KR20210072063A - 고-용량 응용 분야에 사용을 위한 구획화된 세포 배양 - Google Patents

Abstract

본 명세서는 세포 배양 기질 생산에 유용하고, American National Standards Institute of the Society for Laboratory Automation and Screening(ANSI/SLAS)의 마이크로플레이트 표준을 준수하는, 인접 웰 사이의 유동성 연결부를 갖는 다중 웰 플레이트에 관한 것이다.

Description

고-용량 응용 분야에 사용을 위한 구획화된 세포 배양

분야

본 명세서는 고-용량 응용분야에 사용을 위한 구획화된 세포 배양 생성용 신규한 기질에 관계한다. 구체적으로, 일부 구체예들에서, 본 명세서는 실험실 자동화 및 스크리닝 협회 (ANSI/SLAS) 마이크로 플레이트 표준 준수 멀티-웰 플레이트에 관한 것으로, 이때 웰 그룹이 유동적으로 연결되어, 신경 생물학 연구 및 약물 발견 연구에서 광범위한 세포 분석에 사용될 수 있는 세포 배양 기질을 만든다.

1970 년대 중반에 개념화된 이후로, 구획화된 세포 배양 (compartmentalized cell cultures: CCC)은 신경생물학 연구에서 중요한 방법론으로 주목을 받았다. Campenot, R.B., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74: 4516-9 (1977). 예를 들면, CCC는 시냅스 소통 (Vikman et al., J. Neurosci. Methods 105 : 175-184 (2001)), 단백질 및 세포기관의 축삭 수송과 같은 기전의 연구 (Bousset et al., J. Neurosci. Methods 105 : 175-184 (2001))하기 위한 뉴런의 별개 집단 사이의 네트워크 소통을 연구하거나, 또는 세포 네트워크 형성 연구를 목적(Taylor et al., J. Neurosci. 33:5584-5589 (2013))으로 사용할 수 있다. 또한, CCC는 다른 세포 유형 사이의 세포 신호전달, 예를 들어 뉴런 세포-근육 세포간의 신호전달을 연구하는 실험 (Zahavi et al., J. Cell Sci. 128 : 1241-1252 (2015)) 또는 상이한 뇌 영역으로부터의 뉴런 간의 소통 (Berdichevsky, Y., Staley, KJ & Yarmush, ML Lab Chip 10, 999-1004 (2010))을 연구하는데 이용된다.

전통적으로, CCC는 높은 처리량 또는 실험 병렬화에 대한 필요성이 제한되어 있는 기본 연구 적용분야 주로 사용되었다. 그러나, 더욱 발전되며, 옮기는 것과 관련 세포-기반 분석에 대한 제약 업계의 요구가 증가함에 따라, 약물 스크리닝 적용 분야에서 CCC를 사용할 필요가 있다. 예를 들면, 오늘날 관련 방식으로 프리온(prion) 및 프리온- 유사 메커니즘을 모델링하고, 비교적 짧은 시간 내에 수천 개의 화합물을 스크리닝할 수 있는 분석 플랫폼에 대한 엑세스에 큰 관심이 있다 (Zhang, M., Luo, G., Zhou, Y., Wang, S. & Zhong, Z. Phenotypic screens targeting neurodegenerative diseases. J. Biomol. Screen. 19, 1-16 (2014)). 그러나, 최신(state-of-the-art) 제품은 이러한 요구를 충족하기에 충분한 견고성 또는 처리량을 제공할 수 없다.

CCC를 확립하기 위해, 세포 배양 기질은 별개의 세포 배양 영역 (웰)은 극히 작은 튜브들을 통하여 유동적으로 연결되는데, 이들 튜브는 이들 웰 간의 유동적 연결이 되는데 충분히 큰 직경을 가지만, 상이한 다른 세포-배영 영역 간에 세포의 이동은 방지할 수 있을 만큼 충분히 작아야 한다. 전통적으로, CCC는 수작업을 통하여, 그리고 매우 조잡한 방법을 통해 이루어졌다: 메스(scalpel)를 사용하여 세포 배양 접시의 바닥에 수작업을 통하여 홈 또는 스크래치를 만들었다. 그런 다음, 진공-그리스를 사용하여 스크래치를 밀봉하고, 밀봉 된 스크래치 위에 유리 또는 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 링과 같은 물리적 장벽을 조심스럽게 배치하여 별개의 영역을 만들었다. 이러한 방법의 설명은 Campenot, R.B., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74: 4516-9 (1977)을 참고한다. 이 방법은 CCC의 형성에 적합한 기질을 생산하는 데 사용할 수 있지만, 매우 번거롭고 실패률이 높아 힘들다. 최근에는 CCC 형성을 위한 기질 생산에 미세가공 방법이 사용되었다. 예를 들면, 소프트 리소그래피(lithography) 및 폴리디메틸실록산 (PDMS, 즉, 실리콘 고무) 주조를 사용하여, 원래 수제 기질보다 매우 균일하고, 취급이 용이한 미세유동성 기질을 만들었다. Taylor et al., Nat. Methods 2:599-605 (2005); 및 Neto et al., J. Neurosci. 36:11573-11584 (2016) 참고. 그러나, CCC의 형성을 가능하게 하는 데 필요한 다소 복잡한 마이크로채널(microchannel) 네트워크로 인해, 이러한 미세유동성 기질은 몇 가지 단점이 있어 효율적인 실험에 사용되지 못한다. 예를 들면, 이러한 기질은 액체로 채우기가 어렵고, 기포가 형성되기 쉽고, 표면 개질이 어렵고, 시간이 지남에 따라 박리되기 쉽다. 또한, 이러한 기질에는 복잡한 마이크로채널 레이아웃이 필요하기 때문에, 이러한 디자인을 대용량 스크리닝에 필요한 고-밀도 형식으로 확장하기가 어렵다.

요약

여기에서는 고-처리량 스크리닝 (HTS)과 같은 고-용량 실험 적용을 가능하게 하는 CCC 생산용 새로운 기질을 제시한다. 이 기질은 세포의 이동을 방지하고, 웰 사이의 화학적 온전성(integrity)의 유지를 위해 충분히 작게 만들 수 있는, 유동적 연결에 의해 인접한 웰들이 상호 연결되는 표준 384- 웰 플레이트 형식을 기반으로 하지만, 이에 국한되지 않는다. 상기 유동적 연결은 실험에서 높은 성공률을 보장하기 위해 튼튼한 액체 취급이 가능하도록 신중하게 설계되었다. 또한, 상기 기질은 습식-화학 접근법을 사용하여 쉽게 표면을 변형시킬 수 있다. HTS 애플리케이션에서 사용할 수 있도록, 상기 기질은 모든 ANSI/SLAS 마이크로플레이트 표준을 준수하도록 설계되었고, 시중에서 판매되는 대부분의 상용 액체 취급 로봇 및 광학 판독 시스템과 호환된다.

설명에 따르면, 본 명세서는 예를 들어, 웰을 포함하는 다중-웰 플레이트를 포함하고, 여기서 이 플레이트의 적어도 2 개의 인접 웰들은 적어도 2 개의 해당 인접 웰을 구분시키는 벽에 적어도 하나의 유동성 연결구를 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 멀티-웰 플레이트는 American National Standards Institute of the Society for Laboratory Automation and Screening(ANSI/SLAS)의 마이크로플레이트 표준을 준수한다. 일부 구체예들에서, 상기 다중-웰 플레이트는 열가소성 재료로 만든 기질을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 열가소성 재료는 폴리스티렌 (PS), 시클로-올레핀-공중 합체 (COC), 시클로 올레핀 중합체 (COP), 폴리(메틸 메타크릴레이트 (PMMA), 폴리카보네이트 (PC), 폴리에틸렌 (PE), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET), 폴리아미드 (Nylon®), 폴리프로필렌 또는 폴리에테르 에테르 케톤 (PEEK), Teflon®, PDMS 및/또는 열경화성 폴리 에스테르 (TPE)를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 다중-웰 플레이트는 시클로-올레핀-공중합체 (COP), 시클로-올레핀-중합체 (COC) 또는 폴리스티렌 (PS)으로부터 생성된 기질을 포함한다. 다른 구체예들에서, 상기 다중-웰 플레이트는 실리콘, 유리, 세라믹 재료 또는 알루미나로 생산된 기질을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 플레이트는 한 개 이상의 층을 포함하는 기질을 포함하며, 임의선택적으로 이들 층은 초음파 결합(bonding), 열압착 결합, 플라즈마 결합, 용매-지원된 결합, 레이저-지원된 결합 또는 접착제 결합, 또는 이중 접착 테이프를 사용한 결합에 의해 연결된다. 일부 구체예들에서, 상기 플레이트는 단백질 또는 중합체로 피복된 기질을 포함한다. 일부 경우들에서, 상기 플레이트는 하나 또는 그 이상의 폴리-l- 리신, 폴리-L-오르니틴, 콜라겐, 라미닌, Matrigel® 또는 소 혈청 알부민으로 피복된 기질을 포함한다. 일부 경우들에서, 상기 플레이트는 폴리[카르복시베타인 메타크릴레이트] (PCBMA), 폴리[[2-메타크릴로일옥시)에틸]트리메틸암모늄 클로라이드] (PMETAC), 폴리[폴리(에틸렌 글리콜) 메틸에테르 메타크릴레이트] (PPEGMA), 폴리[2-하이드록시에틸 메타크릴레이트] (PHEMA), 폴리[3-설포프로필 메타크릴레이트] (PSPMA) 및 폴리[2-(메타크릴로일옥시)에틸디메틸-(3-설포프로필)암모늄 하이드 록시드] (PMEDSAH)중 하나 또는 그 이상에 의해 화학적으로 변형된 표면을 포함하는 기질을 포함한다.

일부 구체예들에서, 상기 플레이트는 상기 유동성 연결부에 인접한 웰에서 적어도 하나의 금속 전극, 적어도 하나의 금속 산화물 전극, 적어도 하나의 탄소 전극, 및/또는 적어도 하나의 필드 효과 트랜지스터 검출기를 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 플레이트는 잠재적인 기록, 임피던스 분광법, 전압 측정 및 전류측정중 하나 또는 그 이상를 포함하는 전기적 판독이 가능하다.

일부 구체예들에서, 상기 플레이트는 3개의 유동적으로 연계된 웰이 최소한 2개, 최소한 4개, 최소한 8개, 최소한 16개, 최소한 32개, 또는 최소한 96개 그룹을 포함한다. 일부 구체예들에서, 최소한 하나의 상기 유동적 연결부는 최소한 0.5 x 0.2 mm, 그리고 최대한 1.0 x 3.0 mm의 단편 크기를 포함하는데, 임의선택적으로 1:5 ~ 2:1 (높이:폭) 범위의 가로세포 비율(aspect ratio)을 갖고, 일부 구체예들에서, 최소한 하나의 상기 유동적 연결부는 0.1 mm에 대등하거나 또는 이를 초과하는, 0.5 mm에 대등하거나 또는 이를 초과하는, 1 mm에 대등하거나 또는 이를 초과하는, 2 mm에 대등하거나 또는 이를 초과하는 단편 크기 (H 및/또는 W)를 포함하며, 이를 테면, 해당 크기는 0.1 x 0.1 mm에서 최대 1.0 x 2.0 mm (H x W), 이를 테면, 0.1 x 0.1 mm, 0.1 x 0.2 mm, 0.2 x 0.2 mm, 0.3 x 0.3 mm, 0.4 x 0.4 mm, 0.5 x 0.5 mm, 0.5 x 1 mm, 0.6 x 0.6 mm, 0.7 x 0.7 mm, 0.8 x 0.8 mm, 0.9 x 0.9 mm, 1 x 1 mm, 1 x 1.5 mm, 1 x 2 mm, 또는 2 x 2 mm (H x W), 또는 상기 두 가지 크기중 임의의 크기에 의해 경계되는 범위가 된다. 일부 구체예들에서, 최소한 하나의 상기 유동적 연결부는 0.1 x 0.1 mm~ 2 x 2 mm의 단편 크기 (H x W), 이를 테면, 0.5 x 0.5 mm 내지 1 x 1 mm 또는 0.1 x 0.1 mm 내지 1 x 1 mm 또는 0.1 x 0.1 mm 내지 0.5 x 0.5 mm 또는 0.5 x 0.5 mm 내지 2 x 2 mm 또는 0.5 x 0.5 mm 내지 1 x 2 mm의 크기를 포함한다. 일부 구체예들에서, 최소한 하나의 상기 유동적 연결부는 1-20 μm 범위의 단편 크기 (H 및/또는 W), 이를 테면, 1-5 μm, 1-10 μm, 5-10 μm, 10-20 μm, 10-15 μm, 15-20 μm, 5-15 μm를 포함하거나, 또는 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 13 μm, 14 μm, 15 μm, 16 μm, 17 μm, 18 μm, 19 μm, 또는 20 μm의 단편 크기 (H 및/또는 W)를 포함하고, 임의선택적으로 1:5 - 2:1 범위의 가로세로 비율 (H x W)을 또한 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 유동적 연결부는 0.5 x 0.2 mm에 대등하거나 또는 이보다 적은, 또는 100 x 100 μm ~ 0.5 x 0.2 mm (H:W)의 단편 크기를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 유동적 연결부는 5 x 5 μm에 대등하거나 또는 이보다 적은, 또는 3 x 3 μm ~ 5 x 5 μm의 단편 크기를 포함한다. 일부 구체예들에서, 유동적 연결부의 크기, 모양 및 갯수는 신경돌기(neurite) 침투 및 생산성 향상을 위해 적어도 하나의 유동적 연결의 길이에 걸쳐 가변적이다. 일부 구체예들에서, 최소한 하나의 상기 유동적 연결부의 길이는 최소 0.25 mm이며, 최대 2.0 mm이다. 일부 구체예들에서, 상기 최소한 하나의 유동적 연결부 크기의 가로세로 비율은 20:1 (W:H) ~ 1:5 (W:H)이다.

일부 구체예들에서, 상기 다중-웰 플레이트는 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 또는 3456 웰 형식을 포함하고, 선택적으로 2:3의 직사각형 매트릭스로 구성된다. 일부 구체예들에서, 상기 다중-웰 플레이트는 3 개의 인접하고, 유동적으로 상호 연결된 웰의 최소 2개 그룹을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 다중-웰 플레이트는 2 개의 인접하고, 유동적으로 상호 연결된 웰의 최소 3개 그룹을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 다중-웰 플레이트는 4 개의 인접하고, 유동적으로 상호 연결된 웰의 최소 1개 그룹을 포함한다.

본 명세서는 본원의 구체예들중 임의의 하나의 다중-웰 플레이트를 사용하여 관심대상의 물질을 스크리닝하는 것을 포함하는, 관심대상 물질의 고-처리량 스크리닝 방법을 또한 포함한다. 일부 구체예들에서, 관심대상의 물질은 2D 세포 배양이다. 다른 구체예들에서, 관심대상의 물질은 3D 세포 배양이다.

추가 목적 및 이점은 다음의 설명에서 부분적으로 설명 될 것이고, 그리고 일부는 상세한 설명으로부터 명백해질 것이거나 실시에 의해 습득될 수 있다. 목적 및 이점은 첨부된 청구 범위에서 구체적으로 지적된 요소 및 조합에 의해 실현되고 달성될 것이다.

선행된 일반 설명 및 이어지는 상세한 설명은 모두 예시와 설명을 위한 것이며, 본 청구범위를 제한하지 않는다는 것이 이해되어야 한다.

첨부된 도면은 본 명세서에 통합되어 본 명세서의 일부를 구성하고, 본 발명의 하나(몇 가지)의 구체예(들)를 도시하며, 설명과 함께 본 명세서에서 기술된 원리를 설명하는 역할을 한다.

도 1은 마이크로플레이트의 제조 및 조립의 한 방법에 대한 설명을 제공한다. 두개 층 (층 2 및 층 3)는 결합되어 유동적 연결부를 밀봉하고, 한정시키는 라미네이트(laminate)를 형성한다. 예시는 바닥이 없는 384-웰 플레이트 (층 1)에 결합된 복합 라미네이트 (층 2 및 층3)를 보여준다.
층 2: 밑면에 해자(trenches)를 함유하는 384-웰 플레이트 패턴과 합치하는 홀을 통하여 밀링된(milled through holes),두꺼운 + 1mm 기질.
층 1: 바닥이 없는 표준 384-웰 플레이트
바닥 부분 (층 3): 얇고, 투명하고, 바람직하게는 HCA 호환 쉬트
도 2는 웰 사이의 연결부를 함유하는 기질을 나타내고. 전술한 웰 사이의 2 개의 가능한 유동성 연결부를 예시한다.
도 3은 서로 다른 디자인, 즉, 웰들이 짝을 이룬 쌍, 3 개의 연결된 웰 및 4 개의 연결-웰이 마이크로플레이트 형식에 패킹되어 있는 것을 나타낸다.
도 4는 기질의 측면도를 보여주며, 어떻게 3-층 뿐만 아니라 2-층 모양으로 조립될 수 있는지 보여준다.
다음은 도 4A에 나와 있다:
층 1: 384-웰 미량적정 플레이트의 표준 상단-부분;
층 2: 밑면에 해자를 함유하는 384-웰 플레이트 패턴과 합치하는 홀을 통하여 밀링된,두꺼운 + 1mm 기질.
층 3 -플레이트 바닥, 즉, 상기 층 2에 결합된 박막 (100-200 μm).
다음은 도 4B에 나와 있다:
층 1: 384-웰 미량적정 플레이트의 표준 상단-부분;
층 3 -플레이트 바닥, 즉, 상기 층 2에 결합된 박막 (100-200 μm).
도 5는 기질에서 시냅스 기능 분석, 시냅스 전달 및 흥분성의 개념, 그리고 해당 기질에서 조절되고 분석되는 것을 설명한다. 다음은 도 5에 나와 있다:I: Ca5 염료로 항온처리된 E-18 마우스 피질 뉴런을 사용한 CCC의 현미경 사진. 청색 사각형은 자극 영역 (영역 1)이고, 적색 사각형은 판독 영역 (영역 2)이다;
II: 전기적 또는 화학적 자극 이전에, 배양물(culutes)은 무-형광이다;
III: 전기적 또는 화학적 자극에 따라 구역 1의 세포는 활동 전위를 발화하고, 이로써 칼슘 형광의 증가 원인이 된다;
IV: 영역 1에서 유도된 활동 전위가 시냅스 연결 세포를 통해 배양 전체에 퍼지면서, 해당 칼슘 형광이 영역 2로 이동하고, 여기에서 형광이 기록된다.
도 5의 약어는 다음과 같다:
* D-AP5 (NMDAR 길항제; 100 μM) 및 LY341495 (mGluR 길항제; 50 μM);
** 테트라카인 (10 μM); 화합물 항온처리: 30 분.
도 6은 기질에서 시냅스 기능 분석에서 생성된 예시적인 데이터를 나타낸다. 도 6A는 NMDAR 봉쇄의 예를 나타내고, 도 6B는 GABAR 변조 /작용성(agonism)의 예를 나타낸다. 전기적 유발에 의해, 시냅스적으로 매개된 Ca2+ 형광 증가가 탐지될 수 있다. 이러한 사건들은 AMPA 및 NMDARs의 활성화를 통해 조정된다. 알려진 기능의 약리학적 도구는 관찰된 Ca2 + 신호의 예측 가능한 변조를 유발한다.
도 7은 프리온 진행 및 변조 분석 개념을 설명한다. 프리온-유사 기전 유도제 (예를 들면, 병원성 Tau)가 웰 1에 추가되고, 병인의 진행이 웰 2에서 조절되고, 그리고 변조가 웰 3에서 감지될 수 있다.
도 8은 유동성 연결부에 의해 연결된 인접 웰에서 세포 배양 사이에 형광 라벨 NDAP (Tau 입자)의 확산에 대한 현미경 이미지를 보여준다. 이 그래프는 이러한 확산이 유동성 연결부의 수에 따라 달라지며, 웰 사이의 수송에 쎌(cells)이 필요하다는 것을 보여준다.

특정 구체예들의 설명

본 명세서는 고-용량응용분야, 이를 테면, HTS에 사용을 위한 구획화된 세포 배양(이하 "CCC"로 통칭됨) 생성용 신규한 기질에 관계한다. 구체적으로, 본 명세서는 ANSI/SLAS 표준을 준수하는 다중-웰 플레이트에 관한 것으로, 일부 구체예들에서는 384-웰 플레이트 일 수 있고, 이때 해당 웰 그룹은 세포 또는 세포 클러스터의 이동을 방지하고 및/또는 웰 간의 화학적 온전성 유지에 충분히 작은 미세가공된 유동성 연결부를 통해 유동적으로 연결된다.

정의

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약(about)"이란 명시적으로 표시되는지 여부에 관계없이, 예를 들면, 정수, 분수, 및 백분율 등을 비롯한 숫자 값을 나타낸다. 이 용어 "약"이란 일반적으로 인용된 값의 범위 (예를 들면, 언급된 값의 +/-5-10%)를 의미하며, 인용된 값과 동등한 (예를 들면, 동일한 기능 또는 결과) 것으로 간주될 것이다. "적어도"와 "약(about)"과 같은 용어가 숫자 값 또는 범위 목록 앞에 있으면, 해당 용어는 해당 목록에 제공된 모든 값 또는 범위를 수정한다. 일부 경우들에서,"약"이라는 용어는 가장 가까운 유효 숫자로 반올림된 숫자 값을 내포할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "또는"이란 문맥상 대안적인 것만을 의도하는 것이 명백히하지 않는 한, "및/또는"으로 해석되어야 한다.

"다중-웰 플레이트"는 작은 시험관으로 사용할 수 있는 웰 또는 구획이 있는 플레이트를 지칭한다. 상기 다중-웰 플레이트는 일부 예로써, 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 또는 3456 웰로 조직화되거나, 일부 구체예들에서, 2:3 직사각 매트릭스 형태를 가질 수 있다. 플레이트의 "기질(substrate)"은 해당 플레이트 구조 및 플레이트의 웰을 형성하는 일반적인 재료를 의미한다. 기질은 하나 또는 그 이상의 층, 뿐만 아니라 하나 또는 그 이상의 코팅을 포함할 수 있다.

"384-웰 형태"은 2:3 직사각형 매트릭스, 즉 16x24 웰로 구성된 384개의 웰을 갖는 다중-웰 플레이트를 의미한다. 이 문맥에서 "형태(format)"라는 용어는 웰의 행이 구성되는 방식을 지칭하는데, (예를 들면, 2:2, 2:3 및 각 행에 있는 웰의 수, 총 웰의 수를 제공함)을 나타낸다. 예를 들어, 32x48 웰이 있는 더 높은 다중-웰 플레이트 형테 (1536-웰) 또는 8x12 웰이 있는 더 낮은 다중 웰 플레이트 형태(96-웰)도 사용할 수 있다. 제공된 플레이트 형태는 예를 들어, 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 또는 3456 웰이 될 수 있다.

용어 "연결된 웰" 또는 "상호연결된 웰" 또는 "유동적으로 연결된 웰"이란 웰들 사이에 직접적인 유동적 연결부를 갖는 웰을 지칭한다. "이웃 웰"이란 인접한 웰을 말하며, 하나 또는 여러 유동성 연결부로 상호 연결되어 소위 웰 "그룹"을 형성한다. 본원에서 사용되는 웰의 "그룹"은 유동성 연결에 의해 직접 또는 간접적으로 연결된 웰을 의미한다. 일부 구체예들에서, 이러한 웰 그룹은 "분석가능한 구조"또는 "분석 가능한 엔터티(entities)" 또는 "분석가능한 그룹", 즉, 의도된 분석에 사용되는 구조 또는 엔터티를 형성할 수 있다. 예를 들어, 적어도 3 개의 상호연결된 웰 그룹은 분석 가능한 엔터티를 형성할 수 있다. 이러한 웰 그룹은 384-웰 플레이트에서 개별적으로 또는 여러 그룹으로 병렬 또는 순차적으로 다루어질 수 있다.

웰 간의 "유동적 연결부"라는 용어는 목적에 따라, 물질의 이동을 제어하거나 또는 이동을 막을 수 있는 하나 또는 그 이상의 연결부 또는 도관을 갖는 웰을 의미한다. 한 구체예에서, 상기 유동적 연결부는 축삭 및/또는 수상 돌기의 수송을 허용하지만, 미토콘드리아와 같은 세포 또는 세포체의 수송은 막는다. 이 구체예에서, 소분자, 중합체, 단백질 및 나노 입자는 유동성 연결부를 통해 운반될 수 있지만, 세포 또는 미토콘드리아와 같은 더 큰 물질은 운반하기에는 너무 커서 운반이 안되며, 상기 운반은 유체정압(hydrostatic pressure)을 조작하여 조절될 수 있다. 또다른 구체예에서, 상기 유동적 연결부는 세포, 세포 클러스터, 축삭 및 수상 돌기의 수송을 허용한다. 용어 "단면 크기"란 두 웰 사이의 유동성 연결부의 폭과 높이를 의미한다.

"Society for Laboratory Automation and Screening (ANSI/SLAS) 마이크로플레이트 표준"이란 풋프린팅(footprint) 크기, 높이 치수, 바닥 테두리 외부 치수, 웰 위치 및 웰 바닥 높이에 대한 물리적 치수 및 공차를 개략적으로 설명하는 표준 세트를 나타낸다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 상기 다중-웰 플레이트는 유효한 ANSI/SLAS 표준, 즉 ANSI/SLAS 1-2004 (R2012)를 준수한다. 풋프린트 치수, ANSI/SLAS 2-2004 (R2012): 높이 치수, ANSI/SLAS 3-2004 (R2012): 바닥 테두리 외부 치수, ANSI/SLAS 4-2004 (R2012): 웰 위치, 및/또는 ANSI/SLAS 6-2012: 웰 바닥 높이

용어 "열가소성 재료"란 특정 온도 이상에서 성형 가능하거나 또는 유연해지며, 냉각시 응고되는 플라스틱 물질, 가장 일반적으로 중합체 물질을 말한다.

조성물 및 방법

a. 기질 특징

상업용 고-처리량 스크리닝(HTS) 시스템에 대한 현재 요구 사항을 충족하기 위해, 일부 구체예들에서, 본 명세서의 기질은 ANSI/SLAS 마이크로플레이트 표준에 명시된 물리적 풋프린트와 외부 모양을 가질 수 있다. 이러한 표준을 준수함으로써, 본 명세서의 구체예는 HTS에서 사용되는 확립된 로봇 플레이트 핸들링 시스템, 액체 핸들링 시스템 및 광학 판독 시스템과 호환될 수 있다. 그러나, 마이크로플레이트에 대한 표준은 향후 모양이나 디자인이 변경될 수 있으므로, 본 발명은 다양한 모양 및 크기의 다중-웰 플레이트와도 호환된다.

본 명세서의 한 구체예에서, 상기 기질은 세 부분으로 구성된다:

첫째, 상기 기질은 해당 기질의 외부 치수와 모양을 특정하는 상단 부분으로 구성된다. 또한, 첫 번째 부분은 웰 또는 세포 배양 영역의 거시적인 부분을 특정한다. 이러한 웰의 크기와 형상은 액체 취급 및 세포 배양 과정을 용이하게 하도록 설계되어야 한다. 본 명세서의 한 구체예에서, 384-웰 형태가 이용된다. 그러나, 본 명세서의 다른 구체예들에서, 6, 12, 24, 48, 96, 1536 또는 3456 웰을 갖는 다중-웰 플레이트가 이용될 수 있다. (도 1). 예를 들면, 384 웰 플레이트를 사용하는 구체예에서, 해당 플레이트는 3 개의 인접하고, 유동적으로 상호 연결된 웰의 적어도 96 개 그룹, 2 개의 인접하고 유동적으로 상호 연결된 웰의 적어도 192 개 그룹, 또는 4 개의 인접하고 유동적으로 상호 연결된 웰의 적어도 96 개 그룹을 포함한다. 두 개 또는 세 개의 서로 연결된 웰을 갖는 6, 12, 24, 48, 96, 1536 또는 3456 웰로 된 다중-웰 플레이트 또한 사용될 수 있다.

상기 기질의 두 번째 부분과 중간 부분은 인접한 웰 간의 유동적 연결부를 특정한다. (도 1) 적용 분야에 따라, 이러한 유동적 연결부의 크기와 길이는 다양할 수 있으며, 해당 기질이 사용되는 세포 기반 분석의 유형에 따라 달라진다. 예를 들면, 시냅스 효능 분석의 경우, 세포 배양에서 국소 화학적 자극을 유도할 수 있도록, 국소 화학적 온전성을 유지할 수 있는 세포 배양을 만드는 데 중점을 둔다. 본 명세서의 이 구체예에서, 유동적 연결부는 0.1 mm에 대등하거나 이를 초과하는, 0.5 mm에 대등하거나 이를 초과하는, 1 mm에 대등하거나 이를 초과하는, 2 mm에 대등하거나 이를 초과하는 단면 크기를 가질 수 있고, 이를 테면, 0.1 x 0.1 mm~ 최대 1.0 x 2.0 mm (H x W) 범위의 크기, 이를 테면, 0.1 x 0.1 mm, 0.1 x 0.2 mm, 0.2 x 0.2 mm, 0.3 x 0.3 mm, 0.4 x 0.4 mm, 0.5 x 0.5 mm, 0.5 x 1 mm, 0.6 x 0.6 mm, 0.7 x 0.7 mm, 0.8 x 0.8 mm, 0.9 x 0.9 mm, 1 x 1 mm, 1 x 1.5 mm, 1 x 2 mm, 또는 2 x 2 mm (H x W), 또는 상기 두 가지 크기중 임의의 크기에 의해 경계되는 범위를 갖는 유동적 연결부가 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 크기는 0.1 x 0.1 mm 내지 2 x 2 mm의 범위, 이를 테면, 0.5 x 0.5 mm 내지 1 x 1 mm 또는 0.1 x 0.1 mm 내지 1 x 1 mm 또는 0.1 x 0.1 mm 내지 0.5 x 0.5 mm 또는 0.5 x 0.5 mm 내지 2 x 2 mm 또는 0.5 x 0.5 mm 내지 1 x 2 mm의 범위를 가질 수 있고, 예를 들면, 가로세로 비율 (H x W)이 1:5 - 2 범위일 수 있다.

프리온-유사 기전을 분석하기 위해, 예를 들어 서로 다른 세포 배양 구역 (웰) 사이의 세포 이동을 방지하기 위해, 훨씬 더 작은 연결부가 사용될 수 있다. (도 2). 이 경우 상기 유동적 연결부의 단면 크기는 1-20 μm 범위의 크기, 이를 테면, 1-5 μm, 1-10 μm, 5-10 μm, 10-20 μm, 10-15 μm, 15-20 μm, 5-15 μm를 갖는 하나 또는 그 이상의 연결부를 포함하거나, 또는 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 13 μm, 14 μm, 15 μm, 16 μm, 17 μm, 18 μm, 19 μm, 또는 20 μm의 크기 (H 또는 W)를 갖는 하나 또는 그 이상의 연결부를 포함하고, 임의선택적으로 가로세로 비율 (H x W)이 1:5 - 2:1의 범위를 또한 가지는 하나 또는 그 이상의 연결부를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 유동적 연결부의 단면 크기는 최소한 1 x 0.5 mm를 포함한다.

일부 구체예들에서, 상기 유동적 연결부의 단면 크기는 1 x 0.5 mm 미만을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 유동적 연결부는 3 x 3 μm 만큼 작은 크기의 하나 또는 그 이상의 연결부를 포함한다. 이 연결부는 또한 최대 100 x 100 μm까지 더 큰 크기를 또한 가질 수 있다. 가로세로 비율, 즉, 단면 크기의 폭과 높이의 비율은 20:1 (W:H) ~ 1:5 (W:H), 이를 테면, 20:1 ~ 10:1, 10:1 ~ 5:1, 5:1 ~ 1:1, 2:1 ~ 1:2, 1:1 ~ 1:2, 1:1 ~ 1:5, 또는 1:2 ~ 1:5 (모두 W:H)의 범위를 가질 수 있다.

상기 유동적 연결부의 모양과 크기는 해당 연결부의 길이 축에 걸쳐 다양할 수 있고, 생산성, 유체 습윤 및 충전, 유체 커넥터로의 세포 공정 진입과 같은 매개 변수를 최적화될 수 있다. 예를 들면, 상기 유동적 연결부의 입구에 깔때기-유사 구조의 통합으로 신경 돌기 유도 및 침투를 개선시킬 수 있으며, 유동성 연결부의 높이를 변경하면 기계적 안정성과 생산성을 향상시킬 수 있다. 한 구체예에서, 6 x 8 μm (W x H) 치수를 갖는 채널은 200 μm의 거리에 걸쳐 20 x 8 μm (W x H)로 확장되어 유동성 연결부의 축삭 및 수상 돌기 유도를 개선시킨다. 또다른 구체예에서, 이 깔때기-유사 구조는 입구에서 하나의 큰 유동성 연결부을 형성하기 위해 함께 결합되어, 신경 돌기 유도 및 침투를 더욱 향상시킨다. 한 구체예에서, 입구의 이러한 큰 유동성 연결부 또한 더 높아서, 다중-웰 플레이트의 생산 수율을 크게 향상시킨다. 한 구체예에서, 상기 유동적 연결부의 높이는 8μm ~ 50 μm로 증가될 수 있지만, 다른 높이 또한 고려될 수 있다.

또한 분석 응용 프로그램에 따라, 연결된 웰의 수가 달라질 수 있다. 본 명세서의 한 구체예에서, 상기 기질은 쌍으로-연결된 웰의 여러 유닛 (즉, 2 개의 연결된 웰)을 함유하고, 본 발명의 제 2 구체예에서 상기 기질은 3 개의 연결된 웰의 여러 유닛을 함유하고, 그리고 본 발명의 제 3 구체예에서 기판은 4 개 또는 그 이상의 연결된 웰의 여러 유닛을 함유한다. (도 3) 본 명세서의 한 구체예에서, 상기 유동적 연결부는 기질의 제 1 층에 직접 형성되므로, 해당 기질에 제 2 층이 내포되어야 하는 필요는 완전히 없어진다. (도 4).

상기 기질의 제 3 부분은 해당 기질의 바닥을 특정한다. 고해상도 이미징 판독을 가능하게 하기 위해, 일부 구체예들에서 기질의 해당 바닥 부분은 가시 광선 및 원거리 UV 광 스펙트럼 범위 내에서 광학적으로 투명하고, 수치적으로 큰 조리개 현미경 대물 렌즈를 이미지화를 가능하게 할만큼 충분히 얇다. 따라서, 일부 구체예들에서, 제 3 바닥 부분의 두께는 200 μm 미만, 이를 테면, 10-50 μm, 50-100 μm, 또는 100-200 μm이다. 고-해상도 이미징이 이용되지 않는 본 명세서의 다른 구체예들에서, 상기 기질의 바닥 층은 해당 기질의 기계적 견고성을 높이기 위해 더 두껍게 만들 수 있다. (도 1). 따라서, 일부 구체예들에서, 제 3 바닥 부분의 두께는 200-1000 μm 범위, 이를 테면, 200-500 μm, 또는 300-700 μm, 또는 500-1000 μm, 또는 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm, 600 μm, 700 μm, 800 μm, 900 μm, 또는 1000 μm이다.

일부 구체예들에서, 상기 기질에는 유체 커넥터에 인접한 웰에 금속 전극, 금속 산화물 전극, 탄소 전극 또는 필드 효과 트랜지스터 감지기와 같은 추가 부품이 장착되어 있어, 파일된 전위 기록, 임피던스 분광법 또는 전압측정 및 전류측정이 내포되나, 이에 국한되지 않는 전기 판독을 가능하게 한다.

B. 기질 생산 방법

본 명세서의 기질은 광범위한 재료 이를 테면, 열가소성 수지로 만들 수 있다. 예시적인 열가소성 재료에는 예를 들면, 폴리스티렌 (PS), 시클로-올레핀-공중 합체 (COC), 시클로 올레핀 중합체 (COP), 폴리(메틸 메타크릴레이트 (PMMA), 폴리카보네이트 (PC), 폴리에틸렌 (PE), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET), 폴리아미드 (Nylon®), 폴리프로필렌 또는 폴리에테르 에테르 케톤 (PEEK), Teflon®, PDMS 및/또는 열경화성 폴리 에스테르 (TPE)가 내포될 수 있다. 추가 재료군에는 Teflon®과 같은 과불소화 재료, PDMS와 같은 실리콘 중합체, 열경화성 폴리에스테르 (TPE)와 같은 열경화성 중합체 또는 실리콘, 유리 또는 알루미나와 같은 세라믹과 같은 경질 결정 또는 비-정질 재료가 내포될 수 있다. 그러나, 일회용 기질이 선호되고, 많은 양의 기질이 소비될 수 있는 고-처리량 스크리닝에 대한 비용 기준을 충족하기 위해, 해당 기질은 PS, COC 또는 COP에서 생산될 수 있는데, 이러한 재료는 사출 성형, 핫 엠보싱 또는 컴퓨터-지원 제조 (CAM) 마이크로 머시닝과 같은, 비용-효율적인 대량 생산이 가능하기 때문이다. 일부 구체예들에서, 상기 기질에 사용되는 재료는 세포 배양을 가능하게 하는 표면 코팅에 적합하다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 물리적 표면 처리, 예를 들면, 플라즈마 처리 또는 코로나 방전을 수행하는 것이 바람직할 경우, 폴리-l-리신, 폴리-L-오르니틴, 콜라겐, 라미닌, Matrigel®, 소 혈청 알부민 또는 기타 단백질 용액과 같은 단백질 재료 또는 고분자 물질로 기질을 코팅한다. 추가로, 상기 표면에 화학적 변형이 접목될 수도 있는데, 예를 들면, 폴리[카르복시베타인 메타크릴레이트] (PCBMA), 폴리[[2-메타크릴로일옥시)에틸]트리메틸암모늄 클로라이드] (PMETAC), 폴리[폴리(에틸렌 글리콜) 메틸에테르 메타크릴레이트] (PPEGMA), 폴리[2-하이드록시에틸 메타크릴레이트] (PHEMA), 폴리[3-설포프로필 메타크릴레이트] (PSPMA) 및 폴리[2-(메타크릴로일옥시)에틸디메틸-(3-설포프로필)암모늄 하이드 록시드] (PMEDSAH)이 접목될 수 있다.

기질의 상이한 층들을 어셈블리하기 위해, 다양한 결합 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 초음파 결합, 열압착 결합, 플라즈마 결합, 용매-지원된 결합, 레이저-지원된 결합 또는 접착제 결합, 또는 이중 접착 테이프를 사용한 결합과 같은 방법이 이용될 수 있다. 제조 관점에서 바람직하지는 않지만, 기질은 다른 재료로 구성될 수 있다. 본 명세서의 한 구체예에서, 바닥 층은 유리로 구성되고, 반면 다른 층들은 열가소성수지 또는 실리콘 중합체 재료로 구성된다.

실시예

실시예 1 -시냅스 효능을 연구하기 위한 분석

복잡한 신경 네트워크 환경의 미묘한 변화는 시냅스 연결의 파괴 또는 생성을 유발할 수 있다. 따라서, 신경 질환과 정신 질환에 대한 약물 개발 스크리닝은 신경 기능의 변화를 모니터링하는 강력하고 자동화된 정량적 시험관 내 분석의 이점을 누릴 수 있다. 시냅스 기능 분석은 특히 신경 퇴행성 장애와 관련된 치료 영역과 관련된 데이터를 산출해야 하며, 관심대상 화합물이 원래 표적과 연계하여여 신경 기능의 변화를 생성한다는 증거도 제공해야 한다. 기존의 전기생리학적 기술의 낮은 처리량은 약물 발견 프로젝트를 위해 실질적인 시간 프레임 동안 소량의 화합물 만 테스트 할 수 있음을 의미한다.

이 예에서, 우리는 더 큰 화합물 세트의 스크리닝을 가능하게 하고, 본 발명의 세포 배양 기질을 전기생리학적 광학 플랫폼과 어떻게 조합하는 지를 실증하고, 이것으로 인해 연구자들이 올바른 화합물 (들) 및 농도(들)을 선택했음을 더 확신하여, 이로써 온전한 신경 조직에서 표준 전기생리학적 기술을 활용하는 방향으로 전전하도록 한다.

시냅스 기능 검정을 위해, CCC를 활용하는 주요 목적은 세포 배양에서 화학적으로 그리고 전기적으로 분리된 영역을 최소한 두 개 만들기 위한 것이다. 첫 번째 구역은 세포 활동 전위의 유도에 사용되며, 두 번째 구역은 구역 1의 활동 전위가 시냅스 연결된 세포를 통해 구역 2로 전파되었는지 여부를 모니터링하는 판독-구역으로 사용된다. 따라서, CCC 기질의 목적은 세포 배양에서 영역 1과 영역 2를 형성하고, 이러한 영역들이 화학적 및 전기적 무결성을 유지할 수 있도록 하는 것이다.

이를 달성하기 위해, 배아 18 일 (E-18) 시점의 마우스 피질 조직을 기계적으로 분리하고, 단일 세포 용액을 유동적 연결부가 단면 치수가 0.2 x 2.0 mm인 하나의 큰 연결부로 구성된 192쌍의 결합된 웰을 함유하는 384- 웰 플레이트 형식을 갖는 세포-배양 기질 상에 도말했다. 상기 세포를 씨딩하기 전, 상기 기질은 0.01% 폴리-L-오르니틴 용액으로 하룻밤 동안 37℃에서 먼저 피복시켰다. 이들 웰은 그 다음, Ca²⁺/Mg²⁺ 를 포함하는 PBS로 세척하였고, 그 다음 라미닌은 Ca²⁺/Mg²⁺ 를 포함하는 PBS에서 10 μg/ml로 희석된 이의 라미닌을 추가하고, 2 h 동안 37℃에서 항온처리했다. 세포를 씨딩하기 직전, 라미닌은 제거되었다. 배양 14일차 후, 그리고 실험 당일, 상기 기질에 있는 세포에 칼슘 지표를 로딩하였고, 그 다음 농도-반응 포멧으로 관심대상 화합물고 함께 급성(acute) 항온처리 (1 시간)하였다.

상기 기질의 구역 1에서 작용 전위를 유도하기 위해, 상기 플레이트를 이 플레이트의 모든 웰에서 칼슘 형광을 병렬로 모니터링할 수 있는 동적 형광 이미징 플레이트 판독기 (Cellaxess Elektra®, Cellectricon AB,

, Sweden)에 배치했다. 이 실시예에서, 모세관 전극 어레이 (Cellaxess Elektra® Electrostimulation Module, Cellectricon AB,

, Sweden)를 사용하여 플레이트의 모든 구역 1에 평행하고, 균일한 외부 전기장을 제공했다. 대안으로, 증가된 농도의 칼륨 (일반적으로 25-100mM이 삼투압이 조절된 용액에 공급) 또는 기타 활동 전위 활성화제 (예를 들면, 베라트리딘)를 활동 전위를 유도하기 위해 구역 1에 추가했다. 시냅스 전달은 해당 플레이트의 영역 2에서 일시적(transient) 칼슘 형광을 분석하여 평가했다. 상기 실험 프로토콜을 사용하여, 구역 1에서 전기적 또는 화학적으로 유발된 일시적 칼슘 현상을 연구함으로써, 세포 배양에서 신경 세포 흥분성을 또한 모니터링하는 것이 가능하였다. 상기 검정 개념은 도 5에 자세히 설명되어 있다.

방법:

간략하게 설명하자면, 마우스 피질의 절개는 멸균 조건에서 수행되었다. 절개 후, Eppendorf 튜브는 준비 및 세포 씨딩까지 절개 동안 얼음-채워진, 절연 용기 안에 넣어 유지시켰다. 마우스 피질 준비물은 무균 조건하에 출원인 Cellectricon의 세포 실험실에서 수행되었다. 상기 조직을 최소량의 배지 (Hibernate E 마이너스(-) Ca²⁺ BrainBits LLC, Springfield, Il, USA)가 있는 원래 바이알에서 화기로 광댁을 낸 큰 구멍을 가진 Pasteur를 사용하여 Hibernate E에서 트립신 0.05 % + EDTA로 미리 채워진 튜브로 옮겼다. 이들 조직을 37 ℃ 수조에서 15 분 동안 항온처리했다. 그 후, 트립신 + EDTA 용액을 제거하고, 10% 소 태아 혈청이 보충된 Hibernate E를 추가하였다. 조직을 멸균된 9"실란화된 유리 Pasteur 피펫으로 부드럽게 분쇄하여, 조직을 해리시켰다. 해리되지 않은 조직이 침전되도록 용액을 1 분 동안 방치 하였다. 그런 다음, 각 튜브의 상청액을 옮기고 튜브에 모았다. 남아있는 각 펠렛에 신선한 Hibernate E-Ca²⁺를 첨가하였다. 상기 분쇄 절차를 반복하고, 해당 세포 현탁액을 세포 현탁액 튜브로 옮겼다. 최종 분쇄 후, 세포 현탁액을 두 개의 분리된 튜브에 나누고, 실온에서 250 x g에서 5 분 동안 원심 분리했다. 각 튜브에서 상청액을 제거하고, 하나의 튜브에 NbActiv4 (BrainBits LLC, Springfield, Il, USA)를 순차적으로 첨가하고, 다른 하나의 튜브에 DMEM을 순차적으로 첨가하여 펠렛을 조심스럽게 재현탁시켰다. 세포 응집체를 해리시키기 위해, 각각의 추가 사이에 해당 세포 현탁액을 조심스럽게 분쇄하였다. 상기 세포 현탁액은 40μm 기공 직경의 세포 스트레이너(strainer) 상에서 압박을 가하여, 큰 세포 클러스터의 양을 줄였다. 각 세포 현탁액에 적절한 배지를 첨가하여, 총 3ml를 만들고, Scepter 세포 계수기(Scepter® Cell counter 2.0, Merck Millipore)를 사용하여 제조업체 설명서에 따라, 세포를 계수했다. 세포 현탁액을 100,000개의 세포/ml로 희석시키고, 384-웰 플레이트에 웰당 50 μl 세포 현탁액을 첨가하였다. 모든 실험에서, 플레이트는 37℃, 5% CO₂, 95% 습도에서 13-15 일동안 항온처리하였다. 세포의 생존력과 영양분 공급을 지원하기 위해, 3 일차에 50 % 배지를 교체하고, 이후 3 ~ 4 일 간격으로 배지의 절반을 교환수행했다.

EFS 및 칼슘 이미징 실험은 14 DIV 후에 수행되었다. 이러한 실험은 이미징 모듈이 장착된 Cellaxess Elektra® 플랫폼 (Cellectricon AB,

, Sweden)에서 수행되었다. 실험 동안 기기의 온도는 31-32 ℃로 유지되었다. 실험 당일, 칼슘 지표 Calcium 5를 NbActiv4 (마우스 피질 뉴런) 또는 완전 배지 (인간 iPSC 뉴런)에 용해시켰다. 세포 배양은 Calcium 5로 착색되었다(10 % 배지 교환 결과). 그 다음 해당 세포를 37℃, 5% CO₂에서 항온처리하였다. Calcium 5 첨가 후 약 1 시간 후, 해당 세포 플레이트를 Cellaxess Elektra®에 삽입하고, 시간 경과에 따른 칼슘 신호의 변화로 자율 신경 세포 활성을 측정했다. 그 후, 일련의 전기장 자극을 다중-웰 플레이트의 구역 1에 적용하였다. 이 자극에 대한 반응은 칼슘 강도의 변화로 동시에 모니터링되었다 (카메라 이미지 획득 주파수는 카메라 비닝(binned) 4x4로 39ms 노출/이미지로 20Hz로 설정되었다. 그 다음, 칼슘 반응 비율 (최고 반응/기준 수준)의 차이를 사용하여 효과%를 결정했다. 이 분석을 사용하여, 약리학적 데이터를 생성하기 위해 시냅스 기능을 조절하는 다양한 화학 작용제를 특성화했다. 예를 들면, 다수의 상이한 기전을 표적으로 하는 화합물에 대한 농도 응답 데이터가 수행되었다. 실시예에는 NMDR 수용체 길항제 및 GABAAR 수용체 조절자가 내포된다. 대부분의 경우, 시냅스 기능 분석의 데이터는 문헌 데이터와 잘 일치한다. 도 6의 상단 두 그래프는 시냅스 내에서 신호 전파에 가장 중요한 수용체인 NMDA 수용체의 억제를 통해, 시냅스 전달을 차단하는 화합물에 대한 농도 반응 데이터를 나타낸 것이다. 도 6의 하단 두 그래프는 시냅스의 주요 억제 수용체인 GABAA 수용체의 양성 조절을 통해 어떻게 시냅스 전달이 차단될 수 있는 지를 나타낸다. 두 경우 모두, 상기 결과들은 기존 문헌 데이터와 잘 연관된다. 또한, 상기 검정은 중간 수준의 처리량 (예를 들면, 20,000 개 미만의 화합물)을 유지하는 포멧으로 쉽게 확장시킬 수 있고, 따라서 예를 들어, 집중된 HTS 라이브러리의 스크리닝에 유용할 수 있다. 이것은 예를 들면, 192개 집단을 갖는 384-웰 형태 다중-웰 플레이트를 이용함으로써 이루어질 수 있다. 이 포멧을 사용하면, 20,000 개의 화합물 라이브러리를 3 주 이내에 중복으로 스크리닝할 수 있으며, 일일 10개의 플레이트의 스크리닝 속도로 15 % 추가된 실험 대조군, 10 % 재-스크리닝된 플레이트를 작업할 수 있다.

복잡한 다중-요인적 정신 장애와 신경 장애에 대한 질병 기전을 해결하기 위한 혁신적이고, 기능적인 스크리닝 접근 방식이 필요하다. 이와 관련하여, CNS 질환의 세포 모델과 조합된 본 명세서의 응용은 비-정상적인 시냅스 기능을 회복하고, 새로운 기전-기반 치료의 기초로 삼을 수 있는 신규 화합물 또는 표적을 발견할 수 있다.

실시예 2 - 신경 회로에서 신경 퇴행성 질환-연합된 펩티드 (NDAP)의 확산을 연구하기 위한 분석.

뇌 내에서 신경퇴행성 질환 연합된 펩티드 (NDAP)의 확산은 알츠하이머 및 파킨슨 병과 같은 진행성 신경퇴행성 질환의 주요 병리학적 기전 중 하나로 간주된다. 이 개념에서, 아밀로이드-베타, 알파-시누클레인 및 tau 단백질과 같은 병리학적 가용성 형태의 NDAPs는 뉴런에 의해 통합되어, 단백질의 미스폴딩(misfolding), 시냅스 제거 및 뉴런 세포 손실의 진행을 유발한다. 더욱이, 수많은 문헌은 세포 내 NDAPs의 프리온-유사 기전, 즉 NDAPs의 세포 내 수송과 하나의 뉴런에서 또다른 뉴런으로의 확산을 보고한다. 신경 퇴행성 질환은 여전히 사실상 치료가 불가능하기 때문에, 시험관 내에서 이러한 모든 복잡한 신경병리학적 특징을 반영하여, 해당 신경퇴행성 캐스케이드를 방지하기 위해, 더 큰 화합물 세트의 스크리닝 및 프로파일링을 허용하는 고-처리량 분석 플랫폼은 임상적으로 충족되지 않은 시급하게 요구된다.

본 명세서의 기질을 이용하여, 우리는 CNS 신경 회로 내에서 신경퇴행성 질환 캐스케이드의 모든 특징을 반영하는 독특한 고-처리량 시험관 검정법을 만들 수 있었다. 마우스 대뇌 피질 신경 세포 배양은 이러한 배양에서 뉴런이 광범위한 과정으로 발달되고, 시험관 내에서 기능적 시냅스 연결을 형성하기 때문에 사용되고 있다.

구체적으로, 마우스 피질 E18 뉴런은 유동적으로 연결된 3 개의 인접 웰로 구성된 96 개의 실험 유닛을 포함하는 384-웰 플레이트 형태를 갖춘 맞춤형 CCC 기질에 도말되었다. 이러한 적용에서, 세포가 인접한 웰 간에 이동할 수 없도록, 유동적 연결부는 신경 세포체보다 작게 만들어지는 것이 가장 중요하다. 따라서, 각 유동적 연결부는 6 x 8 μm의 단면 크기를 갖는 10-30개 구멍으로 구성되었다. 상기 세포를 씨딩하기 전, 상기 기질은 0.01% 폴리-L-오르니틴 용액으로 하룻밤 동안 37℃에서 먼저 피복시켰다. 이들 웰은 그 다음, Ca²⁺/Mg²⁺ 를 포함하는 PBS로 세척하였고, 그 다음 라미닌은 Ca²⁺/Mg²⁺ 를 포함하는 PBS에서 10 μg/ml로 희석된 이의 라미닌을 추가하고, 2 h 동안 37℃에서 항온처리했다. 세포를 씨딩하기 직전, 라미닌은 제거되었다. 그 다음, 실시예 1에서 기술된 바와 같이, 세포를 준비하였고, 배양하였다. 배양 7 일차 후, 플레이트의 모든 실험 장치에있는 영역 1의 세포를 NDAP 중합체, 예를 들면, 알츠하이머 환자의 CSF로부터 추출한 병원성 tau 단백질 올리고머와 같은 환자로부터 유래된 물질의 50 nM 용액으로 처리했다. 그 후, 해당 플레이트를 다시 인큐베이터로 가져오고, 세포를 7 일 더 항온처리하였다. 14일 DIV 후, 해당 플레이트의 세포를 고정시키고, 면역세포 화학적 프로토콜을 사용하여 뉴런 및 분석 특정 마커에 대해 착색하고, 고-함량 이미징을 사용하여 NDAP 흡수, 뉴런 내 확산 및 시냅스 및 뉴런 생존의 NDAP-매개된 변경을 확인하였다. 간략하게 설명하자면, 세포는 4% PFA/PBS 또는 메탄올을 이용하여 고정시켰다. 뉴런은 마우스 MAP-2AB (1:1000), 닭 MAP-2AB (1:10000) 또는 bTubIII (1:1000)에 결합하는 항체를 이용하여 평가되었다. Hoechst (nuclei) 착색 또한 내포되었다. 항-bTubIII (Sigma-Aldrich Sweden AB, Stockholm, Sweden) (1:1000), 항-PSD-95 (1:1000), 항-Synaptophysin (1:1000), 항-tau (1:1000)는 차례로 MAP-2AB 항체들 (Sigma-Aldrich Sweden AB, Stockholm, Sweden)과 복합되었다. 10x, 20x 또는 40x 확대 (PerkinElmer)에서 Operetta® 고함량 이미지기기를 이용하여 고-함량 영상화(HCA) 분석을 실행하였다.

시냅스 결합된 뉴런에 걸쳐 NDAPs의 확산 조절자를 스크리닝하기 위해, NDAPs를 확산시키는 세포 배양 능력을 조절하기 위해 실험 단위의 2개 웰에서 화학적, 생물학적 또는 유전적 개입을 수행할 수 있으며, 단위 중 3 개 웰은 웰 1에서 세포-배양을 통해 확산된 세포 내 NDAPs의 존재를 측정하는데 이용된다. 분석 개념은 이미지 7에 나와 있다. 이 분석 개념을 사용하여, NDAPs의 흡수 및 변조를 입증했다. 7 DIV 후, 인간 AD 환자의 CSF로부터 추출한 병리학적 Tau를 모든 실험 단위의 구역 1에 있는 세포에 상기와 같이 추가했다. 실험 단위 웰 간에 액체 수준의 균형을 유지함으로써, 실험 단위의 웰 간에 Tau 물질의 대량 수송이 발생하지 않도록 하였다. 병리학적 Tau는 배양물에 의해 빠르게 흡수되었으며, 9 DIV 후, 배양에서 Tau 병리의 전파를 조절하기 위해, 조절 항체를 모든 실험 단위의 영역 2에 추가했다. 다시, 액체 수준은 실험 단위의 웰 간에 항체 물질의 대량 수송이 일어나지 않도록 균형을 맞추었다. 14-16 DIV 시점에서, 일시적 칼슘 형광을 분석하여 플레이트의 모든 실험 장치에서 영역 3에서 시냅스 기능을 평가했다. 그 후, 배양물을 고정시키고, 베타 튜불린 유형 3과 내인성 Tau (MAPT)에 대해 착색하고, 고-함량 이미지화 기기를 사용하여 고-해상도 이미지를 얻었다. 자동화된 이미지 분석에 의해 분석된 네트워크 무결성 및 내인성 Tau 수준에 대한 영향과 함께, 배양물의 시냅스 기능에 대한 효과는 Tau-병증 진행의 조절자에 대한 고용량 스크리닝을 가능하게 했다.

우리가 아는 한, 이러한 접근 방식은 시냅스 결합 뉴런에 걸쳐 NDAPs의 확산을 방지하는 분자 연구에서 더 큰 화합물 세트의 스크리닝 및 프로파일링을 허용하기에 충분한 용량과 견고성을 보여줄 것이다.

참조자료

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3. Bousset, L., Sourigues, Y., Covert, M. & Melki, R. Neuron-to-neuron transmission of α-synuclein fibrils through axonal transport. Ann. Neurol. 72, 517-524 (2013).

4. Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H.-C. & Schuman, E. M. Axonal Translation of Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. J. Neurosci. 33, 5584-5589 (2013).

5. Zahavi, E. E. et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. J. Cell Sci. 128, 1241-1252 (2015).

6. Berdichevsky, Y., Staley, K. J. & Yarmush, M. L. Lab Chip 10, 999-1004 (2010).). - Communication between different brain regions

7. Zhang, M., Luo, G., Zhou, Y., Wang, S. & Zhong, Z. J. Biomol. Screen. 19, 1-16 (2014 - Need for HTS prion-like mechanism platform

8. Anne M Taylor, Mathew Blurton-Jones, Seog Woo Rhee, David H Cribbs, Carl W Cotman, and N. L. J. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods 2, 599-605 (2005).

9. Neto, E. et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. J. Neurosci. 36, 11573-11584 (2016).

10. ANSI/SLAS 1-2004 (R2012): Footprint Dimensions

11. ANSI/SLAS 2-2004 (R2012): Height Dimensions

12. ANSI/SLAS 3-2004 (R2012): Bottom Outside Flange Dimensions

13. ANSI/SLAS 4-2004 (R2012): Well Positions

14. ANSI/SLAS 6-2012: Well Bottom Elevation

전술한 명세서는 당업자가 구체예들을 실시하는데 충분할 것이다. 전술 한 설명 및 실시들은 특정 구체예를 상세히 설명한다. 그러나, 전술한 내용이 텍스트에 아무리 상세하게 나타날 수 있더라도, 구체예들은 다양한 방식으로 실행될 수 있으며, 첨부된 청구 범위 및 그와 동등한 임의의 균등물에 따라 해석되어야 한다는 것이 이해될 것이다.

Claims (29)

1. 웰을 포함하는 다중-웰 플레이트에 있어서, 이때 이 플레이트의 적어도 2 개의 인접 웰들은 적어도 2 개의 해당 인접 웰을 구분시키는 벽에 적어도 하나의 유동성 연결구를 갖는, 다중-웰 플레이트.
2. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 멀티-웰 플레이트는 American National Standards Institute of the Society for Laboratory Automation and Screening(ANSI/SLAS)의 마이크로플레이트 표준을 준수하는, 다중-웰 플레이트.
3. 전술한 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 다중-웰 플레이트는 열가소성 재료로 만든 기질을 포함하는, 다중-웰 플레이트.
4. 청구항 3에 있어서, 이때 상기 열가소성 재료는 폴리스티렌 (PS), 시클로-올레핀-공중 합체 (COC), 시클로 올레핀 중합체 (COP), 폴리(메틸 메타크릴레이트 (PMMA), 폴리카보네이트 (PC), 폴리에틸렌 (PE), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET), 폴리아미드 (Nylon®), 폴리프로필렌 또는 폴리에테르 에테르 케톤 (PEEK), Teflon®, PDMS 및/또는 열경화성 폴리 에스테르 (TPE)를 포함하는, 다중-웰 플레이트.
5. 전술한 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 다중-웰 플레이트는 시클로-올레핀-공중합체 (COP), 시클로-올레핀-중합체 (COC) 또는 폴리스티렌 (PS)으로부터 생성된 기질을 포함하는, 다중-웰 플레이트.
6. 청구항 1 또는 2에 있어서, 이때 상기 다중-웰 플레이트는 실리콘, 유리, 세라믹 재료 또는 알루미나로 생산된 기질을 포함하는, 다중-웰 플레이트.
7. 전술한 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 플레이트는 한 개 이상의 층을 포함하는 기질을 포함하며, 임의선택적으로 이들 층은 초음파 결합(bonding), 열압착 결합, 플라즈마 결합, 용매-지원된 결합, 레이저-지원된 결합 또는 접착제 결합, 또는 이중 접착 테이프를 사용한 결합에 의해 연결된, 다중-웰 플레이트.
8. 전술한 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 플레이트는 단백질 또는 중합체로 피복된 기질을 포함하는, 다중-웰 플레이트.
9. 청구항 8에 있어서, 이때 상기 플레이트는 하나 또는 그 이상의 폴리-l- 리신, 폴리-L-오르니틴, 콜라겐, 라미닌, Matrigel® 또는 소 혈청 알부민으로 피복된 기질을 포함하는, 다중-웰 플레이트.
10. 전술한 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 플레이트는 폴리[카르복시베타인 메타크릴레이트] (PCBMA), 폴리[[2-메타크릴로일옥시)에틸]트리메틸암모늄 클로라이드] (PMETAC), 폴리[폴리(에틸렌 글리콜) 메틸에테르 메타크릴레이트] (PPEGMA), 폴리[2-하이드록시에틸 메타크릴레이트] (PHEMA), 폴리[3-설포프로필 메타크릴레이트] (PSPMA) 및 폴리[2-(메타크릴로일옥시)에틸디메틸-(3-설포프로필)암모늄 하이드 록시드] (PMEDSAH)중 하나 또는 그 이상에 의해 화학적으로 변형된 표면을 포함하는 기질을 포함하는, 다중-웰 플레이트.
11. 전술한 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 플레이트는 상기 유동성 연결부에 인접한 웰에서 적어도 하나의 금속 전극, 적어도 하나의 금속 산화물 전극, 적어도 하나의 탄소 전극, 및/또는 적어도 하나의 필드 효과 트랜지스터 검출기를 추가로 포함하는, 다중-웰 플레이트.
12. 청구항 11에 있어서, 이때 상기 플레이트는 잠재적인 기록, 임피던스 분광법, 전압 측정 및 전류측정중 하나 또는 그 이상를 포함하는 전기적 판독이 가능한, 다중-웰 플레이트.
13. 전술한 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 플레이트는 3개의 유동적으로 연계된 웰이 최소한 2개, 최소한 4개, 최소한 8개, 최소한 16개, 최소한 32개, 또는 최소한 96개 그룹을 포함하는, 다중-웰 플레이트.
14. 전술한 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 최소한 하나의 상기 유동적 연결부는 최소 0.5 x 0.2 mm, 그리고 최대 1.0 x 3.0 mm의 단면 크기를 포함하며, 임의선택적으로 1:5 내지 2:1 (높이:폭) 범위의 가로 세포 비율을 포함하는, 다중-웰 플레이트.
15. 전술한 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 최소한 하나의 상기 유동적 연결부는 0.1 mm에 대등하거나 이를 초과하는, 0.5 mm에 대등하거나 이를 초과하는, 1 mm에 대등하거나 이를 초과하는, 2 mm에 대등하거나 이를 초과하는 단면 크기(H 및/또는 W) 범위의 크기를 가질 수 있고, 이를 테면, 0.1 x 0.1 mm~ 최대 1.0 x 2.0 mm (H x W) 범위의 크기, 이를 테면, 0.1 x 0.1 mm, 0.1 x 0.2 mm, 0.2 x 0.2 mm, 0.3 x 0.3 mm, 0.4 x 0.4 mm, 0.5 x 0.5 mm, 0.5 x 1 mm, 0.6 x 0.6 mm, 0.7 x 0.7 mm, 0.8 x 0.8 mm, 0.9 x 0.9 mm, 1 x 1 mm, 1 x 1.5 mm, 1 x 2 mm, 또는 2 x 2 mm (H x W), 또는 상기 두 가지 크기중 임의의 크기에 의해 경계되는 범위를 갖는 유동적 연결부가 이용될 수 있는, 다중-웰 플레이트.
16. 전술한 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 최소한 하나의 상기 유동적 연결부는 0.1 x 0.1 mm~ 2 x 2 mm의 단편 크기 (H x W), 이를 테면, 0.5 x 0.5 mm 내지 1 x 1 mm 또는 0.1 x 0.1 mm 내지 1 x 1 mm 또는 0.1 x 0.1 mm 내지 0.5 x 0.5 mm 또는 0.5 x 0.5 mm 내지 2 x 2 mm 또는 0.5 x 0.5 mm 내지 1 x 2 mm의 크기를 포함하는, 다중-웰 플레이트.
17. 청구항 1-13중 임의의 한 항에 있어서, 이때 최소한 하나의 상기 유동적 연결부는 1-20 μm 범위의 단편 크기 (H 및/또는 W), 이를 테면, 1-5 μm, 1-10 μm, 5-10 μm, 10-20 μm, 10-15 μm, 15-20 μm, 5-15 μm를 포함하거나, 또는 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 13 μm, 14 μm, 15 μm, 16 μm, 17 μm, 18 μm, 19 μm, 또는 20 μm의 단편 크기 (H 및/또는 W)를 포함하고, 임의선택적으로 1:5 - 2:1 범위의 가로세로 비율 (H x W)을 또한 갖는, 다중-웰 플레이트.
18. 청구항 1 내지 13중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 유동적부는 0.5 x 0.2 mm에 대등하거나 또는 이보다 적은, 또는 100 x 100 μm ~ 0.5 x 0.2 mm (H:W)의 단편 크기를 포함하는, 다중-웰 플레이트.
19. 청구항 1 내지 13중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 유동적 연결부는 5 x 5 μm에 대등하거나 또는 이보다 적은, 또는 3 x 3 μm ~ 5 x 5 μm의 단편 크기를 포함하는, 다중-웰 플레이트.
20. 청구항 17 또는 19에 있어서, 이때 유동적 연결부의 크기, 모양 및 갯수는 신경돌기(neurite) 침투 및 생산성 향상을 위해 적어도 하나의 유동적 연결의 길이에 걸쳐 가변적인, 다중-웰 플레이트.
21. 청구항 1-13 또는 18중 임의의 한 항에 있어서, 이때 최소한 하나의 상기 유동적 연결부의 길이는 최소 0.25 mm이며, 최대 2.0 mm인, 다중-웰 플레이트.
22. 전술한 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 최소한 하나의 유동적 연결부 크기의 가로세로 비율은 20:1 (W:H) ~ 1:5 (W:H)인, 다중-웰 플레이트.
23. 전술한 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 다중-웰 플레이트는 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 또는 3456 웰 형식을 포함하고, 선택적으로 2:3의 직사각형 매트릭스로 구성된, 다중-웰 플레이트.
24. 전술한 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 다중-웰 플레이트는 3 개의 인접하고, 유동적으로 상호 연결된 웰의 최소 2개 그룹을 포함하는, 다중-웰 플레이트.
25. 전술한 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 다중-웰 플레이트는 2 개의 인접하고, 유동적으로 상호 연결된 웰의 최소 3개 그룹을 포함하는, 다중-웰 플레이트.
26. 청구항 1 내지 25중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 다중-웰 플레이트는 4 개의 인접하고, 유동적으로 상호 연결된 웰의 최소 1개 그룹을 포함하는, 다중-웰 플레이트.
27. 청구항 1 내지 26중 임의의 한 항에 따른 다중-웰 플레이트를 이용하여, 관심대상의 물질을 스크리닝하는 것을 포함하는, 관심대상 물질의 고-처리량 스크리닝 방법.
28. 청구항 27에 있어서, 이때 관심대상의 물질은 2D 세포 배양물인, 방법.
29. 청구항 27에 있어서, 이때 관심대상의 물질은 3D 세포 배양물인, 방법.

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