PL235845B1 - Sposób wielostronnej oceny biozgodności materiałów - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wielostronnej oceny biozgodności materiałów metodą in vitro z elementami oceny toksyczności. Sposób ma zastosowanie do oceny wszystkich materiałów proszkowych, które mogą tworzyć w wodzie koloidy lub zawiesiny, a także do materiałów stałych, które po rozdrobnieniu mogą tworzyć koloidy lub zawiesiny. Metoda ma zastosowanie zwłaszcza do oceny nanomateriałów: nanocząstek, nanopłatków, nanorurek, nanodrutów i innych form nanomateriałów, które w co najmniej jednym wymiarze mają wielkość < 100 nm. Metoda może być jednak zastosowana do oceny biozgodności pozostałych materiałów, które tworzą w wodzie zawiesiny.

Biozgodność definiowana jest w różny sposób. Istnieje pięć zasadniczych definicji biozgodności, które jednak odnoszą się do jednej zasadniczej podobnej kwestii, a mianowicie braku szkodliwości materiału w stosunku do organizmu żywego. Część definicji odnosi się do materiałów używanych do budowy implantów, jednak postępująca nanotechnologia i inżynieria materiałowa wytwarza wiele innych form wprowadzanych do organizmu, które również nie mogą wykazywać cech materiału szkodliwego, a m.in. mikro- i nanocząstki używane są w systemach dostarczania leków, w kosmetykach, materiałach użytku codziennego człowieka, materiałach medycznych, używanych bezpośrednio na skórę czy też w komponentach żywności.

Bardzo zróżnicowana forma, struktura, budowa chemiczna biomateriałów niezwykle utrudnia ocenę ich toksyczności, biozgodności, a zwłaszcza powinowactwa biologicznego. Co więcej prowadzenie badań na zwierzętach jest skomplikowane, długotrwałe i często budzące etyczne wątpliwości. Stąd też prowadzi się badania wstępne metodą in vitro. Metody in vitro stosuje się w badaniach: mikro i nanocząstek, dużych materiałów (implanty) oraz powierzchni i warstw.

Obie metody badania (in vitro i in vivo) polegają na określeniu reakcji następującej w wyniku kontaktu biomateriału z komórkami lub tkankami, badanymi w laboratorium. Zwykle w badaniach takich określa się śmiertelność/przeżywalność komórek, integralność błony komórkowej, aktywność enzymów łańcucha transportu elektronów w mitochondriach, rodzaj śmierci komórek, aktywację czynników prozapalnych, degradację DNA oraz stan morfologiczny komórek, jak również wiele innych wskaźników odpowiedzi biologicznej.

Metodycznie, badania te polegają na wprowadzeniu zawiesiny lub koloidu mikro lub nanocząstek do płynu hodowlanego i inkubacji komórek w obecności badanego nanomateriału. Następnie ocenia się ww. cechy komórek. Badania prowadzi się w sposób opracowany dla związków chemicznych i nie uwzględnia on specyficznych fizyko-chemicznych cech nano i mikrocząstek, a także badania powierzchni. Co więcej, metoda ta przez różnych naukowców stosowana jest nieco inaczej, co utrudnia porównanie wyników badań. Brakuje metody, która miałaby uniwersalny i adekwatny dla badania nano i biomateriałów charakter. Fakt ten jest przyczyną istnienia wielu sprzecznych wyników badania tych samych biomateriałów, a zwłaszcza w postaci mikro czy nanostruktur.

Różnice metodyczne badania nanostruktur dotyczą m.in. sposobu wprowadzania mikro i nanocząstek do medium hodowlanego, a zwłaszcza: (i) zawieszania badanych cząstek (płyn hodowlany, woda, bezpośrednio do hodowli); (ii) czasu i sposobu zawieszania cząstek w medium lub wodzie (sonikacja, mieszanie, różny okres czasu); (iii) momentu wprowadzania cząstek do medium hodowlanego (przed wprowadzeniem lub po wprowadzeniu komórek).

W przypadku badania dużych materiałów problem jest jeszcze trudniejszy, ponieważ badanie dużych kawałków implantów metodą in vitro jest niezwykle utrudnione, z uwagi na konieczność hodowli komórek na powierzchni danego biomateriału. Z kolei rozdrobnienie dużego kawałka biomateriału i podawanie do medium hodowlanego pociąga za sobą również pewną rozbieżność metodyczną omówioną powyżej dla cząstek.

Kolejną wadą badania mikro i nanocząstek jest trudność w zastosowani u badania typu dawkozależności - „dose response” czyli określenie biozgodności i toksyczności w miarę zwiększania się koncentracji roztworu cząstek. Zwłaszcza dotyczy to przypadku, gdzie toksyczność występuje dopiero przy dużych koncentracjach. Trudność ta polega na fundamentalnej właściwości mikro i nanocząstek do aglomeracji. Powstałe aglomeraty nie wykazują już cech mikro i nanocząstek, ponadto koncentracja nanocząstek, które nie uległy aglomeracji zmniejsza się i nie jest możliwa do określenia.

Kolejnym problemem badania biozgodności tradycyjnymi metodami, czyli wprowadzania badanych cząstek do medium, jest zafałszowanie bio-interakcji komórek i cząstek. Zarówno komórki,

PL 235 845 B1 jak też mikro i nanocząstki, jak również ich aglomeraty, przemieszczają się w naczyniu hodowlanym. Komórki, dzięki zdolności do migracji, aktywnie przemieszczają się w sposób celowy, natomiast cząstki przemieszczają się wraz z ruchem płynu w naczyniu w sposób przypadkowy, jak również w sposób zależny od ich cech fizycznych, a zwłaszcza ładunku (oraz ładunku komórek), ich wielkości, kształtu czy ciężaru, co może zniekształcać ich biozgodność, ponieważ w warunkach ustroju in vivo komórki (znacząca większość) są zakotwiczone w tkance i nie mogą być „przyciągane” przez naładowane cząstki. Zatem komunikacja dwu badanych struktur - komórek i mikro i nanocząstek nie odzwierciedla w tradycyjnych, stosowanych do chwili obecnej, badaniach sytuacji panującej w organizmie.

Kluczowym mankamentem metod stosowanych do chwili obecnej jest jednak br ak możliwości szybkiej i prostej metody oceny powinowactwa biologicznego, inaczej skłonności do potencjalnego wiązania się komórki (zasiedlania) z badanym biomateriałem.

Celem wynalazku było opracowanie metody o uniwersalnym charakterze, rozwiązującej ww. problemy.

Sposób oceny biozgodności materiałów według wynalazku charakteryzuje się tym, że badany materiał w postaci cząstek zawiesza się w wodzie, przy stężeniu cząstek od 50 ppm (mg/l) do 10000 ppm (mg/l). Uzyskaną zawiesinę (koloid) w formie kropek o średnicy od 2,5 do 3 mm nanosi się na płytkę do hodowli in vitro tak, że pierwszy dołek płytki jest pozbawiony materiału, do drugiego dołka nanosi się od 6 do 12 kropek, do każdego kolejnego dołka nanosi się od 6 do 12 kropek więcej niż w dołku poprzednim, a ostatni dołek płytki jest w całości pokryty cienką warstwą materiału. Zawiesinę pozostawia się do wysuszenia. Następnie, do tak przygotowanych dołków w płytce wprowadza się pożywkę hodowlaną odpowiednią dla danych komórek, a następnie nanosi się biologicz ny materiał hodowlany zawierający badane komórki i prowadzi się hodowlę w znany sposób. Po zakończeniu hodowli określa się i ocenia liczbę komórek żywych w poszczególnych dołkach.

Korzystnie badany materiał ma formę mikrocząstek lub nanocząstek.

Stężenie cząstek materiału w wodzie może wahać się w zależności od wielkości i rodzaju cząstek. Stężenie powinno być jak największe, jednak powinno umożliwić pobranie 5 μl roztworu i naniesienie go w postaci kropli na powierzchnię naczynia do hodowli in vitro. Najczęściej zastosowanie ma stężenie od 100 ppm (mg/l) do 1000 ppm (mg/l), jednak można również zastosować stężenie od 50 ppm (mg/l) do 10000 ppm (mg/l).

Korzystnie stosuje się 6-dołkową standardową płytkę do hodowli in vitro. W przypadku takiej płytki do drugiego dołka korzystnie nanosi się 10 kropek, w każdym kolejnym dołku liczba kropek zwiększa się o dziewięć, zatem trzeci dołek zawiera 19 kropek, czwarty dołek - 28 kropek, piąty dołek - 37 kropek.

Liczbę komórek żywych w poszczególnych dołkach określa się z zastosowaniem licznika komórek lub innych testów dedykowanych do określania liczby komórek lub poprzez liczenie komórek pod mikroskopem.

Ocenę morfologii komórek żywych w poszczególnych dołkach korzystnie prowadzi się poprzez wizualizację z zastosowaniem mikroskopii świetlnej, fluorescencyjnej i elektronowej.

Porównując liczbę komórek w dołkach określa się toksyczność materiału, jego biozgodność i powinowactwo komórek do badanego materiału. Przyjmując liczbę komórek w dołku kontrolnym jako 1 i wyrażając liczbę komórek w kolejnych dołkach jako stosunek liczby komórek w dołku X do liczby komórek w dołku kontrolnym uzyskuje się wartości: X<1; X>1; X= 1. Wartości X<1 oznaczają toksyczność i brak biozgodności (-), wartości X>1 oznaczają brak toksyczności, biozgod ność i biopowinowactwo (+), natomiast wartość X=1 oznaczają brak toksyczności, biozgodność i neutralność (0) badanego materiału, co oznacza się jako odpowiednio; „-„ lub „+” lub „0”. Dodatkowo, porównując wartości dla poszczególnych dołków można określić tzw. „dawkozależność” materiału. Jeśli liczba komórek zwiększa się w dołkach proporcjonalnie oznacza to, że powierzchnia materiału silnie i jednoznacznie stymuluje komórki do namnażania się i charakteryzuje się dużym powinowactwem biologicznym. Jeśli liczba komórek zmniejsza się proporcjonalnie wskazuje to, że materiał jest toksyczny dla komórek. Można również określić, przy którym dołku pozytywny lub negatywny wpływ ulega nasileniu lub zahamowaniu, a to pozwala wskazać progowe wartości biozgodności.

Z kolei wizualizacja hodowli komórek w poszczególnych dołkach pozwala na określenie liczby komórek na powierzchni kropek i poza nimi, z uwzględnieniem strefy zahamowania wzrostu komórek. Umożliwia to kompleksową ocenę morfologii komórek na powierzchni kropek i poza nią, ocenę

PL 235 845 B1 stanu metabolizmu, stresu i odpowiedzi biologicznej komórek na zetknięcie się z powierzchnią biomateriału, a zwłaszcza na granicy biomateriał - dno płytki hodowlanej.

Sposób według wynalazku korzystnie można realizować z wykorzystaniem wzorca rozmieszczenia kropek, który umieszcza się pod przezroczystą płytką hodowlaną. Wzorzec kropek odwzorowuje rozmieszczenie dołków i kropek na płytce hodowlanej.

Sposób według wynalazku, z zastosowaniem kropek materiału, pozwala nie tylko na szybkie, jakościowe oznaczenie biozgodności, ale również na precyzyjną, szybką i wielostronną ocenę biozgodności biomateriałów, a przede wszystkim ich powinowactwa biologicznego. Metoda pozwala na ocenę aktywności komórki i jej „chęci” do zasiedlenia badanego materiału z wykluczeniem przypadkowości wynikającej z fluktuacji cząstek w medium hodowlanym i migracji cząstek. Biomateriał jest unieruchomiony w postaci naniesionej kropki, natomiast komórka może preferencyjnie przemieszczać się w kierunku „do” lub „od” biomateriału oraz ulegać preferencyjnej adhezji do dna naczynia hodowlanego lub do struktury biomateriału.

Sposób według wynalazku pozwala w szczególności na:

- określenie stopnia zasiedlenia kropek przez komórki, wraz z określeniem dynamiki tego procesu, poprzez wizualizację komórek żywych, np. z zastosowaniem mikroskopu odwróconego lub wizualizację utrwalonego preparatu komórek. Stopień zasiedlania, tożsamy do powinowactwa komórek do biomateriału, może wskazywać na toksyczność, neutralność i powinowactwo. Stopień zasiedlenia można określić poprzez oznaczenie liczby żywych komórek zasiedlających kropki, w stosunku do ogólnej liczby komórek w naczyniu;

- określenie biologii powinowactwa komórek do powierzchni biomateriału poprzez porównanie morfologii i struktury komórek na kropkach biomateriału i poza nimi, a także na ich granicy;

- określenie stopnia toksyczności i biozgodności w zależności od liczby komórek w różnych dołkach;

- określenie toksyczności i biozgodności, z uwzględnieniem „dawkozależności powierzchni”, poprzez określenie wielkości proliferacji komórek w zależności od powierzchni biomateriału (suma powierzchni kropek);

- określenie strefy hamowania biomateriału, czyli dla biomateriałów wykazujących negatywne powinowactwo i brak biozgodności można określić stopień niezgodności, wskazujący na toksyczność. Wykorzystując zróżnicowane odległości pomiędzy kropkami w poszczególnych dołkach płytki można określić strefę hamowania w zależności od obecności komórek pomiędzy kropkami, które w poszczególnych dołkach są w odległości proporcjonalnie zmniejszającej się, a więc, przykładowo dla płytki 6-dołkowej: dołek 1 (brak kropek) < dołek 2 < dołek 3 < dołek 4 < dołek 5 < dołek 6 (całkowite pokrycie). A zatem strefa hamowania na poziomie dołka 2 świadczy o największej toksyczności (braku biozgodności), a dołka 5 najmniejszej toksyczności;

Sposób według wynalazku pozwala na uzyskanie znacznej powtarzalności wyników z uwagi na powtarzalność wzoru i nieograniczoną możliwość powtórzenia badania w identyczny sposób. Sposób według wynalazku ma ponadto następujące zalety:

- możliwość określenia tzw „dose response” czyli dawkozależności dla biomateriałów;

- możliwość precyzyjnego określenia powinowactwa komórek do biomateriału, z wykluczeniem przypadkowości wynikającej z fluktuacji cząstek materiału w medium hodowlanym, a badanie jedynie aktywności komórek, wynikającej z ich celowej migracji i zasiedlania kropek badanego biomateriału.

- możliwość obserwacji zachowania komórek w strefie kropek oraz pomiędzy nimi w okresie czasu ograniczonym jedynie liczbą możliwych pasaży komórek oraz toksycznością biomateriału;

- możliwość zgromadzenia do badań i porównania morfologii, metabolizmu, ekspresji białek, mRNA i wszelkiego rodzaju czynników możliwych do oznaczenia w komórkach z podziałem na komórki zasiedlające kropki, które uległy adhezji w miejscu kropek (czyli do biomateriału) i komórki, które są poza kropką (czyli uległy adhezji do dna naczynia hodowlanego).

Materiały badane mogą być pochodzenia organicznego i nieorganicznego, jednak nie mogą występować w postaci jonów, tylko cząstek. Metoda zwłaszcza ma zastosowanie do oceny biozgodności nanocząstek i mikrocząstek: metali, np. takich jak Ag, Au, Pt, Pd, Cu, Fe, tlenków metali, np. takich jak ZnO, Mn2O3, TiO2, CaO, SiO2, Fe2O3, niemetali, np. takich jak alotropowe odmiany węgla

PL 235 845 B1 (m.in. diament, grafit, grafen, nanorurki, fulereny), nierozpuszczalnych soli nieorganicznych, np. CaCOs, Ca3(PO4)2. Wyżej wymienione materiały zostały wskazane jako przykład, ponieważ sposobem według wynalazku można badać każdy materiał tworzący (w wodzie) zawiesinę lub koloid. Korzystnie badany materiał ma w co najmniej jednym wymiarze wielkość < 100 nm.

Komórki używane do oceny biozgodności muszą być komórkami adherentnymi (przylegającymi do podłoża). Komórki mogą pochodzić z dowolnego źródła (linie komercyjne, hodowla pierwotna, komórki pozyskane od ludzi i zwierząt), dowolnego dawcy (ludzkie, zwierzęce) i dowolnej tkanki zwierzęcej lub ludzkiej. Komórki hodowane są zgodnie z procedurami ich hodowli.

Na rysunku przedstawiono:

Fig. 1 - przykładowy wzorzec rozmieszczenia kropek na płytce 6-dołkowej,

Fig. 2 - ocena biozgodności i powinowactwa tlenku grafenu wobec komórek mezenchymalnych pobranych z zarodka kury - zdjęcia z Transmisyjnego Mikroskopu Elektronowego,

Fig. 3 - ocena biozgodności i powinowactwa fibroblastów oraz komórek nowotworowych wątroby do skafoldów (kropek) wybranych form alotropowych węgla,

Fig. 4 - ocena biozgodności i powinowactwa komórek mezenchymalnych do skafoldów (kropek) sporządzonych z ZnO, Mn2Os, tlenku grafenu (GO), Ag i Au.

Wzorzec kropek przedstawiony w przykładzie wykonania na Fig. 1 rysunku został wykonany z papieru i pokryty folią, umożliwiającą jego dezynfekcję 70% etanolem. Wzorzec podkładany jest pod płytkę, tak że pozwala na szybkie i precyzyjne nakroplenie materiału do dołków płytki do hodowli in vitro. Przykładowy wzorzec ma wymiary standardowej płytki 6-dołkowej do hodowli komórek in vitro: 127.8 x 85.5 x 20.0 mm; obszar wzrostu na dołek 940,3 mm²; średnica dołka 34,6 mm, promień pojedynczej kropki - 1,5 mm. Wzorzec ma odwzorowane okręgów dołków, a w nich ma wzorzec kropek w postaci okręgów, rozmieszczonych w odległościach zmniejszających się odpowiednio dla poszczególnych dołków od 1 do 6;

Sposób według wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach.

Badania przeprowadzono w ramach projektu Narodowego Centrum Nauki nr 2016/21/B/NZ9/01029. P r z y k ł a d 1

Ocena biozgodności tlenku grafenu wobec komórek mezenchymalnych, pobranych z różnych narządów i ich zawiązków z zarodka kury (w 6 dniu rozwoju zarodkowego).

Przygotowanie kropek.

Tlenek grafenu (GO), zakupiony w US Research Nanomaterials, Inc., Houston, USA w postaci zawiesiny 2% GO. GO o czystości >99,3% był w postaci płatków o średnicy powierzchni od 1,5 do 5,5 μm i grubości płatków 0,43 do 1,23 nm. Zawartość tlenu wynosiła 30,92%. Zakupioną zawiesinę GO rozpuszczano w superczystej wodzie mili-Q do uzyskania roztworu o koncentracji 1000 ppm (1 mg/L), następnie mieszano go i przygotowywano skafoldy w postaci kropek o wielkości średnicy 3 mm w naczyniu do hodowli in vitro 6-dołkowym, zakupionym w firmie Eppendorf. Czynność tę wykonywano w warunkach sterylnych pod komorą laminarną. Wzorzec do nanoszenia kropek umieszczono w komorze laminarnej pod płytką 6-dołkową, dopasowując obrys dołków do dołków płytki. Do nanoszenia kropek używano pipety 1-10 μL i odpowiednich tipsów (żółtych), delikatnie nakraplano po kropli GO (5 μL) według schematu kropek, umieszczonego pod płytką. Następnie pozostawiano płytkę pod komorą laminarną z otwartą pokrywką do wyschnięcia przez około 3 godziny. Tak przygotowane płytki, na których po wyschnięciu pozostała sucha masa materiału tworzącego trwały skafold w postaci kropki, użyto do hodowli komórek.

Pobieranie i hodowla materiału biologicznego.

Zapłodnione jaja kur mięsnych Ross 308 zdezynfekowano i inkubowano w standardowych warunkach w inkubatorze. W 6 dniu rozwoju zarodkowego jaja wyjęto z inkubatora, dezynfekowano za pomocą KMNO4 i pod komorą laminarną otworzono skorupkę i delikatnie zarodki wyjęto na sterylną płytkę. Skrawki tkanek pobierano sterylną pensetą i skalpelem. Pobrane skrawki mózgu, oka, naczyń, serca, pączka kończyny tylnej. Skrawki umieszczono w sterylnych probówkach z zawartością 0,3 ml trypsyny. Probówki pozostawiono w temperaturze 4°C przez 24 godziny. Po tym czasie do każdej probówki dodano 0,3 ml pożywki DMEM, delikatnie tkankę rozdrobniono przepuszczając ją przez tips, a następnie zawiesinę komórek umieszczono w dołku płytki sześcio-dołkowej z umieszczonymi uprzednio kropkami, dodając 3 ml pożywki DMEM do każdego dołka.

PL 235 845 Β1

Komórki inkubowano przez 24 godziny, a następnie zmieniono płyn hodowlany i ponownie inkubowano komórki w inkubatorze w standardowych warunkach. Komórki inkubowano w pożywce DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle's Medium), wzbogaconą przez dodatek 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz mieszankę antybiotyków (penicylina 100 U/mL oraz streptomycyna 100 mg/mL). Wszystkie wymienione odczynniki pochodziły z Gibco™ (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Hodowlę prowadzono w warunkach standardowych (37°C, dodatek 5% CO2 do atmosfery) w inkubatorze do hodowli in vitro (NuAir; Minessota, USA). Do badań liczby komórek prowadzonych z zastosowaniem licznika komórek oraz testu Presto blue komórki kolekcjonowano w standardowy sposób. Komórki odklejano przez dodanie trypsyny (300 μΙ) do dołków pozbawionych pożywki, następnie umieszczano w inkubatorze na 5-10 minut, zobojętniano trypsynę dodając DMSO i umieszczano zawiesinę komórek w probówce do kolejnych badań z zastosowaniem czytnika komórek i metody Presto Blue. Określano liczbę komórek żywych oraz martwych zgodnie z procedurami określonymi w instrukcji producenta https://www.thermofisher.com/pl/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/elisa-protocol/elisa-sample-preparation-protocols/96-well-sample-preparation-for-adherent-cell).

Analiza wyników badań

Doświadczenie zakończono po 1 i po 2 tygodniach inkubacji. Badano morfologię oraz topografię rozłożenia komórek na płytce z zastosowaniem mikroskopu odwróconego Leica DMi8, a także z zastosowaniem Elektronowego Mikroskopu Skaningowego, po uprzednim przygotowaniu preparatów. Wyniki przedstawiono na Fig. 2. Na Fig. 2 zdjęcie z lewej strony widać zarys kropki (strzałka) pokryty komórkami, co wskazuje na wysokie powinowactwo i biozgodność. Na Fig. 2 zdjęcie środkowe widać granicę pomiędzy polem kropki a powierzchnią płytki (kreska). Można zauważyć, że komórki wybierają powierzchnię kropki. Na Fig. 2 zdjęcie po prawej stronie widać liczne komórki zasiedlające gęsto powierzchnię kropki.

Badano również toksyczność i proliferację komórek z zastosowaniem licznika komórek oraz testu Presto Blue, wykonanym na spektrofotometrze Tecan Infinite M200. Wyniki zestawiono w Tabeli 1.

W doświadczeniu stwierdzono, że największe powinowactwo do GO mają komórki mezenchymalne, pobrane z pączka kończyny tylnej zarodka kury (MSC-M). Komórki te preferencyjnie lokowały się na kropkach grafenowych, zasiedlając całą powierzchnię kropek i pozostawiając pole pomiędzy kropkami prawie czyste. Świadczy to o silnym powinowactwie progenitorowych komórek mięśniowych do GO. Komórki w sposób absolutnie zależny tylko od ich preferencji i aktywności migracji lokowały się na kropkach GO. Co więcej, wyniki uzyskane z określenia liczby komórek pozyskanych z poszczególnych dołków, na których kropki umieszczone były w sposób proporcjonalnie zwiększający całkowitą pokrytą powierzchnię dołka (czyli wg schematu wzorca od 1 do 6) potwierdziły obserwowaną zależność. Liczba komórek wysianych na skafoldy GO wzrastała proporcjonalnie do zwiększającej się powierzchni kropek.

Obserwacja morfologii i ułożenia pozostałych komórek w stosunku do kropek wykazała brak preferencji migracji i zasiedlania kropek i ich okolic. Nie stwierdzono również strefy zahamowania migracji, ani innego rodzaju przegrupowania się komórek w stosunku do kropek. Co więcej, liczba pozostałych komórek mezenchymalnych (pobranych z mózgu, oka, serca i naczyń) nie uległa zwiększeniu w badaniach pomiaru ich liczby (czytnik komórek i test Presto Blue.

Podsumowanie.

1. Skafold sporządzony z tlenku grafenu nie jest toksyczny i jest biozgodny dla komórek mezenchymalnych, pobranych z serca, oka, naczyń, mózgu i zawiązka kończyny tylnej zarodka kury.

2. Komórki mezenchymalne, progenitorowe mięśni zarodka kury wykazują silną migrację i znaczące powinowactwo do tlenku grafenu, a także preferencyjnie zasiedlają skafoldy GO.

3. Ocena topografii komórek wobec kropek GO pozwala stwierdzić, że silny mechanizm indukujący migrację komórek progenitorowych mięśni do GO, a następnie zasiedlanie GO jest potwierdzony poprzez zwiększenie liczby komórek określonych z zastosowaniem tradycyjnych metod.

Przykład 2

Określenie biozgodności i powinowactwa komórek fibroblastów oraz nowotworów wątroby do skafoldów wybranych form alotropowych węgla.

PL 235 845 B1

Materiały i metody:

Skafoldy węglowe przygotowano na 6-dołkowych płytkach przez nakroplenie 5 μΙ 0.1% nanocząstek/skafold (uzyskano kropki o wielkości średnicy 3 mm) oraz n a 96-dołkowych płytkach przez nakroplenie 20 μl 0.1% nanocząstek/dołek, a następnie wysuszono. W doświadczeniu wykorzystano nanocząstki diamentu (ND), f ullerenów (F60), nanorurek (NT), nanorurek z grupami OH (NTOH), nanorurek z grupami COOH (NTCOOH), tlenku grafenu (GO) oraz grafenu naturalnego (pristine) (pG). Linie ludzkich fibroblastów HS-5 (ATCC, CRL-11882) oraz ludzkich komórek nowotworów wątroby HepG2 (ATCC HB-8065) i C3A (ATCC CRL-10741) uzyskane z American Type Culture Collection (ATCC) hodowano w 37°C i 5% CO2 na podłożu Dulbecco's Modified Eagle z niską glukozą (DMEM, Gibco, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). DMEM wzbogacono 10% bydlęcą surowicą płodową (Life Technologies, Houston, TX, USA), penicyliną (100 U/mL) i streptomycyną (100 mg/mL) (Life Technologies). Komórki o konfluencji 80% zostały przesiane (pasaż 1/3 dla C3A i HepG2; pasaż 1/5 dla HS-5) na 6-dołkową płytkę zawierającą skafoldy węglowe. Po 1 dniu hodowli wykonano zdjęcia przyżyciowe, a po 3 dniach komórki wybarwiono metodą May-Grunwalda (Sigma-Aldrich). Gęstość, aglomerację, morfologię oraz powinowactwo komórek do skafoldu oceniono za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego (Leica, TL-LED, Germany) podłączonego do aparatu cyfrowego (Leica MC190 HD), korzystając z oprogramowania LAS V4.10 (Leica). Średnią żywotność komórek HS-5, HepG2 i C3A na skafoldach węglowych oznaczono z użyciem testów metabolicznych, tj. PrestoBlue (Life Technologies, USA) i XTT (Roche Protocol, Germany).

Wyniki:

W badaniach obserwowano zróżnicowaną migrację i zasiedlanie skafoldów węglowych przez komórki (Fig. 3).

Wzorzec kropek umożliwił określenie topografii migracji komórek wobec kropek, obserwowano zarówno rozmieszczenie komórek w strefie pomiędzy skafoldami, jak też na powierzchni skafoldów. Zwłaszcza analizowano ułożenie komórek na granicy skafoldu. Wizualizacja skafoldów pozwoliła na stwierdzenie braku powinowactwa, w nawet toksyczne działanie nanorurek węglowych, a zwłaszcza NT niefunkcjonalizowanych i funkcjonalizowanych grupami OH. Wykazano migrację i zasiedlanie skafoldów diamentu, GO i fulerenów przez komórki, jednak różny dla komórek nowotworowych i fibroblastów. Co więcej, behawior komórek na powierzchni skafoldów również wykazywał znaczące różnice. Obserwacje mikroskopowe zostały potwierdzone badaniem liczby żywych komórek zasiedlających poszczególne dołki, analizowanych tradycyjnymi metodami (Tabela 2) Wyniki badań podsumowano w następujący sposób.

1. Skafoldy węglowe nie są toksyczne i są biozgodne wobec badanych komórek.

2. Skafoldy nano-diamentu, fulerenów i tlenku grafenu, bardziej stymulują proliferację fibroblastów niż komórek nowotworowych

3. Najgorszą niszą dla komórek nowotworowych były NT, które zmniejszały ich proliferację. NT nie hamowały proliferacji fibroblastów.

4. Komórki HepG, C3A i HS-5 miały najwyższe powinowactwo do ND skafoldu.

5. HepG2 i C3A tworzyły mniejsze agregaty na powierzchni GO, tj. nisza zapewniała dobre warunki wzrostu. Odwrotny wynik uzyskano na ND gdzie większe aglomeraty obserwowano na skafoldzie niż poza nim.

6. Komórki HepG2 na skafoldzie F60 różniły się między sobą kształtami, obserwowano komórki lekko skurczone z dobrze widocznymi filopodiami oraz silną adhezję na granicy skafoldu zarówno komórek HepG2 jak i C3A.

7. Komórki C3A miały największe powinowactwo do skafoldu ND i GO. Nie obserwowano różnicy w ich morfologii, miały tendencje do tworzenia aglomeratów.

8. Komórki HS-5 wykazywały wyższe powinowactwo do ND niż F60 oraz GO. Na F60 i GO oraz poza skafoldem gęstość komórek była zbliżona.

P r z y k ł a d 3

Ocena biozgodności skafoldów nanocząstek tlenku cynku, nanocząstek tlenku manganu, tlenku grafenu oraz nanocząstek Ag wobec komórek zarodkowych mezenchymalnych.

Przygotowanie kropek

Proszki: nanocząstek tlenku cynku, nanocząstek tlenku manganu, tlenku grafenu, nanocząstek Ag (Sky-Spring Nanomaterials, USA) rozpuszczano w superczystej wodzie mili-Q do uzyskania roztworu o koncentracji 1000 ppm (1 mg/L), następnie mieszano go i przygotowywano skafoldy w postaci

PL 235 845 B1 kropek w naczyniu do hodowli in vitro 6-dołkowym, zakupionym w firmie Eppendorf. Czynność tę wykonywano w warunkach sterylnych pod komorą laminarną. Wzorzec do nanoszenia kropek umieszczono w komorze laminarnej pod płytką 6-dołkową, dopasowując obrys dołków do dołków płytki. Do nanoszenia kropek używano pipety 1-10 μL i odpowiednich tipsów (żółtych), delikatnie nakraplano po kropli GO (5 μL) wg schematu kropek, umieszczonego pod płytką. Uzyskane kropki (skafoldy) miały średnicę 3 mm. Następnie pozostawiano płytkę pod komorą laminarną z otwartą pokrywką do wyschnięcia ok. 3 godziny. Tak przygotowane płytki użyto do hodowli komórek.

Pobieranie i hodowla materiału biologicznego

Komórki pobierano z mięśnia kończyny zarodka wg metody opisanej w przykładzie 1.

Komórki hodowano metodą in vitro opisaną w przykładzie 1.

Analiza wyników badań.

Doświadczenie zakończono po 1 i po 2 tygodniach inkubacji. Badano morfologię oraz topografię rozłożenia komórek na płytce z zastosowaniem mikroskopu odwróconego Leica DMi8 (Fig. 4), po uprzednim przygotowaniu preparatów. Linia oznacza granicę kropki. Badano również toksyczność i proliferację komórek z zastosowaniem licznika komórek. Wyniki potwierdziły obserwacje morfologii komórek, wykazano, że kropki nano-tlenku cynku we wszystkich dołkach były przyczyną śmierci wszystkich komórek, natomiast nie obserwowano ani toksyczności ani bio-powinowactwa tlenku manganu, komórki wykazywały bardzo duże powinowactwo do tlenku grafenu (GO), komórki nie zasiedlały skafoldu z Ag, jakkolwiek żywe komórki były obecne wokół skafoldu.

Podsumowanie

W doświadczeniu stwierdzono, że:

1. Skafold z nanocząstek tlenku cynku jest wysoce toksyczny dla komórek mezenchymalnych, a skafoldy z nanocząstek tlenku cynku nie sprzyjają ich zasiedlaniu, a nawet są przyczyną śmierci komórek zlokalizowanych pomiędzy skafoldami.

2. Nanocząstki tlenku manganu w postaci skafoldu nie są toksyczne dla komórek mezenchymalnych, jednak nie obserwowano priorytetowego zasiedlania skafoldów z tlenku manganu przez wymienione komórki.

3. Tlenek grafenu (GO) jest wysoce biozgodny, a komórki preferencyjnie zasiedlają skafold z GO.

4. Skafold z nanocząstek AG nie jest zasiedlany przez komórki (jest toksyczny), jednak nie działa negatywnie na komórki zlokalizowane poza skafoldem.

Claims (6)

1. Sposób oceny biozgodności materiałów, w którym tworzy się zawiesinę w wodzie niejonowych cząstek badanego materiału o wielkości mniejszej niż 100 nm, a następnie prowadzi się hodowlę komórek w obecności tego materiału, znamienny tym, że:

- zawiesinę cząstek badanego materiału o stężeniu od 50 ppm do 10000 ppm nanosi się w formie kropek o średnicy od 2,5 do 3 mm na płytkę do hodowli in vitro tak, że pierwszy dołek płytki jest pozbawiony materiału, do drugiego dołka nanosi się od 6 do 12 kropek, do każdego kolejnego dołka nanosi się od 6 do 12 kropek więcej niż w dołku poprzednim, a ostatni dołek płytki jest w całości pokryty cienką warstwą materiału, po czym

- zawiesinę pozostawia się do wysuszenia, a następnie

- do tak przygotowanych dołków w płytce wprowadza się pożywkę hodowlaną odpowiednią dla danych komórek, po czym

- nanosi się biologiczny materiał hodowlany zawierający badane komórki i prowadzi się hodowlę w znany sposób, zaś

- po zakończeniu hodowli określa się liczbę komórek żywych w poszczególnych dołkach i porównuje się liczbę komórek w dołkach, przy czym:

zwiększanie liczby komórek w dołkach oznacza powinowactwo biologiczne badanego materiału a zmniejszanie liczby komórek w dołkach oznacza toksyczność badanego materiału dla komórek.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że badany materiał ma formę mikrocząstek lub nanocząstek.

PL 235 845 B1

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stężenie cząstek badanego materiału w wodzie wynosi od 100 ppm (mg/l) do 1000 ppm (mg/l).

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się 6-dołkową standardową płytkę do hodowli in vitro.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że do drugiego dołka nanosi się 10 kropek, a w każdym kolejnym dołku liczba kropek zwiększa się o dziewięć.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po zakończeniu hodowli porównuje się liczbę komórek w dołkach, przyjmując liczbę komórek w dołku kontrolnym jako 1 i wyrażając liczbę komórek w kolejnych dołkach jako stosunek (X) liczby komórek w danym dołku do liczby komórek w dołku kontrolnym, przy czym wartości X<1 oznaczają toksyczność i brak biozgodności (-), wartości X>1 oznaczają brak toksyczności, biozgodność i biopowinowactwo (+), natomiast wartość X=1 oznacza brak toksyczności, biozgodność i neutralność (0) badanego materiału.