KR101272884B1 - 세포별 흡광 이미지 분석을 이용한 세포사멸 정량분석법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 흡광 이미지 분석을 이용한 세포사멸 정량분석법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 화학시료에 노출되어 세포사멸이 유도된 단일 세포층에 흡광염료 처리를 한 후 형성된 이미지를 촬영하고 각세포별 흡광도를 정량적으로 분석하는 세포사멸 정량분석법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 세포별 흡광 및 형태 인자의 다중변수분석을 이용하여 정상세포와 대비하여 개별 세포가 퇴화되는 사멸의 과정을 MTT 검색법등 기존의 흡광기반 세포 사멸 분석법들에 비하여 보다 정확하게 정량화 할 수 있으므로 고효율, 고집적도의 세포기반 미세유체칩, 신약개발시 사전 인 비트로 스크리닝(in-vitro screening) 장치, 유해 화학물질 세포독성 평가장치 등으로 활용될 수 있다.

Description

세포별 흡광 이미지 분석을 이용한 세포사멸 정량분석법 {METHOD FOR QUANTITATIVE ANALYSIS OF CELL-DEATH PROCESS USING ABSORPTION-BASED IMAGE CYTOMETRY}

본 발명은 흡광 이미지 분석을 이용한 세포사멸 정량분석법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 화학시료에 노출되어 세포사멸이 유도된 단일 세포층에 흡광염료 처리를 한 후 형성된 이미지를 촬영하고 이를 바탕으로 각 세포별 흡광도를 정량적으로 분석하는 세포사멸 정량분석법에 관한 것이다.

현재 세계적으로 유통되고 있는 화학물질은 수십 만여 종에 이르며 매년 여러 종의 새로운 화학물질이 개발되어 상품화되고 있어 이들에 의한 인체 및 환경 위해성이 날로 증가되고 있는 추세이다. 이와 같이 증가하는 신약의 스크리닝 및 신규 화학물질의 유해성에 대한 평가가 신속하게 이루어져야 한다.

세포의 증식 또는 세포의 사멸정도를 정량적으로 측정할 수 있는 기법은 생명과학, 의약 분야에서 필수적인 분석기법 중의 하나이다. 세포사멸 측정법은 동물실험 등 생체에의 적용 단계 이전에 생체 밖에서의 약물에 대한 세포의 성장 및 억제력을 알아보는 과정을 거쳐야 하기 때문에 새로운 약물 및 독성물질에 대한 효능 검색이나 감수성을 알아보기 위하여 널리 사용된다.

현재 많이 사용되고 있는 MTT (Tetrazolium-based colorimetric) 검색법은 96-웰(well) 플레이트를 사용하고 검사결과를 마이크로플레이트 리더를 이용하여 많은 시료를 간단히 빠르고 객관성 높게 판독할 수 있어 세포독성 및 세포증식 검색법으로서 널리 사용되고 있다. 또한 MTT의 변형 색소인 XTT, MTS 등을 이용한 방법 또한 개발되어 사용되고 있다.

마이크로플레이트 리더(Microplate reader)는 마이크로플레이트 웰 내에서 반응한 물질의 정성, 정량 분석에 이용되는 장비로써 적절한 용매, 용해 또는 분산된 시료에 자외선, 가시광선, 적외선 영역 등의 빛을 통과시켜 흡광, 발광, 형광도 등을 측정하여 세포 생리 및 분자생물학, 면역학 분야에서 사용된다. 광원으로부터 유래한 빛은 여러 가지 필터와 단색화 장치를 통해 특정 파장의 빛으로 만들어진 시료에 96개 혹은 그 이상의 경로를 통해 조사되어 각각의 웰에 담긴 시료의 성분 및 농도에 따라 발생한 형광 또는 투과된 빛이 검출기를 통하여 분석될 수 있다. 이와 같은 방법으로 측정된 결과를 바탕으로 세포의 증식능력과 세포 생존능력을 관찰할 수 있다.

유체 세포측정법 (Flow Cytometry, F.A.C.S)의 일반적인 원칙은 일정한 파장의 빛을 세포에 조사하였을 때 세포가 가진 성질 및 부착된 형광색소(fluorochrome)에 따라 방출할 수 있는 파장의 광선이 다르다는 점을 기본으로 세포분석에 이용되고 있다. 한 예로써 혈액 속의 백혈구를 대상으로, 크기에 따라 크게 임파구 (lymphocyte), 단핵구 (monocyte), 그리고 과립구 (granulocyte)등으로 구분할 수 있는데 이러한 세포를 대상으로 일정 파장 (예를 들어 488nm 파장의 blue laser)의 빛으로 세포를 비추게 되면 세포의 크기에 따라 전면으로 산란되는 빛의 각도가 다르게 나타난다. 즉 세포의 크기가 더 크면 빛이 더 많이 튕겨나가게 되어 전면 산란 검출기 (Forward scatter; FSC)에 검출되는 광선의 양이 증가하여 크기 분석이 가능하며, 그리고 세포 표면이나 내부의 성질에 따라 빛이 많이 굴절되는 경우 (예를 들어 granulocyte의 세포 내 granule들) 측면 산란 검출기 (side scatter; SSC)에 검출되는 양이 늘어난다. 이 두 가지 성질을 이용하여 기본적인 세포의 분류를 가능하게 한다.

그러나, 기존의 FACS는 매우 고가의 장비로서 일반적인 연구자들이나 산업용으로 사용되기에는 부적합하다. 또한, FACS는 형광염료를 이용한 시표 표지를 수반하고 일반적으로 많이 사용되는 부착세포들을 웰플레이트 표면에서 떼어낸 후 분석해야하는 비가역적인 전처리가 필요하므로 부착세포의 성장 및 사멸과정 모니터링시에는 어느정도의 불가피한 오류를 수반하게 된다.

MTT 분석법은 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT 테트라졸리움(tetrazolium)을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT 포마잔(formazan) (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)으로 환원시키는 세포내 미토콘드리아의 활성을 측정하는 검사법으로써 다양한 화학물질의 독성을 시험하는 데에 널리 이용된다. 이 기술은 최소한의 물리적 처리로 재현성 있는 광학 농도를 얻을 수 있기 때문에 많이 사용된다. 하지만 세포밖의 무생물적인 요인들이 테트라졸리움염(tetrazolium salts)의 환원과정에 영향을 미치는 경우 분석결과에 치명적인 오류가 발생할 수 있다.

예를 들면, 세포 배양액의 pH, 부가물(혈청, 콜레스테롤, 아스코르브산 염)의 변화에 따라 흡광 측정값도 달라지는 현상들이 발생되기도 한다.(Marquis et al, Analyst, 2009, 134, 425-439) 또한 최근에 몇몇 제조 나노물질에 관한 연구들은 MTT와 같은 세포독성 염색물질과 SWCNTs 및 다른 탄소에 기반한 물질들과의 상호작용에 의해 세포사멸 측정에 오류가 발생할 수 있음을 보고한바 있다. MTT와 SWCNTs의 상호작용은 환원된 MTT 포마잔이 SWCNTs의 표면에 부착되어 용매에 의하여 녹아나오지 않는 성질에 의해 유도됨이 최근 보고되었다.(Worle-Knirsch et al, Nano Lett 2006, 6, 1028-33) 그리고 Laaksonen et al. 등은 PSi 나노입자 표면에서의 산화 반응은 MTT의 환원 반응의 원인이 되며, 직접적으로 MTT를 환원시킬 수 있고, 이에 따라서 MTT 검색법을 이용하여 PSi 입자 성분의 화합물에 대한 독성시험을 수행하는 것은 정량적인 결과를 얻는 데에 한계점이 있다는 점을 보고한 바 있다(Laaksonen et al. Chem. Res. Toxicol., 2007). 이러한 기존 MTT법의 오류는 대부분 세포외부에 존재하는 무생물적인 요인들에 의한 MTT의 MTT-포마잔으로의 환원 등의 상호작용이 주원인이다.

본 발명자들은 상기와 같은 종래 MTT 분석법과 같은 세포 사멸 분석법의 문제점을 해결하고 보다 효율적인 세포 정량 분석법을 개발하고자 예의 연구한 결과, 미세한 세포배양환경이 유지된 단일의 세포층에 흡광 이미지 분석법 및 영상처리법을 적용하여 표면에 부착되어 있는 세포의 사멸과정의 진행정도를 기존 세포사멸의 흡광 분석법 등에 수반될 수 있는 오류를 배제하면서 분석이 가능하게 하고, 단일변수분석법 또는 다중변수분석법 (Multiparmeter Analysis)등의 보다 차별적인 결과 해석을 통하여 보다 다양한 정보를 제공 할 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

결국 본 발명의 목적은 2차원의 단일층으로 배양된 세포를 세포사멸과 관련되는 흡광염료로 염색한 후 이미지를 촬영하고 각 세포별로 형태인자 및 흡광도를 분석할 수 있는 세포사멸 정량분석법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 분석 대상 세포를 배양하여 단일 세포층을 형성하는 단계; 상기 단일 세포층을 시료에 노출시켜 세포 사멸 반응을 유도하는 단계; 상기 세포 사멸 반응이 유도된 단일 세포층에 흡광염료를 주입하고 결정형성 또는 세포 염색을 유도하는 단계; 상기 흡광염료를 이용한 결정형성 또는 세포염색이 이루어진 단일 세포층을 촬영하고 촬영된 이미지로부터 세포별 흡광인자, 세포의 개수 및 형태인자값으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포사멸 인자를 추출하는 단계; 및 상기 추출된 세포사멸 인자의 변수분석을 하여 세포사멸 기전(Mechanism) 및 세포사멸 정도를 정량화하는 단계를 포함하는 흡광 이미지 분석을 이용한 세포 사멸 정량분석법이 제공된다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 분석 대상 세포의 단일 세포층은 미세유체 세포칩, 멀티 웰 또는 슬라이드 글라스에 형성될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 단일 세포층은 배지주입구, 상기 배지주입구와 별개로 형성되는 시료주입구, 상기 배지 주입구 및 시료 주입구로부터의 채널이 합류하여 연결되는 미세유체 채널을 구비하는 미세유체의 확산 구간, 상기 미세유체의 확산 구간에 연결되고 세포의 부착 배양이 이루어지는 세포 배양구간 및 상기 세포 배양 구간에 연결되는 배출구를 포함하는 미세유체 세포칩에 분석 대상 세포를 배양하여 형성할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 흡광염료로는 MTT(3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)), MTS(5-(3-caroboxymeth-oxyphenyl)-2H-tetra-zolium inner salt), WST(4-[3-(4-Iodophenyl)-2(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]1,3-benzene disulfonate) 및 트립판 블루(trypan blue)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 단일 세포층의 촬영은 광학이미지 취득을 위한 가시광선영역에서의 광원으로서 텅스텐 램프(tungsten lamp), LED 광원 및 레이저 광원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 광원; 대물렌즈로부터 모아진 세포영상을 검출하는 CCD(Charge Coupled Device) 카메라: 단일세포층을 포함하는 세포 배양시스템을 배치시키기 위한 세포배양 플랫폼; 사용되는 흡광염료에 적용되는 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 광원에서 파장을 선택적으로 통과시키기 위한 장치: 및 상기 CCD 카메라로부터 얻어진 이미지를 분석하여 세포별 흡광인자, 세포의 개수 및 형태인자값으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포사멸 인자를 추출하고 세포사멸과정을 정량화 할 수 있는 영상처리 프로그램을 포함하는 세포 영상 분석 장치를 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 흡광염료로서 MTT를 사용할 경우 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 선택적으로 통과되는 파장은 550nm ± 60nm의 파장영역이고, MTS 포마잔을 흡광염료로 사용할 경우 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 선택적으로 통과되는 파장은 490nm ± 60nm의 파장영역이며, 트립판 블루를 흡광염료로서 사용할 경우 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 선택적으로 통과되는 파장은 590nm ± 80nm의 파장영역인 것이 바람직하다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 흡광염료로서 MTT를 사용하는 경우 산화·환원반응에 의한 포마잔(formazan) 결정의 형성을 유도하기 위한 최적 시간을 10 ~ 240 분으로 부여하는 것이 바람직하다.

상기 노출된염료에 의한 세포 염색을 유도하는 단계에서는 트립판 블루를 사용하는 경우 노출된 염료에 의한 염색이 이루어지는 최적 시간을 3분 이내로 부여하여 이미지를 분석할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 세포별 흡광인자로서 세포별 흡광도의 추출은 영상획득 구성요소를 구비한 현미경에서 촬영된 이미지 내의 세포들을 식별하여 분할(segmentation)하기 위해 촬영된 이미지를 영상분석 프로그램에서 분석하고, 분석되어 선택된 각각의 세포는 원본 이미지에서 신호 (I)를 이미지의 세포를 포함하지 않은 배경영역의 신호값 (I₀)으로 나눈 뒤 로그값을 취해 흡광도로 변환시킨 이미지에 덮어져 촬영된 이미지 내의 각 세포별 흡광도를 추출할 수 있다. (A:세포별 흡광도, I: 촬영된 광학 이미지에서 세포를 포함하는 영역이 나타내는 빛의 강도, I₀: 촬영된 이미지에서 세포를 포함하지 않는 배경 영역이 나타내는 빛의 강도)

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 세포사멸 정도의 정량화 단계는 촬영된 이미지로부터 각 세포가 차지하는 면적(area) 및 원형성(Circularity)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 형태인자값 또는 흡광인자로서 세포별 평균 흡광도(Mean Absorbance) 및 세포별 총 흡광도(Integrated Absorbance)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포별 흡광도를 분석하여 정량화할 수 있다.

원형성 = 4π x (세포면적 / 세포둘레²)

세포별 평균 흡광도(Mean Absorabnce)

= 세포 영역 내 각 픽셀들의 흡광도값의 평균

세포별 총 흡광도 (Integrated Absorbance)

= 세포별 평균 흡광도 x 세포가 차지하는 영역의 픽셀 수

본 발명의 일실시예에 따르면, 세포사멸 정도를 정량화하는 단계에서 이미지 분석을 통해 얻어진 세포별 흡광도를 포함하는 변수들을 개별적으로 단일 변수 분석하여 용량-반응 곡선을 얻고 세포 사멸 진행 정도의 정량화를 실시할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 광학이미지 취득을 위한 가시광선영역에서의 광원으로서 텅스텐 램프(tungsten lamp), LED 광원 및 레이저 광원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 광원; 대물렌즈로부터 모아진 세포영상을 검출하는 CCD(Charge Coupled Device) 카메라: 단일세포층을 포함하는 세포 배양시스템을 배치시키기 위한 세포배양 플랫폼; 사용되는 흡광염료에 적용되는 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 광원에서 파장을 선택적으로 통과시키기 위한 장치: 및 상기 CCD 카메라로부터 얻어진 이미지를 분석하여 세포별 흡광인자, 세포의 개수 및 형태인자값으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포사멸 인자를 추출하고 세포사멸과정을 정량화 할 수 있는 영상처리 프로그램을 포함하는 영상분석장치를 구비하는 세포사멸 정량분석을 위한 세포 영상 분석 시스템이 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 세포사멸 정량분석법을 이용하면 외부 스트레스에 의한 세포 사멸과정의 진행 정도를 기존에 보고된 MTT 방법 등의 오류를 최소화하면서 고효율로 정밀하게 측정할수 있다. 특히 멀티웰 플레이트, 미세유체기술 등과 결합하여 저렴한 단가의 고효율, 고신뢰도의 다양한 세포분석법 및 관련 분석장치의 개발이 가능하여 플레이트 리더(plate reader), F.A.C.S등 고가의 장비가 사용되거나 노동집약적으로 수행되고 있는 기존의 세포독성 평가장치나 약물 스크리닝 시험에 광범위하게 적용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면 미세유체 세포칩과 세포의 사멸과정에 따른 세포형태분석 그리고 세포별 흡광인자의 측정 기법등을 활용하여 기존의 F.A.C.S 보다 적은 양의 시료와 세포만을 가지고 최소한의 시료전처리 과정만을 사용하여 분석할 수 있으며 분석 장비 소형화 및 저렴한 단가로 많은 분석을 수행함으로서 통계적으로 정확한 데이터를 확보할 수 있다. 또한 기존의 MTT 시험 방법에는 비수용성의 MTT 포마잔을 용해시켜야 하는 전처리 과정이 필요하며, 노란색의 수용성 기질인 MTT 테트라졸리움의 환원 현상이 미트콘드리아의 밖에서 발생하는 것과 같은 현상으로 명확하지 않은 측정 결과를 추출하는 것과는 달리 전처리 과정 없이도 세포 내 형성된 결정을 영상 분석함으로써 세포내 미토콘드리아의 활성을 정량적으로 측정한 결과를 추출해 낼 수 있다.

도 1은, MTT 세포사멸 분석을 위해 각각 (a) 96-웰 플레이트와 (b) 미세유체 세포칩 내에서 세포를 단일층으로 배양한 후 촬영한 이미지이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 미세유체 세포칩을 개략적으로 나타낸 도면이다. (a)는 세포 부착 배양 구간을 포함하는 미세유체 채널 구조이며, (b)는 미세유체의 막 밸브 시스템의 구조이며, (c)는 상기 미세유체 채널 구조 및 막 밸브 시스템이 결합된 칩의 부분도이다.
도 3은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 제조된 미세유체 세포칩의 촬영 이미지이다. 막밸브가 장착되어 정적흐름의 조건을 갖는 세포칩이다.
도 4는 미세유체 세포칩 내에서 세포를 단일층으로 배양하고 독성물질에 노출시킨 후 이미지를 획득하는 전체 실험과정의 개략도이다.
도 5는 본 발명에 제시된 MTT 세포사멸 분석법과 기존의 MTT 분석법에서의 데이터 획득 과정을 비교한 개략도이다. 여기서, (a)는 기존의 MTT 검색법에 따른 데이터 획득 과정을 간략히 나타낸 개략도이며, (b)는 본 발명에 제시된 MTT 세포사멸 분석법에 따른 데이터 획득 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에서 사용되는 영상 획득 및 처리를 위한 현미경과 구성 요소에 관한 개략도이다. (a)는 영상 획득 및 처리와 MTT 흡광영역에 해당하는 빛을 투과시키기 위한 필터가 구비된 현미경의 개략도이며, (b)는 대역 여과기 필터(bandpass filter)에 의해 투과된 빛의 세기(왼쪽의 y축)와 formazan의 흡수(오른쪽의 y축) 파장을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따라 MTT 세포사멸 분석시 필요 단계를 나타낸 것으로, (a)는 흡광도 영상 분석을 위한 흡광도 이미지 변환 과정을 나타낸 개략도이며, (b)는 촬영된 이미지 내의 세포들을 식별하여 분할(segmentation)하는 단계를 나타낸 개략도이다.
도 8은 시료로서 세포독성물질을 도 2(a) 칩의 세포배양구간에 처리하기 전과 후의 사진 및 각 세포에서 원형성 값을 계산하여 나타낸 그림과 각 농도에서의 원형성 값 분포도이다.
도 9는 본 발명에 따른 MTT 세포사멸 분석법에 사용되는 최적의 MTT 노출조건을 도출하기 위한 실험 결과 이미지와 분석 그래프이다. 각각의 수치는 각 컴파트먼트(compartment)에서 배양된 각 세포의 흡광도 평균값을 의미한다.
도 10은 특정 농도에서 독성물질에 노출된 세포의 광학 및 흡광 이미지와, 세포내 원형성과 세포 내 형성된 포마잔의 흡광도 값의 분포 히스토그램들과, 각 세포에 해당하는 두 변수 값들을 산포도(Scatter Plot)로 나타낸 도면들이다.
도 11은 다중변수 분석의 일례로서 세포의 원형성과 세포 내 형성된 포마잔의 흡광도 값을 산포도(Scatter Plot)로 나타내고, 산포도(Scatter Plot)의 기준값에 대하여 상하좌우 영역 내 대표성 있는 세포에 대해 촬영된 이미지를 원형성 및 흡광도와 함께 도시한 것이다.
도 12는 세포별 흡광도 단일 변수를 이용한 분석의 일례로서 Cd^{2 +} 특정 농도에서 독성물질에 노출된 각 세포 내 형성된 포마잔의 흡광도 값을 용량-반응 관계 그래프로 나타낸 도면이다.

이하, 첨부되는 도면을 참조로 하여 본 발명을 상세히 설명하도록 한다.

1) 분석 대상 세포를 배양하여 단일 세포층을 형성

세포 사멸의 정량분석 및 개별 분석을 위해서는 분석대상 세포를 배양하여 단일 세포층을 형성하여야 한다. 단일 세포층을 형성하기 위해서는 멀티웰 플레이트, 슬라이드 글라스 또는 미세유체 세포칩 등의 표면에 분석대상 세포를 배양하고 표면에 부착되지 못하고 배지에 부유하는 세포는 배지를 흘려주어 제거함으로써 단일 세포층을 형성한다.

본 발명에서는 단일 세포층의 형성 및 세포사멸 정량분석의 효율을 극대화하기 위해 상기와 같은 미세유체 세포칩을 이용하여 단일 세포층을 형성하고 MTT 분석을 위한 처리를 한 후, 이미지를 촬영함으로써 영상 분석을 실시한다. 세포 배양 용기를 구성하는 컴파트먼트(compartment)에서 최적의 이미지 분석 조건을 충족시키기 위한 세포의 개수 범위에 맞추어 세포를 적절하게 배양한다. 도 1은, 상기와 같이 MTT 세포사멸 분석을 위해 (a) 96-웰 플레이트와 (b) 미세유체 세포칩 내에서 세포를 단일층으로 배양한 후 촬영한 이미지이다.

도 2에는 본 발명에서 사용될 수 있는 미세유체 세포칩이 도시되어 있다. 도 2a, 2b와 같이 두 구조물로 구성되며, 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS)인 고분자 재질로 제작될 수 있다. 또한 커버슬립과 같은 광학적 측정이 용이한 기판에 접합되어 광학이미지를 실시간으로 영상처리 할 수 있다. 두 개의 유체 주입구(3, 5)를 통해 유입된 유체는 대량발굴탐색(HTS: High througput screening)을 위한 컴포넌트(2)에서 다양한 농도를 형성하며, 지속적인 유체의 흐름이 없이도 농도 그레디언트(gradient)를 유지시키기 위하여 PDMS 막(membrane) 밸브가 추가적으로 구성될 수 있다.

도 3에는 상기 도 2에 개략적으로 도시되었던 미세유체 세포칩을 실제로 제작하고 촬영한 사진을 첨부하였다. 막밸브가 장착되어 정적흐름의 조건을 가질 수 있는 세포칩이다.

세포 배양 구간의 정적 상태는 미세유체 세포칩에 밸브 시스템을 도입함으로써 이루어 질 수 있으며, 상기 밸브 시스템은 공기압을 이용하는 막(membrane) 밸브 시스템이고, 주입구 공기압 밸브와 배출구 공기압 밸브를 포함할 수 있다. 이러한 밸브 시스템을 이용하여 상기 세포 배양 구간의 농도 구배(gradient)를 정적(static) 상태로 유지할 수 있다. 이러한 막 밸브 시스템은 공기압의 조절에 따라 막 밸브의 개폐가 이루어질 수 있다.

상기 미세 유체 세포 칩은 미세 유체 세포 칩 내로 배지 및 시약을 주입함으로써 세포배양과 동시에 다양한 세포기반 분석이 가능하여 약물의 흡수, 분포, 대사, 배설, 독성 등의 분석 및 신약개발 및 시험시 스크리닝 시험에 이용될 수 있는 것이다. 또한 다른 세포배양과 동시에 유해화학물질에 노출로 인한 세포의 반응기작을 이미지를 통해 확인함으로써 이용가능성이 높다. 또한 농도구배의 형성이 가능하므로 유해 화학물질을 여러 번의 시도 없이 다양한 농도별로 세포의 반응기작을 알아볼 수 있다.

2) 단일 세포층을 시료에 노출시켜 세포 사멸 반응을 유도

도 2에 도시된 미세유체 세포칩의 유체 주입구 (3), (5)로부터 유입된 서로 다른 농도를 갖는 화학시료(예를 들어 독성물질(toxicant)는 (1)에서 층류를 형성하고 시간이 지남에 따라 확산(diffusion)되어 (2)에서 다양한 농도를 갖는 화학물질로 존재하게 되고, 단일 세포층 내의 세포들은 화학시료에 일정시간 노출됨으로써 세포사멸 과정을 거치게 된다. 도 4에는 미세유체 세포칩 내에서 세포를 단일층으로 배양하고 독성물질에 노출시킨 후 분석을 위한 이미지를 획득하는 순서도가 도시되어 있다.

3) 흡광염료 주입 및 결정 형성 또는 세포 염색 유도

세포고사 과정에서 세포의 부피는 작아지고 세포질 내의 내막, 리보솜, 사구체와 다른 세포 소기관등은 수축되어 진다. 이러한 과정에서 일어나는 응축은 매우 격렬하게 일어나기 때문에 응축된 부분에서 매우 뚜렷한 경계부를 형성한다. 흡광염료로서 MTT(3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide))를 사용하는 경우, 상기와 같은 세포 고사 과정에서 미토콘드리아의 탈수소 효소작용에 의하여 세포 내 노란색 수용성 MTT 테트라졸리움이 자주색을 띄는 비수용성의 MTT 포마잔으로 환원되어 변화된 세포 내 흡광도를 유기용매에 의한 용해과정 없이 분석 할 수 있다.

MTT를 사용하는 경우 산화·환원반응에 의한 포마잔(formazan) 결정의 형성을 유도를 위해서는 10 ~ 240 분 정도의 시간을 부여하면 이미지 분석이 가능한 결정의 형성이 이루어진다.

기존의 MTT 검색법은 96 웰에서 배양된 세포 내에 형성된 포마잔을 DMSO와 같은 용매로 용해시킨 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 그 용액의 흡광도를 분석함으로써 세포 내 활성을 정량한다. 그러나 본 발명에서는 MTT 분석방법을 사용하되, 표면 부착되어 있는 세포 내에서 환원된 포마잔을 DMSO와 같은 용매로 용해하는 과정 없이 영상 획득 및 특정 필터가 구비된 현미경을 이용하여 직접 흡광이미지를 얻으며, 다음 단계에서 설명되는 영상처리법에 의하여 표면 부착되어 있는 세포의 고사(Apoptosis) 및 괴사(Necrosis) 과정에 의한 세포의 사멸과정의 진행정도를 정량화 할 수 있는 것이다.

도 5에는 본 발명에 제시된 MTT 세포사멸 분석법과 기존의 MTT 분석법에서의 데이터 획득 과정을 비교한 개략도를 나타내었다. 여기서, (a)는 기존의 MTT 분석법에 따른 데이터 획득 과정을 간략히 나타낸 개략도이며, (b)는 본 발명에 제시된 MTT 세포사멸 분석법에 따른 데이터 획득 과정을 간략히 나타낸 개략도이다.

흡광염료로서는 상기와 같은 MTT 이외에도 MTS(5-(3-caroboxymeth-oxyphenyl)-2H-tetra-zolium inner salt), WST(4-[3-(4-Iodophenyl)-2(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]1,3-benzene disulfonate), 트립판 블루(trypan blue) 등도 세포사멸의 분석을 위해 사용 가능하다.

4) 이미지 분석을 통한 세포의 형태인자값 및 세포 내 흡광도 추출

도 6에는 본 발명에서 사용될 수 있는 영상 획득 및 처리를 위한 현미경 과 구성 요소에 관한 개략도를 나타내었다. 여기서, (a)는 영상 획득 및 처리와 흡광영역에 해당하는 빛을 투과시키기 위한 필터가 구비된 현미경의 개략도이며, (b)는 대역 여파기 필터(bandpass filter)에 의해 투과된 빛의 세기(왼쪽의 y축)와 formazan의 흡수(오른쪽의 y축) 파장을 나타낸 그래프이다.

(b)의 주황색 선은 노란색의 MTT 용액의 흡수 파장을 나타낸 스펙트럼이고 점선으로 표시된 선은 세포에 의해 환원된 MTT 포마잔의 흡수 파장을 나타내는 스펙트럼이다. 이미지 촬영시 MTT 포마잔의 신호를 최대화하기 위해 노란색 MTT 용액에서는 흡수 되지 않고 포마잔이 흡수하는 영역에서의 광원을 통과시키기 위한 구간을 필터(filter) 구간으로 설정하였다.

도 6에 도시된 영상 분석 시스템은 광학이미지 취득을 위한 가시광선영역에서의 광원으로서 텅스텐 램프(tungsten lamp), LED 광원 또는 레이저 광원, 대물렌즈로부터 모아진 세포영상을 검출하는 CCD(Charge Coupled Device) 카메라, 미세유체칩을 포함하는 세포 배양시스템, 즉 세포 샘플을 배치시키기 위한 세포배양 플랫폼, 세포를 분석하기 위해 사용되는 흡광염료에 적용되는 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 광원에서 파장을 선택적으로 통과시키기 위한 장치 및 CCD 카메라로부터 얻어진 이미지를 분석하여 세포별 흡광인자, 세포의 개수 및 형태인자값으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포사멸 인자를 추출하고 세포사멸과정을 정량화 할 수 있는 영상처리 프로그램을 포함하는 시스템을 구비한다.

상기 광원에서 파장을 선택적으로 통과시키기 위한 장치는 광원 필터가 일반적으로 사용될 수 있으나, 기타 파장을 선택하여 제공할 수 있는 장치라면 어떠한 것을 사용하여도 무방하다.

흡광염료로서 MTT를 사용할 경우 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 선택적으로 통과되는 파장은 550nm ± 60nm의 파장영역이고, 흡광염료로서 MTS를 사용할 경우 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 선택적으로 통과되는 파장은 490nm ±60nm의 파장영역이며, 흡광염료로서 트립판 블루를 사용할 경우 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 선택적으로 통과되는 파장은 590nm ± 80nm의 파장영역이 적정하다.

상기 영상분석 시스템을 사용하여 얻어진 촬영 이미지를 토대로 세포사멸인자의 변수분석을 수행하여 세포사멸 기전 및 세포사멸 정도를 정량화한다. 여기서 변수분석은 단일변수분석을 실시할 수도 있고, 다중변수분석을 실시할 수도 있다. 변수분석에 대한 보다 구체적인 내용은 하기의 내용 및 실시예에 기재하도록 한다.

흡광도 이미지의 추출은 영상 획득 구성요소를 구비한 현미경에서 촬영 된 원본 이미지에서 세포영역에서의 신호 (I)를 이미지의 세포가 없는 배경부분에서의 신호값 (I₀)으로 나눈 뒤 로그값을 취해 흡광도로 변환된 이미지를 준비하고, 다시 원본 이미지 내의 세포들을 영상 분석 프로그램을 통해 식별하여 분할(segmentation)하고 흡광도로 변환된 이미지에 덮어져 촬영된 이미지 내의 각 세포별 흡광도를 추출할 수 있다.(A: 세포별 흡광도, I: 촬영된 광학 이미지에서 세포를 포함하는 영역이 나타내는 빛의 강도, I₀: 촬영된 이미지에서 세포를 포함하지 않는 배경 영역이 나타내는 빛의 강도)

각 세포별 흡광도는 세포별 평균 흡광도(Mean Absorabnce)(= 세포 영역 내 각 픽셀들의 흡광도값의 평균) 또는 세포별 총 흡광도 (Integrated Absorbance)( = 세포별 평균 흡광도 x 세포가 차지하는 영역의 픽셀 수)를 추출하여 세포사멸 정량화에 적용할 수 있다.

상기 미세유체 세포칩 내부에 2차원적으로 부착 성장한 세포들에 대한 광학이미지를 영상처리하여 세포의 사멸과정의 진행에 따른 세포형상의 변화를 원형성(Circularity)등의 변수로 정량적으로 표현하는 알고리즘을 이용하여 각 세포의 원형성을 수치화할 수 있으며, 이러한 수치화된 형태 인자 값을 이용하여 세포사멸의 정도를 정량화하는 것이 가능하다.

여기서 본 발명이 사용하는 대표적인 형태인자 값은 원형성(circularity)으로서 다음과 같이 정의 된다.

원형성 = 4π x (세포면적/세포둘레²)

계산된 원형성 값이 1.0인 경우는 측정 대상이 완전한 원의 형태를 가짐을 의미하며 원형성 값이 감소하여 0.0에 가까워질수록 측정 대상물체가 장방형 또는 다각형의 형태를 가지게 됨을 의미한다. 표면 부착되어 성장하던 세포가 외부의 환경요인에 의하여 고사사멸과정(apoptotic death process)을 거치게 되면 가장 대표적인 형태변화인 세포의 수축 및 원형화가 동반되게 된다. 그러므로 표면부착세포의 경우 낮은 원형성 값을 가지고 고사사멸과정이 진행될수록 부착세포의 원형성 값이 증가하게 된다.

또다른 형태인자값으로 세포가 차지하는 면적, 즉, 이미지 상에서 각각의 세포에 해당하는 면적(area)을 사용할 수도 있는데, 세포 이미지에서 각 세포 별 면적에 해당하는 픽셀(pixel) 수를 면적값으로 사용한다.

본 발명에서 사용되는 이미지 분석 방법은 영상분석 프로그램의 메크로를 이용하여 순차적인 이미지의 목록을 동시 분석이 가능하며, 세포의 개수 및 형태 인자 값(circularity) 등 여러 인자들 또한 동시 분석이 가능하다. 각각의 세포 내에 생성된 MTT 포마잔 결정에 대한 흡광도를 분석하기 위해 투과성 이미지를 흡광도 이미지로 변환하고, 이에 대한 과정은 도 7(a)에 나타내었다. 촬영된 이미지 내의 세포들을 식별하여 분할(segmentation)하기 위해 원본 이미지를 영상분석 프로그램에 불러와 도 7(b)의 과정으로 분석할 수 있다. 분석되어 선택된 각각의 세포는 흡광도로 변환된 이미지에 덮어져 동일한 각 세포의 흡광도를 추출할 수 있다.

세포사멸 정도를 정량화를 위해서는 이미지 분석을 통해 얻어진 상기 세포별 형태인자값 또는 세포별 흡광도를 포함하는 변수들을 개별적으로 단일변수 분석 (Single-parameter analysis) 하여 얻은 노출 농도별로 정량화된 흡광도 값을 이용하여 용량-반응 곡선, LC₅₀(half maximal lethal concentration), EC₅₀(half maximal effective concentration) 값들을 얻거나, 형태 및 흡광인자들을 이용한 다양한 변수들을 조합하여 다중 분석하고, 그 분석 결과에 따라 세포사멸단계의 상세 구분 및 세포 사멸 진행 정도의 정량화를 실시할 수 있다. 도 11에 도시된 데이터에는 흡광도 및 형태인자를 선택하여 다중변수로서 분석한 예가 나타나있으며, 도 12에 도시된 그래프에는 화학물질 노출농도에 따른 세포별 흡광도를 이용하여 얻은 용량-반응 곡선이 나타나 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

또한, 하기 실시예에 제시된 수단 중에서 미세유체 칩을 이용한 방법은 본 발명의 효율 및 활용도를 극대화하기위한 바람직한 한 예 이며, 기존의 멀티웰 플레이트나 슬라이드 글라스에서의 세포배양으로 2차원의 단일층 세포배양이 가능하여 실시 수단으로 대치될 수 있음 본 발명의 취지상 당업자에게 이해될 수 있을 것이다.

또한, 하기 실시예에 흡광염료로서 MTT를 이용한 분석법이 제시되었으나, 사멸된 세포의 분석을 가능하게 해주는 다른 흡광염료, 예를 들어 MTS, WST 또는 트립판 블루 등을 사용하여도 본 발명의 구현이 가능함은 본 발명의 취지상 당업자에게 이해될 수 있을 것이다.

실시예 1: 미세 유체 세포칩 구조물 제작

도 2와 같은 구조의 미세유체 세포칩 구조물을 제작하였다. 먼저, 공기압 밸브 시스템을 구성하는 칩의 경우 실리콘 웨이퍼(silicon wafer)기판 위에 감광물질 SU-8 50을 굽는 과정으로 증착시켜 패터닝 하였다. 단일세포층을 형성시키는 칩의 경우 실리콘 웨이퍼(silicon wafer)기판 위에 감광물질 SU-8 2150을 굽는 과정으로 증착시켜 패터닝하여 높이 213μm의 미세유체 채널을 제작하였다.

각각의 주형에 pre-PDMS(Sylgard 184, Dow Corning)와 경화제를 10:1의 비율로 혼합된 고분자를 붓고 60℃에서 2시간 동안 경화시켰다. 공기압으로 작동되는 얇은 PDMS막은 페트리 디쉬(90 × 15 mm) 위에 pre-PDMS(Sylgard 184, Dow Corning)와 경화제를 10:1의 비율로 혼합된 고분자와 4:1로 헥산을 혼합하여 500 rpm에서 20초, 4000 rpm에서 50초 동안 스핀 코팅하여 60℃에서 2시간 동안 경화시켰다. 약 9 μm의 얇은 PDMS 막은 두 칩의 구조물 사이에 위치되어 있으며 이렇게 형성된 PDMS 미세유체 구조물들을 산소 플라즈마(O₂ plasma, CUTE, Femto Science, South Korea, 100W, 0.2-1 mbar, 4 min)를 이용하여 부착하였다. 두 층으로 형성된 미세유체 칩(도 1c)을 커버슬립과 부착시켜 세포배양이 가능한 미세유체 칩 제작을 완성하였다.

도 2에 명시되어 있는 각 유닛은 다음과 같은 특성을 나타내고 있다. 도 1b는 두 개의 유체 주입구(3, 5)나 배출구(6)에서 유입되는 유체의 흐름을 제어 할 수 있는 주입구 공기압 밸브와 배출구 공기압 밸브를 구비하는 것을 특징으로 한다. (1)은 일정한 유속에 의해 두 주입구로부터 서로 다른 농도를 갖는 유체가 만나 채널 안으로 유입되면서 분자의 확산에 의해 다양한 농도를 형성하는 미세유체의 확산 희석(microfluidic diffusion diluter)구간이다. (2)와 같이 대량발굴탐색(HTS: High througput screening)을 위하여 배열된 컴파트먼트(compartment)는 세포 배양용기 역할을 한다.

실시예 2: 미세유체 칩내에 2차원 단일층의 부착 세포군을 형성

세포배양 용기에서 배양된 간세포 주(chang liver cell line, chang liver cell line, CCL 13, Manassas, VA, USA)를 바닥면으로부터 10⁴ ~ 10⁵ cells/mL을 갖는 현탁액으로 추출하여 배출구에 흘려주었다. 배출구에서부터 흘러간 세포는 도 2a의 배양 구간(2)에 접근하여 단일 층의 부착 세포군을 형성한다. 하루에 2~3 번씩 배지 RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA, with 10% fetal bovine serum(Gibco, Grand Island, NY, USA), 1% Penicillin-Streptomcyin (Gibco, Grand Island, NY, USA))를 배출구에 흘려주어 교체하여 약 48시간 동안 배양하였다.

실시예 3: 표면부착 세포의 위치에 따라 서로 다른 화학물질 농도 환경에 노출

상기 실시예 2에서와 같이, (2)번 영역에 배양된 세포에 대한 활성도를 측정할 수 있는 독성물질의 농도 그레디언트(gradient)를 형성할 수 있다. (3)과 (5)에 서로 다른 농도를 갖는 독성물질을 주입하면 (1)구간에서 두 용액이 만나게 되고 이를 통하여 형성된 층류(laminar flow)가 시간이 지남에 따라 확산됨으로써 다양한 농도의 독성물질을 갖는 배양용기를 만들게 된다.

(3)번 주입구에 배지를 주입하고 (5)번 주입구에 독성물질로서 카드뮴이 포함된 배지를 실린지 펌프(KDscientific, USA)를 이용하여 10 μL/min의 유속으로 5분간 주입 후 1 μL/min의 유속으로 15간 주입하여 카드뮴의 농도 그레디언트를 형성하였다. 유체의 공급을 중단한 상태로 이전에 형성된 농도 그레디언트 상태에서 노출시키기 위하여 도 2b의 (7), (8)번 PDMS 막 밸브를 닫은 채로 12시간이 동안 37℃ 온도 및 5% 이산화탄소 농도의 환경에서 세포를 배양 시켰다. 광학 현미경을 이용하여 명시야(bright field) 이미지로 세포의 개수 및 세포 형태(morphology, circularity)를 관찰하여 도 8에 각각 나타내었다.

도 8은 시료로서 세포 독성물질을 도 2(a) 칩의 세포배양 구간에 처리하기 전과 후의 사진 및 각 세포에서 원형성 값을 분석한 등고선 차트이다. 이 차트는 미세 유체 칩 내에서 이루어지는 독성 물질의 농도에 따라 세포의 원형성을 분포도를 통해 나타낸 것이며 이를 통해 세포독성물질을 처리한 후 세포들이 사멸되어 각 세포들의 원형성이 증가하였음을 알 수 있다.

실시예 4: MTT 분석법을 이용한 세포사멸 분석

미세유체 칩 내에서 적절하게 배양된 세포에 독성 물질의 처리 후 배지로 10배 희석된 MTT용액을 배출구(6)에 주입하였다. 막밸브를 음의 압력으로 하여 용액을 각 컴파트먼트에 첨가한 후 양의 막밸브로 용액의 흐름을 차단하였다. 약 20분간의 결정 시간을 둔 후 다시 용액을 첨가하였으며 MTT 포마잔 결정에 의한 흡광도 값은 명시야 이미지에서 유효한 화소의 값을 갖는 범위 내에서 이루어져야 하기 때문에 결정 생성 시간을 최적화 할 필요가 있어 총 80분간 포마잔 결정의 형성 시간을 주었다. 약 80분 이후에는 결정 생성의 증가를 보이지 않았으며, 이에 대한 결과는 도 9에 나타내었다.

결정 생성 후 기존의 MTT 검색법과는 달리 유기용매(예, DMSO)로 포마잔의 결정을 녹이는 과정은 필요 없으며, 영상 획득 및 처리를 위한 현미경을 이용하여 세포 내 포마잔이 형성되어 있는 채로 명시야(bright field) 이미지를 획득 하였다. MTT 포마잔의 약 550 nm에서 최대 흡광 파장을 갖기 때문에 광학 이미지를 얻을 때 단파장의 광원을 얻기 위해 530 nm에서 최대 투과도와 45 nm의 띠나비를 갖는 대역 여과기 필터(bandpass filter)를 사용하였다.

< 참고예 : 기존의 MTT 분석법>

기존의 MTT 분석법에 따르면 세포를 96웰에 적당한 양으로 배양 시키고 독성물질의 처리 후 각 웰에 배지로 10배 희석된 비수용성의 노란색 MTT (3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액 100 μL를 첨가한다. 세포 내 포마잔 결정이 생성되도록 37℃ 온도 및 5% 이산화탄소 농도의 인큐베이터에 보관한다. 약 4시간 후 여분의 배지를 제거한 후 세포내 형성된 비수용성의 포마잔을 용해시키기 위해 각 웰에 DMSO를 200 μL씩 첨가한 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 분석하였다.

실시예 5: 세포 영상 분석을 통하여 각 세포들의 형태 인자 및 흡광도 값들의 추출 및 이를 이용한 단일변수 분석 및 다중변수 분석

상기 실시예 4에 기술한 과정대로 얻은 각각의 명시야 이미지를 영상분석 프로그램을 이용하여 각 컴포넌트(2)에 있는 세포의 개수/형태/세포당 흡광도 값을 정량화함으로써 세포의 고사(apoptosis)진행 정도를 분석하였다.

상기 분석결과, 비교적 낮은 농도의 카드뮴에 노출된 컴파트먼트(compartment)의 세포는 낮은 원형성 값(circularity)를 갖지만 높은 농도의 카드뮴에 노출된 컴포넌트의 세포는 높은 형태 인자 값(circularity)을 갖는 분석 결과를 얻을 수 있었다. 배양용기에 부착되어 자라는 세포의 형태 인자 평균값은 0.5~0.7 사이에 존재하며, 고사사멸과정을 거치며 형태가 변한 세포의 형태 인자 값은 0.8 이상의 값을 갖는 것을 알 수 있다. 이에 대한 원형성 값들의 분포 변화를 도 8에 나타내었다.

배양용기에 부착되어 자라는 세포 내에 염색된 포마잔의 흡광도 값은 0.4~0.5 사이에 존재하며, 고사사멸 과정을 거치며 원형성이 증가하기 시작하는 세포 내에 염색된 포마잔의 흡광도 값은 0.6~0.7 사이에 존재하여 비교적 높은 값을 갖는다. 반면 고사사멸이 더욱 악화된 세포 내에는 MTT 포마잔 결정으로 인한 세포 염색이 거의 이루어지지 않아 0.1~0.3 정도의 작은 흡광도 값을 나타내었다.

도 10에는 세포의 원형성과 세포 내 형성된 포마잔의 흡광도 값의 분포를 독성물질의 농도별로 나타내었다. 도 10의 중간에 도시된 (b)의 128μM의 독성물질 농도에서는 세포들이 사멸과정을 거침에 따라 세포가 응축하게 되고 원형성이 증가하면서 세포층이 두꺼워지게 되어 독성물질 농도 0μM(a에 도시)에 비해 흡광도가 증가하였다. 그러나 240.5μM(c에 도시)로 더 높은 농도의 독성물질에 노출되게 되면 세포가 전체적으로 사멸되어 전반적으로 원형성이 높게 유지되는 반면 흡광도는 0μM에 비해 감소하였다.

도 11에는 각각의 세포를 원형성과 세포 내 형성된 포마잔의 흡광도 값을 산포도(Scatter Plot) 그래프로 나타내고, 상기 산포도(Scatter Plot)의 기준값에 대하여 상하좌우 영역 내 대표성 있는 세포에 대해 촬영된 이미지를 원형성 및 흡광도와 함께 도시하였다. 도 11에서 좌측상단에 도시된 촬영이미지는 0μM에서의 세포들이 많이 분포하는 구간으로서 대표성을 갖는 두 세포의 원형성은 0.37 / 0.67의 넓은 분포를 가지며 0.43 / 0.52의 흡광도를 갖는다. 우측상단의 이미지는 128μM의 독성물질 농도에 노출된 세포들이 많이 분포하는 구간으로서, 대표성을 갖는 두 세포는 0.95 / 0.93의 높은 원형성과 0.61 / 0.66의 높은 흡광도를 갖는다. 우측하단의 이미지는 240.5μM의 독성물질 농도에 노출된 세포들이 많이 분포하는 구간으로서 대표성을 갖는 두 세포는 0.95 / 0.92의 높은 원형성을 갖지만 0.20 /0.19의 낮은 흡광도를 갖는다. 좌측 하단의 이미지는 세포의 사멸과정 중 응축이 나타나는 고사과정에서 찌그러짐이 나타나는 괴사과정의 세포들이 나타나는 구간으로 0.45 / 0.73의 낮은 원형과 0.14 / 0.16의 낮은 흡광도를 갖는다.

도 12는 각각의 화학 물질 노출 농도에서 세포 내 형성된 포마잔의 흡광도 값을 정량화 하여 용량-반응관계의 그래프로 나타내고, 상기 그래프를 이용하여 화학물질의 독성이 나타나는 LC50 또는 EC50 값을 얻을 수 있는 단일변수 분석 (Single parameter Analysis) 사례이다.

상기 실시예의 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명에 따른 MTT 분석법을 이용하여 세포사멸 분석을 실시하면, 개별 세포별 형태인자에 대한 상세한 분석과 흡광도 인자의 분석을 통해 개별 세포들의 세포사멸 과정에 대한 정확한 분석 데이터 및 이탈적인 데이터를 보여주는 세포에 대한 추적인 분석 데이터까지 수득이 가능하여, 기존의 마이크로플레이트 리더와 같은 장비를 사용한 용량-반응 관계의 획득은 물론, 현재 세포 사멸과정 연구에 다양하게 활용되고 있는 F.A.C.S.와 같은 고가 장비에서 얻을 수 있는 수준의 정보를 최소한의 세포전처리와 저렴한 비용의 장비를 사용하여 얻을 수 있다.

따라서 본 분석법은 기존의 분석법으로 세포 사멸 분석 수행시 치명적인 오류가 보고된바 있는 제조 나노물질의 세포 독성 평가 및 다양한 세포사멸 기전 등을 연구하는 분야 등에 보다 폭넓게 이용될 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

1: 미세유체의 확산 구간
2: 세포 배양 구간
3, 4, 5: 유체주입구
3: 배지주입구
5: 시료주입구
6: 배출구
7, 8: 막 밸브 채널
9, 10: 막 밸브를 제어하는 압력 주입구

Claims (11)

1. 분석 대상 세포를 배양하여 단일 세포층을 형성하는 단계;
   상기 단일 세포층을 시료에 노출시켜 세포 사멸 반응을 유도하는 단계;
   상기 세포 사멸 반응이 유도된 단일 세포층에 흡광염료를 주입하고 결정형성 또는 세포 염색을 유도하는 단계;
   상기 흡광염료를 이용한 결정형성 또는 세포염색이 이루어진 단일 세포층을 촬영하고 촬영된 이미지로부터 세포별 흡광인자, 세포의 개수 및 형태인자값으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포사멸 인자를 추출하는 단계; 및
   상기 추출된 세포사멸 인자의 변수분석을 하여 세포사멸 기전(Mechanism) 및 세포사멸 정도를 촬영된 이미지로부터 각 세포가 차지하는 면적(area) 및 원형성(Circularity)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 형태인자값 또는 흡광인자로서 세포별 평균 흡광도(Mean Absorbance) 및 세포별 총 흡광도(Integrated Absorbance)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포별 흡광도를 분석하여 정량화하는 것을 특징으로 하는 세포사멸 정량분석법.
   
   원형성 = 4π x (세포면적 / 세포둘레²)
   
   세포별 평균 흡광도(Mean Absorbance)
   = 세포 영역 내 각 픽셀들의 흡광도값의 평균
   
   세포별 총 흡광도 (Integrated Absorbance)
   = 세포별 평균 흡광도 x 세포가 차지하는 영역의 픽셀
   
2. 제1항에 있어서, 상기 분석 대상 세포의 단일 세포층은 미세유체 세포칩, 멀티 웰 또는 슬라이드 글라스에 형성되는 것을 특징으로 하는 세포사멸 정량분석법.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 단일 세포층은 배지주입구, 상기 배지주입구와 별개로 형성되는 시료주입구, 상기 배지 주입구 및 시료 주입구로부터의 채널이 합류하여 연결되는 미세유체 채널을 구비하는 미세유체의 확산 구간, 상기 미세유체의 확산 구간에 연결되고 세포의 부착 배양이 이루어지는 세포 배양구간 및 상기 세포 배양 구간에 연결되는 배출구를 포함하는 미세유체 세포칩에 분석 대상 세포를 배양하여 형성하는 것을 특징으로 하는 세포사멸 정량분석법.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 흡광염료로는 MTT(3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)), MTS(5-(3-caroboxymeth-oxyphenyl)-2H-tetra-zolium inner salt), WST(4-[3-(4-Iodophenyl)-2(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]1,3-benzene disulfonate) 및 트립판 블루(trypan blue)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 세포 사멸 정량 분석법.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 단일 세포층의 촬영은
   광학이미지 취득을 위한 가시광선영역에서의 광원으로서 텅스텐 램프(tungsten lamp), LED 광원 및 레이저 광원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 광원;
   대물렌즈로부터 모아진 세포영상을 검출하는 CCD(Charge Coupled Device) 카메라:
   단일세포층을 포함하는 세포 배양시스템을 배치시키기 위한 세포배양 플랫폼;
   사용되는 흡광염료에 적용되는 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 광원에서 파장을 선택적으로 통과시키기 위한 장치: 및
   상기 CCD 카메라로부터 얻어진 이미지를 분석하여 세포별 흡광인자, 세포의 개수 및 형태인자값으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포사멸 인자를 추출하고 세포사멸과정을 정량화 할 수 있는 영상처리 프로그램
   을 포함하는 세포 영상 분석 장치를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 세포 사멸 정량 분석법.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 흡광염료로서 MTT를 사용할 경우 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 선택적으로 통과되는 파장은 550nm ± 60nm의 파장영역이고, MTS 포마잔을 흡광염료로 사용할 경우 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 선택적으로 통과되는 파장은 490nm ± 60nm의 파장영역이며, 트립판 블루를 흡광염료로서 사용할 경우 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 선택적으로 통과되는 파장은 590nm ± 80nm의 파장영역인 것을 특징으로 하는 세포 사멸 정량 분석법.
   
7. 제4항에 있어서,
   상기 흡광염료로서 MTT를 사용하는 경우 산화·환원반응에 의한 포마잔(formazan) 결정의 형성을 유도하기 위한 최적 시간을 10 ~ 240 분으로 부여하는 것을 특징으로 하는 세포사멸 정량분석법.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 세포별 흡광인자로서 세포별 흡광도의 추출은 영상획득 구성요소를 구비한 현미경에서 촬영된 이미지 내의 세포들을 식별하여 분할(segmentation)하기 위해 촬영된 이미지를 영상분석 프로그램에서 분석하고, 분석되어 선택된 각각의 세포는 원본 이미지에서 신호 (I)를 이미지의 세포를 포함하지 않은 배경영역의 신호값 (I₀)으로 나눈 뒤 로그값을 취해 흡광도로 변환시킨 이미지에 덮어져 촬영된 이미지 내의 각 세포별 흡광도를 추출하는 것을 특징으로 하는 세포사멸 정량분석법.
   

   
9. 삭제
10. 제1항에 있어서,
    세포사멸 정도를 정량화 하는 단계에서 이미지 분석을 통해 얻어진 세포별 흡광도를 포함하는 변수들을 다중 변수 분석하여 용량-반응 곡선을 얻고 세포 사멸 진행 정도의 정량화를 실시하는 것을 특징으로 하는 세포 사멸 정량분석법.
    
11. 광학이미지 취득을 위한 가시광선영역에서의 광원으로서 텅스텐 램프(tungsten lamp), LED 광원 및 레이저 광원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 광원;
    대물렌즈로부터 모아진 세포영상을 검출하는 CCD(Charge Coupled Device) 카메라:
    단일세포층을 포함하는 세포 배양시스템을 배치시키기 위한 세포배양 플랫폼;
    사용되는 흡광염료에 적용되는 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 광원에서 파장을 선택적으로 통과시키기 위한 장치; 및
    상기 CCD 카메라로부터 얻어진 이미지를 분석하여 세포별 흡광인자, 세포의 개수 및 형태인자값으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포사멸 인자를 추출하고 세포사멸과정을 정량화 할 수 있는 영상처리 프로그램;
    을 포함하는 세포사멸 정량분석을 위한 세포 영상 분석 시스템.

Images