理活性物质的响应，以确定所述生理活性物质的最小抑制浓度(MIC)或最小生物膜清除浓度(MBEC)。
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