CN113874711A - 用于实时细胞监测的装置和方法 - Google Patents
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Abstract
提供了一种系统，其包括衍射光栅、配置为以有限波段照射的光源、配置为检测光的零和非零衍射级的光学检测系统、和适用于分析零和非零衍射级以确定有效光学深度的时间依赖性变化的信号处理单元。还提供了使用这些系统实时检测细胞复制、微生物检测和用于选择处理微生物的治疗剂的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年2月8日提交的美国临时专利申请号62/627,797的优先权，其全部内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明涉及细胞监测领域。
背景技术
疾病控制中心(CDC)估计，在美国，每年有超过200万人因抗生素抗性感染而生病，至少有23,000人因此死亡。此外，它还强调了开发改进的诊断工具的重要性，这是确定耐药性特征以告知适当使用药物所必需的。这种工具还应减少对当前抗生素库的广泛过度使用和误用。
任何抗微生物敏感测试(AST)的最重要的结果是在感染治疗中对成功抗微生物剂的快速和可靠的预测。在现代诊断临床微生物学的成熟中坚持(survive)下来的医学上重要微生物的AST方法数量有限。
体外AST可以使用多种表型形式进行，最常见的是圆盘扩散、琼脂稀释、肉汤微量稀释和浓度梯度试验。目前，昂贵的基于核酸的AST方法不能检测所有的抗性标记，并且因此没有被广泛采用。下一代全基因组测序被不断升高的遗传异质性程度所混淆，这是预计会阻碍基因组方法的长期存在的问题。有几百种β-内酰胺酶和众多的突变、获得和表达机制，这导致氟喹诺酮类、氨基糖苷类和大环内酯类耐药；太多以至于无法通过当前的分子技术轻松检测到。因此，很可能在未来几年内，细菌分离株对抗微生物剂的敏感性水平的表型测量将继续具有临床相关性。
目前，AST通常使用经典的手动方法或依赖生长的自动化系统来完成。这些方法的主要限制包括需要相对大量的有生存力的起始生物、复杂的预分析处理、有限的生物谱、分析可变性、获得结果的时间漫长和成本。在过去的20年中，尽管这些技术已被应用于自动化仪器并进行了优化，但是标准诊断技术没有发生显著变化。仍然，完整的分析时间通常仅缩短了10-12小时，这最好也需要两个工作日才能提供AST分析。实验室自动化仅限于(由于成本和基础设施)整合的中央实验室，例如大型医院和区域服务实验室。当地诊所、小医院、老人院、日托机构和其他医疗机构要么执行经典的劳动密集型AST，要么将患者的样本运送到集中位置进行自动化处理。这加剧了AST成本和持续时间的问题，增加了运输消耗的成本和时间。因此，在护理点(POC)缺乏快速明确的微生物学诊断的情况下，医生经常启动经验性广谱抗生素治疗。在许多情况下，这会导致临床不良结果的风险显著增加，死亡率增加，并导致耐药病原体的出现。迫切需要开发新的自动化仪器，这些仪器可以提供更快的结果，并且由于更低的试剂成本和更少的劳动力需求而节省资金。
发明内容
本发明提供了用于测量细胞生长的系统，其包括衍射光栅、配置为以有限波段照射的光源、配置为检测光的零和非零衍射级的光学检测系统，和适用于分析零和非零衍射级以确定有效光学深度的时间依赖性变化的信号处理单元，以及其使用方法。
根据第一方面，提供了一种系统，该系统包括：
a.衍射光栅，其包括具有横向尺寸的隔室，使得细胞可装配在其中；
b.光源，其配置为以不大于25nm的有限波段照射，其产生指向衍射光栅的相干且准直的光束；
c.光学检测系统，其配置为检测来自衍射光栅的光束的零和非零衍射级；和
d.信号处理单元，其适用于分析零和非零衍射级以确定光栅的有效光学深度的时间依赖性变化并由此确定光栅中细胞生长的量度。
根据另一方面，提供了用于实时检测细胞复制或生长的方法，该方法包括：
a.将至少一种细胞接种到本发明的系统的衍射光栅中；
b.用光束照射包括至少一种细胞的衍射光栅；
c.检测来自照射的衍射光栅的光束的零和非零衍射级；和
d.分析随时间的衍射级的强度以确定包括至少一种细胞的衍射光栅的有效光学深度的变化，并且由此确定包括至少一种细胞的衍射光栅中细胞材料的量随时间的变化；
从而实时检测细胞复制或生长。
根据另一方面，提供了选择用于治疗细胞生长的治疗剂的方法，该方法包括：
a.将至少一种细胞接种到本发明的系统的多个衍射光栅中；
b.向来自包括至少一种细胞的多个衍射光栅的至少一个衍射光栅施用至少一种潜在的治疗剂；
c.用光束照射包括至少一种细胞的衍射光栅；
d.检测来自照射的衍射光栅的光束的零和非零衍射级；
e.处理随时间的衍射级的强度以确定包括至少一种细胞的每个衍射光栅的有效光学深度的变化，并且由此确定包括至少一种细胞的每个衍射光栅中细胞材料的量随时间的变化；和
f.选择与对照相比导致细胞材料生长停滞或恶化的治疗剂；
从而选择用于治疗细胞生长的治疗剂。
根据另一方面，提供了确定样品中细胞的存在的方法，该方法包括：
a.将样品施用到本发明的系统的衍射光栅中；
b.用光束照射包括样品的衍射光栅；
c.检测来自包括样品的照射的衍射光栅的光束的零和非零衍射级；和
d.处理随时间的衍射级的强度以确定包括样品的衍射光栅的有效光学深度的变化，并且由此确定包括样品的衍射光栅中细胞材料的量随时间的变化；其中细胞材料的增加指示样品中微生物的存在；
从而确定样品中细胞的存在。
根据另一方面，提供计算机程序产品，其包括其上具有程序代码的非瞬态计算机可读存储介质，该程序代码在由数据处理器执行时使数据处理器计算随时间检测到的单色光的零和非零衍射级之间的差，以确定产生单色光的零和非零衍射级的衍射光栅的有效光学深度的变化。
根据一些实施方式，细胞是微生物，并且任选地是细菌。
根据一些实施方式，系统用于测量细胞的生长。
根据一些实施方式，衍射光栅涂覆有细胞引诱剂，并且任选地其中细胞引诱剂是糖。根据一些实施方式，衍射光栅含有适于细胞存活的液体，并且任选地其中细胞引诱剂配置为扩散到液体中，从而产生浓度梯度。根据一些实施方式，细胞引诱剂通过氢键至光栅上的双键氧而附接至光栅，并且任选地其中光栅包括包含双键氧的活性基团。
根据一些实施方式，光源是激光器、激光二极管或发光二极管(LED)。根据一些实施方式，光源是激光器并且配置为以至多5nm的波段照射。
根据一些实施方式，光学检测系统包括光强度检测器。根据一些实施方式，光学检测系统配置为检测光束的至少一级和二级衍射。
根据一些实施方式，系统进一步包括壳体和流体入口和出口，并且其中至少衍射光栅设置在壳体内部。
根据一些实施方式，系统设置在水分配器中。
根据一些实施方式，该方法用于确定样品中细胞的特性(identity)，其中将样品施用到包括不同的衍射光栅中至少两种不同的选择性生长培养基的多个衍射光栅中，并且其中特定选择性生长培养基中的生长指示细胞的特性。
根据一些实施方式，细胞来自传染性微生物。根据一些实施方式，细胞是癌细胞。
根据一些实施方式，细胞是从患有或怀疑患有微生物感染或癌症的受试者提取的。根据一些实施方式，样品是取自需要其的受试者的样品。
根据一些实施方式，样品是水样品。
根据一些实施方式，衍射级的处理包括处理至少两个非零衍射级，并且其中奇数级和偶数级的强度之间的差异的增加表明有效光学深度的增加和光栅中细胞材料的量的增加。
根据一些实施方式，细胞材料包括下述任一种：
a.细胞；
b.细胞分泌物；
c.细胞外基质；
d.其部分；和
e.其组合。
根据一些实施方式，确定有效光学深度的变化包括通过检测衍射级的强度校准检测器，该衍射级的强度由照射没有至少一种细胞或样品的衍射光栅获得。
根据一些实施方式，该方法进一步包括在接种之后向光栅加入测试剂，其中测试剂具有改变至少一种细胞的生存力、复制、运动性、代谢、蛋白质产生、脂质产生和分泌的至少一种的潜力，并且任选地其中至少一种治疗剂或测试剂选自抗生素、化疗剂、放射性同位素、杀真菌剂、生物抑制剂(biostatic agent)、抗体、免疫细胞和病毒。
根据一些实施方式，接种包括衍射光栅中细胞的最终浓度为每平方毫米衍射光栅至少3个细胞。
根据一些实施方式，方法在不超过90分钟内进行。
根据一些实施方式，数据处理器计算零和非零衍射级的差值的时间依赖性，并且任选地确定衍射光栅中生物材料的量的变化。根据一些实施方式，计算包括比较奇数衍射级和偶数衍射级。
从下文给出的详细描述中，本发明的其他实施方式和全部适用范围将变得显而易见。然而，应当理解，具体实施方式和具体实施例虽然表明了本发明的优选实施方式，但仅作为说明给出，因为从具体实施方式来看，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
附图说明
图1：本发明的系统的示意图。
图2A-2D：(2A)光学光栅结构的示意图。两种材料的折射率分别用n1和n2表示。d和b是光栅尺寸，w是光栅深度，和m是衍射级。L是所有光栅的总宽度。(2B)光穿过光学光栅产生衍射图案的照片。(2C)衍射图案的光强度(Iθ)的示意图，使用常规标记。(2D)衍射分布的局部四分之一视图的照片。箭头指向零衍射级，在激光(650nm)的直接反射附近看到。光栅尺寸是：b＝3μm，d＝4μm，w＝3μm。
图3A-3B：(3A)两个相邻衍射级(奇一级和偶二级)的强度相对于溶液折射率绘制的线图和(3B)对于所使用的光栅使用p＝-0.5的校正因子(p)的变换数据。
图4A-4C：在平行接种有(4A)0、(4B)10^5和(4C)10^7个大肠杆菌细胞的一系列6个未涂覆光栅单元上进行的通过强度偏移测量的光学输出作为时间的函数的最佳拟合线的散点图。
图5A-5D：在平行接种有(5A)10^3，(5B)10^4，和(5C)10^5个大肠杆菌细胞的一系列6个半稳定的蔗糖涂覆的光栅单元上进行的通过强度偏移测量的光学输出作为时间的函数的最佳拟合线的散点图。(5D)三种起始浓度的细菌接种在传感器芯片(衍射光栅)上的衍射级(指示细胞生长)之间的相对光强度线图。
图6A-6D：(6A-B)来自接种有(6A)细菌细胞和(6B)没有细胞的光学光栅的一级和二级衍射的线图，以及(6C-D)从(6C)细胞生长和(6D)当没有细胞存在时其缺乏导致的强度偏移的线图。
图7A-7E：(7A-7D)在平行接种有大肠杆菌细胞，并在一小时后用(7A)0μg、(7B)2.5μg、(7C)5.0μg和(7D)7.5μg G418处理的一系列6个半稳定的蔗糖涂覆光栅单元上进行的通过强度偏移测量的光学输出作为时间的函数的最佳拟合线的散点图。(7E)用于确定处理大肠杆菌的G418的MIC的经典连续稀释方法的照片。
具体实施方式
在一些实施方式中，本发明提供了用于测量细胞生长的系统，其包括衍射光栅、配置为以有限波段照射的光源、配置为检测光的零和非零衍射级的光学检测系统，和适用于分析零和非零衍射级以确定有效光学深度的时间依赖性变化的信号处理单元。本发明进一步涉及使用这些系统实时检测细胞生长或退化、检测样品(比如水样品)中的细胞、确定细菌细胞的特性和用于确定传染性微生物对治疗剂的敏感性的方法，比如可用于治疗有需要的受试者的感染。
在第一方面，提供了一种系统，该系统包括：
a.衍射光栅，其含有具有横向尺寸的隔室，使得细胞可装配在其中；
b.光源，其配置为以有限波段照射，该光源产生指向衍射光栅的相干且准直的光束；
c.光学检测系统，其配置为检测来自衍射光栅的光束的零和非零衍射级；和
d.信号处理单元，其适用于分析零和非零衍射级以确定光栅的有效光学深度的时间依赖性变化。
在一些实施方式中，该系统用于测量细胞的生长。在一些实施方式中，该系统用于测量生物材料或细胞材料的量的变化。在一些实施方式中，系统用于实时检测。在一些实施方式中，系统用于细胞复制的实时检测。在一些实施方式中，系统用于细胞生长的实时测量。在一些实施方式中，系统用于实时检测生物材料或细胞材料的量的变化。
在一些实施方式中，信号处理单元配置为将有效光学深度的时间依赖性变化转化为细胞生长、生物材料、细胞材料和/或细胞复制的量度。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，信号处理单元由有效光学深度的变化确定光栅中细胞的生长。在一些实施方式中，光学深度的变化称为偏移。在一些实施方式中，偏移是衍射强度的相对变化。在一些实施方式中，有效光学深度的降低表示细胞生长、生物材料或细胞复制的增加。在一些实施方式中，大的正偏移表示细胞生长、生物材料或细胞复制的增加。在一些实施方式中，偏移为衍射强度增加至少0.02、0.021、0.022、0.023、0.024、0.025、0.026、0.027、0.028、0.029、0.03、0.031、0.032、0.033、0.034或0.035％。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
另一方面，提供了一种用于实时检测细胞生长或复制的方法，该方法包括：
a.将至少一种细胞接种到本发明的系统的衍射光栅中；
b.用光束照射包括至少一种细胞的衍射光栅；
c.检测来自照射的衍射光栅的光束的零和非零衍射级；和
d.分析随时间的衍射级的强度以确定包括至少一种细胞的衍射光栅的有效光学深度的变化，并且由此确定包括至少一种细胞的衍射光栅中细胞材料的量随时间的变化；
从而实时检测细胞生长或复制。
在一些实施方式中，该方法用于测量生物材料或细胞材料的量的变化。在一些实施方式中，该方法用于实时检测。在一些实施方式中，该方法用于实时检测生物材料或细胞材料的量的变化。在一些实施方式中，细胞是微生物的细胞。
另一方面，提供了一种选择用于治疗细胞生长的治疗剂的方法，该方法包括：
a.将至少一种细胞接种到本发明的系统的多个光栅中；
b.向来自包括至少一种细胞的多个衍射光栅的至少一个衍射光栅施用至少一种潜在的治疗剂；
c.用光束照射包括至少一种细胞的衍射光栅；
d.检测来自照射的衍射光栅的光束的零和非零衍射级；
e.处理随时间的衍射级的强度以确定包括至少一种细胞的每个衍射光栅的有效光学深度的变化，并且由此确定包括至少一种细胞的每个衍射光栅中细胞材料的量随时间的变化；和
f.选择与对照相比导致细胞材料生长停滞或恶化的治疗剂；
从而选择用于治疗细胞生长的治疗剂。
另一方面，提供了确定样品中细胞的存在的方法，该方法包括：
a.将样品施用到本发明的系统的衍射光栅中；
b.用光束照射包括样品的衍射光栅；
c.检测来自包括样品的照射的衍射光栅的光束的零和非零衍射级；和
d.处理随时间的衍射级的强度以确定包括样品的衍射光栅的有效光学深度的变化，并且由此确定包括样品的衍射光栅中细胞材料的量随时间的变化；其中细胞材料的增加指示样品中细胞的存在；
从而确定样品中细胞的存在。
另一方面，提供了确定样品中细胞的特性的方法，该方法包括：
a.将样品施用到本发明的系统的多个衍射光栅中，其中所述多个衍射光栅包括不同光栅中至少两种不同的选择性生长培养基；
b.用光束照射包括样品的衍射光栅；
c.检测来自包括样品的照射的衍射光栅的光束的零和非零衍射级；和
d.处理随时间的衍射级的强度以确定包括样品的衍射光栅的有效光学深度的变化，并且由此确定包括样品的衍射光栅中细胞材料的量随时间的变化；其中特定选择性生长培养基中细胞材料的增加指示细胞的特性；
从而确定样品中细胞的特性。
在一些实施方式中，细胞是原核或真核细胞。在一些实施方式中，细胞是原核细胞。在一些实施方式中，细胞是真核细胞。在一些实施方式中，细胞是微生物。在一些实施方式中，细胞是微生物的细胞。在一些实施方式中，微生物是传染性微生物。在一些实施方式中，细胞是细菌细胞。在一些实施方式中，细胞是真菌细胞。在一些实施方式中，微生物是细菌或真菌。在一些实施方式中，微生物是细菌。在一些实施方式中，微生物是真菌。
在一些实施方式中，微生物是寄生虫。在一些实施方式中，微生物选自细菌、真菌和寄生虫。在一些实施方式中，微生物来自需要治疗微生物感染的受试者。在一些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，细胞是人类细胞。在一些实施方式中，细胞是癌细胞。在一些实施方式中，细胞是病毒感染的细胞。在一些实施方式中，细胞是从需要其的受试者提取的。在一些实施方式中，需要其的受试者是患有癌症的受试者。在一些实施方式中，需要其的受试者是怀疑患有癌症的受试者。在一些实施方式中，需要其的受试者是患有微生物感染的受试者。在一些实施方式中，需要其的受试者是怀疑患有微生物感染的受试者。在一些实施方式中，需要其的受试者是患有癌症或微生物感染的受试者。在一些实施方式中，需要其的受试者是怀疑患有癌症或微生物感染的受试者。
在一些实施方式中，治疗细胞的生长是治疗微生物感染。在一些实施方式中，治疗是杀死。在一些实施方式中，治疗是减缓、延缓或阻止生长。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，治疗是治疗包含细胞的受试者的治疗。在一些实施方式中，细胞是微生物的细胞并且治疗细胞的生长包括治疗被微生物感染的受试者。在一些实施方式中，细胞是癌细胞并且治疗细胞的生长包括治疗患有癌症的受试者。
在一些实施方式中，样品是水样品。在一些实施方式中，怀疑水样品中生长有微生物。在一些实施方式中，水样品是饮用水样品。在一些实施方式中，水样品是灌溉样品。在一些实施方式中，饮用水样品来自水管。在一些实施方式中，水样品来自水冷却器或家庭用水电器(domestic water appliance)。如本文所使用的，术语“家庭用水电器”是指使用水的任何家庭电器。家庭用水电器的示例包括但不限于水冷却器、水起泡器、冰箱、冰柜、制冰机、饮料碳酸化器、咖啡机/浓缩咖啡机和真空吸尘器。
在一些实施方式中，该系统用于测量存在于隔室中的生物材料的量的变化。如本文所使用的，“生物材料”是指由生物体产生的任何生物材料。在一些实施方式中，生物材料包括分泌物、细胞外基质、蛋白质、脂质、细胞器、膜、细胞、其部分及其组合。在一些实施方式中，细胞材料包括分泌物、细胞外基质、蛋白质、脂质、细胞器、膜、细胞、其部分及其组合。在一些实施方式中，生物材料包括病毒。在一些实施方式中，生物材料是复制病毒并因此包含病毒感染的细胞。
在一些实施方式中，该方法用于确定样品中细胞的特性。在一些实施方式中，将样品施用到多个衍射光栅中。在一些实施方式中，多个衍射光栅包括至少两种不同的选择性生长培养基。在一些实施方式中，至少两种不同的选择性生长培养基在不同的衍射光栅中。应当理解，两种培养基不混合在相同的衍射培养基中。如本文所使用的，术语“选择性生长培养基”是指具有仅某些细胞会在其上生长的组成的培养基。这可能是由于培养基具有促进细胞生长、能够使细胞生长、延缓细胞生长或阻止某些细胞的细胞生长的组成。选择性培养基在本领域中是众所周知的，并且可以包含特定的碳源或特定的氨基酸或能够使某些细胞生长或抑制某些细胞生长的其他药物或分子。在一些实施方式中，选择性培养基对某些细菌是选择性的。在一些实施方式中，选择性培养基是鉴别培养基。通过使用足够数量的具有不同性质的不同培养基，可以确定样品中细胞的确切特性或一般特性。选择性培养基的实例包括但不限于含有伊红亚甲蓝的培养基、具有低pH的YM培养基、Thayer-Martin培养基、含有木糖赖氨酸脱氧胆酸盐的培养基、MacConkey培养基和含有X-gal的培养基。
如本文所使用的，术语“识别”细胞是指确定关于细胞的信息。在一些实施方式中，识别是确定细胞的域。在一些实施方式中，识别是确定细胞的界。在一些实施方式中，鉴定是确定细胞的门。在一些实施方式中，识别是确定细胞的纲。在一些实施方式中，识别是确定细胞的目。在一些实施方式中，识别是确定细胞的科。在一些实施方式中，识别是确定细胞的属。在一些实施方式中，识别是确定细胞的种。在一些实施方式中，识别是确定细胞的细胞类型。在一些实施方式中，识别是确定细胞来源的微生物。在一些实施方式中，识别是确定细胞的抗体抗性。
本领域技术人员将理解，本发明的系统可用于测量光学响应。光学响应包括光栅隔室的光学深度的变化等其他因素。当任何能够繁殖的生物有机体放入光栅时，系统可以测量其繁殖率。该系统实时执行此操作，因为可以对隔室进行连续监测。此外，通过使用有限波段的光并分析零和非零衍射级，可以检测到有效光学深度的非常小的变化。因此，本发明的系统甚至可以检测在复制周期之前发生的分泌物、细胞外基质的改变、生物膜的产生或改变或增强的细胞内体积，并且因此可以比当前存在于本领域中的任何方法更快地检测正常复制。
如本文所使用的，“衍射光栅”是指隔室的二维(2D)或1D阵列，其中隔室的尺寸大于由光源产生的光的波长。在一些实施方式中，隔室阵列是有序的。在一些实施方式中，所有隔室的尺寸相同。在一些实施方式中，阵列包括不规则分布。应当理解，隔室形状可以变化或恒定，并且隔室尺寸可以变化或恒定，只要隔室包括大于由光源产生的光的波长的尺寸。隔室形状的实例包括但不限于正方形、矩形、圆形、椭圆形和半圆形。隔室的底部可以是平的或圆形的，或者可以是无底的。此外，隔室可以是穿孔的或实心的。在一些实施方式中，隔室是透明的。在一些实施方式中，隔室的尺寸使得细胞可以装配在其中。在一些实施方式中，尺寸是横向尺寸。在一些实施方式中，隔室被配置为具有足以将细胞装配在其中的尺寸。
在一些实施方式中，衍射光栅包括层状相位光栅。在一些实施方式中，衍射光栅包括光子层状光栅。在一些实施方式中，衍射光栅包括有序光栅网格。在一些实施方式中，衍射光栅由透明材料构成。在一些实施方式中，衍射光栅由反射材料构成。在一些实施方式中，衍射光栅是基于硅的。在一些实施方式中，衍射光栅由无机材料制成。在一些实施方式中，衍射光栅由有机材料制成。在一些实施方式中，衍射光栅由有机或无机材料制成。在一些实施方式中，衍射光栅的第一部分将具有比衍射光栅的第二部分更高的折射率。在一些实施方式中，衍射光栅被蚀刻在硅晶片中。在一些实施方式中，光栅包括配置为容纳细胞的至少一个隔室。在一些实施方式中，光栅包括隔室阵列。在一些实施方式中，光栅是一维的。在一些实施方式中，光栅是二维的。在一些实施方式中，光栅是线性光栅。在一些实施方式中，线性光栅包括每毫米至少10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个线性对齐的隔室。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，光栅包括高达10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、1000000、200000、300000、400000或500000个隔室/平方毫米(mm2)。在一些实施方式中，光栅包括高达100,000个隔室/mm2。
术语“隔室(compartment)”和“孔(well)”在本文中可互换使用，是指衍射光栅的封闭部分，其尺寸足以容纳被分析的生物材料。应当理解，孔必须具有足够的空间以允许不受孔尺寸的阻碍地进行细胞复制。在一些实施方式中，孔被配置为具有足够的空间来容纳向生物材料提供非限制量的营养物所需的培养基体积。在一些实施方式中，孔对培养基储库开放。在一些实施方式中，隔室具有横向尺寸，使得至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个细胞可装配在其中。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，隔室具有横向尺寸，使得最多75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000或50000个细胞可以装配在其中。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，细胞必须粘附到孔的表面。在这样的实施方式中，必须有足够的空间让细胞粘附和繁殖，而不会使空间在检测的时间范围内受到限制。在一些实施方式中，孔被配置为容纳来自至少一个复制周期的细胞。在一些实施方式中，孔被配置为容纳多达2、3、4、5、6、7、8、9或10个复制周期的细胞。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，孔被配置为容纳多达10个复制周期的细胞。在一些实施方式中，隔室具有横向尺寸，使得至少1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或1000个细胞可以粘附在其中。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，孔被配置为在其一半体积内容纳至少1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或1000个细胞。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，孔被配置为在其一半体积中容纳约100个细胞。
本领域技术人员将理解，本发明的系统和方法用于尺寸大于所使用的光的波长的衍射光栅。尽管生物材料可能比所使用的光的波长小，例如，病毒，尽管比光的波长小得多，但仍需要尺寸大于光波长的宿主细胞。
在一些实施方式中，衍射光栅包括细胞生长培养基。在一些实施方式中，向衍射光栅提供细胞生长培养基。在一些实施方式中，将细胞加入衍射光栅中的细胞生长培养基中。细胞生长培养基是本领域众所周知的，并且存在用于不同细胞类型的各种培养基。细胞生长培养基的实例包括但不限于DMEM、RPMI、Muller-Hinton Broth和LB培养基。在一些实施方式中，细胞生长培养基是液体。在一些实施方式中，细胞生长培养基不是固体。
在一些实施方式中，光栅和/或隔室的表面被配置为促进细胞粘附。在一些实施方式中，衍射光栅和/或其中的隔室包括异丙烯基酯或甲基丙烯酸丙酯表面官能团。在一些实施方式中，衍射光栅和/或其中的隔室包括异丙烯基酯官能团。在一些实施方式中，衍射光栅和/或其中的隔室包括甲基丙烯酸丙酯表面官能团。在一些实施方式中，衍射光栅和/或其中的隔室包括表面双键氧官能团。在一些实施方式中，衍射光栅和/或其中的隔室包括表面烷基官能团。在一些实施方式中，表面基团增加细胞对表面的粘附。在一些实施方式中，相对于不具有官能团的表面，表面基团增加细胞对表面的粘附。在一些实施方式中，表面基团使细胞粘附增加至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、3000％、4000％、5000％、7500％或10000％。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，表面基团使细胞粘附增加至少1000％。在一些实施方式中，表面基团将沉降和建群(colonization)时间减少至少1％、5％、10％、20％、20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，表面基团比没有引诱剂时更快地产生随后的细胞的指数生长期。在一些实施方式中，表面基团将直到指数增长的时间减少至少1％、5％、10％、20％、20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，表面基团导致完成细胞生长分析所需的时间减少。在一些实施方式中，时间的减少是至少1％、5％、10％、20％、20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％的减少。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，衍射光栅和/或其中的隔室涂覆有细胞引诱剂。在一些实施方式中，仅隔室的内部涂覆有细胞引诱剂。在一些实施方式中，仅孔中细胞要粘附的底部涂覆有细胞引诱剂。如本文所使用的，术语“细胞引诱剂”是指将细胞募集到引诱剂位点的任何分子。在一些实施方式中，细胞引诱剂通过趋化性募集细胞。在一些实施方式中，细胞引诱剂被配置为从孔表面扩散到周围培养基中，从而产生浓度梯度。在一些实施方式中，浓度梯度通过趋化性募集细胞。在一些实施方式中，细胞引诱剂是糖分子。在一些实施方式中，糖是蔗糖。在一些实施方式中，细胞引诱剂被吸附到隔室的表面。在一些实施方式中，细胞引诱剂粘附到隔室的表面。在一些实施方式中，细胞引诱剂半稳定地吸附到隔室的表面。在一些实施方式中，细胞引诱剂半稳定地粘附到隔室的表面。在一些实施方式中，表面是隔室中细胞要粘附的底部。在一些实施方式中，半稳定的引诱剂足够稳定以在隔室干燥时保留在表面上，但是在添加液体比如培养基后，引诱剂可扩散到培养基中，从而产生梯度。
在一些实施方式中，带有引诱剂的光栅始终保持湿润。
在一些实施方式中，与没有引诱剂的情况相比，细胞引诱剂促进细胞更快地沉降并建群到孔的表面。在一些实施方式中，细胞引诱剂提高了接种效率。在一些实施方式中，引诱剂将接种效率提高至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、3000％、4000％、5000％、7500％或10000％。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，引诱剂将沉降和建群时间减少至少1％、5％、10％、20％、20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，引诱剂将沉降和建群时间减少至少90％。在一些实施方式中，细胞引诱剂比没有引诱剂时更快地产生随后的细胞的指数生长期。在一些实施方式中，引诱剂将直到指数增长的时间减少至少1％、5％、10％、20％、20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，引诱剂将直到指数增长的时间减少至少90％。在一些实施方式中，细胞引诱剂导致完成细胞生长分析所需的时间减少。在一些实施方式中，时间的减少是至少1％、5％、10％、20％、20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％的减少。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，时间的减少是至少90％的减少。
如本文所使用的，术语“有限波段”是指具有有限波长范围的光。在一些实施方式中，光的波长在400和2000nm之间。在一些实施方式中，有限波段光是单色光。在一些实施方式中，光源是单色光源。在一些实施方式中，光源被配置为以不超过1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50nm的有限波段进行照射。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，光源被配置为以不超过50nm的有限波段进行照射。在一些实施方式中，光源被配置为以不超过25nm的有限波段进行照射。在一些实施方式中，有限波段光是带宽不超过2、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50nm的光。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，有限波段光是带宽不超过50nm的光。在一些实施方式中，有限波段光是带宽不超过20nm的光。在一些实施方式中，光大约是特定波长。在一些实施方式中，光是激光。在一些实施方式中，光源是激光器。在一些实施方式中，光源是激光器并且光具有不超过5nm的有限波段。在一些实施方式中，光源是激光器、激光二极管(LD)或发光二极管(LED)。在一些实施方式中，光源是LD。在一些实施方式中，光源是LED。在一些实施方式中，光源是LED并且光具有不超过25nm的有限波段。
在一些实施方式中，单色光是基于光的波长仅具有一种颜色的光。在一些实施方式中，红光是波长在740和625纳米(nm)之间的光。在一些实施方式中，红光是波长在740和620nm之间的光。在一些实施方式中，橙光是波长在625和590、625和585、620和590或620和595nm之间的光。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，黄光是波长在590和565、590和560、585和565或585和560nm之间的光。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，绿光是波长在565和520、565和500、560和520或560和500nm之间的光。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，青光是波长在520和500、520和480或500和480nm之间的光。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，蓝光是波长在500和450、500和435、490和450、490和435、480和450或480和435之间的光。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，紫光是波长在450和400、450和380、435和400或435和380nm之间的光。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，激光是红光。在一些实施方式中，激光器发射波长为约650nm的光。在一些实施方式中，光不是白光。在一些实施方式中，光不是宽带光。在一些实施方式中，光源不发射一定范围的波长。在一些实施方式中，光源不发射光谱。
如本文所使用的，术语“相干光”是指其中波之间的相位差恒定使得波在给定距离内不相互干扰的光。相干光源在本领域中是众所周知的并且包括激光器和LED。在一些实施方式中，光源产生相干光。在一些实施方式中，击中(hit)衍射光栅的光是相干光。在一些实施方式中，光具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25cm的相干长度。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，光具有至少1cm的相干长度。
在一些实施方式中，光源不垂直于光栅。在一些实施方式中，光源不法向(normal)于光栅。在一些实施方式中，光以45度和90度之间的任何角度击中光栅。在一些实施方式中，光以45度和89度之间的任何角度击中光栅。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，光不以90度击中光栅。在一些实施方式中，光束是相干的。在一些实施方式中，光束是准直的。在一些实施方式中，光束是相干的或准直的。在一些实施方式中，光束是相干的且准直的。在一些实施方式中，本发明的系统包括用于使光准直的滤光器。
如本文所使用的，术语“光学检测系统”和“检测器”同义使用并且指的是被配置为检测从光源发出的光的装置。在一些实施方式中，光学检测系统被配置为检测来自窄带光的衍射强度。在一些实施方式中，光学检测系统被配置为检测来自单色光的衍射强度。在一些实施方式中，光学检测系统不被配置为检测白光、宽带光或多色光。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，检测器是有源像素传感器(APS)。在一些实施方式中，APS是互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器。在一些实施方式中，检测器是电荷耦合器件(CCD)传感器。在一些实施方式中，检测器包括光频转换器。在一些实施方式中，光频转换器是TSL253R光频转换器。在一些实施方式中，传感器是Pi摄像机。在一些实施方式中，传感器是Raspberry Pi摄像机。
在一些实施方式中，光学检测系统被配置为检测零级衍射。在一些实施方式中，光学检测系统被配置为检测零和非零衍射级。在一些实施方式中，光学检测系统被配置为检测非零衍射级。在一些实施方式中，光学检测系统被配置为检测所有非零衍射级。在一些实施方式中，系统被配置为检测至少一级和二级衍射。在一些实施方式中，系统被配置为检测至少零级、一级和二级衍射。在一些实施方式中，系统被配置为检测至少两个非零衍射级。在一些实施方式中，系统被配置为检测至少一对奇数级和偶数级衍射。在一些实施方式中，系统被配置为检测至少一对相邻的奇数级和偶数级衍射。在一些实施方式中，测量两个非零衍射级提供比测量零级衍射更多的数据。在一些实施方式中，测量零级和两个非零衍射级提供比仅测量零级衍射更多的数据。在一些实施方式中，测量两个非零衍射级提供比测量零级衍射更大的分辨率。在一些实施方式中，测量两个非零衍射级允许实时监测单个隔室。
在一些实施方式中，信号处理单元适用于分析非零衍射级。在一些实施方式中，信号处理单元适用于分析零级衍射。在一些实施方式中，信号处理单元适用于分析零和非零衍射级。在一些实施方式中，信号处理单元适用于确定光栅的有效光学深度的时间依赖性变化。在一些实施方式中，信号处理单元适用于确定光栅的有效光学深度的时间相关性变化。在一些实施方式中，信号处理单元适用于确定细胞生长速率。在一些实施方式中，信号处理单元适用于确定生物材料的变化率。
在一些实施方式中，该系统还包括壳体。在一些实施方式中，系统被设置在壳体内部。
在一些实施方式中，至少衍射光栅设置在壳体内部。在一些实施方式中，系统进一步包括流体入口。在一些实施方式中，样本和/或细胞经由流体入口被带到衍射光栅。流体入口可以是管道(pipe)、管子(tube)、槽或可以将流体带到衍射光栅的任何类似结构。在一些实施方式中，系统进一步包括流体出口。在一些实施方式中，衍射光栅被设置在流体入口和出口之间。在一些实施方式中，衍射光栅被设置在壳体内部，流体入口和流体出口分别从壳体进入和离开。在一些实施方式中，系统的其他部件也设置在壳体内部。在一些实施方式中，系统的其他部件被布置在壳体外部。在一些实施方式中，光源在壳体外部。在一些实施方式中，光源在壳体内部。在一些实施方式中，光学检测系统在壳体外部。在一些实施方式中，光学检测系统在壳体内部。在一些实施方式中，信号处理单元在壳体内部。在一些实施方式中，信号处理单元在壳体外部。在一些实施方式中，本发明的系统被配置为沉积在使用水的家庭电器中，使得它可以监测电器内或电器内的水中的细胞生长。在一些实施方式中，使用水的家庭电器是水分配器。在一些实施方式中，壳体设置在水分配器内。在一些实施方式中，至少衍射光栅设置在水分配器内。应当理解，例如家用电器中的细菌生长可能是有害的。如果这些电器包含它们或使它们穿过饮用水，细菌生长可能是危险的。因此，可以将本发明的系统安装到电器中以监测细菌生长。在一些实施方式中，系统或至少衍射光栅沉积在滤水器内。在一些实施方式中，系统进一步包括用于通知何时细胞生长达到预定阈值的信号。在一些实施方式中，信号处理单元适用于产生指示细菌生长在任何时间的水平和/或指示细菌生长何时达到阈值水平的输出。以这种方式，系统可以发出告诉用户由于细菌生长而应该清洁或保养电器的输出，比如警报或灯。
另一方面，提供了一种计算机程序产品，包括其上具有程序代码的非瞬态计算机可读存储介质，该程序代码在由数据处理器执行时使数据处理器计算检测到的随时间的窄带光的零和非零衍射级的差，以确定产生窄带光的所述衍射级的衍射光栅的有效光学深度的变化。在一些实施方式中，数据处理器计算检测到的随时间的窄带光的非零衍射级的差的变化。
在一些实施方式中，所述差是强度的差值。在一些实施方式中，数据处理器计算零衍射级、非零衍射级或二者的差的时间依赖性。在一些实施方式中，数据处理器进一步确定衍射光栅中生物材料的量的变化。在一些实施方式中，时间依赖性指示生物材料的生长动力学。在一些实施方式中，计算包括比较相邻的奇数衍射级和偶数衍射级。在一些实施方式中，计算包括比较奇数衍射级和偶数衍射级。在一些实施方式中，计算包括比较至少两个非零衍射级。在一些实施方式中，计算包括找出相邻奇数衍射级和偶数衍射级的强度差。在一些实施方式中，计算包括找出一对奇数衍射级和偶数衍射级的强度差。在一些实施方式中，计算包括找出至少两个非零衍射级的强度差值。
计算机可读存储介质可以是有形装置，其可以保持和存储指令以供指令执行装置使用。计算机可读存储介质可以是例如但不限于电子存储装置、磁存储装置、光存储装置、电磁存储装置、半导体存储装置或前述的任何合适的组合。计算机可读存储介质的更具体实例的非详尽列表包括以下：便携式计算机软盘、硬盘、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦除可编程只读存储器(EPROM或闪存)、静态随机存取存储器(SRAM)、便携式光盘只读存储器(CD-ROM)、数字多功能磁盘(DVD)、存储棒、软盘、机械编码装置，例如穿孔卡或凹槽中记录有指令的凸起结构，以及前述的任何合适组合。如本文使用的，计算机可读存储介质不应被解释为瞬态信号本身，例如无线电波或其他自由传播的电磁波、通过波导或其他传输介质传播的电磁波(例如，穿过光纤电缆的光脉冲)或通过电缆传输的电信号。
本文描述的计算机可读程序指令可以从计算机可读存储介质下载到相应的计算/处理装置，或者通过网络，例如因特网、局域网、广域网和/或无线网络下载到外部计算机或外部存储装置。网络可以包括铜传输电缆、光传输光纤、无线传输、路由器、防火墙、交换机、网关计算机和/或边缘服务器。每个计算/处理装置中的网络适配卡或网络接口从网络接收计算机可读程序指令并转发(forward)计算机可读程序指令以存储在相应计算/处理装置内的计算机可读存储介质中。
用于执行本发明的操作的计算机可读程序指令可以是汇编指令、指令集架构(ISA)指令、机器指令、机器相关指令、微代码、固件指令、状态设置数据或以一种或多种编程语言的任意组合编写的任一种来源的代码或目标代码，包括面向对象的编程语言，比如Java、Smalltalk、C++等，以及常规的程序编程语言，比如“C”编程语言或类似的编程语言。计算机可读程序指令可以完全在用户计算机上、部分在用户计算机上、作为独立软件包、部分在用户计算机上和部分在远程计算机上或完全在远程计算机或服务器上执行。在后一种情况下，远程计算机可以通过任何类型的网络连接到用户的计算机，包括局域网(LAN)或广域网(WAN)，或者可以连接到外部计算机(例如，通过使用互联网服务提供商的互联网)。在一些实施方式中，包括例如可编程逻辑电路、现场可编程门阵列(FPGA)、专用集成电路(ASIC)或可编程逻辑阵列(PLA)的电子电路可以通过利用计算机可读程序指令的状态信息来执行计算机可读程序指令以使电子电路个性化，以便执行本发明的方面。
这些计算机可读程序指令可以提供给通用计算机、专用计算机或其他可编程数据处理装置的处理器以生产机器，使得经由计算机或其他可编程数据处理装置的处理器执行的指令创建用于实施在流程图和/或框图的一个或多个框中指定的功能/动作的机构。这些计算机可读程序指令也可以存储在计算机可读存储介质中，该计算机可读存储介质可以引导计算机、可编程数据处理装置和/或其他装置以特定方式运行，使得其中存储有指令的计算机可读存储介质包括制品，该制品包括实施流程图和/或框图的一个或多个框中指定的功能/动作的方面的指令。
在一些实施方式中，本发明的系统和/或计算机程序产品用于执行本发明的方法
在一些实施方式中，奇数级强度和偶数级强度之间的强度差的变化与有效光学深度的变化相关。在一些实施方式中，从奇数级的强度中减去偶数级的强度。在一些实施方式中，从偶数级的强度中减去奇数级的强度。在一些实施方式中，有效光学深度的增加表明所述至少一个隔室中的细胞材料的量增加。在一些实施方式中，系统被优化和/或校准以将衍射级的偏差与所述微生物的相对生长相关联。在一些实施方式中，确定有效光学深度的变化包括用已知折射率的介质校准衍射级的强度。常用介质的衍射指数在本领域中是众所周知的，或者可以通过在没有细胞的孔中进行本发明的检测来凭经验得出。在一些实施方式中，至少一个光栅是对照光栅。在一些实施方式中，对照光栅不包括生物材料或细胞材料。在一些实施方式中，对照光栅用于校准检测器和/或信号处理单元。在一些实施方式中，在执行本发明的方法之前预先确定对照标准。在一些实施方式中，已经提供了来自对照光栅的结果，使得它们可以用于校准而无需与测试孔并行执行对照。在一些实施方式中，确定有效光学深度的变化包括通过检测从照射没有至少一种细胞或样品的衍射光栅获得的衍射级强度来校准检测器。在一些实施方式中，对照衍射光栅是未接种细胞的光栅。在一些实施方式中，对照衍射光栅是仅具有细胞生长培养基的光栅。在一些实施方式中，系统包括来自对照光栅的结果。在一些实施方式中，信号处理单元包括来自对照光栅或对照实验的结果。在一些实施方式中，系统和/或信号处理单元预加载有来自对照或对照实验的结果。
在一些实施方式中，接种至少一种细胞。在一些实施方式中，接种至少1、10、100、200、300、400或500个细胞。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，接种至少400个细胞。在一些实施方式中，用包含至少10^1、10^2、10^3、10^4、10^5、10^6、10^7或10^8个细胞/ml的溶液进行接种。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，用包含至少10^3个细胞/ml的溶液接种。在一些实施方式中，溶液包含约10^3个细胞/ml。在一些实施方式中，溶液包含约10^3个细胞/ml并且接种约0.4ml。
在一些实施方式中，接种导致每平方毫米衍射光栅至少有3个细胞。在一些实施方式中，接种导致每平方毫米衍射光栅至少有1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个细胞。每种可能性代表本发明的单独实施方式。
在一些实施方式中，本发明的方法可以在少于10分钟、30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、15小时、20小时或24小时内进行。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，本发明的方法可以在约30分钟内进行。在一些实施方式中，本发明的方法可以在约90分钟内进行。在一些实施方式中，本发明的方法可以在少于3小时内进行。在一些实施方式中，本发明的方法可以在少于4小时内进行。在一些实施方式中，本发明的方法可以在少于6小时内进行。在一些实施方式中，确定细胞材料的量的变化发生在少于10分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、15小时、20小时或24小时内。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，确定细胞材料的量的变化发生在少于3小时内。在一些实施方式中，确定细胞材料的量的变化发生在约30分钟内。在一些实施方式中，确定细胞复制速率发生在少于10分钟、30分钟、45分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、15小时、20小时或24小时内。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，确定细胞复制速率发生在少于90分钟内。在一些实施方式中，确定细胞复制速率发生在少于3小时内。在一些实施方式中，确定细胞复制速率发生在约30分钟内。应当理解，本发明的方法需要的时间量将取决于光栅中生物材料的复制和/或生长速率以及材料或细胞的大致初始量，因此更快的复制/越来越多的生物制品以及更大的起始数量和/或量将能够被更快地进行分析。
在一些实施方式中，可以在30分钟和3小时，30分钟和4小时，30分钟和6小时，30分钟和8小时，30分钟和10小时，30分钟和12小时，20分钟和24小时，1小时和3小时，1小时和4小时，1小时和6小时，1小时和8小时，1小时和10小时，1小时和12小时，或1小时和24小时之间执行本发明的方法，确定细胞材料的量的变化发生或确定细胞复制速率发生。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，可以在30分钟和3小时之间执行本发明的方法、确定细胞材料的量的变化发生或确定细胞复制速率发生。在一些实施方式中，可以在至少90分钟内执行本发明的方法、确定细胞材料的量的变化发生或确定细胞复制速率。在一些实施方式中，可以在不超过90分钟内执行本发明的方法、确定细胞材料的量的变化发生或确定细胞复制速率。
在一些实施方式中，用至少1、3、5、10、15、20、30、40、50、100、200、300、400或500个细胞进行接种。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，用至少10个细胞进行接种。在一些实施方式中，用至少3个细胞进行接种。在一些实施方式中，用每平方毫米衍射光栅至少3个细胞进行接种。在一些实施方式中，用接种溶液中至少1、3、5、10、15、20、30、40、50、100、200、300、400或500个细胞/ml进行接种。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，用接种溶液中至少10个细胞/ml进行接种。在一些实施方式中，用约300个细胞进行接种。
在一些实施方式中，用每平方毫米衍射光栅至少3个细胞进行接种，并且本发明的方法在不超过90分钟内进行。在一些实施方式中，衍射光栅包括细胞引诱剂。在一些实施方式中，细胞引诱剂在90分钟内以每平方毫米衍射光栅少至3个细胞促进该方法的执行。
在一些实施方式中，本发明的方法以至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的准确率进行。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，本发明的方法以至少95％的准确率进行。在一些实施方式中，细胞复制的检测以95％的准确率进行。在一些实施方式中，样品中细胞存在的检测以95％的准确率进行。如本文所使用的，术语“准确率”是指衍射光栅中光学深度变化的正确识别。因此，95％的准确率意味着如果测量100个光栅的生物材料生长和/或复制，系统将正确识别该生长或复制至少95次。在一些实施方式中，准确率是生长和/或复制的阳性检测。在一些实施方式中，准确率在于没有检测到衍射光栅中的生长和/或复制，其中它没有发生。在一些实施方式中，准确率包括假阳性率。在一些实施方式中，准确率包括假阴性率。在一些实施方式中，假阴性率小于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0％。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，假阴性率小于5％。在一些实施方式中，假阴性率小于1％。在一些实施方式中，假阳性率小于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0％。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，假阳性率小于5％。在一些实施方式中，假阳性率小于4％。在一些实施方式中，本发明的系统包括以上列举的准确率、假阳性率和/或假阴性率。
在一些实施方式中，感染是细菌感染。在一些实施方式中，感染是真菌感染。在一些实施方式中，感染是酵母感染。在一些实施方式中，感染是细菌、真菌或酵母感染。在一些实施方式中，微生物源自选自尿路感染、阴道感染、呼吸道感染、脑部感染、肠道感染、血液感染、肝脏感染、心脏感染和脑脊液感染的感染。
在一些实施方式中，受试者未接受(is 
to)感染的治疗。在一些实施方式中，受试者已经接受了感染治疗。在一些实施方式中，治疗是无效的。在一些实施方式中，治疗是有效的。在一些实施方式中，受试者尚未接受治疗、已接受无效治疗或已接受有效治疗。在一些实施方式中，受试者被怀疑患有感染。在一些实施方式中，本发明的方法用于确定感染。在一些实施方式中，本发明的方法用于监测感染进展。在一些实施方式中，本发明的方法用于监测感染缓解。在一些实施方式中，本发明的方法用于监测受试者无感染状态的持续性。在一些实施方式中，本发明的方法用于选择感染的治疗剂。
在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括在接种后向光栅加入测试剂，其中测试剂具有改变至少一种细胞的光学性质的潜力。在一些实施方式中，改变细胞的光学性质包括改变复制、改变细胞周期、改变细胞分泌、改变细胞代谢、改变细胞生存力和改变细胞存活中的至少一种。在一些实施方式中，细胞的光学特性指示细胞生存力、细胞复制、细胞运动性、细胞代谢、蛋白质产生、脂质产生、体积扩展和分泌中的至少一种。在一些实施方式中，细胞的光学性质是细胞体积、细胞质量和细胞密度中的至少一种。
在一些实施方式中，至少一种治疗剂和/或测试剂选自抗生素、化疗剂、放射性同位素、杀真菌剂、抗病毒剂、生物抑制剂、抗体、免疫细胞和病毒。在一些实施方式中，至少一种治疗剂或测试剂是抗生素。在一些实施方式中，不同的治疗剂被施加到不同的光栅。在一些实施方式中，不同浓度的治疗剂被施加到不同的光栅。在一些实施方式中，本发明的方法用于确定治疗剂的最低抑制浓度(MIC)。
如本文所使用的，当与值组合时，术语“约”是指参考值±10％。例如，约1000纳米(nm)的长度是指1000nm±100nm的长度。
注意，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“多核苷酸”包括多个这样的多核苷酸，和提及“多肽”包括提及一种或多种多肽及本领域技术人员已知的其等价物等。此外应注意，权利要求可以被起草以排除任何任选的要素。因此，该陈述旨在作为与权利要求要素的叙述相关联的专有术语比如“唯一地(solely)”、“仅(only)”等的使用或“否定”限定的使用的先行基础。
在使用与“A、B和C等中的至少一个”类似的约定的那些情况下，一般而言，这样的构造旨在在本领域技术人员将理解约定的意义上(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于以下系统：仅A、仅B、仅C、A和B一起、A和C一起、B和C一起、和/或A、B和C一起，等)。本领域技术人员将进一步理解，实际上无论是在说明书、权利要求书或附图中的任何呈现两个或多个可选术语的分离词和/或短语都应被理解为考虑包括一个术语、任一个术语或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
应当理解，为了清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。与本发明有关的实施方式的所有组合都被本发明具体地包括并且在此公开，就像每个组合被单独地和明确地公开一样。此外，各个实施方式的所有子组合及其要素也被本发明具体地包括并且在本文中被公开，就好像每个这样的子组合在本文中被单独和明确地公开一样。
本发明的其他目的、优点和新颖特征在审查以下实施例后对本领域普通技术人员将变得显而易见，这些实施例不旨在是限制性的。此外，以上描述的和以下权利要求部分要求保护的本发明的各个实施方式和方面中的每一个在以下实施例中找到实验依据。
上文描述的和下文权利要求部分要求保护的本发明的各个实施方式和方面在以下实施例中找到实验依据。
实施例
通常，本文使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括分子、生化、微生物和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见，例如，“Molecular Cloning:Alaboratory Manual”Sambrook等人，(1989)；“Current Protocols in MolecularBiology”第I-III卷，Ausubel，R.M.编(1994)；Ausubel等人，“Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal，“APractical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等人，“Recombinant DNA”，Scientific American Books,New York；Birren等人(编)“Genome Analysis:A Laboratory Manual Series”，第1-4卷，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1998)；如美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所述的方法；“Cell Biology:A Laboratory Handbook”，第I-III卷，Cellis,J.E编(1994)；“Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique”，Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994)，第三版；“Current Protocols in Immunology”第I-III卷，Coligan J.E.编(1994)；Stites等人(编)，“Basic and Clinical Immunology"(第8版)，Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(编)，“Strategies forProtein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual”，CSHLPress(1996)；所有这些都通过引用以其整体。本文档中提供了其他一般参考资料。
光学原理
实施例1：光栅准备和设置
光栅由硅晶片制成并经历热氧化以产生具有约100nm厚度的稳定的硅外层。用H2SO4/H2O2溶液清洁光栅，并进一步修饰其表面以包括异丙烯酯或甲基丙烯酸丙酯作为表面官能团。使用前，将光栅用乙醇润湿并放置在装置检测通道内。
在图1所图解的标准设置中，将硅光栅网格元件放置在温度受控的盆中，由弹性体分隔件分割成8个单独的通道。通过将薄玻璃压在弹性体上来密封通道，有效地形成20mm长、2mm×3mm的通道。激光模块指向每个通道中放置光栅元件的光点。从光栅元件反射的光的非零衍射级由光传感器阵列获取，并记录衍射级的强度分布。当溶液通过光栅元件时，流动通道允许轻松加入溶液(例如细菌悬浮液、生长培养基、抗生素等)，并且还允许在每次分析完成后轻松处理样品。
穿过光学光栅的光产生衍射图案。图2A显示了相位光栅的示意图，和图2B显示了穿过这种光栅并产生衍射级的激光。两种材料的折射率分别用n1和n2表示。d和b是光栅尺寸，w是光栅深度，m是衍射级。L是所有光栅的总宽度。衍射角取决于光栅之间的距离，并且通常表示为D·sinθ＝nλ。因此，光栅内尺寸的改变将改变所有衍射级的空间位置。当两个衍射光栅垂直叠加时(如在本发明的2D光栅中)，它们形成二维周期性孔径阵列。观察到的衍射图案既不是单个光栅原始图案的总和也不是乘积，而是将单独的图案重复以形成二维阵列。二维阵列的衍射图案类似于阵列的倒易晶格，并且可以标记(索引)，如图2C中所显示的。由于两个光栅轴的对称性，衍射分布的四分之一是彼此相同的反射。图2D展示了由来自硅光栅网格的650nm激光束产生的反射的四分之一衍射图案。由于激光并非准确地垂直于光栅，直接反射与零衍射级(箭头)略有偏移。
对于每个m级，衍射角θ处的光强分布为：
等式1：
对于每个衍射级m，强度值达到其最大值取决于光栅光学深度w(n1-n2)：
等式2：
由于项sinc2(m/2)，奇数级强度在与偶数级强度相反方向上偏移。因此，当w(n1-n2)发生变化时，I(odd)–I(even)会发生变化。这种关系可以简称为ΔIm∝Δn。图3A呈现了一个假设的折射分析示例。测量两个相邻衍射级(奇数一级和偶数二级)的强度，可以将它们的值绘制为溶液折射率的函数。正如等式1所预期的那样，光强度作为光栅光学深度的函数反向分布(这里由溶液折射率调节)。通过绘制强度偏移(ΔI，Iodd-Ieven)，数据可以概括为单个参数，其中增加的ΔI表示增加孔中细胞生物质。
等式1应被视为由余弦项调节的正弦级数。正弦相位数由g表示，即在它之前的最大值gmax或最小值gmin的量。
对于gmax，min＝0；变换是y＝Arccos(1-2x)/2
对于gmax＝1，2，3…；变换是y＝Arcsin(1-2x)/2+p*g
对于gmin＝1，2，3…；变换是y＝Arccos(1-2x)/2+p*g
其中p是与光栅制造变化的细节相关的校正因子，并通过实验确定。对于图3A中给出的实例的光栅，确定p＝-0.5。图3B显示了应用此变换后图3A中的数据。
实施例2：克服检测限
检测限(LOD)是指样品悬浮液中细菌的最小浓度，其可以在本发明的装置内被阳性检测。图4A描绘了一个完全没有细菌的光栅。点代表实际测量值，而黑线代表移动平均值。初始细菌浓度为105/ml(图4B)，该图包含两个部分：一个60分钟的滞后期，然后是一个初始上升的生长期。如果初始细菌浓度从107/ml开始(图4C)，则生长期立即开始，没有延缓。
为了改进LOD并减少滞后期，开发了一种改进的表面处理，其允许蔗糖分子半稳定地吸附到光栅上。半稳定的蔗糖沉积物可以在光栅上方的溶液中维持浓度梯度，通过主动趋化性吸引细菌细胞。这是通过向表面加入双键氧分子来增加糖侧基和表面之间潜在氢键的数量来实现的。然后通过与pH 8的2％蔗糖溶液接触来加载表面。
在应用趋化性方法时，可以使用较低的细菌起始浓度来使光栅建群，既提高LOD又截断滞后期。图5A-C显示了取自初始细菌浓度为103/ml、104/ml和105/ml(分别为图5A、5B和5C)的蔗糖处理光栅的图。在所有这些事件中，生长期迅速开始，没有滞后效应，并以类似的方式进展。因此，使用蔗糖处理通过消除滞后期大大提高了AST的执行速度。
为了确定作为每平方毫米光栅的细胞数的实际检测极限，将0.3ml稀释的细菌悬浮液流到衍射光栅上。测试了三种细胞浓度，每平方毫米30个细胞、每平方毫米3个细胞和每平方毫米少于3个细胞(图5D)。在细菌接种阶段(样品流通)之后，系统接受营养培养基(Muller-Hinton)并在90分钟内每3分钟收集一次数据。即使每平方毫米的光栅只有3个细胞，也可以检测到细胞生长，这表明该系统仅在一个半小时内就可以检测到极低的检测限。
实施例3：具有细菌细胞的光栅
将大肠杆菌细胞接种到包含细菌生长培养基的衍射光栅的孔中并允许自由复制。监测来自该孔以及仅包含培养基的孔的一级和二级衍射3小时(分别为图6A和6B)。在含有细菌的孔中观察到的强度偏移(ΔI)增加(图6C)表明由于光栅中细菌生物质的积累，光学深度随时间增加。从缺乏细菌的孔中没有观察到ΔI的变化(图6D)。
由于以亚细胞精度分析细菌菌落，因此甚至可以在复制周期完成之前观察到变化。这有助于在很短的温育时间后完成分析。如上面所解释的，光栅内部细菌的物理存在有助于光栅光学深度的时间依赖变化，并且因此有望促进奇数衍射级和偶数衍射级强度之间的差值。随着细胞复制，生物质的增长会成比例地增加光学深度，进一步扩大衍射级之间的强度差距。
为了确认系统准确地预测细菌生长，从以色列内坦亚的拉尼亚多医疗中心(Laniado Medical Center)患者的临床尿样中分离了三种细菌菌株(肺炎克雷伯菌(K.pneumonia)、奇异假单胞菌(P.Mirabilis)和大肠杆菌)的样品。将细菌菌落接种在Muller-Hinton肉汤中，并通过光密度分析计算悬浮液中的细胞浓度，然后在磷酸盐缓冲水中稀释至104个细胞/ml。
系统中的每个光学微流体通道都制备有具有化学引诱特性的衍射光栅芯片。系统中的每个通道都是独立的单元，并用专用激光源连续照射。在每个微流体通道中加入0.3ml细菌悬浮液样品，并在那里温育30分钟。接下来，将每个微流体通道用含有或不含抗生素(1μg庆大霉素)的0.5ml肠杆菌科选择性生长培养基(McConkey)冲洗。对于肺炎克雷伯菌，收集了24个样本，其中9个在庆大霉素存在下生长。对于奇异假单胞菌，收集了33个样品，其中12个在庆大霉素存在下生长。对于大肠杆菌，收集了26个样品，其中15个在庆大霉素存在下生长。从每个通道反射的激光衍射产生衍射图像，每1分钟记录一次，持续120分钟。自动分析图像数据以提取每个图像的每个衍射点的强度。经历记录的机械故障的实验被排除在进一步分析之外。
对于每个实验，计算相对衍射强度随时间的趋势。结果中排除了在最后30分钟内与趋势线偏差大于50％的实验。偏移，定义为测量开始和结束时衍射强度之间的相对差异，用于确定是否发生生长。由于所有菌株都对抗生素有反应，因此预期任何加入了庆大霉素的孔都不会生长。对于每种细菌，确实测量到所有具有预期生长的光栅在分析的120分钟内都有生长。还对每种细菌测量了一个假阳性(表1)。因此，对于测量肺炎克雷伯菌的生长，本发明的系统准确率为95.8％，对于奇异假单胞菌，系统准确率为96.9％，对于大肠杆菌，系统准确率为96.15％，总准确率超过96％。
表1：生长实验的总结
实施例4：具有细菌细胞和抗生素的光栅
如本文所述，将大肠杆菌细胞以10^4个细胞/ml的浓度接种到用半稳定蔗糖功能化的光栅的孔中。在接种步骤之后，供应营养培养基，同时监测衍射光学输出。细菌生长60分钟，然后在装置通道中补充不同浓度的G418(遗传霉素)抗生素。
通过监测随时间的衍射，建立了最低抑制浓度(MIC)的范围(图7A-D)。对照孔未接受抗生素，并观察到正常对数生长(图7A)。加入2.5μg G418没有显著抑制细菌生长(图7B)。然而，加入5.0μg(图7C)或7.5μg完全抑制了细菌生长(图7D)。这将使MIC介于2.5和5.0μg之间，这与通过连续抗生素稀释的经典方法发现的范围(2.3-4.7μg)相同(图7E)。
尽管已经结合其具体实施方式描述了本发明，但是很明显，许多替代、修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，其意图包括落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有此类替代、修改和变化。
Claims (30)
1.一种系统，所述系统包括：
a.衍射光栅，其包括具有横向尺寸的隔室，使得细胞可装配在其中；
b.光源，其配置为以不大于25nm的有限波段照射，所述光源产生指向所述衍射光栅的相干且准直的光束；
c.光学检测系统，其配置为检测来自所述衍射光栅的所述光束的零和非零衍射级；和
d.信号处理单元，其适用于分析所述零和非零衍射级以确定所述光栅的有效光学深度的时间依赖性变化并由此确定所述光栅中细胞生长的量度。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述细胞是微生物，并且任选地是细菌。
3.根据权利要求1或2所述的系统，用于测量细胞的生长。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的系统，其中所述衍射光栅涂覆有细胞引诱剂，并且任选地其中所述细胞引诱剂是糖。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的系统，其中所述衍射光栅含有适于细胞存活的液体，并且任选地其中所述细胞引诱剂配置为扩散到所述液体中，从而产生浓度梯度。
6.根据权利要求4或5所述的系统，其中所述细胞引诱剂通过氢键至所述光栅上的双键氧而附接至所述光栅，并且任选地其中所述光栅包括包含所述双键氧的活性基团。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的系统，其中所述光源是激光器、激光二极管或发光二极管(LED)。
8.根据权利要求7所述的系统，其中所述光源是激光器并且配置为以至多5nm的波段照射。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的系统，其中所述光学检测系统包括光强度检测器。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的系统，其中所述光学检测系统配置为检测所述光束的至少一级和二级衍射。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的系统，进一步包括壳体和流体入口和出口，并且其中至少所述衍射光栅设置在所述壳体内部。
12.根据权利要求11所述的系统，其中所述系统设置在水分配器中。
13.一种用于实时检测细胞复制或生长的方法，所述方法包括：
a.将至少一种细胞接种到权利要求1至12中任一项所述的系统的衍射光栅中；
b.用所述光束照射包括所述至少一种细胞的所述衍射光栅；
c.检测来自所述照射的衍射光栅的所述光束的零和非零衍射级；和
d.分析随时间的所述衍射级的强度以确定包括所述至少一种细胞的所述衍射光栅的有效光学深度的变化，并且由此确定包括所述至少一种细胞的所述衍射光栅中的细胞材料的量随时间的变化；
从而实时检测细胞复制或生长。
14.一种选择用于治疗细胞生长的治疗剂的方法，所述方法包括：
a.将至少一种细胞接种到权利要求1至12中任一项所述的系统的多个衍射光栅中；
b.向来自包括所述至少一种细胞的所述多个衍射光栅的至少一个衍射光栅施用至少一种潜在的治疗剂；
c.用所述光束照射包括所述至少一种细胞的所述衍射光栅；
d.检测来自所述照射的衍射光栅的所述光束的零和非零衍射级；
e.处理随时间的所述衍射级的强度以确定包括所述至少一种细胞的每个衍射光栅的有效光学深度的变化，并且由此确定包括所述至少一种细胞的每个衍射光栅中的细胞材料的量随时间的变化；和
f.选择与对照相比导致细胞材料生长停滞或恶化的治疗剂；
从而选择用于治疗所述细胞的生长的治疗剂。
15.一种确定样品中细胞的存在的方法，所述方法包括：
a.将所述样品施用到权利要求1至12中任一项所述的系统的衍射光栅中；
b.用所述光束照射包括所述样品的所述衍射光栅；
c.检测来自包括所述样品的所述照射的衍射光栅的所述光束的零和非零衍射级；和
d.处理随时间的所述衍射级的强度以确定包括所述样品的所述衍射光栅的有效光学深度的变化，并且由此确定包括所述样品的所述衍射光栅中细胞材料的量随时间的变化；其中细胞材料的增加指示所述样品中所述微生物的存在；
从而确定所述样品中所述细胞的存在。
16.根据权利要求15所述的方法，用于确定样品中所述细胞的特性，其中将所述样品施用到包括不同的衍射光栅中至少两种不同的选择性生长培养基的多个衍射光栅中，并且其中特定选择性生长培养基中的生长指示所述细胞的特性。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述细胞来自传染性微生物。
18.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述细胞是从患有或怀疑患有微生物感染或癌症的受试者提取的。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中所述样品是取自需要其的受试者的样品。
21.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述样品是水样品。
22.根据权利要求13至21中任一项所述的方法，其中衍射级的所述处理包括处理至少两个非零衍射级，并且其中奇数级和偶数级的强度之间的差的增加表明有效光学深度的增加和所述光栅中细胞材料的量的增加。
23.根据权利要求13至22中任一项所述的方法，其中所述细胞材料包括下述任一种：
a.细胞；
b.细胞分泌物；
c.细胞外基质；
d.其部分；和
e.其组合。
24.根据权利要求13至23中任一项所述的方法，其中所述确定有效光学深度的变化包括通过检测由照射没有所述至少一种细胞或样品的所述衍射光栅获得的衍射级的强度校准所述检测器。
25.根据权利要求13至24中任一项所述的方法，进一步包括在接种之后向所述光栅加入测试剂，其中所述测试剂具有改变所述至少一种细胞的生存力、复制、运动性、代谢、蛋白质产生、脂质产生和分泌的至少一种的潜力，并且任选地其中所述至少一种治疗剂或测试剂选自抗生素、化疗剂、放射性同位素、杀真菌剂、生物抑制剂、抗体、免疫细胞和病毒。
26.根据权利要求13至25中任一项所述的方法，其中所述接种包括所述衍射光栅中细胞的最终浓度为每平方毫米所述衍射光栅至少3个细胞。
27.根据权利要求13至25中任一项所述的方法，其中所述方法在不超过90分钟内进行。
28.一种计算机程序产品，包括其上具有程序代码的非瞬态计算机可读存储介质，所述程序代码在由数据处理器执行时使数据处理器计算随时间检测到的单色光的零和非零衍射级的差，以确定产生单色光的零和非零衍射级的衍射光栅的有效光学深度的变化。
29.根据权利要求28所述的计算机程序产品，其中所述数据处理器计算零和非零衍射级的差的时间依赖性，并且任选地确定所述衍射光栅中生物材料的量的变化。
30.根据权利要求28至29中任一项所述的计算机程序产品，其中所述计算包括比较奇数衍射级和偶数衍射级。
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