CN104011541A - 细菌或真菌的抗菌药物敏感性的检查方法及其中使用的系统 - Google Patents
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Abstract
提供一种可简便且迅速地检查细菌或真菌对抗菌药物的敏感性的新方法以及用于该方法的检查系统。本发明的检查方法是细菌或真菌的抗菌药物敏感性的检查方法，其特征为，具有以下步骤：使用具有流路的微型装置，在所述微型装置的所述流路内培养抗菌药物与被检菌液的混合液的步骤；及检测所述微型装置的所述流路的观察区域中来自所述被检菌液的细菌或真菌的检测步骤。所述检测步骤例如可通过用显微镜等检测所述观察区域中来自所述被检菌液的细菌或真菌的增减或形态变化而进行。
Description
技术领域
本发明涉及一种细菌或真菌的抗菌药物敏感性的检查方法及其中使用的系统。
背景技术
近年，由于耐药菌的增加，为选择有效的抗菌药物，确认细菌或真菌对抗菌药物的敏感性极为重要。
发表了用于检查细菌及真菌的敏感性、以简便快速化为目的的设备（非专利文献1）。但是，该大型设备昂贵。此外，为进行浊度判定，所述设备必须将菌增殖到可判定的浊度为止。例如，在绿脓杆菌这类增殖缓慢的菌的情况下，即使最短也需要8小时以上。此外，作为不需要所述设备的方法，一般的，可列举通过微量液体稀释法、通过具有浓度梯度的圆盘（disc）从琼脂培养基上形成的培养后的抑制圈判定MIC（最小抑菌浓度）的方法、基于Kirby-Bauer法（K-B法）的圆盘法等（非专利文献2）。但是对于这些方法，从检查开始到敏感性的判定例如需要大约18小时，因此进一步快速化是必需的。
现有技术文献：
非专利文献
非专利文献1：Kanemitsu等，Journal of Clinical Microbiology，2005,p.5808－5810
非专利文献2：石井等，日本化学疗法学会杂志，2002，p.259－265
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种可简便且迅速地检查细菌或真菌对抗菌药物的敏感性的新方法及其中使用的检查系统。
为达到所述目的，本发明的检查方法为下述细菌或真菌的抗菌药物敏感性的检查方法，其特征为：包括以下步骤：使用具有流路的微型装置(microdevice)，在所述微型装置的所述流路内培养抗菌药物与被检菌液的混合液的步骤；及检测所述微型装置的所述流路的观察区域中来自所述被检菌液的细菌或真菌的检测步骤。
本发明的检查系统为根据所述本发明的检查方法用于检查细菌或真菌的抗菌药物敏感性的检查系统，其特征为：具有以下单元：培养具有导入了被检菌液与抗菌药物的混合液的流路的微型装置的培养单元，获取所述微型装置的所述流路的观察区域的图像的图像获取单元，及获取所述图像中细菌或真菌的数量及形态中的至少一者的信息的信息获取单元，及基于所述信息判定来自所述被检菌液的细菌或真菌的抗菌药物敏感性的判定单元。
根据本发明，在所述微型装置的流路内培养抗菌药物与被检菌液的混合液，并通过例如用显微镜等观察所述流路中的观察区域，可简便并且迅速地确认细菌或真菌对抗菌药物的敏感性。此外，根据本发明的检查系统可简便地进行所述本发明的检查方法。因此，本发明在临床检查、环境检测等中极其有用。特别是在临床检查中，例如，由于就作为对象的细菌及真菌可尽早地选择适当的抗菌药，因此可期待提高生存率、减少不必要的药物的使用量等效果，从长期来看的话有抑制耐药菌的增加的可能。
附图说明
图1A是表示微型装置的一例的立体图。
图1B是表示微型装置的一例的俯视图。
图1C是表示微型装置中上基板的一例的仰视图。
图2A是表示微型装置的一例的立体图。
图2B是表示微型装置的一例的俯视图。
图2C是表示微型装置中上基板的一例的仰视图。
图2D是表示微型装置的一例的剖面图。
图3是本发明的实施例中绿脓杆菌的显微镜照片。
图4是本发明的实施例中绿脓杆菌的显微镜照片。
图5是本发明的实施例中绿脓杆菌的显微镜照片。
图6是表示本发明的实施例中65个种类的绿脓杆菌株的分类的图表。
图7是本发明的实施例中绿脓杆菌的显微镜照片。
图8是本发明的实施例中绿脓杆菌的显微镜照片。
图9是表示本发明的检查系统的一例的区块图。
图10A是表示微型装置的一例的立体图。
图10B是表示微型装置的一例的俯视图。
图10C是表示微型装置中上基板的一例的仰视图。
图10D是表示微型装置的一例的剖面图。
具体实施方式
本发明的检查方法如前所述，是细菌或真菌的抗菌药物敏感性的检查方法，其特征为：包括以下步骤：使用具有流路的微型装置，在所述微型装置的所述流路内培养抗菌药物与被检菌液的混合液的培养步骤；及检测在所述微型装置的所述流路的观察区域中来自所述被检菌液的细菌或真菌的检测步骤。
本发明中，所谓细菌或真菌的抗菌药物敏感性的检查包括例如细菌或真菌的抗菌药物耐药性的检查的含义。
本发明的检查方法中，作为检查对象的细菌及真菌的种类没有特别的限定。作为具体例，例如，可以列举金黄色葡萄球菌、肠球菌、大肠杆菌及其他的肠内细菌、绿脓杆菌、不动杆菌属及其他的糖非发酵菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、军团菌、弯曲杆菌属细菌、结核菌等。
本发明的检查方法中，作为检查对象的被检菌液的种类没有特别的限制。所述被检菌液例如可以从由临床样本等分离培养的菌落制备。所述被检菌液不限定于此，例如也可直接使用临床样本。该情况下，所述临床样本优选例如污染可能性低的样本，此外，优选能确保足够的菌密度的样本。此外，使用所述临床样本的情况下，例如优选地，进行从所述临床样本菌的回收和向培养基的再悬浮。
本发明的检查方法中，所述微型装置的结构没有任何限制，只要具备可导入所述被检菌液的流路即可。对于所述微型装置，在后面说明例子。
本发明的检查方法中，对于所述微型装置，所述抗菌药物及所述被检菌液的导入顺序没有特别的限定。导入也可以例如称为接种或供给。所述培养步骤中，例如可在所述微型装置的所述流路中导入所述抗菌药物与所述被检菌液的混合液。此外，例如，在所述微型装置的所述流路中，可以预先配置所述抗菌药物，并在所述培养步骤前或所述培养步骤中在所述微型装置的所述流路中导入所述被检菌液。
本发明的检查方法中，导入所述微型装置的所述被检菌液的量及所述被检菌液中的菌数没有特别的限定。所述量及菌数例如可根据所述微型装置的大小、所述流路的大小等适当地设定。本发明的检查方法中使用的抗菌药物的量没有特别的限定，例如，可根据所述被检菌液的量及推测的临床有效浓度（断点）等适当地设定。
本发明的检查方法中，所述培养步骤的条件没有特别的限定。例如可以根据作为对象的细菌或真菌的最适生长条件，适当地选择所述培养条件。培养温度没有特别的限制，例如为30-37℃，作为具体例，大肠杆菌及绿脓杆菌等一般细菌例如为37℃。培养的时间没有特别的限定，大肠杆菌等增殖快的菌例如为2-3小时，绿脓杆菌及其他的糖非发酵菌例如为3-4小时。培养时间不限定于此，例如，在所述抗菌药物不存在时的所述被检菌的增殖（对照）也可在达到足够进行判定的水平的时间点完成。
就本发明的检查方法而言，例如，该培养时间实质上成为决定检查需要的全部时间的因素。因此，由于根据本发明的检查方法可在短时间内进行所述培养步骤，因此综合地说可以以非常短的时间进行检查。
所述培养步骤中，所述微型装置例如由于通过加温使流路内干燥，可以充分防止所述抗菌药物的浓度变化，因此优选地，在维持湿度条件下进行培养。作为具体例，例如，在装入了含有水的纸等的密闭容器内培养所述微型装置。所述湿度例如为95-100％、优选97-100％。
所述检测步骤中，例如，关于来自所述被检菌液的细菌或真菌，优选地观察所述观察区域中数量的增减及形态变化中的至少一者。所述检测步骤中，例如，可仅仅观察数量及形态的任何一方面，也可观察两方面。所述检测步骤中，例如，可观察细菌或真菌的疏密程度。所述检测步骤中，例如关于细菌或真菌的数量、形态变化及／或疏密程度，可观察培养步骤前后的变化或随时间的变化。细菌或真菌显示对所述抗菌药物的耐药性的情况下，例如，一进行所述培养就通过增殖加增加菌数。另外，细菌或真菌显示对所述抗菌药物的敏感性的情况下，例如，可看到即使进行培养菌数也不增加、由于死亡数量而减少、或形态变化等迹象。因此，例如观察数量的增减及／或形态变化，可以判断细菌或真菌的抗菌药物敏感性。所述敏感性的判断，例如，可判断敏感性的有无，也可判断MIC。
所述检测步骤中，来自所述被检菌液的细菌或真菌的检测方法没有特别的限定，例如，可列举通过显微镜检测。其中，由于可进行更正确的检查，所述检测步骤中，优选地，通过所述显微镜检测来自所述被检菌液的细菌或真菌。对所述显微镜的种类没有特别的限定，例如可列举光学显微镜、荧光显微镜等，优选光学显微镜。此外，所述显微镜例如优选小型显微镜。所述显微镜例如优选具备CCD（电荷耦合器件，ChargeCoupled Device）。本发明的检查方法例如通过使用所述微型装置和所述显微镜，例如，不需要使用昂贵的设备，此外，也可避免根据装置选位置。因此，例如可容易地引入到现有的检查室及研究室，并可非常容易地实施。此外，通过所述显微镜的检测也包括例如根据从所述显微镜输出的图像进行检测的含义。所述显微镜，例如，为了得到其视野中的图像，优选连结输出部件。所述输出部件例如可列举监测器、打印机等。
本发明的检测方法中，所述检测步骤例如在所述培养步骤之前或之后进行，特别地，优选地在所述培养步骤的前后进行。也就是说，优选地在所述微型装置的培养前及培养后的两种情况都进行所述检测。由此，例如可比较培养前的数量和培养后的数量或培养前的形态和培养后的形态。
本发明的检测方法中，所述微型装置如前所述没有任何限定。以下虽举例说明所述微型装置，但本发明不限定于此。
所述微型装置中，所述流路最好是液体可在其内部移动。对所述流路内中液体流动的机制没有任何限定。作为具体例，例如可利用所述流路的毛细现象使所述液体移动，也可通过加压或减压使其移动。所述流路例如优选微流路。例如，为了确保所述流路的流路长度等，所述流路可以设计成弯曲形状。该情况下，例如从降低对通过所述流路的所述液体的阻力的观点来看，所述流路的角部优选为弯曲的形状、圆形形状等。
所述微型装置中，所述流路例如其中一个端部开口。所述开口端部例如成为所述被检菌液的导入口，也叫供给口或接种口。此外，所述流路例如进一步优选另一端部也开口。所述另一开口端部例如形成空气口。此外，所述另一开口端部例如也可作为导出从所述导入口导入并通过了所述流路的被检菌液的导出口。所述导出口例如也可叫做从所述流路排出所述被检菌液的排出口。所述流路中，所述被检菌液从所述导入口流动的方向叫“流动方向”，所述流动方向中，例如，所述导入口侧为上游侧，所述空气口侧为下游侧。所述流路中的所述观察区域例如设定在所述导入口的下游侧，此外，所述观察区域例如设定于所述导入口和所述空气口之间。
所述流路例如可进一步具有排气部。所述排气部例如在所述流路中优选地位于所述观察区域的下游侧，具体的例如位于所述流路的末端。所述排气部例如为空气口。此外，所述流路的末端上，例如，作为可储存通过了所述观察区域的所述被检菌液的区域，可具有排液部。所述流路在所述下游侧的端部可有所述排气部（空气口）和所述排液部二者。
关于所述流路，也可称所述观察区域的上游侧为“导入流路”，称所述观察区域的下游侧为“排出流路”。所述导入流路和所述排出流路的长度，例如可以相同，也可以不同。后者的情况下，优选所述排出流路比所述导入流路短。由此，例如从所述空气口（排气口）供给空气更平稳，使来自所述被检菌液的细菌或真菌容易增殖。所述观察区域的大小（例如流路宽度）和所述导入流路及所述排出流路的大小（例如流路宽度）例如可以相同也可以不同。后者的情况下，从降低所述液体的阻力的观点看，即使扩大前后的流路宽度，所述观察区的大小也例如优选比所述导入流路及所述排出流路小，以同时用显微镜容易地观察多个流路。
所述微型装置中，所述流路例如设于基板（也叫基材）上。所述基板由于例如可用显微镜等观察，优选透明基材。所述透明基材的原料没有特别的限定，例如可列举聚二甲基硅氧烷等聚合物、玻璃等。检测对象的细菌或真菌为好氧型的情况下，所述基板优选例如通气性基板。
对所述微型装置而言，例如，所述基板优选上基板和下基板的层叠体。所述上基板例如优选地在和所述下基板的层叠表面上形成作为所述流路的凹部。优选地，对应所述流路的一个末端或两端的位置上有贯穿孔。所述上基板和所述下基板若层叠，则所述层叠体中，例如，通过所述上基板的凹部形成的空腔成为所述流路，所述上基板的一个贯穿孔成为所述流路的导入口，另一个贯穿孔成为所述流路的空气口（导出口）。所述流路中，将所希望的部位设定为所述观察区域。对所述层叠体从所述上基板的所述导入口供给液体，则所述液体经过所述导入口被导入到所述流路，通过所述流路到达所述流路的另一末端。所述微型装置进一步具备所述排气部的情况下也如此。所述上基板或所述下基板优选例如在所述层叠表面上、在所述流路的下游侧的末端进一步形成作为所述排气部的凹部。此外，所述上基板优选例如在所述排气部对应的位置上具有作为所述空气口的贯穿孔。所述微型装置不限定于这样的形态，例如优选下基板可具有前述的凹部。
所述微型装置例如可预先在所述流路中配置抗菌药物。以下，所述流路中配置所述抗菌药物的部位或配置了所述抗菌药物的部位也称做试剂部。所述试剂部例如可预先配置抗菌药物，使用时可在所述被检菌液导入前配置所述抗菌药。该情况下，例如，通过向所述微型装置供给所述被检菌液，可在所述流路内混合所述被检菌液和所述抗菌药物。
向所述试剂部配置所述抗菌药物的方法没有特别限定，例如，可以将包含所述抗菌药物的抗菌药液供给所述流路的期望的部位，通过干燥而配置。此外，例如可将所述抗菌药液从所述导入口通入所述流路内，从而在所述流路内配置所述抗菌药物，也可将所述抗菌药液从所述导出口通入所述流路内，从而在所述流路内配置所述抗菌药物。在所述微型装置中导入所述抗菌药液后，例如，优选干燥所述微型装置。
在所述微型装置中预先配置抗菌药物时，所述微型装置例如优选地被保存使得直到使用时为止为干燥状态。
此外，所述微型装置例如可不具有所述试剂部。该情况下，例如可将所述被检菌液和所述抗菌药物在所述微型装置的外部混合，将该混合液导入到所述微型装置。
所述微型装置中具有所述观察区域的流路的数量没有特别的限定。可根据例如供给的被检菌液的数量、抗菌药物的数量、抗菌药物浓度数、对照的数量等适当地设定所述流路的数量。具有所述观察区域的流路的数量例如是多个、是两个以上，例如，2-25个。所述流路的数量，例如，根据目的优选为使显微镜容易观察的可以配置的数量。以这种方式，通过具有多个所述流路的所述微型装置，例如可将多种抗菌药物、多种抗菌药物浓度及／或多种被检菌液在一个微型装置中判定。通过例如将微型装置扩大等，可增加所述流路数量。所述流路为多个时，所述各流路的长度例如可相同也可不同。从使来自所述被检菌液的细菌或真菌的增殖速度一致的观点来看，优选前者。
所述微型装置例如具有多个流路时，所述检测步骤中优选地对各流路的观察区域检测所述来自被检菌液的细菌或真菌。此外，所述微型装置中所述多个流路的观察区域例如优选地分别平行且相距较近，也可以说是并列配置。此外，所述检测步骤中使用显微镜时，例如，由于可一次观察全部观察区域，优选配置为所述微型装置中全部观察区域辐合，从而使整个观察区域落在显微镜的视野范围内。
所述微型装置具备具有所述观察区域的多个流路时，所述各流路可分别独立也可部分地连结。如下文所示，前者的微型装置为第1实施方案，后者的微型装置为第2实施方案及第3实施方案。此外，本发明中所述微型装置不限定于这些举例说明。
（第1实施方案）
第1实施方案的微型装置为，例如，所述多个流路分别具有不同的所述导入口及不同的所述观察区域的实施方案。
所述微型装置例如由于所述导入口和所述观察区域分别独立，因此在各流路的观察区域中，能够进行与不同的被检菌液、不同的抗菌药物及／或相同的抗菌药物的不同浓度相关的检查。
图1中示出所述微型装置的一例。图1A是针对微型装置1，使构成其的上基板10和下基板20成为分离状态示出的立体图，图1B是微型装置1的俯视图，图1C是上基板10的仰视图，也就是，上基板10中与下基板20的层叠面的图。
如图1A及图1B所示，上基板10中设有作为导入口的贯穿孔11a’-11d’、21a’-21d’、31a’-31d’、41a’-41d’、51a’，作为空气口的贯穿孔15a’-15d’、25a’-25d’、35a’-35d’、45a’-45d’、55a’。图1A中，虽仅仅立体地示出导入口11a’及空气口15a’，但其他的贯穿孔也一样。
如图1C所示，上基板10的下表面上，对应于导入口11a’-11d’、21a’-21d’、31a’-31d’、41a’-41d’、51a’的导入部11a-11d、21a-21d、31a-31d、41a-41d、51a、导入流路12a-12d、22a-22d、32a-32d、42a-42d、52a、观察区域13a-13d、23a-23d、33a-33d、43a-43d、53a、排出流路14a-14d、24a-24d、34a-34d、44a-44d、54a、及对应于空气口15a’-15d’、25a’-25d’、35a’-35d’、45a’-45d’、55a’的排气部15a-15d、25a-25d、35a-35d、45a-45d、55a分别连结，形成为凹部。此外，图1C中，观察区域13a、23a、33a、43a以外的观察区域省略了符号，平行于观察区域13a的区域，从观察区域13a侧起依次为：观察区域13ｂ-13d，平行于观察区域23a的区域从观察区域23a侧起依次为：观察区域23ｂ-23d，平行于观察区域33a的区域从观察区域33a侧起依次为：观察区域33ｂ-33d，平行于观察区域43a的区域从观察区域43a侧起依次为：观察区域43ｂ-43d，导入口51a和排气部55a之间的流路中的中心区域为观察区域53a。53a以外的观察区域虽有两个位置弯曲，但优选地观察与53a平行的部位。
以下所述导入口、所述导入部、所述导入流路、所述观察区域、所述排出流路、所述排气部及所述空气口连结的空腔可分别叫做“通路（レーン）”，各通路的名称用所述导入口的符号表示。也就是，例如，导入口11a’、导入部11a、导入流路12a、观察区域13a、排出流路14a、排气部15a及空气口15a’连结的空腔称为通路11a’。
微型装置1的大小没有特别的限定，例如，可如下举例说明。
整体大小
宽度（图1A中箭头X方向的长度）：例如，30-40mm
长度（图1A中箭头Y方向的长度）：例如，30-40mm
厚度（图1A中箭头Z方向的长度）：例如，1-3mm
上基板10、
厚度：例如，0.8-2.8mm
凹部的深度：例如，10-25μm
所述导入口
直径：例如，0.75-1.5mm，优选0.75mm
所述导入流路
长度：例如，10-15mm
所述观察区域
长度：例如，1-5mm
所述排出流路
长度：例如，10-15mm
所述排气部
直径：例如，0.75-1.5mm
下基板20
厚度：例如，0.12-0.17mm
所述微型装置例如可以具有试剂部也可没有试剂部。前者的情况下，所述试剂部的部位例如优选地至少包括所述观察区域，更优选包括从所述导入口到所述观察区域，进一步优选所述导入口到所述空气口的范围，即，为包括所述导入流路和所述排出流路的流路整体。
所述微型装置中预先配置所述抗菌药物的情况下，例如将所述抗菌药液从所述导入口及所述空气口中的任意一个导入（充填）到所述流路，然后可通过干燥所述微型装置配置所述抗菌药物。
所述微型装置中导入到各通路的所述抗菌药液的液体量没有特别的限定，例如每通路0.2-3μL。所述抗菌药液的制备没有特别的限定，可根据抗菌药物的种类适当地决定例如溶剂、浓度等。所述溶剂没有特别的限定，例如可列举乙醇、水、缓冲液等。
所述微型装置中，导入到各通路的被检菌液的液体量没有特别的限定。所述微型装置中，导入到各通路的所述被检菌液的菌量没有特别的限定，例如期望将所述被检菌液的浊度调制到McFarLand0.5。所述被检菌液的菌量例如可根据菌种或检查的目的改变。
所述微型装置的流路分别具有不同的导入口。因此，通过所述微型装置，例如通过将混合了不同抗菌药物的被检菌液导入到各流路，关于特定的被检测菌可确定对多个抗菌药物的敏感性。此外，通过所述微型装置，例如，通过将相同的抗菌药物以不同的浓度充填到各流路并将相同的被检菌液导入到各导入口，可以确定对特定抗菌药物的MIC（最小抑菌浓度）。此外，通过所述微型装置，例如，将相同的抗菌药物配置到各试剂部，并将不同的被检菌液导入到各导入口，可确认对特定抗菌药物的各被检菌液的敏感性。
作为具体例，对微型装置1而言，例如，在通路11a’-11d’的组、通路21a’-21d’的组、通路31a’-31d’的组、通路41a’-41d’的组中分别配置不同的抗菌药物，各组内的各通路中以不同的浓度配置相同的抗菌药物，可列举通路51a’作为未配置抗菌药物的对照而使用的方案。根据该方案，例如，对于1种被检菌液，可确认对4个种类的抗菌药物的敏感性及耐药性，此外，各组中各通路由于配置不同浓度的抗菌药物，可确定MIC。
以下举例说明使用在所述流路中充填了抗菌药物的微型装置1，检查被检菌液的抗菌药物敏感性的方法。
首先，将所述被检菌液供给于微型装置1内的所述各导入口。供给所述各导入口的所述被检菌液从所述导入口起在所述流路中移动，和填充于所述流路的所述抗菌药物混合。
然后，培养微型装置1。培养条件例如如前所述。然后，用显微镜观察微型装置1的观察区域，确认细菌数量或真菌数量的增减及细菌或真菌的形态变化。由此，可检查对抗菌药物的敏感性。
（第2实施方案）
第2实施方案的微型装置为，例如多个流路具有相同的所述导入口，并分别具有不同的观察区域的形态。所述微型装置除非特别说明，否则可参考所述第1实施方案的说明。
所述微型装置例如由于多个流路具有同一导入口，因此各流路的观察区域中，例如对同一被检菌液，可进行与不同抗菌药相关的检查和/或对于同样的抗菌药的不同浓度的检查。
图2中示出所述微型装置的一例。图2A是针对微型装置2，使构成其的上基板60和下基板70为分离状态而示出的立体图，图2B是微型装置2的俯视图，图2C是上基板60的仰视图，也就是，上基板60中与下基板70的层叠面的图，图2D是图2B的Ⅰ-Ⅰ方向剖面图。
如图2A及图2B所示，上基板60设有作为导入口的贯穿孔61’、作为空气口的贯穿孔65a’-65d’。如图2C所示，上基板60的下表面上，对应于导入口61’的导入部61、第1导入流路66、从第1导入流路66的下游末端分支的第2导入流路62a-62d、观察区域63a-63d、排出流路64a-64d及排气部65a-65d分别连结，形成为凹部。
以下、所述导入口、所述导入部、所述第1导入流路、所述第2导入流路、所述观察区域、所述排出流路、所述排气部及所述空气口连结的空腔可分别叫做“通路”，各通路的名称用所述第2导入流路的符号表示。也就是，例如，导入口61’、导入部61、第1导入流路66、第2导入流路62a、观察区域63a、排出流路64a、排气部65a及空气口65a’连结的空腔称为通路62a。
微型装置2的大小没有特别的限定，例如，可如下举例说明。
整体大小
宽度（图2A中箭头X方向的长度）：例如，30-40mm
长度（图2A中箭头Y方向的长度）：例如，30-40mm
厚度（图2A中箭头Z方向的长度）：例如，1-3mm
上基板60
厚度：例如，0.8-2.8mm
凹部的深度：例如，17μm
所述导入口
直径：例如，0.75mm
所述导入流路
长度：例如，50mm
所述第1导入流路：例如，2mm
所述第2导入流路：例如，3-5cm
所述观察区域
长度：例如，8mm
所述排出流路
长度：例如，2-5mm
所述排气部
直径：例如，1.5mm
微型装置2例如可以具有试剂部。所述试剂部的部位没有特别的限定。所述试剂部例如优选地至少包括所述观察区域，更优选包括从所述第1导入流路下游（例如，所述第2导入流路的中间）到所述排气部的范围。
微型装置2中，导入到所述各流路的所述抗菌药液的液体量没有特别的限定，例如每通路0.25-1μL。
微型装置2中，导入的被检菌液的液体量没有特别的限定，例如，9-10μＬ。微型装置2中导入的被检菌液的菌量没有特别的限定。
微型装置2的流路分别具有相同的导入口和不同的观察区域。因此，微型装置2例如通过在各流路中配置不同的抗菌药物，并从所述导入口在各流路中导入相同的被检菌液，可对特定的被检测菌确认对多个抗菌药物的敏感性。此外，通过微型装置2，例如，通过将相同的抗菌药物以不同的浓度配置到各流路，并将相同的被检菌液导入到所述导入口，可决定对特定的抗菌药物的MIC（最小抑菌浓度）。
作为具体例，对微型装置2而言，例如，可列举在通路62a-62d中的任意3个中分别配置不同的抗菌药物，剩余的1个通路作为未配置抗菌药物的对照而使用的方案。根据该方案，例如，对于1种被检测菌，可确认对3个种类的抗菌药物的敏感性。
使用微型装置2检查被检菌液的抗菌药物敏感性的方法没有特别的限定，除了将所述被检菌液从导入口61’导入到微型装置2以外，也可参照前述图1中的例示。
（第3实施方案）
第3实施方案的微型装置和前述的第2实施方案同样地例如多个流路具有同一所述导入口，并分别具有不同的观察区。所述微型装置除非特别说明，否则可参考所述第1实施方案及所述第2实施方案的说明。
所述微型装置例如由于多个流路具有同一导入口，因此各流路的观察区域中，例如，对同一被检菌液，可进行与不同的抗菌药物相关的检查及／或对同样的抗菌药物的不同的浓度的检查。
图10中示出所述微型装置的一例。图10A是针对微型装置3，使构成其的上基板90和下基板100为分离状态而示出的立体图，图10B是微型装置3的俯视图，图10是上基板90的仰视图，也就是，上基板90中与下基板100的层叠面的图，图10D是图10B的Ⅱ-Ⅱ方向的剖面图。
如图10A及图10B所示，上基板90上设有作为导入口的贯穿孔91’、作为空气口的贯穿孔95a’-95f’。如图10C所示，上基板90的下表面中，对应于导入口91’的导入部91、第1导入流路96、从第1导入流路96的下游末端分支的第2导入流路92a-92f、观察区域93a-93f、排出流路94a-94f及排气部95a-95f分别连结，形成为凹部。
以下、所述导入口、所述导入部、所述第1导入流路、所述第2导入流路、所述观察区域、所述排出流路、所述排气部及所述空气口连结的空腔可分别叫做“通路”，各通路的名称用所述第2导入流路的符号表示。也就是，例如，导入口91’、导入部91、第1导入流路96、第2导入流路92a、观察区域93a、排出流路94a、排气部95a及空气口95a’连结的空腔叫做通路92a。
微型装置3的各通路中，第2导入流路92a-92f的角部为圆形。观察区域93a-93f的流路宽度比第2导入流路92a-92f的流路宽度及排出流路92a-92f的流路宽度狭窄。此外，对各通路，从观察区域93a-93f到排气部95a-95f的流路的长度相同。
微型装置3的大小没有特别的限定，例如，如下可举例说明。
整体大小
宽度（图10A中箭头X方向的长度）：例如，30-40mm
长度（图10A中箭头Y方向的长度）：例如，30-40mm
厚度（图10A中箭头Z方向的长度）：例如，1-4mm
上基板60
厚度：例如，0.8-3mm
凹部的深度：例如，50μm（导入口部分：例如，300μm）
所述导入口
直径：例如，1mm
所述导入流路
长度：例如，25-35mm
所述第1导入流路
长度：例如，2mm
所述第2导入流路
长度：例如，23-33cm
宽度：例如，200μm
所述观察区域
长度：例如，4mm
宽度：例如，100μm
所述排出流路
长度：例如，2-3mm
宽度：例如，500μm
所述排气部
直径：例如，1.5mm
微型装置3例如具有试剂部。所述试剂部例如与前述的第2实施方案中相同。
微型装置3中，导入到所述各流路的所述抗菌药液的液体量没有特别的限定，例如，每通路0.2-0.4μL。
微型装置3中，导入的被检菌液的液体量没有特别的限定，例如，为15-25μL。微型装置3中，导入的被检菌液的菌量没有特别的限定。
微型装置3的流路分别具有相同导入口和不同的观察区域。因此，微型装置3例如与前述的第2实施方案同样，对特定的被检菌，可确认对多个抗菌药的敏感性，或可确定对特定的抗菌药的MIC（最小抑菌浓度）。
作为具体例，对微型装置3而言，例如可列举在通路92a-92ｆ中的任意5个中分别配置不同的抗菌药物，剩下的一个通路作为未配置抗菌药物的对照而使用的方案。根据该方案，例如，对1种被检菌液，可确认对5种抗菌药物的敏感性。
使用微型装置3检查被检菌液的抗菌药物敏感性的方法没有特别的限定，除了将所述被检菌液从导入口91’导入到微型装置3中之外，也可参照前述的图1中的例示。
然后，本发明的检查系统为如前所述用于根据所述本发明的检查方法检查细菌或真菌的抗菌药物敏感性的检查系统，其特征为：具有以下单元：培养具有导入了被检菌液与抗菌药物的混合液的流路的微型装置的培养单元；获取所述微型装置中的所述流路的观察区域的图像的图像获取单元；获取所述图像中细菌或真菌的数量、疏密程度及形态中的至少一者的信息的信息获取单元；及基于所述信息确定来自所述被检菌液的细菌或真菌的抗菌药物敏感性的确定单元。
本发明的检查系统可列举例如由计算机系统构建的检查装置。所述系统的硬件结构没有限制，例如，在控制部CPU上连接存储装置、键盘或鼠标等输出装置，此外例如，结果的输出装置可连接显示输入数据或结果的显示装置（显示器）等。此外，各单元例如可为通过计算机的CPU运行预定的程序而实现的功能模块。因此，例如，各构成单元可不实际安装硬件，也可为网络系统。
本发明的检查系统，例如，进一步具有安装所述微型装置的固定单元。所述微型装置例如可为一次性的，也可每次测定、检测样本时更换。所述检查系统例如具有用于将样本导入到所述已安装的微型装置中的导入口，所述导入口可和所述微型装置导入口是同一个。所述检查系统例如具有通过温度控制等自动地培养所述微型装置内导入的样本的单元。所述检查系统具有例如间歇地或连续地、自动地获取所述微型装置的观察区的图像的方法。此外，具有例如从各图像数据获得样本的细菌或真菌的数量、疏密程度或形态或其变化的数据，并将这些数据与基准值比较的单元。
对于本发明的检查系统的结构，图9区块图中示出一例。图9是示意图，其大小及形状等没有任何限定。图9是一例，本发明不限定于此。
如图9所示，所述检查系统具备测定部7和图像处理部8。测定部7具备显微镜700。显微镜700内置CCD相机701，并具备安装微型装置71的配置部702、及控制配置部702的温度的温度控制部703。显微镜700虽没有图示，但包括例如其他的光源等显微镜所具备的一般构造。图像处理部8具备CPU80、存储部81、输出部82。存储部81可列举例如ROM、HDD及HD等。输出部82例如可列举显示器、打印机等。
根据所述检查系统，例如可按以下实行本发明的检查方法。首先，将微型装置71安装在测定部7中的显微镜700的配置部702上。微型装置71例如可为预先导入了所述被检菌液与所述抗菌药物的混合液的微型装置，也可为仅预先导入了抗菌药物的微型装置，哪种都可以。在仅导入所述抗菌药的微型装置的情况下，可将微型装置安装在配置部702上后导入所述被检菌液。然后，通过用温度控制部703控制配置部702的温度，培养安装于配置部702的微型装置71。
通过显微镜700的CCD相机701，拍摄微型装置71的观察区域的图像，以其作为信号输出。拍摄例如可间歇地或连续地进行。这种情况下，测定部7优选进一步具备控制图像拍摄的控制部。所述控制部可列举例如CPU。然后输出的信号被输入到图像处理部8的CPU80中。用CPU80计算处理所述信号后，计算后的数据输出到输出部82中，计算后的数据存储在存储部81中。
通过用CPU80计算处理从测定部7输出的信号，例如，可计算出表示细菌或真菌的数量、疏密程度及／或形态的变化的数据，并进一步进行算出的数据和预先设定的基准值的比较，判断抗菌药物敏感性。
【实施例】
以下，对本发明的实施例进行说明。此外本发明不限定于下述的实施例。
［实施例1］
（1）微型装置
按照如下所示制备图1示出的微型装置1。微型装置1的上基板10采用PDMS制备，下基板20采用玻璃制备。微型装置1的大小如下所示。
整体长度（Y方向）：30mm
整体宽度（X方向）：40mm
整体厚度（Z方向）：2-3mm
上基板的凹部的深度：17μm
导入口的直径：0.75mm
导入流路的长度：10-15mm
导入流路的宽度：0.1mm
观察区域的长度：2-5mm
观察区域的各流路的宽度：0.1mm
排出流路的长度：10-13mm
排出流路的宽度：0.1mm
排气部的直径：1mm
上基板的贯穿孔的直径：0.75mm
（1-1）模具的制备
1）在40mm×50mm的盖玻片（No.5，厚度1mm，Matsunami GlassInd.,Ltd.,）或硅晶片（3英寸，Ferrotec Co.,）上，以4000rpm旋涂涂覆剂（商品名Omni Court，MicroChem）10秒钟，在180℃煅烧1分钟。
2）以2000rpm旋涂光致抗蚀剂（SU8－25、MicroChem）30秒。膜厚为16-17μm。
3）在65℃用3分钟及在95℃用7分钟预烘焙。
4）用光罩对准曝光机(mask aligner)（商品名ES20，NanomericTechnology）对微型图案（micropattern）进行11秒钟曝光。
5）曝光后，在65℃用1分钟及在95℃用3分钟烘焙。
6）用SU8－Developer（商品名、Microchem公司），显影2分钟。
7）为了烧硬，在180℃用30分钟后烘（hard bake）。
8）以4000rpm旋涂0.84wt％的Cytop809ME（商品名、Asahi GlassCo.，Ltd.，），并在180℃处理1小时，使得后述的PDMS容易剥离。
（1－2）PDMS流路的成型
1）将聚二甲基硅氧烷（PDMS）（商品名Silpot184、Dow CoringToray Co.，Ltd.,）和聚合催化剂以重量比10：1混合，进行30分钟脱气。
2）浸渍于模具中，在100℃用30分钟烘焙固化。
（1－3）玻璃基板和PDMS的层叠
1）剥离固化的PDMS基材。将所述PDMS同预先用乙醇洗涤的盖玻片（No.1、厚度0.12-0.17mm、Matsunami Glass Ind.，Ltd.，）一起放入到反应离子刻蚀设备（商品名RIE-10NR，Samco）。
2）将所述盖玻片和所述PDMS基材暴露于氧流量100标准状态毫升／分（sccm）、压力50Pa、RF功率30W的条件的氧等离子体中20秒。
3）将所述盖玻片和所述PDMS基材以等离子体处理后的面层叠，进行粘接。
4）用穿孔机（商品名BP－15F、Kai Industries Co.，Ltd.，）在所述粘接的层叠体上开贯穿孔作为导入口及空气口。
（2）抗菌药液的制备
将以下示出的3种抗菌药物以成为下述浓度的方式混合在磷酸缓冲生理食盐水（PBS，10mmol／L，pH7.2-7.4）中，制备抗菌药液。
阿米卡星Amikacin(商品名AMK，Sigma）
640、320、160、80μg／mL
环丙沙星Ciprofloxacin（商品名CPFX，东京化成工业有限公司）
80、40、20、10μg／mL
亚胺培南Imipenem／西司他汀cilastatin（商品名IPM，万有制药有限公司）
320、160、80、40μg／mL（IPM浓度）
（3）被检菌液的制备
使用Mueller-Hinton琼脂（Becton,Dickinson and Company）板将绿脓杆菌在37℃下预培养24小时。将菌落悬浮于Mueller-Hinton液体培养基中,使MacFarLand=0.5（OD600=0.132）而进行制备。绿脓杆菌分别使用多药耐药性菌株＃2株及＃5株（从BML获得）、Ｓ1株（敏感性菌株，从BML获得）。
（4）培养
所述（2）的抗菌药液和所述（3）的培养液以体积比1：9混合，在微型装置1的各导入口中分别注入1μL混合液。此外，作为对照，将灭菌水代替所述抗菌药液和所述培养液以体积比1：9混合，将混合液1μL注入到微型装置1的导入口中。然后，在培养皿中装入微型装置1，并将所述培养皿装入到密闭容器中。此外，所述培养皿及所述密闭容器中分别装入含有水的Kimwipe。将所述密闭容器放入37℃的培养箱中，培养3小时。所述密闭容器及所述培养皿内的相对湿度为97％。
（5）判定
从所述密闭容器取出微型装置1，用显微镜对观察区域确认相对于对照的菌量的增减及形态变化，确定MIC（最小抑菌浓度）。
另一方面，对相同的绿脓杆菌，根据遵循标准法CLSI标准的微量液体稀释法，测定AMK、CPFX及IPM的MIC。
图3中示出培养后的绿脓杆菌＃2株的显微镜照片。图3中，AMK、CPFX及IPM的照片的数字表示各抗菌药物的最终浓度（μg／mL），“+”表示与对照0hr相比增殖，“-”表示与对照0hr相同程度，抑制增殖。如图3所示，根据使用所述微型装置的方法，可知相对于绿脓杆菌＃2株，AMK的MIC为32μg／mL以上，CPFX的MIC为4μg／mL以上，IPM的MIC为16μg／mL。另一方面，标准法中AMK的MIC为64μg／mL，CPFX的MIC为32μg／mL，IPM的MIC为32μg／mL。所述微型装置法的IPM和标准法的IPM中，显示2倍不同的MIC，但以任一者的CLSI的断点作为指标，则在耐药性（Ｒ）的判定上一致。
图4中示出培养后的绿脓杆菌S1株的显微镜照片。图4中AMK、CPFX及IPM的照片的数字表示各抗菌药物的最终浓度（μg／mL）。如图4所示，各抗菌药物的任一浓度中，均看不到如对照3hr的增殖，因此可确认显示对任一抗菌药物的敏感性。
图5中示出培养后的绿脓杆菌＃5株（MDRP）的显微镜照片。图5中AMK、CPFX及IPM的照片的数字表示各抗菌药物的最终浓度（μg／mL）。如图5所示，由于各抗菌药物的任一浓度中均比对照0hr增殖，可确认显示对任一抗菌药物的耐性。
［实施例2］
（1）微型装置
与所述实施例1同样地制备图2中示出的微型装置。微型装置的上基板采用PDMS制备，下基板采用玻璃制备。微型装置2的大小如下所示。
整体长度（Y方向）：40mm
整体宽度（X方向）：30mm
整体厚度（Z方向）：2mm
上基板60D的凹部的深度：17μm
导入口的直径：0.75mm
导入部的直径：3mm
导入流路的长度：30-40mm
第1导入流路：1-2mm
第2导入流路：28-39mm
导入流路的宽：0.3-0.5mm
观察区的长度：8mm
观察区的宽：0.5mm
排出流路的长度：2-4mm
排出流路的宽：0.5mm
排气部的直径：1.5mm
然后，将阿米卡星Amikacin(商品名AMK，Sigma）、环丙沙星Ciprofloxacin（商品名CPFX，东京化成工业有限公司）及亚胺培南Imipenem／西司他汀cilastatin（商品名IPM，万有制药有限公司）分别以成为2-4mg／mL的浓度溶解于PBS，并用100％乙醇稀释，制备预定浓度的抗菌药液（AMK160μg／mL、CPFX20μg／mL、IPM80μg／mL）。然后，向微型装置2的各导入口中注入0.25μL所述各抗菌药液后，室温下干燥微型装置2约15分钟。
（2）判定
将同所述实施例1一样制备出的被检菌液约10μＬ注入到共用的导入口，除此以外，与所述实施例1同样地操作，进行培养及判定。
图7中示出培养后的绿脓杆菌S1株（敏感性株）的显微镜照片。如图7所示，根据使用微型装置2的方法，确认绿脓杆菌S1在未添加抗菌药物（对照）的流路中随着培养时间的增殖，并确认添加抗菌药物时任一流路中都没有增殖。
图8示出培养后的绿脓杆菌＃5株（MDRP）的显微镜照片。如图8所示，根据使用微型装置2的方法，确认绿脓杆菌＃5株添加抗菌药物的情况也和未添加抗菌药物（对照）同样地，随着培养时间增殖。
［实施例3］
对65个种类的绿脓杆菌株，与所述实施例2同样地，用AMK、CPFX及IPM进行处理，进行多药耐药性（3药剂耐药性）、2药剂耐药性、1药剂耐药性及敏感性（3药剂敏感性）的分类。此外，对同样的65个种类的绿脓杆菌株，根据所述实施例1中记载的标准法，同样地进行耐药性及敏感性的分类。图6中示出这些结果。图6是表示65个种类的绿脓杆菌株中耐药性及敏感性的株数的图表。如图6所示，根据本实施例的微型装置法，可获得和标准法同样的分类结果。从该结果可知，根据本发明的微型装置法，与需要长时间的标准法相比，可在显著更短的时间内（3小时）进行耐药性及敏感性的判断。
【工业上的可利用性】
如上，根据本发明，在所述微型装置的流路内，培养抗菌药物与被检菌液的混合液，并例如通过用显微镜等观察所述流路中的观察区域，可简便并且迅速地确认细菌或真菌对抗菌药物的敏感性。另外，根据本发明的检查系统可简便地进行所述本发明的检查方法。因此，本发明在临床检查、环境检测等中极其有用。特别是在临床检查中，例如，由于就作为对象的细菌及真菌可尽早地选择适当的抗菌药物，因此可期待提高生存率、减少不必要的药物的使用量等效果，从长期来看的话有抑制耐药菌的增加的可能。
附图标记说明
1、2、3 微型装置
10、60、90 上基板
20、70、100 下基板
11’、21’、31’、41’、51’、61’、91’ 导入口
11、21、31、41、51、61、91 导入部
12、22、32、42、52、62、92 导入流路
13、23、33、43、53、63、93 观察区域
14、24、34、44、54、64、94 排出流路
15、25、35、45、55、65、95 排气部
15’、25’、35’、45’、55’、65’、95’ 空气口
7 测定部
700 显微镜
701 CCD相机
702 配置部
703 温度控制部
71 微型装置
8 图像处理部
80 CPU
81 存储部
82 输出部
Claims (9)
1.一种细菌或真菌的抗菌药物敏感性的检查方法，其特征为，包括以下步骤：
使用具有流路的微型装置，在所述微型装置的所述流路内培养抗菌药物与被检菌液的混合液的步骤；以及
检测所述微型装置的所述流路的观察区域中来自所述被检菌液的细菌或真菌的检测步骤。
2.根据权利要求1所述的检查方法，所述检测步骤中，对于来自所述被检菌液的细菌或真菌，在所述观察区中观察数量及形态中的至少一者。
3.根据权利要求1或2所述的检查方法，所述检测步骤中，通过显微镜检测来自所述被检菌液的细菌或真菌。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的检查方法，所述培养步骤中，在所述微型装置的所述流路中导入所述抗菌药物与所述被检菌液的混合液。
5.根据权利要求1-3任意一项所述的检查方法，在所述微型装置的所述流路中预先配置所述抗菌药物，并且
所述培养步骤中，在所述微型装置的所述流路中导入所述被检菌液。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的检查方法，在所述培养步骤的前后进行所述检测步骤。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的检查方法，所述微型装置为具有两个以上流路的装置，并且
所述检测步骤中，检测各流路的观察区域中来自所述被检菌液的细菌或真菌。
8.根据权利要求7所述的检查方法，所述微型装置中，所述两个以上流路的观察区域并列配置。
9.一种检查系统，其用于根据权利要求1-8任意一项所述的检查方法检查细菌或真菌的抗菌药物敏感性，其特征为，具有以下单元：
培养具有导入了被检菌液与抗菌药物的混合液的流路的微型装置的培养单元；
获取所述微型装置的所述流路的观察区域的图像的图像获取单元；
获取所述图像中细菌或真菌的数量及形态中的至少一者的信息的信息获取单元；及
基于所述信息，确定来自所述被检菌液的细菌或真菌的抗菌药物敏感性的确定单元。
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