BR112012006558B1 - composição para magnetizar células, composição compreendendo células magnetizadas e método para mover células - Google Patents

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Abstract

MATERIAIS PARA MAGNETIZAÇÃO DE CÉLULAS E MANIPULAÇÃO MAGNÉTICA Trata-se de um material que compreende nanopartículas negativamente carregadas, em que uma dentre as ditas nanopartículas contém um elemento magneticamente responsivo, que são combinadas com uma molécula de suporte, que é uma molécula ou polímero longo natural ou sintético para produzir uma montagem de nanopartícula magnética. Quando a montagem de nanopartícula magnética é combinada com células, isso irá magnetizar essas células. As células magnetizadas podem, então, ser lavadas para remover a montagem de nanopartícula magnética e as células magnetizadas manipuladas em um campo magnético.

Description

COMPOSIÇÃO PARA MAGNETIZAR CÉLULAS, COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO CÉLULAS MAGNETIZADAS E MÉTODO PARA MOVER CÉLULAS REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica a prioridade para o pedido provisório sob o número US61/245846, que foi depositado em 25 de setembro de 2009 e é incorporado por referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A invenção refere-se aos campos de nanotecnologia, materiais, biossíntese, medicina, biologia celular e engenharia de tecido. Mais particularmente, as composições e métodos da presente revelação se referem a métodos de magnetização de células e cultura de célula em 3D, manipulação de célula e padronização de célula com o uso de campos magnéticos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0003] A manipulação de células, o controle de seu ambiente e a promoção de condições que imitam ou proíbem respostas teciduais ou celulares in vivo ou naturais é uma área de pesquisa intensa. Na área de células-tronco e medicina regenerativa, há uma necessidade particular por métodos e materiais que replicam as condições nativas em que as células crescem in vivo. As condições que as células experimentam quando removidas de seu ambiente nativo promovem homeostase, onde as células se alteram para se adaptarem a seu novo ambiente, induzindo assim as alterações celulares. Muitos desses processos não são elásticos ou reversíveis, portanto, as células não podem retornar para seu estado nativo. Há uma forte necessidade por materiais e métodos que promovam ambientes celulares naturais e minimizem ou controlem alterações celulares adversas antes de a engenharia celular e tecidual poder alcançar todo seu potencial.
[0004] Atualmente, estão sendo desenvolvidos materiais que podem suportar condições de cultura de célula tridimensionais (3D). A maior parte das técnicas de cultura de célula em 3D célula envolve a rotação dos frascos, o uso de um arcabouço exterior ao qual as células podem aderir, o uso de campos magnéticos para suspender células ou alguma combinação dessas abordagens.
[0005] Por exemplo, Felder em US2005054101, WO2005010162 descreve um substrato de hidrogel que forma um arcabouço exterior no qual as células podem crescer e ser suportadas em um ambiente 3D. Isso introduz um substrato artificial com o qual as células interagem, em vez de promover rapidamente as interações célula-célula, e embora um aprimoramento sobre cultura 2D, o arcabouço é propenso a perturbar as células e permanece no produto finalizado. Adicionalmente, as células podem crescer sobre ou nos microcarreadores, mas as células não podem ser levitadas de uma maneira em que tudo em torno de contato/interação célula-célula seja possível.
[0006] Nacionalmente, há um nível significativo de complexidade envolvido na fabricação dos microcarreadores de Felder, que inclui química difícil e a necessidade por equipamentos complexos. Adicionalmente, algimatrix, um dos reagentes principais na produção dos microcarreadores, pode ser uma fonte de endotoxinas. O controle de flutuabilidade também parece ser relevante para facilitar a levitação e é controlado pela infusão de bolhas de vidro nos microcarreadores, contribuindo novamente para a complexidade e a dificuldade. Finalmente, o hardware especializado é necessário para agitação, que é necessário para alcançar troca de gás e para prevenir a aglutinação dos microcarreadores, e impulsores são frequentemente usados para agitar as células. Entretanto, a tensão de cisalhamento resultante da agitação é conhecida por ocasionar dano celular. Adicionalmente, a agitação confere qualquer controle de formato de campo magnético de culturas 3D.
[0007] Becker em US2009137018, WO2005003332 usa um revestimento de partículas de núcleo magnetizadas bioatrativas, iniciando assim a aderência das células biológicas às partículas de núcleo magnetizadas e permitindo sua suspensão em um campo magnético. O revestimento permanece com as células durante a cultura, introduzindo assim um elemento não natural na cultura e perturbando provavelmente as células. Os inventores contemplam o uso de um revestimento biodegradável que poderia eventualmente ser eliminado, mas nenhum deles é revelado, então, não se sabe se essa abordagem seria bem sucedida. Adicionalmente, devido ao fato de as células serem crescidas no núcleo dos microcarreadores, a levitação de células individuais na qual podem ser unidas por levitação magnética para o propósito de promoção da interação célula-célula é improvável de ocorrer. Portanto, não é óbvio que a montagem rápida (horas) de estruturas multicelulares 3D devido ao contato célula-célula possa ser demonstrada quando se usa microcarreadores. Ademais, através do crescimento de células nos microcarreadores, a cocultura de diferentes tipos de células, especialmente, através da levitação de células individuais e, então, da união mecânica das mesmas, não é demonstrada. Finalmente, esse sistema é inconveniente e não adequado para aplicações de aumento de escala e alto rendimento.
[0008] Uma melhor abordagem pode ser magnetizar temporariamente as células, permitindo sua cultura 3D. Por exemplo, Akira em US2006063252, WO2004083412, WO2004083416 usa lipossomos catiônicos magnéticos (MCL) para magnetizar células através da absorção dos lipossomos. As células magnetizadas são, então, crescidas em uma lâmina no fundo de uma placa que usa atração magnética e, então, liberadas para uso. Entretanto, embora capazes de produzir lâminas de células, as células ainda estão crescidas no fundo de uma placa e, dessa forma, isso não ocorre para a cultura em 3D por levitação magnética. Adicionalmente, Shimizu e Akira et. al. Em uma publicação recente intitulada "Effective Cell-Seeding Technique Using Magnetite Nanoparticles and Magnetic Power onto Decellularized Blood Vessels for Vascular Tissue Engineering" usam um guia magnético para semear células sobre um vaso sanguíneo descelularizado.1 Seu estudo mostra resultados encorajantes, mas não usam as células magnetizadas como a fonte de tecido a ser descelularizada. As células magnetizadas são somente usadas para recelularizar os vasos sanguíneos descelularizados.
[0009] No pedido de patente WO2010036957 de Souza, as células são levitadas em um campo magnético através do contato das células com um "hidrogel" que compreende um bacteriófago com nanopartículas que são responsivas a um campo magnético. Em particular, o fago filamentoso, tal como bacteriófago fd, fl ou Ml 3, são usados. Tendo em vista que os trabalhos do método não são completamente claros, entretanto, é teorizado que o fago fornece uma estrutura ou montagem similar a gel que reveste as células, e de alguma forma auxilia as células na absorção ou adsorção das nanopartículas magneticamente responsivas. Dessa forma, mesmo quando o hidrogel é removido por lavagem, as células permanecem magneticamente responsivas, e podem ser levitadas em um campo magnético apropriado. Entretanto, embora o hidrogel seja na maior parte removido por lavagem, o potencial para infectividade de fago ou transferência de material genético permanece e, dessa forma, é desejado fornecer um material que permita que a absorção ou adsorção celular sem o uso de fago.
[0010] A presente revelação supera as deficiências existentes na técnica através do fornecimento de materiais e métodos aprimorados que promovem os ambientes celulares nativos. Esses incluem utilizar composições e métodos para gerar materiais à base de nanopartícula e preparar as células para permitir a cultura da célula em 3D, padronização da célula e formação de imagem da célula.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0011] Conforme usado na presente invenção, "nanopartícula positivamente carregada” ou "nanopartícula positiva” é definido como qualquer partícula menor que 200 nm, de preferência, 100 nm ou menos, que tem uma carga positiva total. De preferência, a partícula é não tóxica, mas isso não é essencial, posto que as partículas não permanecem com as células.
[0012] Conforme usado na presente invenção, "nanopartícula negativamente carregada" ou "nanopartícula negativa" é definido como qualquer partícula menor que 200 nm, de preferência, 100 nm ou menos, e com máxima preferência, cerca de 2 a 25 nm, que tem uma carga negativa total. De preferência, a partícula é não tóxica, mas isso não é essencial, posto que as partículas não permanecem com as células por um longo período de tempo.
[0013] Conforme usado na presente invenção, um "elemento magneticamente responsivo" pode ser qualquer elemento ou molécula que irá responder a um campo magnético. Conforme detalhado abaixo, uma das nanopartículas precisa conter ou ser um elemento magneticamente responsivo.
[0014] Conforme usado na presente invenção, "molécula de suporte" se refere a qualquer molécula longa que irá interagir com as nanopartículas para criar uma estrutura fibrosa do tipo manta ou gel e, dessa forma, reter a nanopartícula magnética muito próximo à célula para absorção.
[0015] As seguintes abreviações são usadas no presente documento:
Figure img0001
Figure img0002
[0016] Em termos gerais, a invenção é um novo material que permite que as células absorvam ou adsorvam os elementos magneticamente responsivos e, dessa forma, sejam levitáveis em cultura celular quando um campo magnético é aplicado. Os materiais incluem nanopartícula negativamente e positivamente carregadas, uma dessas precisa conter um ou mais elementos magneticamente responsivos, tal como óxido de ferro. Essas nanopartículas são adicionalmente combinadas com um polímero, de preferência, um polímero derivado de célula ou natural ou outra molécula longa que atua como um suporte (chamada no presente documento de "molécula de suporte”) para as nanopartículas carregadas e as células, que retém as nanopartículas no local para sua absorção ou adsorção pelas células. A inclusão tanto de nanopartículas negativas quanto positivas permite a mistura por adição intensa das nanopartículas e aciona a montagem dos três componentes, assegurando assim a distribuição uniforme e a boa absorção. A molécula de suporte combina intensamente todos os três componentes com as células em estrutura do tipo manta fibrosa que permite que as células absorvam o elemento magneticamente responsivo.
[0017] Após um período de incubação, o material pode ser removido por lavagem, permitindo que as células sejam manipuladas em um campo magnético. Uma etapa alternativa consiste em otimizar ou sintonizar a absorção de material magnético através do aumento da razão entre o número de células e a quantidade de nanopartícula magnética. Se um grande número de células estiver presente, esses irão absorver a maior parte das nanopartículas magnéticas, e a etapa de remoção por lavagem de qualquer material deixado pode não ser necessária, particularmente, se as moléculas e/ou nanopartículas de suporte remanescentes forem não tóxicas e/ou benéficas para a célula. Isso é particularmente verdadeiro onde as moléculas de suporte compreendem uma ou mais proteína de matriz extracelular, glicoproteína ou polissacarídeo. As partículas magnéticas são eventualmente perdidas das células, deixando-as em um estado completamente natural.
[0018] Além das simples cultura em 3D, o campo magnético pode ser usado para manipular o formato, padrões e movimento da célula. Por exemplo, o uso de um ímã toroidal (em formato de arruela) pode promover a montagem das células em um formato similar ou um campo inclinado pode tornar a cultura celular 3D mais espessa em um lado. Também foram criadas lâminas densas fortes de células, através da colocação de um ímã forte no fundo de um placa de cultura por um período de crescimento. A simples reversão do campo permite que a lâmina seja, então, levitada e pode-se, então, continuar a crescer a lâmina em uma cultura 3D. Também é possível combinar vários formatos e continuar a cultura em 3D e, dessa forma, criar formatos mais complexos em uma cultura 3D.
[0019] O elemento magneticamente responsivo pode ser qualquer elemento ou molécula que irá responder a um campo magnético, por exemplo, ímãs de terra-rara (por exemplo, samário-cobalto (SmCo) e neodimio-ferro-boro (NdFeB)), materiais de ímã de cerâmica (por exemplo, ferrita de estrôncio), os elementos magnéticos (por exemplo, ferro, cobalto e níquel e suas ligas e óxidos). São particularmente preferenciais os materiais paramagnéticos que reagem a um campo magnético, mas não são os próprios magnetos, tendo em vista que isso permite a montagem mais fácil dos materiais.
[0020] De preferência, o campo magnético usado para levitar tais células é cerca de 300 G a 1000 G. Entretanto, a resistência de campo varia tanto com a distância da célula quanto com a quantidade e o tipo de elemento de resposta magnética absorvido ou adsorvido pelas células. Dessa forma, a resistência de campo ideal irá variar, mas é facilmente determinada empiricamente.
[0021] As nanopartículas negativamente carregadas incluem metais de carga estabilizada (por exemplo, prata, cobre, platina, paládio), mas, de preferência, é uma nanopartícula de ouro.
[0022] As nanopartículas positivamente carregadas incluem óxidos e/ou ligas revestidas ou estabilizadas com tensoativo ou polímero (por exemplo, ferro elementar, ferro-cobalto, óxido de níquel) e, de preferência, é um nanopartícula de óxido de ferro.
[0023] Uma das duas nanopartículas precisa ser magneticamente responsiva, mas obviamente uma poderia conter esse recurso.
[0024] As nanopartículas devem ter um tamanho nanoescala e, dessa forma, são cerca de 100 nm. O tamanho pode estar na faixa, entretanto, entre cerca de 5 a 250 nm, 50 a 200 nm, 75 a 150 nm, mas pode ser menor ou maior, desde que somente o tamanho seja apropriado para permitir a entrada ou a adsorção ao tipo de célula em uso. Foi mostrado na presente documento que há um limite superior no tamanho eficaz da nanopartícula magnética, e o tamanho de micrômetro é muito grande para eficácia, embora alguma funcionalidade fosse ainda observada.
[0025] A "molécula de suporte” é geralmente um polímero ou outra molécula longa que serve para reter as nanopartículas e as células juntas em uma mistura por adição intensa. A molécula de suporte pode ser positivamente carregada, negativamente carregada, de carga misturada ou neutra, e pode ser combinações de mais de uma molécula de suporte.
[0026] Os exemplos de tais moléculas de suporte incluem os polímeros naturais, tais como os peptídeos, polissacarídeos, ácidos nucleicos e similares, mas polímeros sintéticos também podem ser empregados. As moléculas de suporte particularmente preferenciais incluem polilisina, fibronectina, colágeno, laminina, BSA, hialuronano, glicosaminoglicano, glicosaminoglicano não sulfatado aniônico, gelatina, ácido nucleico, proteína de matriz extracelular misturas, matrigel, anticorpos, e misturas e derivados dos mesmos.
[0027] Em termos gerais, a concentração da molécula de suporte é substancialmente maior que a concentração das nanopartículas positivamente e negativamente carregadas, na faixa de 1 a 1000 vezes maior, 10 a 500 ou 20 a 200 vezes maior. Entretanto, quantidades maiores ou menores são possíveis, dependendo de qual tipo de célula está sendo usado e qual molécula de suporte e nanopartículas estão sendo usadas. Quanto mais longo o polímero, menos pode ser necessário para formar estrutura suficiente para reter as nanopartículas no local para absorção.
[0028] Em geral, as nanopartículas são usadas em concentrações muito baixas. As concentrações podem estar na faixa entre 10-12 a 10-6 Molar, mas estão, de preferência, na faixa nanomolar, e a(s) molécula(s) de suporte(s) 10-9 a 10-3 Molar, e, estão, de preferência, na faixa micromolar.
[0029] Os três componentes se unem através da interação eletrostática e, dessa forma, as moléculas de suporte carregadas ou de carga misturada, tal como polilisina, são preferenciais. Entretanto, qualquer um dos três componentes pode ser funcionalizado, derivatizado ou revestido com a finalidade de promover adicionalmente a interação dos componentes e/ou das células. Dessa forma, um ou mais membros podem ser funcionalizados, derivatizados ou revestidos com um anticorpo que, por exemplo, se liga a um antígeno de superfície celular. Dessa forma, as interações entre os componentes e/ou células seria adicionalmente promovida. Outros pares de ligação incluíram receptores-ligantes, biotina-estrepavidina, ácidos nucleicos complementares, aglutinina de gérmen de trigo (WGA), moléculas que contêm ácido siálico e similares.
[0030] Os revestimentos também podem incluir revestimentos protetores ou de passivação, particularmente, para as nanopartículas, tais como PVP, dextrano, BSA, PEG e similares. As nanopartículas, especialmente, a nanopartícula que compreende o elemento magneticamente responsivo, podem ser identificadas para visualização, por exemplo, com um fluoróforo, radiomarcação ou similares, particularmente, durante o desenvolvimento e teste in vitro de células e tecidos magnetizados. Entretanto, para usos terapêuticos, pode ser preferencial omitir tais marcações.
[0031] Em outras modalidades, as composições incluem as células que serão levitadas ou manipuladas em um campo magnético, incluindo, mas não se limitando a, células-tronco, células cancerígenas, células primárias, células de mamífero, células humanas, células extraídas diretamente de tecido fresco, bactérias, levedura, células vegetais ou misturas dos mesmos.
[0032] A presente revelação fornece métodos de cultura de células, padronização de células e formação de imagem de células em três dimensões, que compreende a mistura das células com uma ou mais das composições presentemente reveladas e a cultura, padronização ou manipulação da mistura na presença de um campo magnético. O campo magnético pode estar acima ou abaixo do recipiente de cultura, mais próximo ou mais longe (por exemplo, mais forte ou mais fraco), estar inclinado ou ao lado, ou o formato do campo pode ser variado ou combinações de um ou mais dos mesmos podem ser aplicadas. Desse modo, as células podem ser padronizadas ou movidas para alcançar objetivos particulares .
[0033] O presente teste extensivo do sistema descrito acima mostrou que existe um grande número de aprimoramentos disponíveis agora em relação aos métodos da técnica anterior. Primeiro, uma química de fabricação de automontagem torna o método simples e reprodutível, e nenhum equipamento especializado é necessário para a fabricação da montagem de nanopartícula magnética ou para a magnetização, cultura em 3D ou manipulação de célula subsequente. Os únicos requisitos foram um campo magnético, pipetas, recipientes e uma placa quente. Dessa forma, o método é compatível com grande escala e alto rendimento.
[0034] Se desejado, a montagem de nanopartícula magnética pode se tornar livre de moléculas biológicas, tais como produtos de fago ou célula, devido ao fato de que as moléculas de suporte, tal como polilisina, podem ser facilmente produzidas sinteticamente. Ainda todos os componentes são geralmente não tóxicos, baratos ou fáceis de produzir. Adicionalmente, as estruturas similares à manta fibrosas permitem que a incorporação de moléculas de suporte de célula adicionais (tais como componentes de matriz extracelular) seja incluída nas montagens magnéticas de nanopartícula.
[0035] A magnetização de células com montagens magnéticas de nanopartícula consiste somente na adição de montagem às células em meios regulares de cultura celular. As células podem ser magnetizadas dentro de minutos a partir do tratamento de nanopartícula magnética (5 minutos) e as células fixadas ou suspensas podem ser tratadas com montagens magnéticas de nanopartícula. As células podem ser crioconservadas antes ou após o tratamento com nanopartículas magnéticas e o método ainda funciona. Se for desejado, a montagem de nanopartícula magnética pode ser removida por lavagem das células magnetizadas antes do uso, e as células remanescentes ainda irão levitar.
[0036] A levitação e a cultura das células em 3D através de levitação magnética não requer quaisquer equipamentos ou métodos especializados ou dispendiosos (tal como para agitar ou manter a flutuabilidade) além dos requisitos de cultura de célula 2D padrão, e o controle de formato de cultura celular 3D magneticamente levitado pode ser alcançado através da variação do formato do campo magnético. Finalmente, e talvez mais importantemente, a invenção promove a interação célula-célula rápida (escala de segundos e minutos) com levitação de células e montagem nos agrupamentos multicelulares 3D dentro de minutos, e essas estruturas de cultura complexas podem ser produzidas através da manipulação do campo magnético e/ou através do contato magnético de diferentes tipos de célula.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0037] A Figura 1 é uma vista esquemática para um método de montagem direta para gerar montagens de nanopartícula. Nesse diagrama, 1 é a nanopartícula negativamente carregada, 3 é a nanopartícula positivamente carregada e 5 é a molécula de suporte e a montagem de nanopartícula magnética concluída é 7. Os três componentes podem ser combinados em qualquer ordem, mas são mostradas aqui as nanopartículas primeiro combinadas e, então, adicionadas à molécula de suporte.
[0038] A Figura 2A é uma vista esquemática que mostra uma montagem de nanopartícula magnética variante 19. A nanopartícula positiva é 15, a nanopartícula negativa é 17, e 21 e 23 fazem referência a duas moléculas de suporte diferentes, por exemplo, polilisina (carga +) e um peptídeo rico em glutamato e/ou aspartato (carga -) ou, como um outro exemplo, laminina e fibronectina.
[0039] A Figura 3 é os espectros de absorbância de montagens de nanopartícula reais compostas de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro e ouro e várias moléculas de suporte conforme mencionado à direita.
[0040] A Figura 4 mostra a formação de imagem em campo escuro (a) e os hiperespectros (b) de uma nanomontagem de FeO2-Au-PL exemplificativa.
[0041] A Figura 5a-d mostra imagens fluorescentes e em campo de brilho sob ampliação de l0x, a é uma imagem em campo de brilho com molécula de suporte IgG-AlexaFluor 488, b é uma imagem verde fluorescente do mesmo campo, c é a foto em campo de brilho com moléculas de suporte de camundongo IgG e de anticamundongo IgG AlexaFluor 555 e d é a imagem vermelho fluorescente do mesmo campo.
[0042] A Figura 6a-d é fotografias de células HEK293 levitando após o tratamento com montagens magnéticas de nanopartícula de diferentes composições, incluindo a=PL, b=COL, c=LAM, d=NT.
[0043] A Figura 7 é uma vista esquemática que indica o uso de células ou fluido de um animal no método da invenção.
[0044] A Figura 8 é uma vista esquemática que mostra o uso cíclico de célula ou extratos da invenção a serem adicionados a amostras já crescentes.
[0045] A Figura 9 mostra fotografias de diversos exemplos de manipulação de formato e densidade de célula com o uso dos métodos da invenção.
[0046] A Figura 10 mostra alteração de espessura de cultura 3D através da inclinação do campo magnético.
[0047] A Figura 11 é uma fotografia que mostra um exemplo do método da Figura 10.
[0048] A Figura 12 é uma vista esquemática que ilustra o uso de uma película magnética para células magnetizadas, em que as células não são intensamente misturadas por adição com a montagem de nanopartícula magnética, mas somente assentadas sobre a superfície da mesma.
DESCRIÇÃO DE MODALIDADES DA INVENÇÃO
[0049] A presente revelação fornece composições que compreendem nanopartículas negativamente carregadas, nanopartículas positivamente carregadas e uma molécula de suporte que compreende um polímero ou molécula longa, ou polímero ou molécula de ligação a metal. Os seguintes exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a limitar indevidamente a invenção.
EXEMPLO 1: MONTAGENS MAGNÉTICAS DE NANOPARTÍCULA
[0050] A Figura 1 mostra um esquema geral para preparar montagens magnéticas de nanopartícula (7) através da combinação de nanopartículas negativas (1) e nanopartículas positivas (3) (pelo menos uma nanopartícula é de natureza magnética) e moléculas de suporte (5).
[0051] As soluções de nanopartículas são preparadas através da mistura separada das nanopartículas em água ou tampão de baixa resistência iônica (concentração de sal < 10 mM) em um pH desejado. A carga superficial de partícula pode ser ajustada através da escolha do pH apropriado, em que o tampão de baixo pH (tal como tampão de citrato ou carbonato) pode aumentar geralmente a carga total nas nanopartículas. Adversamente, o tampão de alto pH (tal como tampão de borato) pode diminuir geralmente a carga total nas partículas. Idealmente, o pH de escolha para cada solução deve resultar em cargas opostas entre as duas partículas. Isso pode ser alcançado devido ao fato de as nanopartículas de diferente composição terem usualmente pontos isoelétricos distintos.
[0052] Por exemplo, as nanopartículas de Au são negativamente carregadas na maioria dos valores de pH, frequentemente, devido à presença de íons de citrato ou cloreto adsorvidos, em contraste às nanopartículas de óxido de ferro, que podem variar de pH = 3,3 a 8, dependendo do tipo do óxido de ferro. Portanto em pH 4, espera-se que as nanopartículas de Au sejam negativamente carregadas e as nanopartículas de óxido de ferro devam ser positivamente carregadas. As nanopartículas também podem ser revestidas com moléculas, tal como dextrano, polietileno glicol ou tiois, que podem ditar carga como um todo também das nanopartículas. É desejável que uma má combinação de cargas assegure que a montagem ocorra com moléculas de suporte que são positiva ou negativamente carregadas, misturadas ou neutras.
[0053] As soluções de moléculas de suporte (5) são geralmente preparadas através da solubilização ou mistura das mesmas com água ou soluções tamponadas (tal como citrato, fosfato, borato) de um pH desejado e, de preferência, baixa resistência iônica (de preferência, concentração de sal < 10 mM, mas a concentração de sal poderia ser maior se necessário para assegurar a solubilização da molécula). A baixa resistência iônica é geralmente desejável para reduzir a classificação de carga e, portanto, promove a interação de carga entre as nanopartículas e os polímeros de cargas opostas. As concentrações de moléculas de suporte (5) devem ser geralmente maiores que a concentração de nanopartícula (faixa de 10 nM a 1 mM, mas outras concentrações podem ser usadas), usualmente, acima de 10X em relação às concentrações molares de nanopartículas (1) e (3).
[0054] Em detalhes adicionais, a molécula de suporte também pode fornecer funcionalidade para a montagem, tal como: aprimorar a adesão de nanopartículas magnéticas a células (tal como polilisina); aprimorar o ambiente de cultura de célula (tal como através do uso de proteínas de matriz extracelular, tal como colágeno e laminina); permitir a entrega de uma molécula específica (tais como DNA, fármacos, ligantes, marcações, etc.) para células; fornecer função como relatores de sinal (tal como marcação de fluorescência); e/ou aprimorar biocompatibilidade célula/tecido das montagens magnéticas de nanopartícula (por exemplo, através do fornecimento de suporte nutricional ou uma imunosuperfície compatível e similares).
[0055] A Figura 2 mostra uma união de nanopartícula magnética (19) em que a nanopartícula negativamente carregada (17) e a nanopartícula positivamente carregada (15) são retidas pode duas moléculas de suporte (21, 23). Um exemplo do pareamento de moléculas de suporte poderia ser laminina e fibronectina, um outro pode ser anticorpo e antígeno.
[0056] Foi preparada uma ampla variedade de montagens magnéticas de nanopartícula, e testadas sua funcionalidade com várias células em vários meios. A Tabela 3 mostra a faixa de componentes testados:
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[0057] A Figura 3 mostra os espectros de absorção de várias uniões. As variações em espectros de extinção entre diferentes soluções são um resultado dos níveis variantes de reticulação esletrostática entre as nanopartículas e as várias moléculas de suporte. Com a exceção dos espectros para laminina (5), colágeno (7) e FuGENE-GFP (21), todos apresentaram um suporte amplo centralizado aproximadamente a 560 nm, resultante da absorção característica de nanopartícula de Au. A natureza dos espectros planos em relação ao espectro de nanopartícula de Au é um resultado da presença e dos espectros de extinção amplos da nanopartícula de óxido de ferros polidispersa (geralmente menor que 100 nm). Os espectros para laminina (5) e colágeno (7) são as montagens de nanopartícula preparadas com os componentes de matriz extracelular. Os espectros designados como FuGENE-GFP (21) são das montagens de nanopartícula preparadas com FuGENE (um lipossomo) carregado com plasmídeo de DNA que codifica uma molécula relatora de GFP. A presença do plasmídeo de DNA é indicada pela presença do suporte de UV a 260 nm (DNA absorve a 260 nm) no traço para (21).
[0058] A Figura 4 mostra a formação de imagem em campo escuro (a) e os hiperespectros (b) de uma nanomontagem de FeO2-Au-PL exemplificativa. A formação de imagem de hiperespectros é uma tecnologia óptica que combina microscopia baseada em campo escuro com espectros resolvidos com comprimento de onda de luz difundida (400 a 1000 nm) de uma amostra imageada. Essa tecnologia permite a identificação de nanomateriais com base em suas características de difusão óptica. Espera-se um pico de nanopartículas monodispersas, mas aqui, a ampliação prevista dos espectros se deve à presença de nanopartículas de óxido de ferro e sua montagem. Embora haja ampliação dos espectros, isso ainda fornece resolução espectral suficiente para identificar essas amostras dentro de um tecido. Dessa forma, esse é um método para monitorar a montagem in vitro ou in vivo.
[0059] Referindo-se agora à Figura 5, um sinal de fluorescência de nanomontagens magnéticas (a, c) preparado com proteína fluorescente é conjugado como a molécula de suporte (b, d). A montagem de nanopartícula mostrada nas imagens a e c, foi gerada através do uso do esquema da Figura 1A, com o uso de nanopartículas de óxido de ferro e ouro, e IgG anticamundongo de macaco AlexaFluor 555 e IgG camundongo de proteína como moléculas de suporte em duelo. Primeiro, o óxido de ferro e ouro foram misturados, então, o IgG de camundongo de proteína foi adicionado para formar uma montagem de nanopartícula magnética. Então, em uma a segunda/separada etapa, a montagem foi incubada com IgG anticamundongo de macaco AlexaFluor de anticorpo relator de fluorescência. Dessa forma, a montagem de nanopartícula magnética pode ser marcada e monitorada em uso.
[0060] A Figura 6a-d mostra fotografias de células que levitam após o tratamento com uma montagem de nanopartícula magnética de diferentes composições geradas com o método descrito na Figura 1. O procedimento usado foi o seguinte: uma montagem de óxido de ferro-Au foi gerada, primeiro, através da mistura de 6 ml de uma solução de X mg/ml com uma solução de nanopartícula de Au com diâmetro de aproximadamente 74 nm (gerada pela redução de citrato, com 4,1 de extinção no comprimento de onda 548 nm) com 3 ml de 1,0 mg/ml de solução de nanopartícula de óxido de ferro polidispersa em água picopure. Então, 1,0 ml da mistura de óxido de ferro-Au foi imediatamente adicionado para separar 1,0 ml de soluções de polilisina (a 0,0001%), colágeno (a 30 μg/ml), laminina (a 10 μg/ml) ou oligonucleotídeo (a 1 μg/ml) todas dissolvidas em água picopure.
[0061] Após a mistura com as moléculas de suporte, permitiu-se que as soluções incubassem de um dia para o outro. Uma fração de sobrenadante foi removida com o uso de separação magnética, puxando a montagem de nanopartícula magnética para o fundo com o uso de um ímã e o sobrenadante descartado. Para remover os reagentes não reagidos em excesso, a montagem de nanopartícula magnética foi lavada duas vezes com 5 ml de água picopure cada vez. Então, isso foi armazenado em 5 ml de água picopure a 4°C.
[0062] Finalmente, 5 ml de células HEK293 (50.000 células/ml) foram cuidadosamente pipetados em um tubo cônico de 15 ml com 0,5 ml da montagem de nanopartícula. Essa mistura foi vagarosamente misturada através da ação da pipeta e permitiu-se a incubação e o assentamento por 5 minutos. Então, permitiu-se que as células se assentassem por 5 minutos no tubo cônico e, então, o sobrenadante foi removido (colocado em um tubo cônico) e substituído por meios de cultura. Esse procedimento de lavagem foi repetido duas vezes mais.
[0063] Devido ao fato de as células acopladas às montagens de nanopartícula se assentarem muito mais rápido que as nanopartículas não aderidas, as nanopartículas não aderidas foram removidas com o sobrenadante. As nanopartículas não aderidas podem ser visualmente detectadas no sobrenadante através da colocação de um ímã no fundo do tubo cônico com o sobrenadante, e as nanopartículas visualizadas devido à sedimentação magnética. Após a terceira lavagem, o sobrenadante pareceu esgotado de montagens magnéticas de nanopartícula livres. As células foram, então, transferidas para placa Petri de 3,5 cm e levitadas com um ímã de neodímio em formato de anel (20 x (8,5 x 4,5) x 7 mm; resistência de puxamento: 13 lbs). Todas as células levitaram e coalesceram em uma cultura 3D dentro de minutos de aplicação de um campo magnético, independentemente de qual molécula de suporte foi usada. Muitos outros materiais de suporte foram testados na presente invenção e todos funcionaram, mas somente poucos resultados exemplificativos são mostrados.
EXEMPLO: MOLÉCULAS COMPONENTES
[0064] Também foi demonstrada a importância dos vários componentes da montagem de nanopartícula magnética da presente invenção, através do teste de nanopartículas de Fe2O3 sozinhas, (<50 nm de tamanho de partícula), nanopartículas de Au-(Fe2O3) e montagens magnéticas de nanopartícula completas de PL-AU-(Fe2O3).
[0065] As células foram tratadas com amostras que portam a mesma quantidade de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro ou aproximadamente 1,0 μ! por 5.000 células, e as microfotografias foram tiradas diretamente após o início da levitação com um ímã de 500G, bem como após as células terem sido cultivadas por levitação magnética por 7 dias com um ímã de 300 G ou um ímã 500 G (dados não mostrados).
[0066] Todas as células foram capazes de levitar em um dia, entretanto, essas amostras tratadas com PL-AU-(Fe203) mostraram estruturas 3D maiores e mais coesivas, especialmente, quando cultivadas com o ímã de 500G. Portanto, todos os três componentes são necessários para levitação e coalescência de célula eficazes em uma estrutura 3D. Embora as nanopartículas sozinhas mostraram desempenho inferior, ainda há valor na capacidade de levitar e cultivar células que são tratadas com as nanopartículas que requerem menos manipulação que as modalidades na Figura 1.
EXEMPLO: ENTREGA DE MATERIAL PARA CÉLULAS
[0067] Também foi demonstrada a capacidade das montagens magnéticas de nanopartícula em portar e entregar materiais para as células. Como prova-de-princípio, as células HEK293 foram tratadas e levitada com as nanomontagens magnéticas que portam DNA de GFP e, então, o sinal de fluorescência de GFP foi detectado no interior das células da cultura celular 3D levitada.
[0068] Em detalhes adicionais, o procedimento de preparação das nanomontagens magnéticas que portam DNA foi o seguinte: primeiro, as soluções de FuGENE foram preparadas de acordo com as instruções do fabricante (Roche Applied Science, FuGENE HD Transfection Reagent), onde 2 μg de DNA de plasmídeo de GFP (DNA) foram dissolvidos em 200 μl de meio DMEM livre de soro.
[0069] Então, 6 μl de solução FuGENE foram adicionados diretamente na solução de 200 μl do DNA diluído (FuGENE-DNA). Permitiu-se o assentamento dessa mistura por 15 minutos à temperatura ambiente. Duas outras amostras foram preparadas: uma com 6 μl de FuGENE adicionado diretamente em 200 μl de meio DMEM livre de soro (sem DNA, controle negativo, chamado no presente documento de FuGENE), e uma outra com 4 μl de DNA em 200 μl de meio DMEM livre de soro (chamado no presente documento de DNA). Então, 3 ml de razão de 2:1 (v/v) da solução de nanopartícula de óxido de ferro e Au (1 mg/ml de óxido de ferro antes da mistura com Au) foram combinados e misturados completamente e, então, adicionados diretamente a 100 μl de FuGENE-DNA, 100 μl de FuGENE e 100 μl de DNA.
[0070] A solução foi bem misturada e permitiu-se a incubação de um dia para o outro a 4°C. Após um período de incubação de um dia para o outro, as nanopartículas se assentaram. Os espectros de extinção tirados das montagens de nanopartícula eram compostos de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro e ouro e seu sobrenadante livre de nanopartícula (coletados após as nanopartículas se assentarem), o que indicou a incorporação do DNA e/ou FuGENE de sua alta absorção de UV. Os espectros do sobrenadante mostram absorbância inferior que as amostras misturadas, indicando a incorporação de DNA e FuGENE na montagem de nanopartícula.
[0071] As montagens magnéticas de nanopartícula foram adicionadas às células, e as células levitada conforme acima, e as células em levitação foram, então, fotografadas. A presença de sinal de fluorescência de GFP nas células de ambos os sistemas que portam DNA (não mostrados), mostra a capacidade dessas montagens magnéticas de nanopartícula em portar e entregar DNA para células enquanto magnetiza e cultiva essas células em 3D através de levitação magnética. Esse resultado prova que a montagem de nanopartícula magnética pode ser usada tanto para magnetizar células quanto para entregar materiais funcionais para as células, tal como DNA ou fármacos.
EXEMPLO: LEVITAÇÃO DE CÉLULA PRIMÁRIA
[0072] As células primárias são, frequentemente, difíceis de cultivar in vitro, mas foi demonstrado que as células primárias foram cultivadas com sucesso em 3D por levitação magnética após terem sido magnetizadas com óxido de ferro-Au-PL.
[0073] Várias montagens magnéticas de nanopartícula foram feitas, incluindo nanopartículas de Au, PL e diferentes nanopartículas de óxido de ferro. Os vários óxidos de ferro foram Ferridex-PL, óxido de ferro-Au-PL (<50 nm), óxido de ferro-Au-PL (~5 nm Au) e óxido de ferro- Au-PL (<5 μl, um exemplo de micropartícula). O Ferridex é composto de superparananopartículas magnéticas de óxido de ferro revestidas com dextrano (SPIONs). O ponto isoelétrico (pi) ou o pH no qual uma molécula ou superfície particular porta nenhuma carga elétrica em rede para o seguinte é: SPION, 7,3-5 magnetita (y-Fe2O3), 3,3 a 6,7,'2 e magnetita (Fe3O4), 6,5 a 6,8.2
[0074] Para as diferentes montagens de nanopartícula, os seguintes foram usados: 11,2 mg/ml de Feridex I.V. (Advanced Magnetics, Inc., Cambridge, MA, EUA), óxido de ferro (III) (Sigma Aldrich, 544884, <50 nm de tamanho de partícula, Fe2O3. Esse produto consiste principalmente da magnetita de forma gama, mas tanto a forma alfa quanto a forma gama estão presentes na forma mineral naturalmente). Também foi usado óxido de ferro (II, III) óxido (Sigma Aldrich, 310069, 310069, Fe3O4, magnetita). Todas as três amostras de ferro foram diluídas para soluções de trabalho de 1 mg/ml em água. O coloide de Au ~5 nm foi preparado de acordo com Duff et al.6
[0075] A preparação de óxido de ferro-Au-PL consistiu em seis diluições em série de poli-L-lisina aquosa (PL) com concentrações na faixa de 1,00x10-3 a 3,12x10-5%, que foram preparadas separadamente. Uma razão 1:1 de parte igual (v/v) da solução de nanopartícula de óxido de ferro e Au foi adicionada a cada diluição. Após um período de incubação de um dia para o outro, as nanopartículas se assentaram no fundo de cada frasco e metade do sobrenadante foi removida. Começando com a menor diluição, as misturas de diluições em série foram combinadas e misturadas com a próximo diluição menor em série até que toda a solução permanecesse em um frasco. A concentração de PL total foi 1,24x10-3%.
[0076] A mistura dos reagentes como amostras serialmente diluídas permite aos reagentes não acoplados de diluições superiores a chance de serem incorporados na montagem. Ademais, diferentes diluições apresentam frequentemente características ópticas, estruturais, adesivas e outras físicas distintas; através da mistura das diferentes diluições, essas propriedades podem ser integradas. Frequentemente, a integração de tais propriedades pode ser desejável. Por outro lado, esse processo pode ser um bom diagnóstico visual para determinar e escolher as condições ideais dependendo da aplicação. Por exemplo, uma ou inúmeras diluições poderiam ser pegajosas no plástico ou pipetas.
[0077] Quatro tipos de células pulmonares primárias humanas (SCIENCELL RESEARCH LABORATORIES™, Carlsbad, CA, EUA) foram tratados com montagens de óxido de ferro-Au-PL e, então, cultivadas em 3D. Esse procedimento consistiu na cultura dessas células como monocamadas para confluência de -80% em um frasco de cultura de célula 2D. Então, a solução de óxido de ferro-Au-PL foi adicionada ao frasco de células (com concentrações na faixa de 1,56 a 13,00 μl/cm2) e permitiu-se a incubação com as células. O tempo de incubação foi de aproximadamente um dia para o outro (ou -12 horas). As células primárias foram, então, lavadas com PBS (óxido de ferro-Au-PL não aderido removido). Finalmente, as células foram separadas por digestão de tripsina, transferidas para placas Petri de 3,5 cm Petri e, finalmente, levitadas com um ímã de neodímio em formato de anel (20 x (8,5 x 4,5) x 7 mm; resistência de puxamento: 13 lbs).
[0078] Todos os quatro tipos de nanomontagens foram preparados com diferentes formas e tamanhos de óxido de ferro aderido e foram capazes de levitar prontamente as células (dados não mostrados), mesmo onde o contato de célula original empregou células aderidas. Entretanto, as montagens preparadas com óxido de ferro maior (<5 μm, Fe3O4, magnetita) não formam estruturas de célula tão grandes e coesivas quanto as outras, indicando que há um limite superior para o tamanho do elemento magneticamente responsivo que pode ser absorvido por células. Aqui, é provável que menores agrupamentos de célula resultem da presença de partículas de óxido de ferro maiores que não entram prontamente nas células, portanto, as células são menos magnetizadas e tais partículas de tamanho maior também podem revestir a superfície celular e atrapalhar ou impedir a interação célula-célula.
EXEMPLO: LEVITAÇÃO DE CÉLULA EX VIVO
[0079] Referindo-se à Figura 7, quaisquer células retiradas de animais ou humanos (41), incluindo, mas não se limitando a, células de sangue, soro, plasma ou tecido desagregado (43), são misturadas com nanopartículas (45) e, então, incubadas juntas por 30 segundos a 48 horas. Durante a incubação, a amostra (43) e as nanopartículas (43) interagem eletrostaticamente juntas com quaisquer proteínas, DNA ou polissacarídeo que pode estar contido nisso para formar a montagem de nanopartícula (47). Então, a montagem de nanopartícula magnética (47) é separada por força magnética, centrifugação e/ou sedimentação, onde o sobrenadante é separado da mistura, e um ímã usado para manipular as células magnetizadas remanescentes.
[0080] Ainda se referindo à Figura 7, a montagem de nanopartícula é gerada a partir da interação entre as proteínas, DNA ou polissacarídeo presente no sangue ou outra amostra (43). Os tipos de interações podem incluir, mas não são limitados a, interações de natureza eletrostática, covalentes (grupos funcionais de tiol e/ou outros reticuladores), de faixa curta e/ou hidrofóbicas (usualmente através de uma molécula em ponte) de natureza específica e não específica. Por exemplo, as interações eletrostáticas podem ser permitidas e/ou controladas através da manipulação de pH, em que as proteínas de diferentes pontos isoelétricos interagem com duas cargas superficiais de nanopartículas correspondentes.
[0081] Adicionalmente, as moléculas de suporte adicionais também podem ser adicionadas à montagem para suportar o crescimento celular ou ligar em ponte adicionalmente os vários componentes da montagem. Esse tipo de ligação em ponte pode ser alcançado através da modificação da amostra original (43) ou da montagem de nanopartícula magnética (47) com anticorpos ou outras moléculas (por exemplo, rótulos de peptídeos ou proteína), então, as moléculas específicas são enriquecidas/capturadas na montagem.
[0082] A modalidade descrita no presente documento pode ser de valor para preparar as montagens de nanopartícula com proteínas nativas a fim de reduzir qualquer resposta imunológica quando as células finais são para ser usadas terapeuticamente. Isso poderia ser significante quando se trata de células em cultura para procedimentos celulares autólogos, uma vez que soro, sangue, ou outros tecidos ou fluidos corporais poderiam ser usados para preparar as montagens de nanopartícula para mascarar os efeitos de corpo estranho.
EXEMPLO: CÉLULAS MAGNETIZADAS CONGELADAS
[0083] Foi mostrado no presente documento que as células podem ser congeladas quando magnetizadas e, então, posteriormente, descongeladas e usadas para cultura em 3D. As células são misturadas com a montagem de nanopartícula magnética pelos procedimentos acima. O excesso de montagem de nanopartícula magnética é, então, removido, e as células lavadas e crioconservadas de acordo com as técnicas padrão. Posteriormente, são descongeladas e cultivadas em um sistema de cultura 3D. Isso é muito conveniente, tendo em vista que permite preparar e comercializar células magnetizadas para uso em pesquisa e terapia.
[0084] O seguinte procedimento foi usado. Um frasco de células T-25 de Rim Embrionário Humano (HEK293) (ATCC CRL-1573) foi crescido para 80% de confluência e tratado com 200 de óxido de ferro- Au-PL. Após um período de incubação de 12 horas. Então, as células foram lavadas com PBS (óxido de ferro-Au-PL não aderido removido), tripsinizadas, divididas em dois frascos, colocadas em meios que contêm DMSO e, então, congeladas a -80°C. No dia seguinte, foram transferidas em um Dewar de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
[0085] Oitenta e um dias depois, 1 frasco foi descongelado em um banho de água a 37°C por 2 minutos. Após ressuspender o frasco em 7,5 ml de meios, as células foram divididas entre três placas Petri de 35 mm de diâmetro Petri e ímãs de 1000G foram colocados no topo de cada placa. As células foram recuperadas da crioconservação e foram cultivadas por dias em 3D por levitação magnética. Foi possível crescer culturas 3D levitadas satisfatórias com essas células. Esse procedimento também foi executado com sucesso com células de músculo liso primárias, células de fibroblasto primárias, células de glioblastoma (LN299) e hepatoma (células cancerígenas H4IIE, hepatocarcinoma). Portanto, as células magnetizadas podem ser preparadas antecipadamente para uso posterior.
EXEMPLO: TRATAMENTO CÍCLICO
[0086] Também podem ser executados múltiplos ciclos de levitações de célula, adicionando célula ou extratos celulares às culturas 3D existentes. Desse modo, as culturas podem ser enriquecidas para várias células ou produtos celulares conforme a cultura 3D é crescida.
[0087] Na Figura 8, as células (51) são adicionadas a uma montagem de nanopartícula magnética (53) e as células e a montagem de nanopartícula magnética incubadas juntas (55) para permitir que as células se magnetizem. A seguir, as células magnetizadas são levitadas (59) com o uso de um ímã (61). Posteriormente, as células são levitadas por 4 horas, de um dia para o outro, ou dias (dependendo do tipo de célula), as células foram removidas da levitação, os meios foram substituídos por água picopure (73), e as células foram lisadas por ação de congelamento/descongelamento (75) (as células foram colocadas em nitrogênio líquido por pelo menos 10 minutos). Alternativamente, as células podem ser puxadas para o fundo da placa de cultura (65) com o uso de um ímã (61), onde essa etapa pode ser repetida 1 a 4 vezes. Então, as células (67), um extrato celular (69) ou diferentes células (71) podem ser alimentadas de volta em uma outra amostra e o processo de cultura em 3D continuou. As fotografias não são mostradas, mas esses procedimentos foram demonstrados com sucesso.
EXEMPLO: CULTURAS DIMENSIONADAS
[0088] Também foi demonstrado que o formato da cultura celular 3D pode ser variado através da modificação do campo magnético. O uso de um ímã forte que puxa as células para o fundo da placa, cria uma lâmina bem formada claramente densa de células (não mostrada). Essa pode, então, ser levitada através da reversão do campo magnético. Também foram criadas culturas em 3D que são mais espessas em um lado através da inclinação do ímã. As culturas em formato de rosca foram criadas com o uso de ímãs toroidais.
[0089] A Figura 9a-e, por exemplo, mostra poucas culturas celulares exemplificativas onde as células podem ser comprimidas mais ou menos através da variação da resistência do campo magnético, ou da distância do ímã da placa, e onde o formato toroidal é alcançado com o uso de um ímã em anel. As Figuras 10 e 11 mostram uma cultura 3D tornada mais espessa em um lado através da inclinação do campo magnético.
[0090] Também foi previsto que se empilhar tais culturas celulares em lâmina ou formato de rosca, dessa forma, criando eventualmente estruturas mais complexas. Por exemplo, uma estrutura similar a tubo poderia ser criadas através do empilhamento de discos. Um compartimento pode ser criado através do empilhamento de discos e, então, das lâminas em camadas em uma ou ambas as extremidades, e o compartimento poderia ser preenchido com o mesmo tipo de célula ou diferente. Desse modo, a engenharia de tecido mais complexa pode ser realizada.
[0091] Também é possível mover as células com o uso do campo magnético e esse movimento pode afetar as propriedades e a composição da cultura 3D. Quando as células são semeadas com o hidrogel (também conhecido como montagem de nanopartícula magnética), o movimento vertical e/ou horizontal dos campos magnéticos, através do movimento de ímãs permanentes ou através da variação dos campos magnéticos gerados a partir de eletromagnetos, impede que as células se fixem diretamente à placa de cultura celular. A frequência desse movimento pode variar de, por exemplo, 1 Hz (60 vezes por minuto) a 0,001 Hz. Adicionalmente, diferentes tipos de célula poderiam interagir muito diferentemente com um gel em movimento. Através da combinação dos movimentos vertical e/ou horizontal, a rigidez do material em movimento irá ditar adicionalmente o tipo de células que adeririam diferencialmente ao gel em movimento. Uma variação dessa abordagem também poderia ser alcançada através da aplicação de um movimento de oscilação ao ímã. Esse método é uma alternativa valorosa para preparar, separar e classificar células para manipulação magnética, incluindo, mas não se limitando a, cultura de célula 3D por levitação magnética.
EXEMPLO: CONTATO DE SUPERFÍCIE
[0092] Nas modalidades acima, foi misturada a montagem de nanopartícula magnética com as células, fornecendo assim uma mistura por adição intensa dos componentes. Entretanto, também foi mostrado que não é necessário, e que estando simplesmente adjacentes à montagem de nanopartícula magnética as células irão absorver as nanopartículas magnéticas. Esse é o benefício quando as células precisam estar livres dos materiais da montagem de nanopartícula magnética.
[0093] A Figura 12 ilustra o método através do qual a montagem de nanopartícula magnética (200) é exposta a um campo magnético. Isso tem o efeito de concentrar ou comprimir a montagem de nanopartícula magnética formando uma película magnética mais densa. As células (400) podem ser adicionadas acima da película e irão se assentar naturalmente através da gravidade sobre a película, e sua proximidade à película irá permitir que as células sejam magnetizadas. Então, as células podem ser facilmente levitadas e separadas da película, levitadas e crescidas em cultura 3D. Esse conceito foi testado com uma ampla variedade de moléculas de suporte e demonstrou que funciona.
[0094] Todas as composições e/ou métodos revelados e reivindicados no presente documento podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da presente revelação. Embora as composições e métodos dessa invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferenciais, será evidente para aqueles elementos versados na técnica que variações podem ser aplicadas às composições e/ou métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método descrito no presente documento sem que se afaste do conceito, espírito e do escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que certos agentes que são tanto química quanto fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos no presente documento, embora resultados iguais ou similares sejam alcançados. Todos os tais substituintes e modificações similares evidentes para aqueles elementos versados na técnica pretendem estar incluídos no espírito, escopo e conceito da invenção conforme definido pelas reivindicações em anexo.
[0095] As seguintes referências são incorporadas por referência em sua totalidade:
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Claims (9)

  1. Composição (7) para magnetizar células, a dita composição compreendendo:
    • a) uma nanopartícula negativamente carregada (1);
    • b) uma nanopartícula positivamente carregada (3); e
    • c) uma molécula de suporte (5),
    em que a nanopartícula positivamente carregada (3) é um elemento magneticamente responsivo, e em que a dita molécula de suporte (5) retém a dita nanopartícula negativamente carregada (1) e a dita nanopartícula positivamente carregada (3) em uma mistura por adição intensa que forma uma estrutura do tipo manta fibrosa, caracterizada por a uma nanopartícula negativamente carregada (1) ser uma nanopartícula de ouro.
  2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita nanopartícula positivamente carregada (3) é uma nanopartícula de óxido de ferro.
  3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de suporte (5) compreende peptídeos, polissacarídeos, ácidos nucleicos, polímeros ou combinações dos mesmos; e/ou em que a molécula de suporte (5) compreende polilisina, fibronectina, colágeno, laminina, BSA, hialuronano, glicosaminoglicano, glicosaminoglicano não sulfatado aniônico, gelatina, ácido nucleico, proteínas de matriz extracelular, extrato celular, anticorpo, ou misturas ou derivados dos mesmos.
  4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as ditas células são obtidas a partir de fluidos ou tecido animal, e a dita molécula de suporte (5) é fornecida pelo dito tecido de fluidos.
  5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que
    • a) a molécula de suporte (5) compreende peptídeos, polissacarídeos, ácidos nucleicos, polímeros, polilisina, fibronectina, colágeno, laminina, BSA, hialuronano, glicosaminoglicano, glicosaminoglicano não sulfatado aniônico, gelatina, ácido nucleico, proteína de matriz extracelular misturas, anticorpo, ou misturas ou derivados dos mesmos, e
    • b) a dita nanopartícula positivamente carregada (3) é uma nanopartícula de óxido de ferro.
  6. Composição caracterizada pelo fato de que compreende células magnetizadas que são produzidas por incubação com a composição conforme definida na reivindicação 1, em que as ditas células são congeladas.
  7. Método para mover células caracterizado pelo fato de que compreende colocar em contato as células com a composição conforme definida na reivindicação 1 e incubar por 1 a 12 horas até que as células se tornem magnetizadas, e submeter as ditas células magnetizadas a um campo magnético suficiente para mover as ditas células.
  8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito campo magnético é assimétrico, e/ou em as ditas células estão em suspensão ou aderidas.
  9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente lavar as ditas células para remover a dita composição antes de submeter as ditas células magnetizadas a um campo magnético suficiente para mover as ditas células.
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