JP6624933B2 - 細胞播種培養装置 - Google Patents
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Description
1.ピペットを利用した細胞播種方法では、多くの細胞配置領域に短時間で播種できないという問題があり、播種時間が長くなることにより、細胞が死滅してしまうことがある。
2.インクジェットプリンターの原理を利用した細胞播種方法では、細胞配置領域に凹部を設け、かかる凹部に細胞を定着させることが必要であるところ、凹部の深さが細胞の厚みと比較して十分に深くないと、細胞が配置領域から飛び出してしまい、正確な位置に播種ができない一方で、凹部の深さが深くなることにより細胞間のネットワークが形成しづらくなるという問題が生じる。
3.マイクロ流路を用いた播種方法でも同様に、凹部に細胞を配置することから、細胞間のネットワークが形成しにくいという問題が生じる。
[1] 複数の突起部により包囲された細胞配置領域を複数有する、神経ネットワーク形成可能な細胞の培養基板と、当該培養基板上に配置された、複数の貫通孔を有する流路基板とを含む神経ネットワーク形成可能な細胞の播種培養装置であって、各貫通孔が、基板上面側を入口、基板下面側を出口とする流路を規定し、各流路の出口が、いずれかの細胞配置領域上に位置する、前記細胞播種培養装置。
[2] 前記培養基板と前記流路基板との間に、突起部の高さより厚いスペーサー部材を配置する、項目1に記載の細胞播種培養装置。
[3] 前記培養基板と前記流路基板との間に、スペーサー部材の厚さに対応する、細胞配置領域間で神経ネットワークを形成可能な空隙を有する、項目1又は2に記載の細胞播種培養装置。
[4] 前記流路の出口と、前記突起部との間に、細胞が流出する隙間が存在しない、項目1〜3のいずれか一項に記載の細胞播種培養装置。
[5] 前記流路基板の上面に、貯液部を規定する貯液基板をさらに含む、項目1〜4のいずれか一項に記載の細胞播種培養装置。
[6] 前記培養基板が、プレーナーパッチクランプに用いる電気絶縁性基板であり、細胞配置領域内に、細胞を通過させないが電通を達成しうるプレーナーパッチクランプ用貫通孔を有する、項目1〜5のいずれか一項に記載の細胞播種培養装置。
[7] 前記培養基板が、神経ネットワークのイメージング用基板である、項目1〜5のいずれか一項に記載の細胞播種培養装置。
本発明の細胞播種培養装置(1)は、複数の細胞配置領域(8)を有する細胞培養基板(2)と、複数の貫通孔(14)を有する流路基板(3)とを含んでおり、各貫通孔(14)が、いずれかの細胞配置領域(8)上に位置するように、流路基板(3)を配置する構成をとる(図1)。流路基板(3)に開けられた各貫通孔(14)は、流路基板(3)の上面側を入口(15)、流路基板(3)の下面側を出口(16)とする流路を規定しており、各流路の出口(16)が、いずれかの細胞配置領域(8)の上に位置するように構成される(図4)。細胞播種培養装置(1)は、細胞培養基板(2)と流路基板(3)以外に、貯液部を規定する貯液基板(4)や基板を固定する基板固定基板を含んでもよい。基板固定基板は、これらの基板を動かないように固定できれば任意の形状であってよく、例えばこれらの基板を挟み込んで固定する基板固定基板(下)(5)と基板固定基板(上)(6)、さらにはねじやクリップなどの固定具(7)で固定されてもよい。
カルシウムイメージングとは、神経細胞に予めカルシウムプローブ(カルシウムイオンと結合して蛍光を発する色素)を導入しておき、神経細胞に活動電位が発生した時に細胞体にカルシウムイオンが流入する現象を蛍光として捉える方法であり、その細胞のイオンチャンネル電流を活動電位の発生時あるいは活動電位の伝搬時に生じる蛍光の観察により行う解析することができる。
Synaptophysinやsynapsinはシナプスベシクルの膜タンパク質であり、前シナプス部位のマーカーであるが、これらの抗体に色素を結合させ、抗原抗体反応を利用してこれらのタンパク質に色素を結合させることができる。これにより、シナプス部位を標識することができる。
MAP2は樹状突起のマーカーであるが、この抗体に色素を付加し、反応させることにより、樹状突起部位を標識することができる。
FM1−43やFM4−64は細胞膜に可逆的に入り、細胞膜を透過せず、細胞膜に結合したときにのみ蛍光を発するという特徴を有し、エンドソームやエキソソームを標識することができる。細胞の生命機能を維持して標識できるという特徴を有する。
本発明に係る細胞播種培養装置を用いて播種された細胞を含む細胞培養基板に対して、イメージング解析を行うには、以下の光学系要素を備える装置を用いることが好ましい。
プレーナーパッチクランプ法は、ピペットパッチクランプ法では難しかった多点計測によるハイスループットスクリーニングを可能にする方法であり、電気絶縁性の基板上に複数の微細なプレーナーパッチクランプ用貫通孔(21)を設け、かかるプレーナーパッチクランプ用貫通孔(21)上に配置された細胞における電気的変化、例えば膜電位又は膜電流を、電気絶縁性基板の各面に配置された電極を用いて計測、又は細胞に電気的刺激を付与する手法である。プレーナーパッチクランプ装置(20)として、まず、単一チャンネル型のプレーナーパッチクランプ装置(これを適宜「単一チャンネル装置」と略称する。)について説明する(図6)。単一チャンネル装置は、プレーナーパッチクランプ法による測定が可能な単一の構造単位(これを「チャンネル」と呼ぶ)を有する装置であり、このチャンネルを複数設けて、同時又は順次に電気的特性の計測を可能にする多チャンネル型プレーナーパッチクランプ装置や、さらに多チャンネル型プレーナーパッチクランプ装置を複数集めた複合多チャンネル型プレーナーパッチクランプ装置とすることができる。
次に、単一チャンネル装置を複数組み合わせた多チャンネル型プレーナーパッチクランプ装置(これを適宜「多チャンネル装置」と略称する。)について説明する。多チャンネル型プレーナーパッチクランプ装置は、プレーナーパッチクランプ法による測定が可能な構造単位(チャンネル)を複数有する装置である。上で説明した単一チャンネル装置を構成する要素を複数設けることにより、多チャンネル装置を構成してもよいし、図7に示すとおり、プレーナーパッチクランプ用流路の電気的導通を妨げるバルブを用いることにより、電極の数を増やさないで多チャンネル装置を構成することもできる。但し、本発明のプレーナーパッチクランプ装置は、図7の多チャンネル装置(20a)に限定されるものではない。
また、複数の第二液溜部(23’)の各々に連結される送液支流路(25b)及び/又は排液支流路(26b)に、バルブ(27)が設けられる。
その他の構成等は、図6の単チャンネル型装置(20)と同様である。
本実施例においては、図1に示す細胞播種培養装置(1)を用いた。細胞播種培養装置(1)に用いた細胞培養基板(2)として、ポリカーボネート製基板(厚さ0.2mm、大きさ11mm×11mm)を用いた。当該細胞培養基板(2)の細胞配置領域(8)には、円柱状突起部(12)(直径30μm、高さ8μm、本数6本または、4本、または5本)が設けられている。流路基板(3)として、入口(15)の大きさ150μm×150μm、出口(16)の大きさ40〜50μm×40〜50μmの貫通孔(14)を設けたポリカーボネート製基板(厚さ200μm)を用いた。
2 細胞培養基板
3 流路基板
4 貯液基板
5 基板固定部(下)
6 基板固定部(上)
7 固定具
8 細胞配置領域
9 スペーサー部材
10 細胞保持部
12 突起部
13 溝部
14 貫通孔
15 入口
16 出口
17 ガイド
18 貯液部
19 位置調節ねじ
20 単チャンネル型プレーナーパッチクランプ装置
20a 多チャンネル型プレーナーパッチクランプ装置
21 プレーナーパッチクランプ用貫通孔
22 細胞
23 第一液溜部
23a 主液溜部
23b 副液溜部
23c 導入用通液路
23’ 第二液溜部
24 第一電極部
24’ 第二電極部
25 送液流路
26 排液流路
25a 送液主流路
26a 排液主流路
25b 送液支流路
26b 排液支流路
27 バルブ
28 第一プレート部材
28’ 第二プレート部材
29 蓋部材
30 隙間
Claims (11)
- 細胞の移動及び流失を妨げる複数の突起部により包囲された細胞配置領域を複数有し、
突起部により規定される細胞配置領域が、1〜数個の細胞を収容できるサイズであり、神経ネットワーク形成可能な細胞の培養基板と、当該培養基板上に配置された、細胞の通過を許容する複数の貫通孔を有する流路基板とを含む神経ネットワーク形成可能な細胞の播種培養装置であって、各貫通孔が、基板上面側を入口、基板下面側を出口とし、該入口から該出口にかけて縮小する細胞播種のための流路を規定し、各流路の出口が、いずれかの細胞配置領域上に位置し、該出口の大きさが細胞配置領域よりも小さく、該培養基板と該流路基板との間に突起部の高さより厚いスペーサー部材を配置し、スペーサー部材の厚さに対応する、細胞配置領域間で神経ネットワークを形成可能な空隙を形成し、前記出口と前記突起部との間に、細胞が流出する隙間が存在せず、ここで播種時に該空隙が液体で満たされる、前記細胞播種培養装置。 - 前記入口から出口にかけて縮小する細胞播種のための流路が、漏斗形状である、請求項1に記載の細胞播種培養装置。
- 前記細胞播種のための流路の入口が100〜500μmであり、出口が20〜50μmであり、及び前記流路基板の厚さが、0.2mm〜5mmである、請求項1又は2に記載の細胞播種培養装置。
- 前記細胞の移動及び流失を妨げる複数の突起部から構成される細胞保持部の内径が、10〜25μmである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞播種培養装置。
- 前記突起部の高さが、5〜15μmである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞播種培養装置。
- 前記細胞播種培養装置が、1の細胞配置領域あたり、1〜数個の細胞の配置を可能にする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の細胞播種培養装置。
- 前記流路基板が、細胞定着後に培養基板から取り外し可能に配置されており、流路基板が取り外された培養基板が実験に供される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞播種培養装置。
- 前記流路基板の上面に、貯液部を規定する貯液基板をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の細胞播種培養装置。
- 前記培養基板が、プレーナーパッチクランプに用いる電気絶縁性基板であり、細胞配置領域内に、細胞を通過させないが電通を達成しうるプレーナーパッチクランプ用貫通孔を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の細胞播種培養装置。
- 前記培養基板が、神経ネットワークのイメージング用基板である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の細胞播種培養装置。
- 細胞の移動及び流失を妨げる複数の高さ5〜15μmの突起部により包囲された内径10〜25μmの細胞配置領域を複数有する、神経ネットワーク形成可能な細胞の培養基板と、当該培養基板上に配置された、細胞の通過を許容する複数の貫通孔を有し、0.2mm〜5mmの厚さを有する流路基板とを含む神経ネットワーク形成可能な細胞の播種培養装置であって、各貫通孔が、基板上面側に100〜500μmの入口、基板下面側に20〜50μmの出口を有し、入口から出口にかけて縮小しており、各流路の出口が、いずれかの細胞配置領域上に位置し、培養基板と流路基板との間にスペーサー部材が存在し、スペーサー部材の厚さに対応する、細胞配置領域間で神経ネットワークを形成可能な空隙を形成し、そして播種時に該空隙が液体で満たされ、前記出口と前記突起部との間に、細胞が流出する隙間が存在しない、前記播種培養装置。
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