CN107109331A - 使用胶凝剂跟踪单细胞的新型生物活性测试结构 - Google Patents

使用胶凝剂跟踪单细胞的新型生物活性测试结构 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于使用胶凝剂的单细胞跟踪的新型生物活性测试结构和包括测试结构的生物活性测试系统。本发明还涉及使用测试结构的生物活性测试、药物敏感性测试、抗生素筛选和诊断方法。本发明的生物活性测试结构实现了非常快速且简单的细菌，特别是结核分枝杆菌的药物敏感性测试、药物筛选和细菌诊断。特别地，使用测试结构可以仅通过预处理进行DST和细菌的诊断，而不需要浓缩人类痰样品，不考虑接种效应，确保与常规结核病诊断或DST系统相比，更快速、准确且简单的测试。此外，本发明的测试结构同时能够进行结核病的诊断和药物敏感性测试。因此，本发明提供了现有技术的有效替代方案。

Description

使用胶凝剂跟踪单细胞的新型生物活性测试结构
技术领域
本发明涉及一种用于使用胶凝剂跟踪单细胞的新型生物活性测试结构和包括测试结构的生物活性测试系统。
另外，本发明还涉及使用上述测试结构的生物活性测试、药物敏感性测试、抗生素筛选和诊断方法。
背景技术
威胁全世界三分之一人口健康的传染病是结核病(TB)。尽管存在抗结核药物，但全世界每年约1％的人口感染结核病且130万人死于结核病。由于对TB患者或TB疑似群体管控不善，多重耐药性结核病(MDR-TB)和广泛耐药性结核病(XDR-TB)正逐渐增加。近年来，首例完全耐药性结核病(TDR-TB)已被报道出现在印度。为了减少结核病的传播并改善结核病患者的疗效，在药物敏感性测试(DST)之后需要进行快速且准确的药物治疗。TB对标准一线抗TB药剂中的某些药物的耐药性的诊断在确定MDR-TB、XDR-TB和XDR-TB以及避免药物治疗无效方面是非常重要的。
常用DST方法是基于在固体和液体培养基上培养细胞。根据固体培养基培养方法，结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)(MTB)接种于包含抗生素的固体培养基中，并用肉眼测试观察是否形成菌落。由于MTB缓慢生长(细胞分化约24小时)，因而常规的DST方法耗费至少4-6周。对于液体培养基，MTB生长被加速，并可以减少DST所需的时间。可以利用使用了被称为MGIT960系统的液体培养基的商用DST平台。MGIT系统测试随着MTB生长并消耗氧产生的荧光信号。该MGIT系统的DST时间短至约为1周，然而，这种方法导致错误率的增加，原因是MTB细胞的生长不是被直接观察到，而是间接确定的。
为了缩短DST时间，开发了直接观察的显微镜观察药物敏感性(MODS)方法。根据该方法，将痰样品与药物一起接种在24孔板中，且每天监测菌落形成，这在确定MTB是否生长中起重要作用。该方法可以在一周内产生DST结果。然而，由于MTB的单细胞不能固定在液体培养基中，使得不可能跟踪单细胞。该方法可以在一周内产生DST结果。然而，由于MTB的单细胞不能固定在液体培养基中，使得不可能跟踪单细胞。为了获得DST结果，在整个孔区域的显微镜观察对于测试菌落形成是必不可少的，并且长期观察是不可避免的。
已经开发了许多实验室芯片技术用于单细胞跟踪：使用微尺度孔的阵列、被动微流体捕获、主动阀微流体系统和液滴微流体。在使用微尺度孔和被动微流体捕获的阵列方法中，细胞通过重力沉降并通过流体流动被捕获在堰板中。然而，与控制流体环境相关的困难阻碍了药物测试的多重测定。为了更好地控制细胞和药物负载，主动阀微流体方法采用计算机控制的气动致动捕获方法，通过多个控制元件准确控制少量液体。然而，这种方法依赖于复杂的控制，这带来高成本和过多的运营努力。因此，该方法不适用于常规临床药物测试。液滴微流体采用少量腔室用于复用药物测试。然而，这些方法不能保证细菌细胞在液滴内的固定，这对于单细胞跟踪是必需的。
接种效应(IE)在实验室中是不希望的现象，并可能导致在体外耐药性的过高估计，导致最小抑菌浓度(MIC)的增加。因此，接种效应恶化了实验再现性。此外，由于MIC是确定抗生素在药效学中的微生物功效的参数，通过细胞密度不同的MIC值可以限制抗生素的临床评价。
发明内容
本发明要解决的问题
本发明人认真深入研究开发有效和快速诊断细菌，特别是结核分枝杆菌、DST和筛选的方法，结果发明了一种新的腔室(简称“DAC系统”)，以制成薄层的琼脂糖混合物，并在薄层之上具有畅通表面用于供给液体培养基和药物。此外，本发明人已经发现，DAC系统对于快速和简单的药物DST、药物筛选和结核病诊断是有效的。基于这些发现实现了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种新的生物活性测试结构和包括其的生物活性测试系统。
另外，本发明的另一个目的是提供一种用于使用生物活性测试结构进行的生物活性测试、细菌的抗生素敏感性测试、抗生素筛选和细菌诊断的方法。
解决问题的手段
本发明的一个方面提供一种生物活性测试结构，其包括板体，布置在板体上的一个或多个培养单元100和底板110，在底板110下面，在每个培养单元的底面上将形成固体薄膜。
生物活性测试可能是药物敏感性、药物筛选或细菌培养诊断测试。
每个培养单元还可以具有形成在底板之上的容纳凹陷部120。
每个培养单元可以具有形成在底板中的入口111，并且含有胶凝剂和生物剂的液体培养基的混合溶液将通过该入口111引入。
每个培养单元100可以具有一个或多个连接构件113，基板110通过该连接构件113连接到板体的阻挡部(分隔壁)和形成在连接构件之间的切割凹槽114。
每个培养单元可以具有形成在基板110中的一个或多个贯通孔112。
优选地，每个培养单元100具有1-50mm×1-50mm的尺寸和1-50mm的高度。
优选地，容纳凹陷部120具有1-5mm的宽度和1-3mm的高度。
混合溶液在底板下被固化，形成生物剂被固定的固体薄膜。
薄膜可以具有1μm至10mm的厚度，并且混合溶液中的生物剂的密度可以为101至1080cfu/ml。
胶凝剂不限于特定种类，其可以是琼脂，琼脂糖，明胶，藻酸盐，胶原蛋白或纤维蛋白。
可以将生物活性剂进一步引入培养单元中，且更优选地，将生物活性剂以冷冻干燥的形式引入到容纳凹陷部中。
板体、培养单元和底板可以由透明或半透明的材料制成。
本发明的另一方面提供了一种生物活性测试方法，其包括：将含有胶凝剂和生物剂的液体培养基的混合溶液提供到生物活性测试结构的底面；固化混合溶液以形成固体薄膜，其中生物剂被固定在固体薄膜中；向固体薄膜供应生物活性剂并允许生物活性剂扩散到固体薄膜中；以及观察生物剂的单细胞对生物活性剂的个体应答或观察生物剂是否形成菌落或菌落形成单位(CFU)。
该方法可以进一步包括将生物剂的单细胞对生物活性剂的个体应答、生物剂的菌落或菌落形成单位(CFU)进行成像，并分析图像。更优选地，该方法还包括基于图像的分析确定生物活性剂的最小抑菌浓度(MIC)。
本发明还提供了一种用于细菌的抗生素敏感性测试方法，其包括：向生物活性测试结构的底面提供含有胶凝剂和细菌菌株的液体培养基的混合溶液；固化混合溶液以形成固体薄膜，其中细菌菌株被固定在固体薄膜中；向固体薄膜提供抗生素并使抗生素扩散到固体薄膜中；以及观察细菌菌株的单细胞对抗生素的个体应答或观察细菌菌株是否形成菌落或菌落形成单位(CFU)。
优选地，该方法还包括对单细胞的个体应答、菌落或菌落形成单位(CFU)进行成像，分析图像以及基于图像分析确定抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。
细菌菌株可以是结核分枝杆菌或非结核分枝杆菌(NTM)。结核分枝杆菌可能是多重耐药性(MDR)结核病、广泛耐药性(XDR)结核病或完全耐药性(TDR)结核病。
该方法显示无接种效应。
本发明的另一方面提供了一种抗生素筛选方法，其包括：向生物活性测试结构的底面提供含有胶凝剂和细菌菌株的液体培养基的混合溶液；固化混合溶液以形成固体薄膜，其中细菌菌株被固定在固体薄膜中；向固体薄膜提供抗生素并允许抗生素扩散到固体薄膜中；以及观察细菌菌株的单细胞对抗生素的个体应答或观察细菌菌株是否形成菌落或菌落形成单位(CFU)。
该方法还可以包括对单细胞的个体应答、菌落或菌落形成单位(CFU)进行成像，分析图像以及基于图像分析确定抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。
本发明的另一方面提供了一种细菌诊断的方法，其包括：将含有胶凝剂和细菌菌株的液体培养基的混合溶液提供到生物活性测试结构的底面；固化混合溶液以形成固体薄膜，其中细菌菌株被固定在固体薄膜中；向固体薄膜提供细菌菌株的培养基并允许培养基扩散到固体薄膜中；以及观察细菌菌株的单细胞的个体应答或观察细菌菌株是否形成菌落或菌落形成单位(CFU)。
细菌菌株的培养基可以进一步补充抗生素，并且诊断方法可以与药物敏感性测试同时进行。
本发明的又一方面提供了一种生物活性测试系统，其包括：生物活性测试结构，生物活性测试结构包括培养单元和底板，培养单元中被提供生物活性剂，使含有胶凝剂和生物剂的液体培养基的混合溶液固化以在每个培养单元的底面上形成薄膜；支撑并观察测试结构的台；以及测量系统，其用于当通过扩散递送生物活性剂时，对生物剂的单细胞的个体应答或生物剂的菌落的形成成像，或对菌落形成单位(CFU)进行成像，分析图像并基于图像分析确定生物活性剂的最小抑菌浓度(MIC)。
测量系统可以包括成像系统和图像处理系统。
本发明的效果
本发明的生物活性测试结构实现了非常快速且简单的细菌，特别是结核分枝杆菌的药物敏感性测试、药物筛选和细菌诊断。特别地，使用测试结构可以仅通过预处理进行DST和细菌诊断，而不需要浓缩人类痰样品，而不考虑接种效应，从而确保与常规结核病诊断或DST系统相比，快速、准确且简单的测试。此外，本发明的测试结构同时能够进行结核病的诊断和药物敏感性测试。因此，本发明提供了现有技术的有效替代方案。
附图说明
图1示出了根据本发明的DAC芯片的示意图。
图2a和2b分别是根据本发明的测试结构的第一实施方案的透视图和平面图。
图3a和3b分别是根据本发明的测试结构的第二实施方案的平面图和透视图。
图4示出了DAC芯片和使用DAC芯片的DST方法的详细图。
图5示出了作为抗生素的罗丹明B从琼脂糖的扩散。
图6示出了药物敏感性测试后的结核分枝杆菌的延时图像和处理过的图像。
图7示出了通过使用连续的数字数据处理图6的图像而绘制的耐药性和敏感性示例的生长曲线。
图8比较了通过在DAC系统和MGIT 960系统上进行N-乙酰基-L-半胱氨酸-NaOH(NALC-NaOH)方法来检测49份H37Rv痰样品中的结核分枝杆菌的生长所需的时间。
图9比较了在DAC系统和MGIT 960系统上进行的NALC-NaOH方法或直接接种方法(无浓缩)的结果。
图10示出了用于计算接种物浓度的在7H11培养基中计数的菌落数目。
图11示出了从TDR 102患者中分离出的第一临床菌株在不同浓度的药物下的生长以计算药物的MIC的图像。
图12是通过量化图11的图像获得的图。
图13示出了从TDR 103患者中分离出的第二临床菌株在不同浓度的药物下的生长以计算药物的MIC的图像。
图14是通过量化图13的图像获得的图。
具体实施方式
将参照以下实施例更详细地说明本发明。然而，这些实施例仅为了说明的目的而提供，并不意图限制本发明的范围。
实施例1：DAC系统的开发及DST的验证
1.1.样品
琼脂糖被用作MTB固定材料。将琼脂糖溶液与TB贮备溶液混合，如果使用高温琼脂糖溶液，则存在热冲击风险。为了降低这种风险，使用0.5％浓度的琼脂糖，因为该浓度足够低以防止在37℃下固化。较低浓度的琼脂糖增强了培养基和药物的扩散。用于DST的药物购自Sigma-Aldrich。液体培养基是补充有10％OADC的Middlebrook 7H9肉汤。
1.2.菌株
标准菌株，结核分枝杆菌H37Rv以及临床菌株，MDR和XDR-TB是从韩国结核病研究所获得的。将结核病菌株在LJ培养基上预培养，直到存在数个菌落用于DST过程。
1.3.芯片的设计和制造
对于结核病的微观延时成像，需要测试芯片以将结核病固定在琼脂糖中，以确保药物的充分递送和光学透明度。为了满足这些要求，设计和制造了新的芯片，即盘琼脂糖通道(DAC)芯片。
DAC芯片的示意图如图1所示。
图2a和2b以及图3a和3b示出了DAC芯片的详细透视图和平面图。
DAC芯片由一个盘形通道(底板)组成，其装有琼脂糖和TB的混合物。该芯片还具有增强培养基和药物扩散的结构，诸如含有培养基、药物的孔、畅通的空间和孔洞。
具体来说，DAC芯片基本上由布置在板体上的一个或多个培养单元和底板组成，在底板下面，固体薄膜将形成在每个培养单元的底面上。每个培养单元还可以具有形成在盘形通道(底板)之上的容纳凹陷部。每个培养单元可以具有形成在底板中的入口，通过该入口引入琼脂糖和TB的混合物。每个培养单元具有一个或多个连接构件，底板通过该连接构件连接到板体的阻挡部及形成在连接构件之间的切割凹槽。每个培养单元可以具有形成在底板中的一个或多个贯通孔。盘形通道的深度(例如300μm)由间隔件的高度决定。TB的DST需要长的孵育时间且应向TB提供充足量的培养基。然而，使用注射泵来提供培养基是不方便的且限制了系统的处理量。因此，每个孔被设计成具有与24孔板中的单个孔相同的尺寸。具体地说，孔的直径为11mm，且孔的高度为10mm。这些孔含有1ml培养基，其适合1个月以上的孵育。
使用PDMS制造芯片限制了芯片的尺寸，并且制造产量低。因此，注塑成型用于DAC芯片制造。在使用3D设计工具(SolidWorks)设计芯片之后，对铝模具进行加工。聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)用于生产芯片。制造芯片后，使用溶剂结合法将聚碳酸酯膜结合到芯片的底部。腔室由3D设计工具和注塑成型过程制造。此外，下部膜，聚碳酸酯在压力下被结合(80％重量的乙醇和20％重量的1,2-二氯乙烷，Sigma-Aldrich)。然后对芯片进行O2等离子体处理以确保亲水性。然后将该芯片用γ射线处理5小时以便灭菌。
1.4.DST过程
对于DAC芯片中的DST，对芯片进行O2等离子体处理以确保亲水性，然后用γ辐射处理进行灭菌。通过使用灭菌的回路从LJ培养基中收集菌落来制备TB贮备溶液。通过用2mm直径的玻璃珠涡旋将聚集的菌落分散在U形底部的管中。出于安全考虑，将涡旋的管静置15分钟。稳定后，加入含有10％OADC的7H9培养基，以制备含有McFarland 1.5-3.0的贮备溶液。通过涡旋将贮备溶液与37℃的0.5％琼脂糖混合。随后，将40μl含有TB贮备溶液的0.375％琼脂糖混合物装入DAC芯片的入口。然后使琼脂糖在室温下固化1分钟。然后将含有10％OADC和TB药物的7H9的0.5ml等份试样加入到DAC芯片中。然后将培养基中的药物扩散到琼脂糖中。在该过程之后，用透气膜密封DAC芯片，以防止培养基蒸发，并在37℃的温度控制培养腔室中孵育。使用延时法，每天在倒置显微镜上用×40透镜将琼脂糖边缘处的一个区域成像。这些程序都是在清洁的工作台上进行。
1.5.使用3D培养DAC芯片用于MTB的DST
在本发明中，使用琼脂糖作为MTB的DST的3D培养基质。为了长期孵育MTB，需要稳定的3D培养基质。
图4示出了DAC芯片和使用DAC芯片的DST方法的详细图。为了验证琼脂糖基质的稳定性，将0.5％琼脂糖以3:1的体积比与微珠在磷酸盐缓冲盐水中混合。将混合物加入到DAC芯片的入口，并将7H9培养基加入孔中。对于MTB的DST条件，芯片在37℃下被培养在腔室中。在同一区域中，琼脂糖基质中的珠被良好观察3周，表明3D培养基质对于MTB的DST是足够稳定的。当H37Rv在琼脂糖基质中被培养时，在单细胞跟踪3周期间，结构也保持良好。为了确保液体培养基和药物的均匀供应，琼脂糖基质合适地形成在模具中。为了可视化琼脂糖基质的形成，将含有3(食用染料):1(琼脂糖)体积比的食用染料的0.5％琼脂糖混合物加载到芯片中并成像。琼脂糖基质在DAC芯片上良好地形成。
1.6.DAC芯片的扩散特性
琼脂糖被用来固定TB。将TB药物溶解在液体培养基，7H9肉汤中，以递送至琼脂糖基质。在本发明中，DAC芯片角落处的药物浓度(成像区域)需要均匀以确保DST结果的准确性。计算小分子(分子量200)扩散到成像区域所需的时间。成像区域内的分子的浓度相同。使用罗丹明B(分子量479.02g/mol)来可视化DAC芯片中琼脂糖基质的扩散特性，因为其分子量与TB药物相似。用各种浓度的这些分子处理芯片，并在0、10、30和60分钟进行成像以评估扩散的均匀性。荧光信号在装载荧光染料的30分钟内变得均匀，这意味着该系统适用于DST(考虑MTB的细胞分裂，约为20-24小时)。MTB的生长速率在芯片的整个区域内是相同的，这表明液体培养基和药物在芯片中以相同的水平扩散。
图5示出了抗生素罗丹明B从琼脂糖的扩散。具体地，在图5中，A显示了在装载罗丹明B后立即拍摄的图像，B、C、D分别示出了以10分钟间隔依次拍摄的图像。扩散时间为0.1秒。
1.7.跟踪DAC芯片中的单细胞
常规的DST方法依赖于通过肉眼观察固体培养基上的菌落形成来测量MTB生长或依赖于测量液体培养基中的氧消耗的基于荧光的间接检测方法。
本发明的单细胞生长跟踪方法用于各种药物条件下的MTB生长的测量。DAC芯片上的MTB细胞每天都被跟踪并持续数天。一个成像区域(200μm×300μm)含有许多不同尺寸的TB，因为MTB细胞由固体培养基上的菌落(大的簇形式)制备。
1.8.自动的敏感性确定的图像处理
固体培养基(LJ培养基)上的常规DST方法依赖于经验丰富的实验者对MTB生长的肉眼观察的评估。因此，这种方法受人为错误的影响。
在本发明中，使用自动图像处理来确定MTB的药物敏感性并避免人为错误。处理具有CCD相机的微观延时图像以数字化TB药物条件下的MTB生长。将CCD相机的原始图像处理为二进制形式。尽管由于MTB菌落的边界不清楚且成像区域含有一些碎片，因而并不是所有的白色区域都代表生长的MTB细胞，但是大多数白色区域是由于琼脂糖基质中MTB的生长，因此与此参数成比例。
图6示出了延时图像和处理过的图像。
A)和A')是耐药性示例，B)和B')是敏感性示例。在耐药性示例中，发现了成像区域中许多菌落的形成。图像处理后，白色区域代表了图像中生长的MTB菌落。在敏感性示例中，图像中的MTB生长没有差异。
通过计算像素的数目来计算图像中的白色区域。使用连续的数字数据，图7中绘制了随时间变化的生长曲线。通过设定阈值，确定TB菌株在不同浓度的结核病药物下的药物敏感性。
图7示出了耐药性示例和敏感性示例的量化生长曲线。通过测量图像中MTB的生长区域所占的面积来构建生长曲线。耐药性示例中的细菌区域所占的面积连续增加，而敏感性示例中则无明显变化。
1.9.使用DAC系统的MTB的DST
MTB DST基于对一种药物的单一“临界浓度”存在下的MTB菌株的生长或非生长的估计或测量。如果观察到生长，抗结核病药物的临界浓度表示临床上相关的耐药性，而敏感的MTB菌株在该临界浓度下被抑制。在DAC系统中，每种抗结核病药物的临界浓度由MGIT的临界浓度决定，因为DAC系统比起固体培养系统，更类似于液体培养系统。在确定每种抗结核病药物的临界浓度后，使用DAC系统在接近临界浓度的连续两倍浓度下进行DST，以获得最小抑菌浓度(MIC)和MTB的敏感性。
抗结核病药物的MIC值可以通过各药物浓度下的充分测试来确定。此后，当MIC值等于或低于临界浓度时，该菌株被认为是敏感的，而耐药性菌株由超过临界浓度的MIC值定义。具体来说，利福平的临界浓度在DAC系统中为1.0μg/ml。使用DAC系统的DST在利福平浓度为0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml和2.0μg/ml下进行。绘制每种抗结核病药物的浓度随孵育时间变化的生长曲线。通过测量基于临界浓度的MIC值来确定敏感性。
随着全世界感染MDR、XDR和TDR的患者数量的增加，为了公众健康和诊断，迫切需要快速的DST。DAC系统基于微流体通道的概念实现快速DST。为了验证用于快速SDT的DAC系统，测试了MTB，H37Rv的毒性标准菌株以及MDR和XDR菌株的临床菌株，以确定异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇的敏感性。
常用的基于LJ培养基的DST被用于质量控制和作为比较目标，因为它被认为是DST的“黄金标准”。通过使用DAC系统来确定异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇对H37Rv、MDR和XDR的MIC值。
从这些MIC值，确定H37Rv、MDR和XDR对异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇的敏感性低于临界浓度，或通过测量除临界浓度以外的浓度下的MIC值来确定。
所有测试菌株的图像采用延时方法每隔一天在同一位置进行采集，持续5天。使用每日延时数据处理图像持续5天，并绘制曲线以确定四种抗结核病药物的MIC值。
结果如表1所示。
[表1]使用DAC系统测量的DST结果
测试H37Rv、MDR和XDR TB菌株对四种原发性结核病药物异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)的敏感性。测试浓度由相应药物的临界浓度确定。
延时图像中的MIC确定之后，通过约束点测试值并确定药物敏感性。
在表1中，A显示从了DAC系统获得的DST的MIC值，并且B显示了由MIC数据和药物临界浓度确定的敏感性。
从表1的A可以看出，异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇的MIC值分别为0.05μg/ml、0.25μg/ml、2.0μg/ml和5.0μg/ml。从MIC数据，发现菌株H37Rv对异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇敏感。在LJ培养测试中也获得了相同的结果。
来自MDR和XDR患者的另外两株测试菌株被发现在DAC系统中对所有药物都有耐药性。使用被认为是黄金标准的LJ培养方法证明了敏感性结果。DAC系统中的所有敏感性结果与黄金标准方法的结果一致。从这些验证的结果看出，证明了DAC系统可以缩短DST时间，并用于准确诊断抗结核病药物的敏感性和耐药性。
实施例2：DAC系统与常规培养诊断产品的比较
通过将本发明的DAC系统与常规的TM培养诊断方法进行比较，可以证实DAC系统的有用性。
2.1.恢复率的比较
在三个系统中测试了同一痰样品的三个被分开的部分。将结果进行比较。
具体来说，对6/25涂片阳性肺结核患者进行了测试。在25个临床痰样品中，发现3个阳性样品(阳性率为12.0％)。在三个阳性样品中，一个在Ogawa培养基、Middlebrook7H11培养基和DAC系统中呈阳性，另一个在7H11培养基和DAC系统中呈阳性，另一个在DAC系统中呈阳性。Ogawa培养基、Middlebrook 7H11培养基和DAC系统中的阴性样品数分别为23个(阴性率92.0％)、22个(阴性率88.0％)和21个(阴性率84.0％)。在所有方法中，一个样品被污染(4.0％)。
比较三种培养方法中结核分枝杆菌的恢复率。结果，在DAC系统中获得的恢复率(12.0％)高于Ogawa培养基的(4.0％)和Middlebrook 7H11培养基的(8.0％)。三种方法的污染率相同。
详细的比较结果在表2中示出。
[表2]
2.2.菌落形成单位(CFU)与现有技术的比较
对49份H37Rv痰样品进行预处理后，将样品接种在DAC系统和Middlebrook 7H11培养基中且对它们的菌落形成单位(CFU)计数。初始CFU为1×104/ml。通过培养方法计数痰样品中的CFU值。结果发现DAC系统中的CFU值与Middlebrook 7H11培养基中通过常规方法获得的值相似。然而，在DAC系统中的CFU结果在9天内获得，而在Middlebrook 7H11培养基中的CFU结果在21天内获得。DAC系统的中值CFU为4.27log10CFU/ml(SD±0.75)，Middlebrook7H11培养基中的中值CFU为4.32log10CFU/ml(SD±0.64)。(图15)
2.3.培养检测时间与现有技术的比较
在DST系统中使用的结核病培养诊断或LJ培养基方法需要4-6周。MGIT 960(BDBACTECTM)目前是结核分枝杆菌的培养诊断中最快的产品。将根据本发明的DAC系统的培养诊断时间与该现有技术的进行比较。
结果如图8所示。
图8比较了通过在DAC系统和MGIT 960系统上进行N-乙酰基-L-半胱氨酸-NaOH(NALC-NaOH)方法来检测49份H37Rv痰样品中结核分枝杆菌的生长所需的时间。
如图8所示，TTD在MGIT 960系统中为5-13天，在DAC系统中为5-9天。MGIT 960系统和DAC系统中的结核分枝杆菌的最高检测水平是7天。
比较了结核分枝杆菌在不同接种物浓度下的TTD值，结果见表3。
[表3]
具体来说，共使用49份H37Rv痰样品来检测结核分枝杆菌，以便根据Middlebrook7H11培养基中的CFU值确定TTD值。
在DAC系统中，检测结核分枝杆菌所需的时间分别为1、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28、35以及42天。
根据Middlebrook 7H11培养基中的CFU值的中值TTD值是DAC系统中的7天(5-6log10CFU/ml)至9天(2-3log10CFU/ml)。
根据Middlebrook 7H11培养基中的CFU值的TTD值是MGIT 960系统中的6天(5-6log10CFU/ml)至12天(2-3log10CFU/ml)。
当结核分枝杆菌计数为2-3log10CFU/ml时，MGIT 960系统和DAC系统中的结核分枝杆菌的中值TTD值分别为12天和9天。
当结核分枝杆菌计数为3-4log10CFU/ml时，MGIT 960系统和DAC系统中的结核分枝杆菌的中值TTD值分别为8天和7天。
当结核分枝杆菌计数为4-5log10CFU/ml时，MGIT 960系统和DAC系统中的结核分枝杆菌的中值TTD值分别为7天和6天。
当结核分枝杆菌计数为5-6log10CFU/ml时，MGIT 960系统和DAC系统中的结核分枝杆菌的中值TTD值分别为6天和7天。
当结核分枝杆菌计数为2-5log10CFU/ml时，与MGIT 960系统相比(范围从7到12天)，DAC系统中结核分枝杆菌生长的检测(范围从6到9天)更快。当结核分枝杆菌计数为5-6log10CFU/ml时，与DAC系统(7天)相比，MGIT 960系统中结核分枝杆菌生长的检测(6天)更快。
49份样品中的4个(8.2％)在MGIT 960系统中被污染。液体培养中的结核分枝杆菌显示出比DAC系统中更高的假阳性率。
2.4.使用直接接种方法的MGIT960系统和DAC系统的比较
对痰液进行净化后，使用直接接种方法(无浓缩)比较MGIT960系统和DAC系统的效率。
结果如图9所示。
图9比较了在MGIT 960系统和DAC系统上进行的NALC-NaOH方法(有浓缩)或直接接种方法(无浓缩)的结果。
使用DAC系统测试结核分枝杆菌生长需要1、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28、35、42天。
在接种前，将18份H37Rv痰样品用2％NALC-NaOH净化并分成2个样本。根据标准NALC-NaOH方法将一个样本以3,000g离心15分钟，另外一个样本以直接法(无浓缩)使用。分别在MGIT 960系统和DAC系统中培养用NALC-NaOH法(有浓缩)和直接法(无浓缩)预处理的样品。
发现上述两种痰预处理方法，诸如使用直接预处理方法(无浓缩)的DAC系统培养方法和使用NALC-NaOH方法(有浓缩)的MGIT 960培养方法具有相似的培养形态。
在DAC1(5-7天)、DAC2(5-7天)和MGIT1系统(6-7天)中的中值TTD为7天。
相比之下，在MGIT2系统中，检测样品中的结核分枝杆菌所需的中值TTD为14天(7-24天)。
在DAC系统中没有观察到污染，而在MGIT1和MGIT2系统中分别有5.6％和27.8％被污染。
也就是说，在DAC培养方法中发现阳性样品在5-7天之间，而与痰液预处理无关。相反，当痰样品根据供应商推荐的NALC-NaOH方法进行预处理时，在6-7天之间发现阳性样品，并且在MGIT 960培养方法中获得低的假阳性率。
2.5.比较获得真阴性结果所需的时间
对于基于液体培养基的MGIT 960系统，需要6周检测分枝杆菌。
测量使用DAC系统获得真阴性结果所需的时间。结果如表4所示。
[表4]测试结核分枝杆菌生长所需的时间
检测三份临床痰样品(25份临床痰样品中有3份阳性样品)和49份H37Rv痰样品中的结核分枝杆菌生长所需的时间取决于DAC系统中分枝杆菌的恢复率，如上表4所示。在DAC系统中测试结核分枝杆菌所需的时间分别为1、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28、35和42天。
总共74份样品中，52份样品为阳性，22份样品为阴性，没有样品被污染。在第5天测定时，52份阳性样品中的6个(11.5％)从阴性变为阳性，在第9天测定时，52份阳性样品中的50个(96.2％)从阴性变为阳性，并且在第14天测定时，所有样品从阴性变为阳性。22份阴性样品长达42天没有变化。从这些结果，确定在DAC系统中，第9天获得显著的培养结果(p<0.05)，并且在第14天获得所有准确的培养结果。看起来，DAC系统比MGIT 960系统快了约28天来确定真阴性结果。
实施例3：识别DAC系统中接种效应(IE)的存在
本发明人评估了使用DAC系统的利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素作为抗结核病的原发性药物的抗菌活性以及DAC系统是否受细胞密度变化的影响。该系统可以绘制可重复的且可靠的药物的MIC值，而不考虑接种量。
3.1.样品和生长条件
结核分枝杆菌是从韩国结核病研究所(KIT)的肺结核病患者中分离出来的。在使用前，使用L-J方法鉴定了总共150株临床菌株，其包括134株广泛敏感性菌株和59株耐药性菌株。所有分离物在使用前在L-J培养基上进行新鲜地预培养。
通过Kent和Kubica描述的N-乙酰基-L-半胱氨酸-NaOH方法将痰样品消化并净化。处理过的样品在MGIT小瓶中培养42天。在测试当天，通过ZN染色检查所有阳性管中AFB的存在或不存在，并用平行管进行药物敏感性测试。
三个临床ESBL大肠杆菌菌株和一个非ESBL大肠杆菌ATCC菌株用于内酰胺酶底物分析。将大肠杆菌菌株在Mueller-Hinton肉汤(Difco Laboratories，Detroit,MI)的Mueller-Hinton琼脂(Difco)上生长、传代培养以及分析。
3.2.抗生素
所有药物均购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。根据供应商的建议，粉末在使用前被储存在干燥器中。将异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、链霉素(SM)和头孢吡肟溶解在去离子水(DW)中，将利福平(RIF)溶解于DMSO中。所有贮备溶液通过0.22μm孔的Millex-GS过滤器单元(Millipore，Bedford，MA)的膜过滤进行灭菌。将各种贮备抗生素溶液的少量等份试样储存在-80℃下。冷冻干燥的药物溶液在解冻后立即被使用，弃去其余物质，无需储存在冷冻箱中。从贮备溶液中新鲜地制备工作溶液，并连续稀释以达到所需浓度。
3.3.使用DAC系统的DST
通过ZN染色鉴定结核分枝杆菌，并从L-J斜坡或MGIT管生长并进行DST。为了从LJ培养准备接种，从生长培养中提取长达14天的菌落。菌落随玻璃珠振动以粉碎大块。为了获得高密度(～5×109CFU/ml)，将悬浮液以3000g离心10分钟，且颗粒被重新悬浮于无菌PBS中。随后，将悬浮液加入到液体琼脂糖中，接种在细菌-琼脂糖混合物中，其范围为101至5×108CFU/ml，并装入主通道。固化后，将含有每种抗生素的7H9肉汤施加到腔室中。用倒置光学显微镜(IS71,Olympus)对所有细菌的细胞进行成像。
3.4.L-J比例法和使用MGIT 960系统的DST
以LJ比例法作为参考。根据对L-J培养基进行的标准程序，以40μg/ml(RIF)、0.1μg/ml(INH)、2.0μg/ml(EMB)和1.0μg/ml(SM)的浓度测试所有菌株，不同之处在于它们以101至5×108CFU/ml的范围被接种。并且在使用MGIT 960系统的DST中，除了接种量外，根据供应商的建议测试所有菌株。
为了准备检测当天的接种物，通过ZN染色检查所有阳性管存在或不存在AFB。在阳性反应后0、3、10和15天，在MGIT 960和DAC系统中用平行管进行药物敏感性测试。
3.5.通过微量稀释法的DST
除了细菌浓度之外，根据标准CLSI指南确定头孢吡肟对大肠杆菌的MIC。在37℃培养16小时后，检查肉汤微量稀释孔。
3.6.β-内酰胺酶活性分析
使大肠杆菌的培养物生长至初始对数期(OD 600＝0.4)。此后，通过在3,000g离心10分钟从上清液中分离出细菌。将上清液通过0.45mm过滤器过滤，并储存培养滤液。用无菌PBS将颗粒洗涤两次，并在冰上通过60％的功率和30秒脉冲的超声处理6分钟以上且用冰来溶解。将粗裂解物在4℃和20,000g下离心30分钟，将颗粒重新悬浮于相同体积的PBS中。将对应于107CFU/ml细菌的每个级份接种在96孔板中用于分析。向每个孔中加入4.5μMFluorocillin Green(Invitrogen)，并将板在室温下轻轻摇动5分钟，并在37℃下培养0.5至20小时。在485nm的激发波长和530nm的发射波长下测量荧光的变化。
3.7.分析培养基中抗生素的有效残留浓度
在液体培养物中用每种抗生素处理两个高密度或低密度的细菌培养物。
在每个时间点，过滤培养基以除去细胞，然后加入到不同的DST组中以测量抗生素的残留功效。以与上述相同的方式进行肉汤微量分析和DAC协议。
3.8.对DAC系统中标准菌株H37Rv的非世代接种效应及LJ系统与MGIT系统的比较
为了证实DAC系统中不存在IE，在DAC系统上以各种接种浓度对标准菌株H37Rv进行DST。同时，以与DAC系统中相同的浓度在LJ和MGIT系统上进行DST。TB以10倍浓度(103至107)被使用。接种量表示DAC系统的琼脂糖中的TB的浓度、LJ系统的TB贮备溶液的浓度以及MGIT系统的培养瓶中的TB的最终浓度。四种原发性药物，利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素被用于DST。
在DAC系统中，在各种接种物浓度下，MIC值相同或差约2倍(参见表1)。
在MGIT系统中，所有菌株均被证实在≤105CFU/ml时是敏感的，但由于初始接种浓度过高，DST在106CFU/ml和107CFU/ml不可能进行测定。因此，这被认为是MGIT系统中的错误。在LJ系统(MKIT)中，发现所有菌株在≤106CFU/ml时是敏感的，但在107CFU/ml时变为耐药性的。
总之，只有DAC系统在103至107CFU/ml的接种量下显示相同的DST结果。
[表5]对标准菌株H37Rv的接种效应测试结果的比较
3.9.识别DAC系统中不存在对临床菌株的接种效应
标准菌株H37Rv显示对四种抗结核病药物的敏感性。临床菌株表达各种表型，特别是在药物敏感性中。为了证实DAC系统对各种药物敏感性菌株没有显示接种效应，从KIT获得的5种临床菌株以103至107CFU/ml的不同接种浓度进行测试，此浓度范围被证明在对标准菌株的测试中是有效的。使用利福平、异烟肼、链霉素和乙胺丁醇作为测试药物。临床菌株的实际CFU值如表6所示。对于131株菌株，最高浓度为1.3×109。
从103-107CFU/ml的五株临床菌株获得的DST结果显示在表6中。三株菌株KHS、CMS和CUD显示对三种原发性药物的敏感性。DST结果在103-107下相同或相差仅约两倍。因此，敏感性测定不受接种浓度变化的影响，且所有菌株均被发现是敏感的。1088和131株菌株对四种原发性药物均是耐药性的。无论接种浓度如何，所有MIC值均相同。总体而言，在DAC系统中没有发现对药物敏感性的接种效应。
[表6]DAC系统上对临床菌株的接种效应的结果
3.10.使用DAC系统的不需要调整接种量的准确DST
在LJ(Mkit)系统中准确的DST和MGIT(一种基于液体培养基的自动化DST)需要准确的接种量。因此，应该进行麻烦的程序来调节接种浓度。
从以前的结果看出，已经证明DAC系统中不需要调节接种量。在该实施例中，在该测试中省略了接种浓度的调节，并且在DAC系统中对制备的贮备溶液直接进行DST。因此，将接种量用于各种范围。如图10所示，通过7H11培养基中的菌落数目获得实际的接种浓度。接种浓度为105-108CFU/ml。将DAC系统中获得的DST结果与LJ(Mkit)系统中的结果进行比较，并计算其出错率。共测试117株菌株，共516例。
对所有药物敏感的PanS菌株没有观察到差异。在MDR的情况下，LJ系统中8例被证实是敏感性(主要错误(ME))且4例被证实是耐药性(非常主要的出错(VME))。总共516次测试，总出错率仅为6.2％。
[表7]使用LJ(Mkit)和DAC系统的DST结果和出错率的比较
PanS MDR XDR 总计
总样品 26 50 41 117
总测试 108 216 192 516
ME 0 8 15 23
VME 0 4 2 6
NG 4 16 28 48
出错率 0.0％ 6.0％ 10.4％ 6.2％
3.11.根据使用琼脂糖包裹细菌不存在接种效应
接种效应的两个主要原因如下。
第一个原因是大量接种量的衍生自细菌的抗生素降解蛋白可能会破坏抗生素并导致MIC值的增加。另一个原因是较大接种量的衍生自细菌的抗生素降解蛋白质相对于细菌的单细胞可以减少抗生素分子的数量并导致MIC的增加。为了验证DAC系统中不存在接种物效应的原因，ESBL阴性大肠杆菌(ATCC 35218)、ESBL阳性大肠杆菌(ATCC 25922)和临床获得的大肠杆菌菌株(它们是众所周知的分泌抗生素-降解蛋白的细菌菌株)，在5×107、5×106和5×105CFU/ml的接种浓度下进行测试。这些浓度表示在DAC系统的琼脂糖和MDT系统的液体中的细菌的浓度。
头孢吡肟是第四代头孢菌素抗生素，其被测试以证明接种效应的存在。ESBL阴性大肠杆菌和ESBL阳性大肠杆菌的MIC范围为0.015μg/ml至0.12μg/ml。
[表8]在各种接种浓度下来自DAC系统和MDT系统的AST结果的比较
在DAC系统中，在各种接种量中没有观察到接种效应。相比之下，在MDT系统中，ESBL+和#5菌株显示出随着接种量的增加而逐渐增加的MIC值。这些结果表明，与MDT系统不同，DAC系统中没有接种效应。
本发明人假设在DAC系统中不存在接种效应的原因可能是因为从细菌释放的蛋白被琼脂糖捕获，并且不同于肉汤培养条件下，其不能降解抗生素。为了证明这一假设的效果，其他测试使用ESBL阳性大肠杆菌菌株在接种物浓度为5×107、5×106和5×105CFU/ml下进行。这些浓度表示DAC系统的所有孔中的细菌浓度和MDT系统的液体中的。因此，DAC系统和MAC系统中细菌的最终浓度是相同的。头孢吡肟用于这些测试。培养过夜后，提取和过滤DAC和MDT系统的孔中的抗生素溶液以得到纯抗生素。使用抗生素进行使用ESBL阳性大肠杆菌菌株的MDT。结果如表9所示。
[表9]抗生素溶液培养过夜后使用DAC系统和MDT系统的AST结果的比较
在DAC系统中，在各种接种量中没有产生MIC值的差异，这表明降解率与接种量相似。相比之下，在MDT系统中，MIC值随着接种量的增加而增加，表明抗生素的降解增强。这些结果表明，DAC系统中抗生素的降解降低归因于细菌在琼脂糖中的捕获。
也就是说，本发明的DAC系统具有控制分子相互作用和细菌种群动态的能力，其是当细胞密度增加时药物与细菌的过度结合以及所得到的产物引起的。DAC系统的能力是因为细菌种群被固定在基质内，并且含有每种药物的培养基以梯度模式供应到腔室中。
该系统有助于DST，而不需要严格限制分枝杆菌上的接种，因为当接种量大于每毫升107个分枝杆菌的接种量时，观察不到IE。因此，DAC系统可以准确预测抗结核病药物的微生物功效，并有望有效地取代常用方法。
实施例4：DAC系统在抗生素筛选中的应用
本发明的DAC系统应用于抗生素筛选。
具体来说，测量由申请人的分包商开发的抗结核病药物Q203的MIC，以证实TDR临床菌株的敏感性。
通过在DAC系统上用3.9、7.8、15.6、31.2、62.5、125、250、500和1000ng/ml的Q203处理来自TDR 102患者的第一临床菌株来测定药物对该菌株的MIC。DAC系统中的图像如图11所示。对图像进行量化和绘制。结果如图12所示。
通过以与上述相同的方式用Q 2O3处理来自TDR 103患者的第二临床菌株来测定药物对该菌株的MIC。DAC系统中的图像如图13所示。对图像进行量化和绘制。结果如图14所示。
实施本发明的方式
现在将参考附图详细描述本发明的实施方案。提供这些实施方案使得本公开内容将是彻底和完整的，并且将向本领域技术人员充分地传达本发明的范围。因此，本发明可以以许多不同的形式实施，并且不应被解释为限于本文所阐述的示例性实施方案。在附图中，为了清楚起见，元件的尺寸例如宽度、长度和厚度可能被夸大。从观察者的观点来解释附图。应当理解，当元件被称为在另一元件“上”时，其可以直接在另一元件上，或者也可以存在一个或多个中间元件。本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可以进行许多修改和变化。在所有附图中，相同的附图标记用于表示基本相同的元件。
本发明的一个方面提供一种生物活性测试结构，其包括板体，布置在板体上的一个或多个培养单元100以及底板110，在底板110下面，将在每个培养单元的底面上形成固体薄膜。图2a和2b分别是根据本发明的测试结构的第一实施方案的透视图和平面图。
参考图2a和2b，每个培养单元可以具有形成在底板中的入口111，并且通过该入口111将含有胶凝剂和生物剂的液体培养基的混合溶液引入。每个培养单元100可以具有一个或多个连接构件113，底板110通过该连接构件113连接到板体的阻挡部以及形成在连接构件之间的切割凹槽114。每个培养单元可以具有形成在底板110中的一个或多个贯通孔112。生物活性剂可以通过切割凹槽114和贯通孔112均匀地扩散到固体薄膜中。
固体薄膜的厚度和宽度取决于容纳凹陷部120的深度和宽度。本文所用的术语“薄膜”是指具有足以固定生物剂并观察单细胞的厚度的薄层。例如，薄膜的厚度可以在1μm至5mm、1μm至3mm、1μm至2mm、1μm至1.5mm、1μm至1mm、1μm至800μm、1μm至500μm、1μm至100μm、10μm至3mm、10μm至1mm、100μm至1mm、200μm至1mm或500μm至1mm的范围内，但不特别限于这个范围。固体薄膜的厚度可以对应于待观察的固体薄膜表面的垂直方向的尺寸。在上述固体薄膜的厚度范围内，可以观察固定在固体薄膜中的生物剂的单细胞、可以有效地观察菌落的形成或可以对菌落形成单位计数。
每个培养单元的宽度(尺寸)不受限制，并且可以根据生物剂的种类和特性而变化。优选地，每个培养单元的尺寸为1-50mm×1-50mm、1-30mm×1-30mm、5-50mm×5-50mm、5-30mm×5-30mm、10-50mm×10-50mm、10-30mm×10-30mm或1-20mm×1-20mm。最优选地，培养单元的尺寸为12mm×12mm。
每个培养单元的高度也没有限制，并且可以根据生物剂和生物活性剂的种类和特性而变化。例如，每个培养单元可以具有1至50mm、1至30mm、5至30mm或5至15mm的高度。
贯通孔112的尺寸没有限制。贯通孔112的直径通常为1mm或以下，例如可以为0.99mm或以下、0.90mm或以下、0.85mm或以下、0.80mm或以下、0.75mm或以下、0.70mm或以下、0.65mm或以下、0.60mm或以下、0.55mm或以下、0.50mm或以下、0.45mm或以下、0.40mm或以下、0.35mm或以下、0.30mm或以下或0.25mm或以下。
在本发明的一个实施方案中，含有胶凝剂和生物剂的液体培养基的混合溶液可以在底板下被固化，以形成生物剂被固定的固体薄膜。
液体培养基可以含有约80％或更多的水或缓冲溶液。由于存在胶凝剂，液体培养基可以被固化。作为胶凝剂，可以列举琼脂、琼脂糖、明胶、藻酸盐、胶原蛋白或纤维蛋白。优选使用琼脂或琼脂糖。例如，琼脂可以以按重量计液体培养基中的0.5％～5％的量被使用。液体培养基通常不需要营养物。然而，在一些实施例中，液体培养基可以包括营养物。
合适的生物剂的示例包括病毒、细菌、真菌、藻类、原生动物、寄生病原体、人和哺乳动物细胞以及生物膜。生物剂可以在液体或固体培养基中生长，并且其生长可能受外部生理活性剂的种类和浓度的影响。
混合溶液中的生物剂的密度没有限制。特别地，本发明的特征在于生物剂的密度与DST或诊断结果无关。也就是说，本发明的DAC系统显示无接种效应。生物剂的密度可以在101至1080cfu/ml的范围内，例如1070cfu/ml或更低、1060cfu/ml或更低、1050cfu/ml或更低、1040cfu/ml或更低、1030cfu/ml或更低1020cfu/ml或更低、1010cfu/ml或更低、109cfu/ml或更低、108cfu/ml或更低、107cfu/ml或更低、106cfu/ml或更低、105cfu/ml或更低或104cfu/ml或更低。
混合溶液可以在底板下被固化，以形成生物剂被固定的固体薄膜。随着液体培养基的温度降低，培养基被固化，结果生物剂的移动减弱。因此，固定化有助于连续观察移动的生物剂。
图3a和3b分别是根据本发明的测试结构的第二实施方案的平面图和透视图。
参考图3a和3b，每个培养单元还可以具有形成在底板之上的容纳凹陷部120。
容纳凹陷部120的宽度不受限制，优选地为1～5mm，例如1～4.5mm、1～4.0mm或1～3.5mm。容纳凹陷部的高度优选地为1～3mm，例如为1～2.5mm。
可以将生物活性剂进一步引入培养单元。生物活性剂可能在生理上影响生物剂，其实例包括：药物诸如抗生素、抗癌剂和免疫抑制剂、营养物、细胞分泌物、信号转导剂、病毒、细胞、微RNA、蛋白、抗原、抗体和DNA。
可以将与液体培养基混合的生物活性剂引入每个培养单元中。可选择地，可以将生物活性剂引入容纳凹陷部120内。在这种情况下，生物活性剂可以是易于运输和储存的冷冻干燥形式。
板体、培养单元和底板可以部分或全部由透明或半透明材料制成。优选地，测试结构是透光衬底，其在光学成像方面是被期望的。测试结构没有特别限制，只要其具有适用于通过施加液体培养基形成薄膜的表面特性即可。
本发明的另一方面提供了一种生物活性测试方法，包括：将含有胶凝剂和生物剂的液体培养基的混合溶液提供到生物活性测试结构的底面；固化混合溶液以形成固体薄膜，生物剂被固定在固体薄膜中；向固体薄膜提供生物活性剂并允许生物活性剂扩散到固体薄膜中；以及观察生物剂的单细胞对生物活性剂的个体应答或观察生物剂是否形成菌落或菌落形成单位(CFU)。
该方法可以进一步包括将生物剂的单细胞对生物活性剂的个体应答、生物剂的菌落或菌落形成单位(CFU)进行成像，并分析图像。更优选地，该方法还包括基于图像的分析确定生物活性剂的最小抑菌浓度(MIC)。
可以使用光学测量系统进行观察。光学测量系统可以包括诸如CCD或CMOS相机的成像系统。光学测量系统可以包括聚焦和光成像所需的光学单元或设备，诸如透镜、照明器和光导。光学测量系统可以包括用于处理和分析由成像系统观察到的图像数据的图像处理系统。光学测量系统快速记录和分析在测试过程中观察到的生物剂生长的变化，以获得测试结果。
生物活性测试方法可用于各种应用，包括细菌的抗生素敏感性测试、抗生素筛选和细菌诊断。
本发明的另一方面提供了一种抗生素筛选方法，包括：向生物活性测试结构的底面提供含有胶凝剂和细菌菌株的液体培养基的混合溶液；固化混合溶液以形成固体薄膜，细菌菌株被固定在固体薄膜中；向固体薄膜提供抗生素并允许抗生素扩散到固体薄膜中；以及观察细菌菌株的单细胞对抗生素的个体应答或观察细菌菌株是否形成菌落或菌落形成单位(CFU)。
该方法还可以包括对单细胞的个体应答、菌落或菌落形成单位(CFU)进行成像，分析图像以及基于图像分析确定抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。
本发明的另一方面提供了一种细菌诊断方法，包括：将含有胶凝剂和细菌菌株的液体培养基的混合溶液提供到生物活性测试结构的底面；固化混合溶液以形成固体薄膜，细菌菌株被固定在固体薄膜中；向固体薄膜提供细菌菌株的培养基，允许培养基扩散到固体薄膜中；以及观察细菌菌株的单细胞的个体应答或观察细菌菌株是否形成菌落或菌落形成单位(CFU)。
细菌菌株的培养基可以进一步补充有抗生素，并且诊断方法可以与药物敏感性测试同时进行。
生物活性测试可能是药物敏感性、药物筛选或细菌培养诊断测试。
对细菌菌株的种类没有限制。最优选地，细菌菌株是结核分枝杆菌或非结核分枝杆菌(NTM)。结核分枝杆菌可能是多重耐药性(MDR)结核病、广泛耐药性(XDR)结核病或完全耐药性(TDR)结核病。
本发明的另一方面提供了一种生物活性测试系统，包括：生物活性测试结构，生物活性测试结构包括培养单元和底板，培养单元中被提供生物活性剂，在底板下面，使含有胶凝剂和生物剂的液体培养基的混合溶液固化以在每个培养单元的底面上形成薄膜；支撑并观察测试结构的台；以及测量系统，其用于当通过扩散来递送生物活性剂时对生物剂的单细胞的个体应答或生物剂的菌落形成进行成像，或对菌落形成单位(CFU)成像，分析图像并基于图像分析确定生物活性剂的最小抑菌浓度(MIC)。
测量系统可以包括成像系统和图像处理系统。成像系统可以是CCD或CMOS相机。图像处理系统适于处理和分析由成像系统观察到的图像数据。
附图标记说明
100：培养单元
120：容纳凹陷部
110：底板
111：入口
112：贯通孔
113：连接构件
114：切割凹槽

Claims (30)

1.一种生物活性测试结构，包括板体、布置在所述板体上的一个或多个培养单元以及底板，在所述底板下面，每个培养单元的底面上形成有固体薄膜。
2.如权利要求1所述的生物活性测试结构，其特征在于，所述生物活性测试是药物敏感性、药物筛选或细菌培养诊断测试。
3.如权利要求1所述的生物活性测试结构，其特征在于，每个所述培养单元还具有形成在所述底板之上的容纳凹陷部。
4.如权利要求1所述的生物活性测试结构，其特征在于，每个所述培养单元具有形成在所述底板中的入口，并且通过所述入口引入含有胶凝剂和生物剂的液体培养基的混合溶液。
5.如权利要求1所述的生物活性测试结构，其特征在于，每个所述培养单元具有一个或多个连接构件，所述底板通过所述连接构件与所述板体的阻挡部和形成在所述连接构件之间的切割凹槽连接。
6.如权利要求1所述的生物活性测试结构，其特征在于，每个所述培养单元具有在所述底板中形成的一个或多个贯通孔。
7.如权利要求1所述的生物活性测试结构，其特征在于，每个所述培养单元的尺寸为1-50mm×1-50mm且高度为1-50mm。
8.如权利要求3所述的生物活性测试结构，其特征在于，所述容纳凹陷部的宽度为1-5mm且高度为1-3mm。
9.如权利要求4所述的生物活性测试结构，其特征在于，将含有胶凝剂和生物剂的液体培养基的混合溶液在所述底板下固化以形成生物剂被固定的固体薄膜。
10.如权利要求1所述的生物活性测试结构，其特征在于，薄膜的厚度为1μm至10mm。
11.如权利要求4所述的生物活性测试结构，其特征在于，所述混合溶液中的所述生物剂的密度为101cfu/ml至1080cfu/ml。
12.如权利要求4所述的生物活性测试结构，其特征在于，所述胶凝剂选自由琼脂、琼脂糖、明胶、藻酸盐、胶原蛋白、纤维蛋白及其混合物组成的组。
13.如权利要求1所述的生物活性测试结构，其特征在于，将生物活性剂进一步引入所述培养单元中。
14.如权利要求13所述的生物活性测试结构，其特征在于，所述生物活性剂以冷冻干燥的形式引入所述容纳凹陷部中。
15.如权利要求1所述的生物活性测试结构，其特征在于，所述板体、所述培养单元和所述底板由透明或半透明材料制成。
16.一种生物活性测试方法，包括：将含有胶凝剂和生物剂的液体培养基的混合溶液提供到如权利要求1至15中任一项所述的生物活性测试结构的底面；固化所述混合溶液以形成固体薄膜，所述生物剂被固定在所述固体薄膜中；向所述固体薄膜提供生物活性剂并允许所述生物活性剂扩散到所述固体薄膜中；以及观察所述生物剂的单细胞对所述生物活性剂的个体应答或观察所述生物剂是否形成菌落或菌落形成单位(CFU)。
17.如权利要求16所述的生物活性测试方法，还包括将所述生物剂的所述单细胞对所述生物活性剂的个体应答、所述生物剂的所述菌落或所述菌落形成单位(CFU)进行成像，并分析所述图像。
18.如权利要求17所述的生物活性测试方法，还包括基于所述图像的分析来确定所述生物活性剂的最小抑菌浓度(MIC)。
19.一种用于细菌的抗生素敏感性测试的方法，包括：将含有胶凝剂和细菌菌株的液体培养基的混合溶液提供到如权利要求1至15中任一项所述的生物活性测试结构的底面；固化所述混合溶液以形成固体薄膜，所述细菌菌株被固定在所述固体薄膜中；向所述固体薄膜提供抗生素并允许所述抗生素扩散到所述固体薄膜中；以及观察所述细菌菌株的单细胞对所述抗生素的个体应答或观察所述细菌菌株是否形成菌落或菌落形成单位(CFU)。
20.如权利要求19所述的方法，还包括：对所述单细胞的个体应答、所述菌落或所述菌落形成单位(CFU)进行成像，分析图像以及基于所述图像分析确定所述抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。
21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述细菌菌株是结核分枝杆菌或非结核分枝杆菌(NTM)。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述结核分枝杆菌是多重耐药性(MDR)结核病、广泛耐药性(XDR)结核病或完全耐药性(TDR)结核病。
23.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法显示无接种效应。
24.一种抗生素筛选方法，包括：将含有胶凝剂和细菌菌株的液体培养基的混合溶液提供到如权利要求1至15中任一项所述的生物活性测试结构的底面；固化所述混合溶液以形成固体薄膜，所述细菌菌株被固定在所述固体薄膜中；向所述固体薄膜提供抗生素并允许所述抗生素扩散到所述固体薄膜中；以及观察所述细菌菌株的单细胞对所述抗生素的个体应答或观察所述细菌菌株是否形成菌落或菌落形成单位(CFU)。
25.如权利要求24所述的抗生素筛选方法，还包括对所述单细胞的个体应答、所述菌落或所述菌落形成单位(CFU)进行成像，分析图像以及基于所述图像分析确定所述抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。
26.一种细菌诊断方法，包括：将含有胶凝剂和细菌菌株的液体培养基的混合溶液提供到如权利要求1至15中任一项所述的生物活性测试结构的底面；固化所述混合溶液以形成固体薄膜，所述细菌菌株被固定在所述固体薄膜中；向所述固体薄膜提供所述细菌菌株的培养基并允许所述培养基扩散到所述固体薄膜中；并观察所述细菌菌株的单细胞的个体应答或观察所述细菌菌株是否形成菌落或菌落形成单位(CFU)。
27.如权利要求26所述的细菌诊断方法，其特征在于，所述细菌菌株的培养基进一步补充有抗生素。
28.如权利要求26所述的细菌诊断方法，其特征在于，所述诊断方法与药物敏感性测试同时进行。
29.一种生物活性测试系统，包括：如权利要求1至15中任一项所述的生物活性测试结构，所述生物活性测试结构包括培养单元和底板，所述培养单元中被提供生物活性剂，在所述底板下面，使含有胶凝剂和生物剂的液体培养基的混合溶液固化以在每个培养单元的底面上形成薄膜；支撑并观察测试结构的台；以及测量系统，所述测量系统用于当通过扩散来递送所述生物活性剂时对所述生物剂的单细胞的个体应答或所述生物剂的菌落形成进行成像，或对菌落形成单位(CFU)成像，分析图像并基于所述图像的分析确定所述生物活性剂的最小抑菌浓度(MIC)。
30.如权利要求29所述的生物活性测试系统，其特征在于，所述测量系统包括成像系统和图像处理系统。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018187548A2 (en) * 2017-04-05 2018-10-11 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Antimicrobial susceptibility testing with large-volume light scattering imaging and deep learning video microscopy
CN107130011A (zh) * 2017-05-09 2017-09-05 上海理工大学 一种食源性致病菌单细胞生长过程的显微观测方法
PL235845B1 (pl) * 2017-11-10 2020-11-02 Szkola Glowna Gospodarstwa Wiejskiego W Warszawie Sposób wielostronnej oceny biozgodności materiałów
JP7076203B2 (ja) 2017-12-13 2022-05-27 株式会社日立ハイテク 細菌検査用抗菌剤導入プレート、および透明プレート
CN116969604A (zh) * 2018-04-20 2023-10-31 先进创新者股份有限公司 处理废水和提供a类污泥的系统和方法
KR20200044450A (ko) * 2018-10-19 2020-04-29 주식회사 이지다이아텍 세포의 격리 및 형태학적 분석 방법
US11845976B2 (en) * 2019-08-27 2023-12-19 SeLux Diagnostics, Inc. Systems and methods for performing antimicrobial susceptibility testing
KR102132630B1 (ko) * 2020-03-16 2020-07-10 주식회사 퀀타매트릭스 섬 구조물을 포함하는 신속한 세포배양검사 장치
JP2023542769A (ja) * 2020-06-23 2023-10-12 スペクトラル プラットフォームズ， インコーポレイテッド 抗微生物剤感受性に関して細菌を検出、同定、および特徴付けするための、分光学的方法、試薬、およびシステム
CN117625394A (zh) * 2023-12-01 2024-03-01 广东香勤生物科技有限公司 一种荔枝菌菌种培养液、制备方法及培养方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1039432C (zh) * 1992-09-28 1998-08-05 贝克顿迪金森公司 细胞培养插管
US20040132218A1 (en) * 2003-01-08 2004-07-08 Ho Winston Z. Self-contained microfluidic biochip and apparatus
US20130196364A1 (en) * 2012-02-01 2013-08-01 QuantaMatrix Rapid antibiotic susceptibility testing system based on bacterial immobilization using gelling agent, antibiotic diffusion and tracking of single bacterial cells
US20140080206A1 (en) * 2011-03-04 2014-03-20 Centre National De La Recherche Scientifique Microfluidic system for controlling a concentration profile of molecules capable of stimulating a target

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6251624B1 (en) * 1999-03-12 2001-06-26 Akzo Nobel N.V. Apparatus and method for detecting, quantifying and characterizing microorganisms
KR20050088124A (ko) 2002-12-18 2005-09-01 코닌클리케 필립스 일렉트로닉스 엔.브이. 광 픽업장치
EP1479760A1 (de) * 2003-05-19 2004-11-24 ProBioGen AG Künstliches Immunorgan
EP1711590B1 (en) * 2004-01-08 2016-12-14 Dako Denmark A/S Apparatus and methods for processing biological samples and a reservoir therefore
KR100733914B1 (ko) * 2005-09-22 2007-07-02 한국과학기술원 미세유체 기술을 이용한 3차원 세포배양 시스템
JP4959710B2 (ja) 2005-11-01 2012-06-27 レンセレアー ポリテクニック インスティテュート 毒物学アッセイのための３次元細胞アレイチップおよびプラットフォーム
US8501462B2 (en) * 2007-02-27 2013-08-06 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Insert device for multiwell plate
CN103635587A (zh) * 2008-04-08 2014-03-12 麻省理工学院 三维微流平台和其使用方法
US9261496B2 (en) * 2010-09-29 2016-02-16 Massachusetts Institute Of Technology Device for high throughput investigations of multi-cellular interactions
US10526572B2 (en) * 2011-04-01 2020-01-07 EMD Millipore Corporaticn Cell culture and invasion assay method and system
JP5516482B2 (ja) 2011-04-11 2014-06-11 東京エレクトロン株式会社 基板搬送方法、基板搬送装置、及び塗布現像装置
KR101965737B1 (ko) 2011-10-19 2019-08-27 엘지전자 주식회사 공기조화기의 전동기 구동장치
KR20140053582A (ko) 2012-10-26 2014-05-08 단국대학교 산학협력단 절화의 선도유지 및 개화를 지연시키는 절화의 포장방법
CN105209595B (zh) * 2013-05-02 2017-03-08 昆塔麦特利斯株式会社 微流体多孔型细胞培养测试装置

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1039432C (zh) * 1992-09-28 1998-08-05 贝克顿迪金森公司 细胞培养插管
US20040132218A1 (en) * 2003-01-08 2004-07-08 Ho Winston Z. Self-contained microfluidic biochip and apparatus
US20140080206A1 (en) * 2011-03-04 2014-03-20 Centre National De La Recherche Scientifique Microfluidic system for controlling a concentration profile of molecules capable of stimulating a target
US20130196364A1 (en) * 2012-02-01 2013-08-01 QuantaMatrix Rapid antibiotic susceptibility testing system based on bacterial immobilization using gelling agent, antibiotic diffusion and tracking of single bacterial cells

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