CN107850592A - 确定细胞表型的方法 - Google Patents

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Abstract

提供确定生物样本中细胞的表型的方法。所述方法是基于：基于从具有多个隔室的衍射光栅接收的衍射图案来测量所述细胞的折射率，所述隔室具有横向尺寸以使得所述细胞可适合其中。

Description

确定细胞表型的方法
相关申请
本申请要求2015年3月9日提交的美国临时专利申请号62/130,259的优先权权益，所述美国临时专利申请的内容以全文引用的方式并入本文。
发明领域和背景
生物传感在工业中和尤其在食品工业中是重要的领域，其中对生物污染物的水平诸如食品中的细菌水平进行检测和监测在维持现代健康标准中是至关重要的。在食品工业中，对离开生产线的产品进行持续监测的需要是特别重要和成问题的，因为导致产品生物污染的任何生产故障必须在产品被运送销售之前检测到。这目前往往借助测试从来自每个生产线和批次的样本生长的培养物来进行。然而，由于生长和测试这类培养物所花费的时间，甚至使用现代加速的培养物生长和测量技术，在检测到污染之前大量的产品可能已被生产和包装好准备运送，因此导致可观的损失。存在诸如表面等离子体共振(SPR)的技术使得能够持续监测产品中的生物污染物水平，但这类技术是价格高昂——典型装置花费好几万美元。由于在不同生产线上生产大量不同产品，这类生物传感技术对于食品工业中的一般用途而言往往过于昂贵，并且似乎不存在可对食品进行有成本效益的普遍在线监测的低成本生物传感设备。
近年来，多孔Si (在下文中PSi)已作为有前途的纳米材料出现，用于生物传感应用和用于传感具有纳米级尺寸的其他靶标。常见PSi基光学传感器和生物传感器由纳米孔(通常具有小于20 nm的尺寸)或中孔(通常在20-100 nm范围内)的薄膜组成，因此具有远小于所用光波长的截面尺寸。在产生薄膜装置期间孔一般随机产生。这些传感器的操作是基于用靶标分析物替换孔中的介质和/或用靶标分析物渗入，并且观测所得光反射率的变化。PSi膜的有效折射率变化表现为反射光谱中的波长偏移。仅渗透入这些纳米结构的靶分子可被检测到。实际上，已成功证实了对诸如荧光分子、有机磷酸酯、挥发性有机化合物、DNA和蛋白质的各种化学和生物分析物的传感和生物传感。许多这些研究采用反射干涉测量傅立叶变换光谱学(RIFTS)的方法来监测中孔Si薄膜内的生物相互作用。
这类填充或部分填充的随机定位的孔可被简单地视为具有与未填充孔不同的有效折射率，因为孔远小于光波长。因此，孔的随机性质不导致光的散射，而是导致来自硅基板和孔(填充和未填充)的组合的总反射光最终达到平衡。然而，这种检测方案不适用于靶向大的生物或其他物质，诸如大小为大约几百纳米直至几微米和更大的那些，包括细胞、细菌和病毒。如果生产具有这类较大的孔的多孔硅，则基板变成被称为“黑硅”的材料，其因从大尺寸孔的随机分布强力散射光而看起来如此。基本上所有入射光被孔随机散射并且吸收于介质中，使得所述入射光不能用于传感。因此，常规多孔硅技术不能用于对大小为传感所用光的波长的绝大部分的较大靶标进行传感或生物传感。
存在替代方法，所述方法在生物传感器表面的顶部上、而非在其孔中直接捕获较大细胞靶标后监测反射光谱的强度变化。然而，这些类型的传感器是受限的，因为反射光谱的强度变化可能起因于不可预测的来源，诸如环境效应和非特异性结合事件。另外，灵敏度可能是低的，因为这类表面结合传感器不利用大孔体积。
近年来已作出尝试来开发用于对大体而言细菌和具体而言病原菌进行快速检测的新生物测定法和生物传感器。然而，尽管在领域内取得显著进展，但当前技术缺乏“实时”或在实验室环境外检测微生物的能力。
WO 2014/155381教导了用于细菌监测的方法和装置。
发明内容
根据本发明的一些实施方案的方面，提供确定生物样本中细胞的表型的方法，所述方法包括：
(a)在包含有序阵列的隔室的衍射光栅上对包括细胞的生物样本培养预定时间，所述隔室具有横向尺寸以使得细胞可适合其中；
(b)在利用经一系列波长的照明对表面进行照射后，在预定时间内连续检测从包括细胞的衍射光栅衍射的照明，并且从其中产生输出光谱信号；
(c)从输出光谱信号确定培养有生物样本的隔室的有效光学厚度(EOT)的时间依赖性变化，时间依赖性指示生物样本中细胞的表型。
根据本发明的一些实施方案的方面，提供确定细胞的表型的方法，所述方法包括：
(a)将细胞置于衍射光栅的多个隔室中；
(b)通过衍射光栅衍射多色光束；
(c)基于从衍射光栅接收的衍射图案计算指示细胞的折射率的参数；以及
(d)确定参数的变化的时间依赖性，时间依赖性指示生物样本中细胞的表型。
根据本发明的一些实施方案，参数包括隔室的有效光学厚度(EOT)，并且变化是相对于不存在细胞时EOT的值。
根据本发明的一些实施方案，衍射包括实现反射式衍射。
根据本发明的一些实施方案，衍射包括实现透射式衍射。
根据本发明的一些实施方案，多色光束一般是白色的。
根据本发明的一些实施方案，生物样本包括测试剂。
根据本发明的一些实施方案，衍射光栅包括粘附至隔室的测试剂。
根据本发明的一些实施方案，所述方法进一步包括在不存在测试剂时进行所述方法。
根据本发明的一些实施方案，参数的变化是存在测试剂时参数值相对于不存在测试剂时参数值的值的变化。
根据本发明的一些实施方案，时间依赖性指示测试剂对生物样本中细胞的表型的影响。
根据本发明的一些实施方案，表型选自由存活力、运动性、生物膜产生、定殖、蛋白质产生和脂质产生组成的组。
根据本发明的一些实施方案，测试剂是细胞生长抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，测试剂是杀细胞剂。
根据本发明的一些实施方案，当时间依赖性指示有效光学厚度(EOT)减小时，测试剂是杀细胞剂。
根据本发明的一些实施方案，当时间依赖性大致上平坦时，测试剂是细胞生长抑制剂。
根据本发明的一些实施方案，将细胞用衍射光栅培养以便在添加测试剂之前填充隔室。
根据本发明的一些实施方案，表型是存活力。
根据本发明的一些实施方案，表型是运动性。
根据本发明的一些实施方案，细胞是细菌。
根据本发明的一些实施方案，细胞是真核细胞。
根据本发明的一些实施方案，真核细胞是癌细胞。
根据本发明的一些实施方案，测试剂选自由抗生素、化疗、放射性同位素、除草剂和杀真菌剂组成的组。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供计算机软件产品。计算机软件产品包括其中存储程序指令的计算机可读介质，所述指令在由数据处理器读取时，使数据处理器：接收涉及光的衍射图案的数据，所述光衍射离开具有容纳细胞的多个隔室的衍射光栅；基于衍射图案计算指示细胞的折射率的参数；以及确定参数的变化的时间依赖性，时间依赖性指示生物样本中细胞的表型。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。虽然与本文中描述的那些类似或等同的方法和材料可在本发明的实施方案的实践或测试中使用，但下文描述示例性方法和/或材料。在冲突的情况下，将以本专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅为说明性的，并且不意图为必然限制性的。
本发明的实施方案的方法和/或系统的实施方法可涉及手动、自动、或以它们的组合进行或完成选定任务。此外，根据本发明的方法和/或系统的实施方案的实际仪表和设备，可使用操作系统，通过硬件、通过软件或通过固件或通过它们的组合来实施几个选定的任务。
例如，用于进行根据本发明的实施方案的选定任务的硬件可实施为芯片或电路。作为软件，根据本发明的实施方案的选定任务可实施为通过使用任何合适的操作系统的计算机执行的多个软件指令。在本发明的示例性实施方案中，根据如本文中所述的方法和/或系统的示例性实施方案的一个或多个任务通过数据处理器，诸如用于执行多个指令的计算平台来进行。任选地，数据处理器包括用于存储指令和/或数据的易失性存储器，和/或用于存储指令和/或数据的非易失性存储器，例如磁性硬盘和/或可移动介质。任选地，还提供网络接线。任选地，还提供显示器和/或诸如键盘或鼠标的用户输入装置。
附图的若干视图的简要说明
本发明的一些实施方案在本文中仅以举例方式参考附图和图像来描述。现在在详细地特定参考附图的情况下，要强调所示详情是以举例方式并且出于说明性论述本发明的实施方案的目的。在这点上，关于附图所做的描述使得本领域技术人员对可如何实践本发明的实施方案显而易见。
在附图中：
图1A-F示出：增殖细菌细胞的2D柱周期性阵列的俯视图(图1A)，从孔顶部和底部反射的光产生入射束与反射束之间的相位延迟(图1B)，与孔周期性相关联的干涉光谱(图1C)，原始光谱的快速傅立叶变换(FFT) (图1D)，展现在孔内细菌细胞存在的存在下对多孔层的折射率的影响的图示，以及展现孔中的细菌部分可通过收集有效光学厚度(EOT)来监测的图表。
图2是说明适合用于在将细菌悬浮液受控引至表面和/或添加药物/物质之前、期间和/或之后，对从具有反射周期性形貌学(PRT)的表面获得的光干涉测量谱进行监测的方法的流程图。
图3描述了其中将有限数量的细胞置于光子微阵列衍射光栅上的程序。EOT的偏移与由细胞增殖引起的衍射光栅中细胞的数量增大有关。
图4展现限制细胞生长的抗生物质的添加可通过与物质的浓度成比例的EOT偏移速率的诱发变化来追踪。当EOT偏移的速率变得不显著时可确定MIC (最低抑制浓度)。
图5A和5B示出细菌悬浮液中杀细菌分子的存在可通过与所述物质的浓度成比例的EOT偏移速率的诱发变化来追踪。
图5C示出细菌悬浮液中抗附着因子的存在可通过与所述物质的浓度成比例的EOT偏移速率的诱发变化来追踪。
图6A至6F3展现在孔处的细胞粘附稳定性。
图7是示出细菌易感性测定的结果的图表。示出了随时间变化的相对EPT偏移。
图8是示出其中监测对不同药物机制的细菌动力学反应的实验的结果的图表。示出了随时间变化的相对EOT偏移。
图9是示出其中监测对营养缺乏的细菌依赖性的实验的结果的图表。示出了随时间变化的相对EOT偏移。
图10是示出其中监测存在防附着药物时细菌定殖动力学的实验的结果的图表。示出了随时间变化的相对EOT偏移。
图11是示出其中监测存在药物时细菌粘附的实验的结果的图表。示出了随时间变化的相对EOT偏移。
图12A和12B是展现硅光子阵列(SiPA)定殖取决于其表面官能的图表。
图13A和13B是展现SiPA定殖速率随细胞浓度变化的图表。
图14是示出根据本发明的一些实施方案进行的研究的实验和光学原理的示意性说明。
图15A示出在将细菌引入至孔中之前和之后获得的例示性光谱。
图15B示出图15A中所示的例示性光谱的FFT。
图16A-C是示出直接对应于细菌随时间生长的有效光学厚度(EOT)的相对变化的图表。时间0代表将抗生素引入至光子微阵列衍射光栅内的细菌的时刻。(a)头孢曲松钠(CRO)的MIC被观测到介于0.005-0.05 μg/mL之间。(b)环丙沙星(CIP)的MIC被观测到介于0.005-0.05 μg/mL之间。(c)三甲氧苄二氨嘧啶(TMP)的MIC被观测到介于5-50 μg/mL之间。
图17是示出在相同浓度下环丙沙星、头孢曲松钠和三甲氧苄二氨嘧啶的交叉比较的图表。在5 μg/mL的各抗生素下，发现TMP低于MIC浓度(蓝色)，CIP是抑细菌的(洋红色)，并且CRO是杀细菌的(绿色)。
图18是通过电子显微术成像的在光子微阵列衍射光栅上生长的间充质干细胞的图像，其中红色箭头指向可看见细胞穿透入隔室的位置。
发明特定实施方案的描述
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，要理解本发明不必局限于应用于以下描述中阐述以及/或者附图和/或实施例中说明的构造细节和组件的布置和/或方法。本发明能够具有其他实施方案或者以各种方式实践或实施。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，要理解本发明不必局限于应用于以下描述中阐述或实施例所例示的细节。本发明能够具有其他实施方案或者以各种方式实践或实施。
本发明的一些实施方案在下文描述并且可在本文中所描述和要求保护的方法的实施方法中使用。
提供用于对诸如细胞、细菌或病毒形式的微生物的大靶标或者其他大的具体生物靶标或其他靶标的浓度进行检测和测量的示例性方法和系统。
本公开的方法和系统基于将靶标要素捕获于孔或微隔室中，并且可通过指出其以下特性来简要概述：
(a)这类靶标被捕获于具有一定大小的孔或微隔室中，所述大小被选择以容纳预定靶标，并且因此应至少与靶标一样大。另外，可将微隔室或孔的表面修饰或剪裁以增强细胞至孔的捕获和粘附。例如，可针对待检测的靶细胞和细菌的特定类型调整孔的表面化学、孔表面的粗糙度和其可湿性(疏水或亲水)。
(b)布置孔/隔室的次序以使得入射于其上的光被散射或反射，但并非随机地，而是散射或反射成一组衍射级，诸如光栅特有的衍射图案。在这种情况下，如由反向散射光测量的衍射图案的零级允许对孔/微隔室的有效光学厚度(EOT)进行直接传感。因此，衍射光的零级预期显示由孔的EOT所确定的干涉图案。可调整孔的深度以允许EOT的灵敏检测。
(c)通过使用孔中介质的折射率的变化以指示孔内靶细胞的存在来实现传感。介质通常是用来维持靶细胞的液体或缓冲液，并且其折射率的变化改变进入孔和从孔反射的光的EOT。
(d)用来检测EOT、当EOT大于光的光波长(EOT > λ)时特别有用的一种具体方法(但不一定是仅有的一种方法)是通过使用快速傅立叶变换分析，借此反射光的光谱被傅立叶变换以获得单一强度峰，所述峰的位置表征EOT。
(e)用于实施上述装置和方法的特别便利的布置使用光子微阵列衍射光栅，其原理描述于图1中。在本发明的一些实施方案中，使用2维周期性大多孔硅阵列结构(MPSiAS)。可利用各种制造技术来制造这种装置，诸如电化学方法或使用反应离子蚀刻(RIE)的干蚀刻法。然而，要理解所述方法和结构可通过其他材料和平台实施，诸如其他半导体、有机聚合物、凝胶、玻璃和甚至金属表面。
现在考虑上述特征的更多细节。因为靶标的大小等于或大于常用光源(包括紫外、可见和近红外光谱范围)的波长，不能使用具有足够大以容纳这些靶标的孔大小的常规PSi基板，因为如先前提及的，由于孔的大的大小分布和随机位置，在包含这类大孔的无序集合的基板上入射光学照明将导致随机散射光。在本公开的装置和方法中，使用孔或微结构的二维(2D)有序阵列，在垂直于孔平面的方向上照射。
这种结构克服了对具有大于测量所用光的波长的大小的孔进行光学测量的问题。这种结构是有效的层状相位光栅，并且可便利地以光子微阵列衍射光栅(例如，MPSiAS)的形式实施，具有被配置成适合靶标的大小的孔径。例如，如果待捕获细菌细胞的典型大小在0.5至2 μ范围内，则孔或微隔室的大小可制造为1至10 μ范围内以容纳那些细胞。然后这些结构用作用于检测诸如细菌细胞的靶标的光学传感平台。
具有大小与细菌细胞可比的孔径的PSi光子晶体的这类周期性结构可通过光刻法接着电化学阳极化方法(使用氢氟基溶液)或诸如反应离子蚀刻(RIE)的干蚀刻技术将孔的图案蚀刻成标准的、市售可得的硅片来制造。两种方法在半导体工业中都是众所周知的并且与标准硅加工技术相兼容。
所得PSi结构充当层状或相位光栅，其根据由物理光学决定的光栅的周期性与光波长之间的严格关系以各种角度将反射光散射成一组衍射级。如果正交于孔表面收集反射光，则仅测量零级衍射。这通常通过使用具有适当f值的光学透镜以及用于传送入射光和收集反向散射的零级反射光的光学纤维来实现。在这种情况下，仅与孔深度相关联的相位延迟促成由反向散射光产生的干涉图案。这种干涉图案被用于对孔的有效光学厚度(EOT)进行测量。
孔内靶细胞的存在改变孔中介质的折射率，因此改变层状光栅中孔的有效光学厚度(EOT)。填充有靶细胞的大孔的百分比越大，则EOT的变化越大。因此，EOT的测量使得能够发现靶细胞于寄主溶液(host solution)中的浓度。对层状光栅的EOT的测量可通过用多色、优选宽频带的光源照射光子微阵列衍射光栅(例如，MPSiAS)来实时进行(例如，在少于一小时或少于一分钟或少于一秒或少于100 ms或少于10 ms或少于1 ms或少于100 μs或少于10 μs或少于1 μs内)。待测量的波长范围内的反射光谱是从光子微阵列衍射光栅(例如，MPSiAS)的顶表面的反射以及从在穿过孔之后反射和从其底表面反射的光的反射的复杂组合。可测量反射光谱的一种便利方法是通过对此光谱进行快速傅立叶变换(FFT)分析，由此获得单一强度峰，所述峰的位置表征层的有效EOT。然而，要理解可使用任何其他光谱分析方法或直接光程差方法。这提供对由靶细胞填充的孔的百分比(有时称为孔的“填充因子”)的测量。
因此，当孔中的寄主分析物(host analyst)被待检测的靶细胞替换时，EOT因井孔内光学介质的折射率改变而改变，并且因此FFT分析的输出峰的位置也发生改变。峰位置的偏移越大，孔中靶细胞的浓度越高。因为可基本上瞬时进行光学测量，因此这些装置提供对寄主溶液中靶细胞浓度的有效实时测量，仅有的延迟是用寄主溶液的靶细胞有效填充有序孔结构的时间。而且，因为PSi阵列结构可通过常规半导体技术容易地制造，所以可以低成本提供阵列芯片以用于大规模生产运行。另外，光学测量系统也可容易地以小型光谱仪的形式购得，使得与目前用于检测生物污染的常规系统相比，监测系统的成本可实质上更低，可能低两个数量级。
为了对抗甚至在孔结构的内容物无任何变化的情况下将导致EOT偏移的环境变化的影响，可使用双孔结构，其中井孔的内端、即更远离暴露于寄主溶液的表面的那端的截面尺寸小于井孔的外部的截面尺寸。在这种状况下，靶细胞可被捕获于外部中，但不能渗透井孔的更窄内部。然而，寄主溶液渗透内部并且独立于寄主溶液中被捕获靶细胞的存在或不存在而测量。对于这种双井孔结构而言，检测到三个FFT峰与(i)从基板的表面至内部的底面、(ii)从表面至外部的底部和(iii)内部与外部的底部之间的有效光程差相关联。因为靶细胞浓度通过EOT (i)和(ii)相对于EOT (iii)的变化来确定，而所有三种EOT同样地发生环境变化偏移至一级，峰与井孔的内部相关联，所以EOT (iii)可用作补偿环境变化，特别是周围温度变化的基线标志。此外，通过使用合适的选择性涂层，内部可用来检测来自被捕获于井孔的外部中的靶细胞的分泌物。
上述装置和方法使得能够确定光子微阵列衍射光栅(例如，MPSiAS)的井孔中捕获的靶标要素的存在，并且对所述要素在寄主分析物SAME中的比较水平进行定量估计。然而，虽然这可以是用于其中靶标身份唯一的一些应用中的足够的信息，但在许多应用中可存在多种不同靶标要素，都具有与靶标要素相比类似或更小的尺寸，这将使它们能够被捕获在井孔内，从而使得所进行的光学分析将不提供关于特定靶标辨识的信息。因此，例如，在意图确定细菌病原体，诸如大肠埃希氏菌(E. coli)的某些菌株的存在的系统中，在分析物中也可被捕获在装置的孔中的其他细菌的存在将致使关于测定大肠埃希氏菌的水平的测量结果有问题。
因此，为了进行这类特定测定法，可有利的是提供识别机制的一些形式以便特定地捕获意图检测和测量的靶标微生物，因此对装置提供一定水平的选择性。因此，例如，井孔的壁的表面化学可受处理以提供用来捕获意图由装置测量的微生物的捕获探针。然后所述微生物将保持被捕获，而其他细菌和细胞将不被捕获。所需效应可通过用对靶标微生物具有高亲和性的特异性抗体或适体或其他肽涂布来获得。然后可能需要生物机构以确保井孔中捕获探针的定向，使得探针捕获进入的细菌或其他细胞或生物体。所用的识别部分将一般特异于待检测和测量的微生物。因此，可提供一系列不同的检测装置，每种装置用适于该装置意图测量的微生物的识别部分来处理。原则上，本公开中所述的生物传感器可包含几个或甚至一阵列的光子微阵列衍射光栅(每一个可几μm对几μm，至多几mm对几mm)。这些光子微阵列衍射光栅的每一个可被官能化以选择性检测不同类型的微生物，使得可由这种传感器实现多级细菌识别。
本公开的光子微阵列衍射光栅还可用于执行确定微生物的存活力的方法，即为了区分活细胞和死细胞。因此，如果装置用于捕获某种类型的细菌细胞，则引入生长培养基将导致活细菌的数量倍增。这将反映为EOT信号位置的偏移，因为孔的有效折射率升高。
虽然本公开中的阵列已描述为以硅形成，硅是可形成阵列的常见和便利材料，但要理解硅基板的使用不意图以任何方式限制本发明，并且本发明可使用诸如玻璃、塑料基板的其他材料和关于本公开中所述那些的制造技术来实施。然而，硅的一个可能的优点是将其他电子装置和电路与光子微阵列衍射光栅传感器整合在同一芯片上的能力；例如，用于远程传感应用的无线通信能力。
此外，虽然本公开的方法和结构一般描述为适用于检测具有与检测所用光的波长同一级或稍大的尺寸的生物靶标，但要理解这些方法和结构不意图局限于这类生物靶标，而要理解为可适用于检测任何类型(生物或非生物)大小合适的靶标。这类其他应用可见于水技术、环境污染测量、化学工业和其他的领域。
此外，因为具有一系列波长的白光或多色、优选宽频带来源应被用于本公开中所述的装置中和用于进行本申请的方法，并且这类来源可具有充分延长超出其中进行光谱检测的区域的波长，要理解在本公开中和如所要求保护的，对用来进行检测的光或照明的波长的引用要理解为指代其中来源的大多数能量被集中的波长，诸如峰强度的点处的波长，或包含大多数光强的光谱区域的平均波长，或检测器的最大灵敏度的波长，或类似的定义。在任何情况下，术语“入射照明的波长”和具有类似含义的措辞不意图包括基于来源的发射光谱的最末端处波长的限度，在所述最末端处检测效率或照明水平不切实际地低。
另外，靶标要素进入和被捕获、并且测量其有效光学深度的陷阱已在本公开中多方面地描述为孔、微隔室和井孔，所述这些全部理解为涉及同一特征。术语“井孔”在权利要求书中用作代表这些特征中任何一者的简单通用术语。
因此，根据本公开中所述装置的示例性实施方法提供用于在寄主分析物中检测靶标要素的系统，所述系统包括：
(i)基板，其包含形成于其表面中的有序阵列的井孔，至少一些的井孔具有横向尺寸以使得靶标要素可适合其中，
(ii)多色、优选宽频带的照明来源，其发射一系列波长，被设置以便照射基板的表面，
(iii)光学检测器，被设置以使得它收集从基板衍射的光，并输出反射光谱信号，以及
(iv)信号处理单元，其适于分析反射光谱信号以提供井孔的有效光学深度的量度，
其中至少一些的井孔具有至少与由光学检测器检测的照明来源的波长一样大的横向尺寸。
在这种系统中，信号处理单元可使用快速傅立叶变换来分析反射光谱信号。在这种情况下，从得自对反射光谱进行该快速傅立叶变换分析的结果的峰的位置来确定有效光学深度。此外，光学检测器可设置成正交于基板，以使得它收集来自基板的零级衍射光。
另外，在上述系统的替代实施方法中，井孔的有效光学深度可提供对捕获在井孔的阵列内靶标要素的浓度的指示，并且因此还提供对分析物中靶标要素的浓度的指示。
在任何上述系统中，有序阵列的井孔可包括层状光子晶体光栅。另外，基板可为硅基片，并且有序阵列的井孔可通过微电子制造方法来构建。
另外的实施方法可包括诸如先前所述那些的系统，其中靶标要素是具有大于由光学检测器元件检测的照明来源的波长的尺寸的细菌细胞。井孔可包括对意图由系统测量的靶细胞具有高亲和性的捕获探针。这类捕获探针可涂布在井孔的壁上。作为特定实例，靶标要素可为微生物，并且然后捕获探针可为抗体、适体或其他肽中的任一者。这些微生物可为细菌细胞，并且捕获探针可为特异性抗体。此外，井孔可加入细胞营养供应，以使得可在应用营养供应之后观测到微生物的生长。在应用营养供应之后缺乏微生物生长则可被用作微生物通常死亡的指示。而且，在任何这些系统中，至少一些井孔可包括适于待检测靶标元件的识别部分。如果这样的话，则基板可包括至少两个不同区域，在所述区域的每一者中的井孔包括不同的识别部分，以使得不同区域的每一者可同时检测不同靶标要素。
通常，任何上述系统可适于提供微生物的实时检测(例如，在少于一小时或少于一分钟或少于一秒或少于100 ms或少于10 ms或少于1 ms或少于100 μs或少于10 μs或少于1μs内检测微生物)。
另一个实例实施方法可涉及诸任何如先前所述那些的系统，其中至少一些井孔具有横向尺寸不同的至少两个连续部分，并且其中比第一部分更远离表面的第二部分具有小于第一部分的横向尺寸。在这种配置中，第二部分的尺寸可使得靶标要素不能渗透第二部分，而寄主分析物可渗透。在这种情况下，至少一些井孔的第二部分的所测有效光学深度的变化可用作补偿造成第一和第二部分两者的有效光学深度改变的环境条件变化的标志。第二部分可具有对第一部分中捕获靶标可分泌的材料的灵敏度。在这种情况下，灵敏度可用来提供关于井孔的第一部分中捕获的靶标的水平的进一步信息。
此外其他实施方法进行用于检测寄主分析物中靶标要素的方法，所述方法包括：
(i)提供基板，所述基板包含形成于其表面中的有序阵列的井孔，
(ii)利用多色、优选宽频带的照明来照射基板的表面，
(iii)检测从基板衍射的光并且从其中产生反射光谱信号，以及
(iv)从反射光谱信号确定井孔的有效光学深度的量度，
其中至少一些的井孔具有大于所检测多色、优选宽频带照明的波长的横向尺寸。
在这种方法中，从反射光谱信号测定井孔的有效光学深度的量度的步骤可通过快速傅里叶变换分析来进行。在任何情况下，可正交于基板进行检测，以使得从基板衍射的零级光被检测到。靶标要素可为细菌，并且寄主分析物可为水、缓冲溶液、血液、尿液或在食品加工期间所得到的溶液中的任一者。
在这种方法的一些实施方法中，至少一些井孔可具有横向尺寸不同的至少两个连续部分，并且比第一部分更远离表面的第二部分应具有小于第一部分的横向尺寸。在这种方法中，第二部分的尺寸可使得靶标要素不能渗透第二部分，而寄主分析物可渗透。任何这种方法可进一步包括检测至少一些井孔的第二部分的有效光学深度的变化的步骤，以使得可对造成第一和第二部分两者的有效光学深度改变的环境条件变化作出补偿。
本发明的优选实施方案提供适合用于确定细胞的表型的方法。在这些实施方案中，将细胞置于在基板上形成周期性阵列(例如，衍射光栅)的多个隔室中。多色光束优选衍射离开周期性阵列。根据需要，衍射可为反射式或透射式。基于从周期性阵列接收的衍射图案，优选计算出指示细胞折射率的参数。
例如，参数可为EOT或其代替物，并且参数的变化可为EOT的值相对于不存在细胞时其值的变化。EOT的值相对于不存在细胞时其值的变化任选和优选地表示为ΔEOT/EOT0= 2(Δn/n0)L，其中n0是在将细胞引入至组件中之前隔室的折射率，Δn是由于将细胞引入至隔室中引起的折射率变化，并且EOT0是在将细胞引入至隔室中之前的EOT。
然后确定参数变化的时间依赖性，并且基于时间依赖性确定生物样本中细胞的表型。
理想地，所得图案和所计算的参数是连续的，导致在连续时间间隔内参数的连续组值。然而，这类连续组的值难得达到，并且在实践中在多个离散时间示例时获得参数的多个值。值的数量仍然足够用于在预定时间段(例如，几分钟至几小时)获得(例如，通过内插法)参数的时间依赖性。因此，在互相分开足够短时间间隔的不同时间示例时产生一系列参数的样本。对于在预定时间段[t1，t2]内至少几个示例而言，所得时间依赖性是表示参数的值随时间t变化的数学函数。对于任何时间t∈[t1，t2]，数学函数还可为表示参数的值随时间变化的连续函数。
在本发明的各种示例性实施方案中，所得系列参数值经受起始信号处理，诸如但不限于傅立叶变换、快速傅立叶变换、自相关处理、小波变换等等。起始处理的目的是将数学函数的分量描绘于具体域并且允许从进一步处理中去除不需要的分量。例如，可使用傅立叶变换、快速傅立叶变换或小波变换来描绘时间依赖性的各种频率分量，并且去除辨识为噪声的那些频率分量。
表型的确定可借助参考时间依赖性的数据库来进行。数据库可存储在非暂时性计算机可读介质上。这种数据库可包括一个或多个条目，每个条目可包括数据库表型和与此表型相关联的数据库时间依赖性。数据库时间依赖性可为图表的形式，或如下文中进一步详述的表征时间依赖性的一组表征参数的形式。在其中采用起始信号处理的实施方案中，数据库时间依赖性优选对应于这种起始信号处理。几种例示数据库条目示于图4、5A、5B、6A、7-11、12A和13A的曲线图中，其中每条曲线图线可为数据库时间依赖性，并且相关联的图例可代表表型。
所述方法可存取存储数据库的计算机可读介质并且针对最佳匹配所得时间依赖性的数据库时间依赖性搜索数据库。可通过图形比较技术(例如，通过计算在时间依赖性上点之间的距离的平方的总和)来进行匹配。当数据库时间依赖性呈一组表征参数的形式时，数据库时间依赖性的表征参数可与所得时间依赖性的表征参数进行比较，任选和优选一个接一个地比较。
在本发明的一些实施方案中，所计算参数(例如，EOT，或EOT相对于不存在细胞时其值的变化)的时间依赖性由使用从所得时间依赖性中提取的一个或多个表征参数的方法来表征。表征参数可包括例如对时间依赖性的转变点处所计算参数的值。通常，转变点根据所计算参数的时间依赖性被辨识为其中发生泛函转变(functional transition)的点。
本文中所使用的“泛函转变”指的是函数的任何可检测数学转变，非限制地包括给定函数的转变(例如，斜率变化，从递增转变至递减或反之)和从一种特征性泛函行为转变为另一种(例如，从线性转变至非线性行为或从第一非线性行为转变为第二不同的非线性行为)。
泛函转变可例如通过计算时间依赖性的导数和找到其零点来辨识。如将由本领域普通技术人员理解的，函数的转变可由其导数的一者的零点来表征。例如，从递增转变至递减或反之由一阶导数的零点来表征，从凹区域转变至凸区域或反之(拐点)由二阶导数的零点来表征，等。可使用时间依赖性的任何导数。通常，泛函转变可由时间依赖性的第n阶导数的变符来表征，其中n为正整数。
另外或替代地，泛函转变可通过观测时间依赖性与光滑的偏离来辨识。在此实施方案中，泛函转变可用或不用计算时间依赖性的导数来辨识。例如，与光滑的偏离可通过将时间依赖性与已知光滑函数进行比较来辨识。
本文中所使用的短语“生物样本”指的是包括可存活细胞的任何样本。在一些示例中术语分析物可与生物样本交换使用。
根据特定实施方案，生物样本可为临床样本。生物样本可直接使用或可以稀释形式使用。
生物样本可为临床样本、实验室样本或环境样本，
根据特定实施方案，生物样本是从体液如痰液、唾液、血液获得的样本，或通过从组织或体液来源提取、分离或纯化获得的组织源性生物样本。
根据特定实施方案，生物样本是粪便、尿液、血液、痰液或唾液。例如，从个体获得的样本可以稀释或非稀释形式使用。可利用生理可接受的液体如盐水或合适的培养基例如丰富培养基来实现(任何生物样本的)稀释。任选地，根据本示教分析的细胞可根据一般已知方法提前分离。
替代地或另外，生物样本可为实验室接种体或样品或实验室制备物，诸如细菌或真核细胞培养物。
替代地或另外，生物样本来自工业来源。
例如，生物样本可来自食品工业，例如乳品、肉等等。
替代地或另外，生物样本(环境样本)包括废水、淡水、卤水、盐水。从表面(例如，过滤器、动物房、医院设备等)收集的样本。
本文中所使用的“细胞”指的是真核细胞或原核细胞或如下文所例示的它们的部分。
根据特定实施方案，细胞属于微生物，例如细菌、真菌、酵母。
原核细胞可为细菌细胞或蓝绿藻细胞。
根据特定实施方案，细菌细胞可为革兰氏阳性细胞或革兰氏阴性细胞。根据特定实施方案，细菌细胞属于病原菌。
根据特定实施方案，细菌属于选自由以下组成的组(但不限于此)的物种：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，化脓链球菌(Streptococcus pyogenes) (A族)，链球菌属(草绿色族)，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae) (B族)，牛链球菌(S. bovis)，链球菌(厌氧种)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，和肠球菌(Enterococcus)属；革兰氏阴性球菌，诸如(但不限于)淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)，脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)，和卡他布兰汉氏菌(Branhamella catarrhalis)；革兰氏阳性芽孢杆菌，诸如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，痤疮丙酸杆菌(P. acne)，白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)，和类白喉菌的棒杆菌属(需氧和厌氧)，单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，破伤风梭菌(Clostridium tetani)，艰难梭菌(Clostridium difficile)，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，肠杆菌(Enterobacter)种，奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)和其他属，绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，沙门氏菌(Salmonella)，志贺氏菌(Shigella)，沙雷氏菌(Serratia)，拉塞氏杆菌(Rathayibacter)，利夫森氏菌(Leifsonia)，棍状杆菌(Clavibacter)和空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)。
根据特定实施方案，病原菌选自(但不限于)耐万古霉素肠球菌(VRE)，肺炎球菌种，耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌，抗多种药物的金黄色葡萄球菌(MDRSA)，抗多种药物的假单胞菌种，奈瑟球菌属，嗜血杆菌(Hemophilus)属，变形杆菌属，克雷伯氏菌属和大肠埃希氏菌。优选地，病原菌选自VRE、MDSA和抗多种药物的假单胞菌。
根据特定实施方案，细菌细胞属于非病原菌。
根据特定实施方案，细菌是非致病互生、共生、益生细菌菌株或微生物组菌株。
真核细胞可为单细胞或多细胞生物体的细胞系或初生细胞。根据特定实施方案，细胞是非病原细胞(例如，癌细胞、免疫细胞)。真核细胞可为分化细胞或未分化干细胞(例如，多能干细胞、造血细胞、间充质干细胞)或祖细胞。根据特定实施方案，细胞是病原细胞。可根据本示教使用的真核细胞的实例包括但不限于原生动物，酵母细胞，植物细胞，真菌细胞，动物细胞，例如哺乳动物细胞(例如，灵长类动物细胞或人类细胞)或昆虫细胞等等。
根据特定实施方案，从有例如个人化疗法需要的受试者分离细胞。
细胞可为天然存在的细胞或被遗传修饰(例如，感染、转染或转化以表达异源性遗传成分)或以其他方式修饰(例如，化学或物理地)。
根据特定实施方案，细胞处于悬浮液中。
根据另一个实施方案，细胞形成组织碎片或细胞团块的部分。将理解不需要细胞在那时一个个或整体进入微阵列。对于哺乳动物细胞而言，仅进入细胞的部分即足够，例如细胞质延伸部、纤毛、绒毛、树突等等。为清楚起见，图18示出处于光栅上方的间充质干细胞，其中延伸部进入隔室。
在每个隔室中细胞或细胞部分的数量根据隔室大小确定。
根据特定实施方案，用遗传成分遗传修饰细胞以例如上调(过表达)或下调(沉默)感兴趣的基因。根据特定实施方案，这种修饰赋予细胞生长优点，诸如对应激的耐性、致癌转化等等。替代地，这种修饰赋予细胞生长缺点。
本文中所使用的术语“表型”指的是可根据本示教观测的细胞的任何特性或性状。
根据特定实施方案，表型选自由存活力、运动性、生物膜产生、定殖、蛋白质产生和脂质产生组成的组。
本文中所使用的“存活力”指的是确定细胞是否活着或死亡。根据本示教，以时间依赖性方式确定存活力，在这类示例中存活力也称为复制速率或生长速率。在其他示例中它被称为凋亡速率或坏死速率。
根据特定实施方案，表型不是存活力。
根据特定实施方案，表型是存在测试剂，例如药物，例如用来测定细菌、真菌、癌细胞的例如抗生素抗性的抗生素时的存活力。
本文中所使用的“运动性”指的是细胞迁移的能力。运动性指的是典型地在过程中消耗能量的自发或主动移动(例如，朝向趋化因子)。
本文中所使用的术语“生物膜形成”指的是微生物互相粘附和往往粘附至表面。这些粘附细胞常常嵌入自产生的胞外聚合物质(EPS)的基质内。根据本示教，生物膜形成影响折射率并因此影响EOT。
多种不同的细菌形成生物膜。实例包括但不限于革兰氏阳性(例如芽孢杆菌属，单核细胞增生李斯特氏菌，葡萄球菌属，和乳酸菌，包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis))和革兰氏阴性物种(例如大肠埃希氏菌，或绿脓假单胞菌)。生物膜由定殖植物的细菌形成，所述细菌例如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)以及为在叶、根上和土壤中发现的常见植物相关联细菌的相关假单胞菌，并且大多数它们的天然分离物形成生物膜。豆类的几种固氮共生体，诸如豆科根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)在豆类的根和其他惰性表面上形成生物膜。
本文中所使用的“定殖”指的是微生物的菌落建立或定居于一个具体位点。如果情况对微生物有利，则数量可迅速增加 。
根据本示教，通过在微阵列例如SiPA内的任何位点处建立单个微生物或微生物菌落来确定定殖。
本文中所使用的“蛋白质产生”指的是诸如在细菌包涵体中的细胞内蛋白质积累。
本文中所使用的“脂质产生”指的是诸如在存储病症中的细胞内脂质积累。
本文中所使用的“RNA产生”指的是细胞内RNA (例如，mRNA)积累。
蛋白质积累、RNA产生和脂质积累的每一者都影响EOT。
可监测的其他表型是收缩、裂解、细胞壁完整性等等。
可使用各种测定条件来区分不同表型，诸如在存在迁移抑制剂、蛋白合成抑制剂等等时区分表型。
为了确定表型，将细胞置于生长培养基中的衍射光栅上，基于分析的表型确定其组成。对照培养基典型地包括细胞生长培养基，从其中可根据本示教获得校准曲线。
根据特定实施方案，本示教涉及确定测试剂对细胞(即，对细胞表型)的影响。
如本文中所使用的，测试剂指的是化学试剂或生物试剂或替代地物理条件。
化学试剂可为合成或天然存在的分子，例如小分子，
生物试剂可为合成或天然存在的核酸(例如，多核苷酸，寡核苷酸，DNA编辑剂，RNA沉默剂，例如ddsRNA、miRNA、siRNA，适体)或蛋白质性质试剂(例如，抗体，肽)。
物理条件可指任何物理处理，包括但不限于压力、温度变动、辐射等等。
根据特定实施方案，测试剂选自由抗生素、化疗、放射性同位素、除草剂和杀真菌剂组成的组。
根据特定实施方案，测试剂可穿透入细胞或修饰以穿透细胞。
根据特定实施方案，测试剂不穿透入细胞。
根据特定实施方案，测试剂是细胞生长抑制剂。
这类测试剂造成细胞生长和增殖的抑制。
癌症的化疗、皮肤病的治疗和感染的治疗是细胞生长抑制药物的常见使用情况。活性卫生产品一般包含细胞生长抑制物质。
在诸如癌症的过度增殖疾病的治疗中使用各种细胞生长抑制性抗生素。实例包括但不限于多柔比星(Caelyx)、 道诺红菌素(Cerubidin)、 更生霉素(Cosmegen Lyovac)、表柔比星(Pharmorubicin)和伊达比星(Zavedos)。
根据特定实施方案，测试剂是引起细胞死亡的杀细胞剂。杀细胞剂的实例包括但不限于：CY，DDP，VCR，Ara-C，所述者往往用于癌症治疗。
可将测试剂添加至隔室以使得它被固定于此，即，衍射光栅包括粘附至隔室的测试剂。
替代地或另外，测试剂处在生物样本中(即，不固定至隔室)。
如所提及的，典型优选的是还评估不存在测试剂时的表型。这种评价通常用作对照。
根据本发明的一些实施方案，存在测试剂时相对于不存在测试剂时时间依赖性的诱发变化指示测试剂对生物样本中细胞表型的影响。
可在添加细胞之前将测试剂添加至衍射光栅。
替代地，将细胞用衍射光栅培养以便在添加测试剂之前填充隔室。
根据特定实施方案，当时间依赖性指示EOT相对于不存在细胞时其值的变化减少时，所述测试剂是杀细胞剂。
根据特定实施方案，当时间依赖性大致上平坦时，测试剂是细胞生长抑制剂。
如本文中所使用的，“平坦的时间依赖性”意指在X分钟的时段内各个量(参数，参数的变化)的最大变化小于在这一时段内各个量的最大值的Y%，其中X为至少1或至少10或至少20或至少40或至少60，并且Y为约20或约15或约10或约5或更小。
基于本示教，本发明人能够确定选测试剂对细胞表型的影响。本系统对确定实现表型的有效量足够灵敏，如图16A-C和17中所示。
因此，本示教允许随时间变化监测细胞表型并且不作为单个事件(即使实时地)，相反作为任选地响应于测试剂的其表型的连续变化。
这是通过监测细胞的物理性质，例如细胞体积和组成的相对变化速率来进行的。
EOT改变的速率充当已存在于微阵列中的细胞的体积或组成的相对变化的指示。
因此，本发明在其一些实施方案中随着输入以进行易感性试验而区分静止状况(其中细胞不能增殖)和致死状况(其中细胞停止活着)。
本实施方案的方法可以多种形式实施。例如，它可在用于执行方法操作的有形介质诸如计算机上实施。它可在计算机可读介质上实施，包括用于进行方法操作的计算机可读指令。它还可在具有数字计算机能力的电子装置中实施，所述电子装置被布置成在有形介质上运行计算机程序或在计算机可读介质上执行指令。
本实施方案的方法的至少部分可通过数据处理系统，例如专用电路系统或通用计算机来实施，所述数据处理系统被配置接收数据和执行本文中所述的至少一些操作。至少部分的操作可通过处于远程位置的云计算设施来实施。
实施本实施方案的方法的计算机程序可通常在分配介质上被分配至用户，所述分配介质诸如但不限于软盘、CD-ROM、闪速存储器装置和便携式硬盘驱动器。计算机程序可从分配介质拷贝至硬盘或类似的中间存储介质。可通过从其分配介质或其中间存储介质将计算机指令载入至计算机的执行存储器中来运行计算机程序，从而配置计算机根据本发明的方法行动。所有这些操作是计算机系统领域的技术人员众所周知的。
根据本发明的一些实施方案，计算机软件产品可包括其中存储程序指令的计算机可读介质，所述指令在由数据处理器读取时，使数据处理器：接收涉及光的衍射图案的数据，所述光衍射离开具有容纳细胞的多个隔室的衍射光栅；基于衍射图案计算指示细胞的折射率的参数；以及确定参数的变化的时间依赖性，时间依赖性指示生物样本中细胞的表型。涉及光的衍射图案的数据可呈由用于从光栅收集光信号的系统的光检测器(例如，CCD照相机)产生的电子信号的形式。
本文中所使用的术语“约”指的是±10%。
术语“包含(comprises、comprising)”、“包括(includes、including)”、“具有”和它们的变化形式意指“包括但不限于”。
术语“由...组成”意指“包括和限于”。
术语“基本上由...组成”意指组合物、方法或结构可包括其他成分、步骤和/或部分，但只有当所述其他成分、步骤和/或部分不实质上变更所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特性时才成立。
如本文中所使用的，除非上下文另有明确规定，单数形式“一（个、种…）”和“所述”包括复数引用。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括它们的混合物。贯穿本申请，本发明的各种实施方案可以范围格式呈现。应理解以范围格式描述仅为方便和简洁起见，并且不应解释为对本发明的范围不可改变的限制。因此，范围的描述应被视为已明确地公开所有可能子范围以及该范围内的个别数值。例如，诸如1至6的范围描述应被视为已明确地公开诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及该范围内的个别数，例如，1、2、3、4、5和6。不论范围的广度，这都适用。
无论何时在本文中指示数值范围时，它都意指包括指示范围内任何引用的数字(分数或整数)。短语“在第一指示数值与第二指示数值之间变化”和“从第一指示数值变化至第二指示数值” 在本文中可交换使用，并且意指包括第一和第二指示数值以及其间的所有分数和整数数字。
本文中所使用的术语“方法”指的是用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于为化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知或由所述从业者从已知方式、手段、技术和程序容易地开发的那些方式、手段、技术和程序。
如本文中所使用的，术语“治疗”包括终止、大致上抑制、减慢或逆转病状的进展，大致上改善病状的临床或美学症状或者大致上预防病状的临床或美学症状的出现。
当引用具体序列表时，这种引用要理解为还涵盖大致上对应于其互补序列的序列，其包括由例如测序错误、克隆错误、或导致碱基置换、碱基缺失或碱基添加的其他变更产生的较小序列变异，条件是这类变异的频率低于1/50核苷酸，替代地，低于1/100核苷酸，替代地，低于1/200核苷酸，替代地，低于1/500核苷酸，替代地，低于1/1000核苷酸，替代地，低于1/5,000核苷酸，替代地，低于1/10,000核苷酸。
要理解，为清楚起见，描述于单独实施方案的情形中的本发明的某些特征还可在单个实施方案中提供为组合形式。相反地，为简洁起见，描述于单个实施方案的情形中的本发明的各种特征还可单独地或以任何合适的亚组合形式或以在本发明的任何其他所述实施方案中合适的方式来提供。不应认为描述于各种实施方案的情形中的某些特征是那些实施方案的必需特征，除非实施方案在没有那些要素的情况下不生效。
如上文中描写和如在上文权利要求书部分中要求的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中找到实验支持。
实施例
现在参考以下实施例，所述实施例连同上文的描述以非限制性形式说明本发明的一些实施方案。
通过光学干涉测量分析进行的连续细菌易感性测试
装置，其用于连续监测细菌细胞对外部分子或粒子的易感性，所述分子或粒子可具有杀细菌、抑细菌、抗粘附或抗运动效应，或者对细胞粘附、增殖或产生表面积垢的能力有任何其他影响。
缩写：
EOT：有效光学厚度
RPT：反射周期性形貌
MIC：最低抑制浓度
装置和工具
1. 具有光子干涉测量性质的反射周期性微米尺度形貌的反射表面，包括反射干涉测量光谱(参见图1)。所述形貌可由孔、柱或树丛组成。
2. 用于管理所述光子表面的界面处细菌悬浮液的微流体装置(参见图2)。
图1A-F：A)具有增殖细菌细胞的RPT (例如2D柱周期性阵列)的俯视图。(B)从孔顶部和底部反射的光产生入射束与反射束之间的相位延迟，与孔深度(L)和填充孔的介质的折射率(n)成比例。(C)与孔周期性相关联，反射比相位延迟显现为干涉光谱。(D)对原始光谱应用快速傅立叶变换，产生多孔层的有效光学厚度(EOT)，EOT取决于孔平均深度和折射率。(E)孔内细菌细胞的存在影响随它们占据相对体积的变化的多孔层的折射率。(F)通过收集有效光学厚度(EOT)来实时监测孔中的细菌部分，因这种性质由细菌对折射率n的相对贡献决定。
方法：
方法包括在将细菌悬浮液受控引入至表面和/或添加药物/物质之前、期间和/或之后，对从具有反射周期性形貌(PRT)的表面获得的光干涉测量谱进行连续或迅速串行监测。分析(例如通过快速傅立叶变换)所述干涉测量光谱来揭示光学偏移的速率，例如由细胞的行为(例如沉降、粘附、迁移或增殖)造成的所述PRT的反射光性质的时间依赖性变更。
实例：
从EOT变更轮廓的偏离分析和推导各种分子实体的存在和对细胞的影响，所述偏离证明所述实体对细胞具有的影响。
图14是示出根据本发明的一些实施方案进行的研究的实验和光学原理的示意性说明。SiPA置于具有入口和出口的流动装置中。SiPA任选和优选地安置于光学装置的焦点处，所述光学装置具有透镜、光源(在本实施例中为钨丝灯)和配备有光谱仪的光检测器(在本实施例中为CCD照相机)。通过入口引入包含细菌的流体。由光学装置收集从孔的顶部和底部反射的光。入射与反射光束之间的相位延迟与孔的深度(L)和填充孔的介质的折射率成比例。在孔中细菌细胞的存在提高孔的折射率。因此，存在细菌时反射光的相位延迟不同于不存在细菌时反射光的相位延迟，使得对由光学装置收集的光的分析可提供关于细胞表型的指示。
图15A示出在将细菌引入至孔中之前和之后获得的例示光谱，并且图15B示出图15A中所示的例示光谱的FFT。FFT提供值(2nL)，其中L是孔的平均深度并且n是其折射率。这一量也称为有效光学厚度(EOT)。EOT值的所测偏移随孔折射率的变化而变化：ΔEOT/EOT0= 2(Δn/n0)L，其中n0是在将细菌引入至孔中之前孔的折射率，Δn是由于将细胞引入至隔室中引起的折射率变化，并且EOT0是在将细胞引入至隔室中之前的EOT。因此Δn与细菌细胞所占据孔的体积分数相关。
图3：按照随时间变化的ΔEOT绘制的大肠埃希氏菌在混合PSi阵列芯片上的增殖。为了使细胞在离散时间点在PSi阵列中可见，将一些混合芯片用戊二醛轻轻地冲洗并且通过使用CLSM和SEM成像。在CLSM图像中，在较低孔平面处制作光学切面，揭示出被碘化丙啶染红的大肠埃希氏菌细胞。在SEM图像中，大肠埃希氏菌细胞被石墨沉积反衬。
图4：在引入卡那霉素（氨基糖苷杀细菌抗生素药物）(50 μg/ml)后，对大肠埃希氏菌细菌生长停滞的实时光学监测。
图5：EOT偏移对细胞存活力和运动性的依赖性。(A)伴随改变杀细菌碘浓度而记录的由大肠埃希氏菌悬浮液产生的EOT偏移。(B)随存活细胞和碘浓度变化呈现的EOT偏移的速率；R2 = 0.98；(C)在悬浮液中蔓越橘提取物脱离因子的存在以剂量依赖性方式影响EOT偏移的速率。
图6A至6F3展现在用洁净缓冲液冲洗装置后EOT偏移的逆转(蓝线)。图6A是EOT曲线图，详述了在PRT的细菌定殖期间EOT的增加和其响应于冲洗装置的部分逆转。曲线图中的红线指示信号强度的相对变化。图B示出PRT (蓝色)和重建成PRT虚拟模型的细菌细胞(红色)的显微镜光学截面(用CLSM获得)。图6C1至6C3示出揭示内部3D结构的3D模型的对角线切片。图6C1代表无冲洗的装置，图6C2代表暴露于短时间(10 min)冲洗的装置，并且图6C3代表暴露于更长时间(20 min)冲洗的装置。图6D是描绘大肠埃希氏菌细胞填充所有可用的SiPA孔的CLSM图像，展现出当无空闲的孔空间被留下以容纳另外的细菌细胞时相对EOT值的增加达到其最大。图6E示出描绘SiPA孔内大肠埃希氏菌细胞的特写SEM图像。在建立稳定的EOT基线之后，将大肠埃希氏菌悬浮液引入至流动池中并且细胞开始定殖SiPA孔，从而产生EOT值的相对增加。图6F1至6F3示出展现细胞避开冲洗以占据大部分孔体积并通过其延伸部和丝状分泌物固定至孔表面的SEM图像。
在光子微阵列衍射光栅(例如，SiPA)上由细菌细胞所制得的光学动力轮廓的类型包括但不限于：
1.细菌细胞被接种至孔/结构中。将完全生长培养基供应至细胞直至建立生长曲线。
a.将抗增殖药物(抑细菌剂/抗生素)添加至培养基(参见图7)并且分析EOT生长曲线和药物浓度的相关性。当EOT偏移变为零时确定MIC (最低抑制浓度)。
b.在药物效应可逆的情况下，如果随后从培养基中去除药物(参见图8)，细胞生长可重新开始。
c.如果药物是杀细菌剂或其抑细菌效应不可逆，则EOT曲线将因死细胞分解和离开孔而缩回(参见图8)。
d.如果生长培养基缺乏关键营养或因子，则EOT生长曲线将关于该缺乏而下倾(参见图9)。
2.在持续流动条件下，将细菌悬浮液引入至在盐缓冲溶液中的光子微阵列衍射光栅。
a.如果悬浮液包含将影响孔/结构定殖的抗附着药物/因子，则可分析EOT曲线和药物浓度的相关性(参见图10)。
b.一旦建立稳定的EOT曲线，用洁净缓冲液替换细菌悬浮液以挑战细菌粘附。如果细胞被冲洗出孔，EOT曲线图将缩回(参见图11)。
图12A和12B是展现SiPA定殖取决于其表面官能的图表。图12A示出用小麦胚芽凝集素(WGA)涂布SiPA改善大肠埃希氏菌定殖超出净SiO2或白蛋白5倍。在悬浮液中掺合WGA配体(NAG)完全消除这种效应。图12B示出针对上述硅表面官能给出的EOT偏移速率。
图13A和13B是展现SiPA定殖速率随细胞浓度变化的图表。图13A示出按照每个孔可得到的细胞计悬浮液中大肠埃希氏菌的浓度。图13B示出EOT偏移的速率与细胞数线性相关。
图16A-C和17示出使用本实施方案的光子微阵列衍射光栅的抗生素易感性测试。对初步AST实验选择了三种不同的抗生素：环丙沙星，头孢曲松钠和三甲氧苄二氨嘧啶。除它们在目前的临床AST中流行以外，因它们不同的抗细菌机制而选择这些抗生素。环丙沙星是氟喹诺酮，其抑制DNA促旋酶，因此阻止细胞复制和展示抑细菌效应。头孢曲松钠是β-内酰胺抗生素，第三代头孢菌素，其扰乱细胞壁的合成，最终随着细菌开始分裂造成细胞裂解，理想地展示出杀细菌效应。三甲氧苄二氨嘧啶干扰叶酸合成和阻止DNA合成，因此展示抑细菌效应。进行标准微稀释肉汤测试以确定每种抗生剂的最低抑制浓度(MIC)。测试环丙沙星、头孢曲松钠和三甲氧苄二氨嘧啶在各种浓度下对大肠埃希氏菌增殖的结果描绘于图16A-C中，其中以升高的浓度引入抗生剂，从低于其已知MIC值高于该值开始。观测到头孢曲松钠(CRO)的MIC介于0.005-0.05 μg/mL之间。观测到环丙沙星(CIP)的MIC介于0.005-0.05μg/mL之间。观测到三甲氧苄二氨嘧啶(TMP)的MIC介于5-50 μg/mL之间。因此，这些结果展现本实施方案的光子微阵列衍射光栅正确地响应于从细菌生长相关性EOT偏移取回的抗生剂MIC的能力。在同一浓度下三种抗生素的效应的交叉分析呈现于图13中。本研究证明在大肠埃希氏菌暴露于有关抗生素MIC值之后2小时可可靠地检测到细菌生长停滞。
虽然已结合本发明的特定实施方案描述了本发明，但明显的是，多种替代、修改和变型将对本领域技术人员显而易见。因此，意图包括落入随附权利要求书的精神和宽范围内的所有这类替代、修改和变型。
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在仿佛每一个别出版物、专利或专利申请被特定和单独地指示为以引用方式并入本文的相同程度上以引用入说明书的方式整体并入本文。另外，在本申请中对任何参考文献的引用或辨识不应解释为承认这类参考文献可作为本发明的现有技术得到。在使用章节标题的程度上，标题不应解释为必然限制。

Claims (24)

1.一种确定生物样本中细胞的表型的方法，所述方法包括：
(a) 在包含有序阵列的隔室的衍射光栅上对包括所述细胞的所述生物样本培养预定时间，所述隔室具有横向尺寸以使得所述细胞可适合其中；
(b) 在利用经一系列波长的照明对所述表面进行照射后，在所述预定时间内连续检测从包括所述细胞的所述衍射光栅衍射的照明，并且从其中产生输出光谱信号；
(c) 从所述输出光谱信号确定培养有所述生物样本的所述隔室的有效光学厚度(EOT)的时间依赖性变化，所述时间依赖性指示所述生物样本中所述细胞的所述表型。
2.一种确定细胞的表型的方法，所述方法包括：
(a) 将所述细胞置于衍射光栅的多个隔室中；
(b) 通过所述衍射光栅衍射多色光束；
(c) 基于从所述衍射光栅接收的衍射图案计算指示所述细胞的折射率的参数；以及
(d) 确定所述参数的变化的时间依赖性，所述时间依赖性指示所述生物样本中所述细胞的所述表型。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述参数包括所述隔室的有效光学厚度(EOT)，并且所述变化是相对于不存在所述细胞时所述EOT的值。
4.如权利要求2-3中任一项所述的方法，其中所述衍射包括实现反射式衍射。
5.如权利要求2-3中任一项所述的方法，其中所述衍射包括实现透射式衍射。
6.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中所述多色光束一般是白色的。
7.如权利要求1-6中任一项的权利要求所述的方法，其中所述生物样本包括测试剂。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述衍射光栅包括粘附至所述隔室的测试剂。
9.如权利要求7或8中任一项所述的方法，进一步包括在不存在所述测试剂时进行所述方法。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述参数的所述变化是在所述测试剂的所述存在时所述参数值相对于在所述测试剂的所述不存在时所述参数值的值的变化。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述时间依赖性指示所述测试剂对所述生物样本中所述细胞的所述表型的影响。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述表型选自由存活力、运动性、生物膜产生、定殖、蛋白质产生和脂质产生组成的组。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述测试剂是细胞生长抑制剂。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述测试剂是杀细胞剂。
15.如权利要求10-14中任一项所述的方法，其中当所述时间依赖性指示有效光学厚度(EOT)减小时，所述测试剂是杀细胞剂。
16.如权利要求10-14中任一项所述的方法，其中当所述时间依赖性大致上平坦时，所述测试剂是细胞生长抑制剂。
17.如权利要求7-16中任一项所述的方法，其中将所述细胞用所述衍射光栅培养以便在添加所述测试剂之前填充所述隔室。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述表型是存活力。
19.如权利要求8-15中任一项所述的方法，其中所述表型是运动性。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述细胞是细菌。
21.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。
22.如权利要求19所述的方法，其中所述真核细胞是癌细胞。
23.权利要求1-8中任一项的权利要求所述的方法，其中所述测试剂选自由抗生素、化疗、放射性同位素、除草剂和杀真菌剂组成的组。
24.一种计算机软件产品，包括其中存储程序指令的计算机可读介质，所述指令在由数据处理器读取时，使所述数据处理器：接收涉及光的衍射图案的数据，所述光衍射离开具有容纳细胞的多个隔室的衍射光栅；基于所述衍射图案计算指示所述细胞的折射率的参数；以及确定所述参数的变化的时间依赖性，所述时间依赖性指示所述生物样本中所述细胞的所述表型。
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