ES2532960T3 - Identificación de resistencia a antibióticos usando antibióticos marcados - Google Patents

Abstract

Método para la detección de una resistencia a antibióticos en un microorganismo particular en una muestra biológica, que comprende las etapas: (a) proporcionar un antibiótico marcado, (b) poner en contacto el antibiótico marcado con una muestra biológica que comprende el microorganismo en condiciones que permitan la unión del antibiótico marcado a su sitio de unión en el microorganismo, (c) detectar el antibiótico marcado en el microorganismo e identificar este microorganismo en la misma muestra biológica, y (d) determinar si la cantidad de marcador detectable está alterada respecto a la cantidad de marcador detectable en el microorganismo particular en su forma no resistente, en el que los microorganismos en los que la cantidad de marcador detectable está alterada respecto a la cantidad de marcador detectable en el microorganismo particular en su forma no resistente son microorganismos resistentes frente al antibiótico.

Description

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DESCRIPCIÓN

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Identificación de resistencia a antibióticos usando antibióticos marcados

El objeto de la presente invención es un método para la detección de una resistencia a antibióticos en un microorganismo.

La caracterización de microorganismos en procedimientos de diagnóstico rutinarios engloba la determinación de la identidad de una especie y su sensibilidad frente a antibióticos. Con el fin de conseguir esto, es necesario tomar los microorganismos de su entorno y enriquecerlos en un entorno selectivo para la identificación separada (ID) y ensayo de sensibilidad a antibióticos (AST). Actualmente, la AST/ID de microorganismos se consigue identificando la presencia o ausencia de una matriz de características bioquímicas y la capacidad (o incapacidad) de crecer en presencia de antibióticos. Alternativamente, puede extraerse el ADN de una muestra y entonces se ensaya el ADN combinado para la presencia/ausencia de secuencias específicas utilizando técnicas de amplificación génica. Esto puede señalar la presencia de un organismo en la muestra. Igualmente, puede detectarse en la muestra la presencia de un gen que codifica resistencia a antibióticos. Por definición, la extracción de ADN directamente de una muestra da lugar a ADN combinado a partir de una mezcla desconocida de células. Sólo se pueden conseguir resultados inequívocos si el ADN se extrae de una colonia pura.

Staphylococcus aureus es una de las causas más comunes de infecciones nosocomiales o comunitarias, que dan lugar a enfermedades graves con altas proporciones de morbilidad y mortalidad. En los últimos años, el incremento en el número de cepas bacterianas que muestran resistencia a Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) se ha convertido en un problema clínico y epidemiológico grave porque este antibiótico (o análogo) se considera la primera opción en el tratamiento de infecciones por staphylococci. La resistencia a este antibiótico implica resistencia a todos los antibióticos ß-lactama. Por estas razones, tiene una importancia clave la exactitud y prontitud en la detección de resistencia a meticilina para asegurar un tratamiento con antibiótico correcto en pacientes infectados así como para controlar aislados de MRSA en entornos hospitalarios, para evitar su diseminación.

Las cepas de MRSA portan el gen mecA, que codifica una proteína PBP2 modificada (PBP2' o PBP2a) con baja afinidad para meticilina y todos los antibióticos ß-lactama. La expresión fenotípica de resistencia a meticilina puede alterarse dependiendo de las condiciones de crecimiento para S. aureus, tales como temperatura u osmolaridad del medio, y esto puede afectar la exactitud de los métodos usados para detectar resistencia a meticilina (1). Las cepas bacterianas hetero-resistentes pueden evolucionar a cepas totalmente resistentes y, por lo tanto, pueden seleccionarse en aquellos pacientes que reciben antibióticos ß-lactama, causando así un fracaso terapéutico. Desde un punto de vista clínico, deberían considerarse, por lo tanto, completamente resistentes.

Existen varios métodos para detectar resistencia a meticilina (1,9) incluyendo métodos clásicos para determinar una concentración inhibidora mínima MIC (difusión en disco, Etest, o dilución de caldo), técnicas de cribado con medio de cultivo sólido que contiene oxacilina, y métodos que detectan el gen mecA o su producto proteico (proteína PBP2') (3,4). La detección del gen mecA se considera como el método de referencia para determinar resistencia a meticilina (1). Sin embargo, muchos laboratorios a lo largo del mundo no tienen los fondos requeridos, la capacidad

o el personal experimentado requerido para proporcionar ensayos moleculares para detectar aislados de MRSA. Por lo tanto, es esencial, que se incorporen otros métodos de cribado, más útiles, en la práctica clínica rutinaria. Además, la presencia de resistencia a antibióticos tiene su relevancia a varios niveles, todos los cuales tienen significancia clínica

1.

Presencia de un gen que confiere resistencia, tal como mecA, mef(E),

2.

Presencia de un gen represor que inhibe la expresión fenotípica de dicho mecanismo de resistencia, por ejemplo, represor MecA

3.

Mecanismos de resistencia múltiples; por ejemplo, resistencia a Macrólidos mediante la modificación del sitio de unión ribosomal y presencia de mecanismo(s) de eflujo.

4.

Nivel de expresión de dicho mecanismo de resistencia regulado a través de la transcripción y traducción detectable como el fenotipo

Las técnicas de cultivo actuales requieren el aislamiento de una colonia discreta y la identificación posterior y ensayo de resistencia, asumiendo que una única colonia deriva de una única célula y, por lo tanto, se considera pura. En la realidad, sin embargo, la generación de una colonia pura a partir de una muestra clínica, en la que los patógenos viven frecuentemente en comunidades de bio-película, no puede garantizarse. Igualmente, usando tecnologías de amplificación, se extraen y se amplifican secuencias de ácido nucleico de múltiples células y, por lo tanto, pueden dar lugar a resultados positivos falsos. Sólo si la identificación y resistencia pueden llevarse a cabo y leerse en células individuales, es posible una visión verdadera del patógeno invasor.

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Un amplio rango de antibióticos porta un grupo amino primario. Es muy conocido en la técnica que reactivos tales como Isotiocianato de fluoresceína (FITC), Fluoresceína-éster de N-hidroxisuccinimida reaccionarán fácilmente con dichas aminas primarias.

La diseminación creciente de resistencia a antibióticos tanto en sistemas comunitarios como sanitarios necesita la precisión y velocidad de la biología molecular. Sin embargo, la complejidad y coste de estos ensayos prohíbe la aplicación generalizada en un entorno de ensayo rutinario.

Teniendo en cuenta las dificultades en la identificación de un microorganismo y su resistencia potencial frente a un antibiótico en una muestra biológica, es deseable poder identificar rápidamente un patógeno directamente a partir de una muestra sin cultivo ni amplificación y, además, poder detectar o excluir la presencia de resistencia frente a un antibiótico elegido.

Es la intención de esta invención proporcionar una solución permitiendo de manera simultánea la identificación y ensayo de resistencia a nivel celular. Esto reduce la complejidad de los ensayos de manera que puede hacerse una asignación inequívoca de un fenotipo para células individuales. Los ensayos se diseñan para reducir el tiempo de manejo y de obtención de resultados para permitir programas de cribado tales como el cribado de todos los pacientes entrantes por ejemplo para MRSA.

Un primer objeto de la presente invención es así un método para la detección de una resistencia a antibióticos en un microorganismo particular en una muestra biológica, que comprende las etapas:

(a)

proporcionar un antibiótico marcado,

(b)

poner en contacto el antibiótico marcado con una muestra biológica que comprende el microorganismo en condiciones que permitan la unión del antibiótico marcado a su sitio de unión en el microorganismo,

(c)

detectar el antibiótico marcado en el microorganismo e identificar este microorganismo en la misma muestra biológica, y

(d)

determinar si la cantidad de marcador detectable está alterada respecto a la cantidad de marcador detectable en el microorganismo particular en su forma no resistente,

en el que los microorganismos en los que la cantidad de marcador detectable está alterada respecto a la cantidad de marcador detectable en el microorganismo particular en su forma no resistente son microorganismos resistentes frente al antibiótico.

El principio subyacente del método es que si un organismo es sensible o resistente a un antibiótico, se diferenciará claramente de su equivalente resistente o sensible. Los antibióticos pueden unirse a sus sitios de unión respectivos bien en el lumen celular, citoplasma, la pared celular o a proteínas secretadas tales como beta-lactamasas. Dependiendo del mecanismo de resistencia, los organismos resistentes pueden mostrar en la mayor parte de los casos bien afinidad reducida o ausencia de afinidad para el antibiótico debido a una afinidad reducida, por ejemplo, para ribosomas o proteínas de unión a penicilina. A la inversa, si el mecanismo de resistencia se debe a la ab/adsorción a la membrana celular externa, el organismo resistente presentará una fluorescencia muy aumentada.

La muestra biológica puede ser cualquier muestra de origen biológico, tal como una muestra clínica o alimentaria, que se sospecha que comprende un microorganismo resistente a antibiótico. El microorganismo puede seleccionarse del grupo que consiste en bacterias, levaduras y hongos, en particular de bacterias Gram positivas y Gram negativas.

Preferiblemente, el microorganismo particular se selecciona del grupo que consiste en Staphylococcus, Enterococcus, y Streptococcus.

Más preferiblemente, el microorganismo particular se selecciona del grupo que consiste en Staphylococcus resistente a meticilina, Staphylococcus resistente a vancomicina, Enterococcus resistente a vancomicina, y Enterococci resistente a aminoglicósido de alto nivel.

El microorganismo se selecciona aún más preferiblemente del grupo que consiste en Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), Staphylococcus aureus resistente a vancomicina (VRSA), Staphylococcus resistente a vancomicina (VRS), Enterococci resistente a vancomicina (VRE), Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pneumoniae resistente a fármaco (DRSP), y Enterococci resistente a aminoglicósido (HLAR).

El antibiótico que se va a proporcionar en la etapa (a) puede ser cualquier antibiótico. Preferiblemente, el antibiótico se selecciona del grupo que consiste en aminoglicósidos, carbacefemos. carbapenemos, cefalosporinas, glicopéptidos, macrólidos, monobactamas, antibióticos beta-lactama, quinolonas, bacitracina, sulfonamidas, tetraciclinas, estreptograminas, cloranfenicol, clindamicina, y lincosamida.

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Más preferiblemente, los antibióticos se seleccionan de antibióticos beta-lactama, macrólidos, lincosamida, y estreptograminas.

Incluso más preferiblemente, el antibiótico se selecciona del grupo que consiste en Amicacina, Gentamicina, Kanamicina, Neomicina, Netilmicina, Estreptomicina, Tobramicina, Loracarbef, Ertapenem, Imipenem, Cilastatina, Meropenem, Cefadroxil, Cefazolina, Cefalexina, Cefaclor, Cefamandol, Cefoxitina, Cefprozil, Cefuroxima, Cefixima, Cefdinir, Cefditoreno, Cefoperazona, Cefotaxima, Cefpodoxima, Ceftazidima, Ceftibuteno, Ceftizoxima, Ceftriaxona, Cefsulodina, Cefepima, Teicoplanina, Vancomicina, Azitromicina, Claritromicina, Diritromicina, Eritromicina, Roxitromicina, Troleandomicina, Aztreonam, Amoxicilina, Ampicilina, Azlocilina, Carbenicilina, Cloxacilina, Dicloxacilina, Flucloxacilina, Mezlocilina, Nafcilina, Penicilina, Piperacilina, Ticarcilina, Bacitracina, Colistina, Polimixina B, Ciprofloxacina, Enoxacina, Gatifloxacina, Levofloxacina, Lomefloxacina, Moxifloxacina, Norfloxacina, Ofloxacina, Trovafloxacina, Mafenida, Prontosil, Sulfacetamida, Sulfametizol, Sulfanilimida, Sulfasalazina, Sulfisoxazol, Trimetoprima, Trimetoprima sulfa, Sulfametoxazol, Co-trimoxazol, Demeclociclina, Doxiciclina, Minociclina, Oxitetraciclina, Tetraciclina, Cloranfenicol, Clindamicina, Etambutol, Fosfomicina, Furazolidona, Isoniazid, Linezolid, Metronidazol, Mupirocina, Nitrofurantoína, Platensimicina, Pirazinamida, Quinupristina/Dalfopristina, Rifampina, Espectinomicina, Amfotericina B, Flucanazol, Fluoropirimidinas, Gentamicina, y ácido clavulánico.

Lo más preferiblemente, el antibiótico se selecciona de Vancomicina, Meticilina, Clindamicina, Trimetoprima, Trimetoprima sulfa, Gentamicina, y ácido clavulánico.

Ball et al. (Biochem.Biophys.Res. 93(1), 74-81, 1980) describe el uso de tetraciclina como un antibiótico naturalmente fluorescente marcador de eflujo.

Sorprendentemente, una modificación de un antibiótico con un grupo marcador no dificulta la unión de un antibiótico a su sitio de unión en el microorganismo.

Preferiblemente, el antibiótico se marca con un grupo marcador luminiscente. Están disponibles muchos fluoróforos adecuados como grupos marcadores en la presente invención. El grupo marcador puede seleccionarse para ajustarse a los filtros presentes en el mercado. El antibiótico puede marcarse con cualquier grupo marcador adecuado que puede detectarse en un microorganismo. Preferiblemente, el grupo marcador es un grupo marcador fluorescente. Más preferiblemente, el grupo marcador se selecciona de Fluoresceína y Atto-495-NSI.

El grupo marcador puede acoplarse al antibiótico en un grupo funcional. Un amplio rango de antibióticos porta un grupo amino primario. Por ejemplo, un compuesto fluorescente tal como Isotiocianato de fluoresceína (FITC), Fluoresceína-éster de N-hidroxisuccinimida puede hacerse reaccionar con un grupo amino de un antibiótico, lo que resulta en un antibiótico marcado con Fluoresceína. Otros antibióticos tales como Clindamicina portan un grupo tiometilo que puede acoplarse a un grupo marcador. Se encontraron las condiciones para sustituir moderadamente el grupo metilo de Clindamicina con una molécula espaciadora formando un puente ditio.

El grupo marcador puede acoplarse al antibiótico mediante un espaciador. En la técnica se conocen muchos espaciadores y pueden aplicarse. Usando técnicas de química de proteínas muy conocidas en la técnica son factibles muchas maneras de unir un espaciador y posteriormente unir un fluoróforo. En una realización preferida se elige la cisteína ya que su grupo amino primario puede marcarse fácilmente con un fluoróforo. También pueden elegirse moléculas con núcleos de carbono más largos y otros grupos reactivos muy conocidos en la técnica como conector/espaciador entre cualquier fluoróforo y una sustancia antibiótica.

Una lista de antibióticos modificados con un fluoróforo con o sin un espaciador se recopilan en la Tabla 1. Se prefiere que los antibióticos (en particular de la Tabla 1) estén marcados con Fluoresceína o Atto-495-NSI.

Con el fin de combinar la identificación con el estado de resistencia, las condiciones que permiten la unión del antibiótico marcado a su sitio de unión en el microorganismo en la etapa (b) pueden referirse a un ensayo de unión que no se inhibe por el procedimiento de hibridación in-situ, lo que permite una determinación bien concomitante o posterior tanto de la identificación como del estado de resistencia en células individuales y poblaciones de células.

Un sitio de unión preferido es la proteína PBP2 (Proteína de Unión a Penicilina) en Staphylococcus codificada por el gen mecA. En Staphylococcus resistente frente a antibióticos beta-lactama, el gen mecA codifica una proteína PBP2 modificada (PBP2' o PBP2a) con baja afinidad para meticilina y todos los antibióticos ß-lactama. Así, en una realización más preferida, el microorganismo es una cepa MRSA que porta el gen mecA, que codifica una proteína PBP2 modificada (PBP2' o PBP2a) con baja afinidad para meticilina y todos los antibióticos ß-lactama, y el antibiótico es un antibiótico beta-lactama.

Una aplicación preferida adicional es para la determinación de resistencia debida a mutaciones puntuales en el ARN ribosomal 23s. Las mutaciones puntuales en diferentes posiciones inducen resistencia a una amplia matriz de antibióticos tales como Macrólidos, Ketólidos, Tetraciclina, Tiazolantibióticos, Lincosamina, Cloranfenicol, Estreptogramina, Amecitina, Animosicina, Esparsoicina y Puromicina. Los efectos detallados de mutaciones puntuales respectivas se listan en la Tabla 3. Las mutaciones puntuales en diferentes posiciones del ARNr 23S pueden generar un iso-fenotipo. Se requeriría una matriz de sondas de oligonucleótidos para abarcar todas las posibilidades. Esta invención ofrece una manera rentable y eficiente de detectar resistencia a antibióticos independientemente de la posición de la mutación.

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Otra aplicación preferida es la detección de la unión de Vancomicina a proteínas de superficie de Staphylococcus aureus que están ancladas al péptidoglicano de la pared celular. Los Staphylococci resistentes a Vancomicina unen el antibiótico en un grado tal que hacen que la Vancomicina sea inefectiva. La Vancomicina marcada, por lo tanto, se unirá preferiblemente a organismos resistentes.

En la presente invención, la cantidad de marcador detectable en el microorganismo corresponde a la señal del grupo marcador del antibiótico. La cantidad de marcador detectable puede ser directamente proporcional a la señal obtenida del grupo marcador.

El método de la presente invención puede comprender etapas para eliminar grupos marcadores que se han eliminado por escisión del antibiótico o/y para eliminar antibiótico marcado que no se une a un microorganismo. Dichas etapas pueden mejorar la proporción señal a ruido.

En la etapa (c) del método de la presente invención, el marcador puede detectarse por cualquier método adecuado conocido en la técnica. La lectura del ensayo puede requerir una resolución de hasta la célula individual. Preferiblemente, el marcador se detecta mediante microscopía de epifluorescencia, citometría de flujo, dispositivos de escaneo por láser, fluorometría de tiempo resuelto, detección por luminiscencia, detección por isótopos, escáner de visualización hiper espectral, Resonancia de Plasmón Superficial o/y otra tecnología de lectura basada en evanescencia.

En la etapa (d) del método de la presente invención, la alteración de la cantidad de marcador detectable puede ser un incremento del marcador detectable o una disminución del marcador detectable. En el método de la presente invención, la resistencia a antibióticos que se va a detectar se predetermina por el suministro de un antibiótico marcado en la etapa (a). La Tabla 4 indica mecanismos de resistencia frente a antibióticos comúnmente conocidos en microorganismos clínicamente relevantes. A partir del mecanismo de resistencia de un microorganismo particular, tal como se indica en la Tabla 4, puede deducirse qué combinación de microorganismo/resistencia a antibióticos se espera que muestre una cantidad incrementada de marcador detectable en las células resistentes a antibiótico, y qué combinación muestra una cantidad disminuida de marcador detectable. Por ejemplo, una disminución de la cantidad de marcador detectable se espera en microorganismos resistentes frente a antibióticos ß-lactama o macrólidos, tales como MSRA, ORSA, etc. Una cantidad incrementada de marcador detectable se espera en VRSA. Una disminución de marcador detectable se espera en Enterococci resistentes a Vancomicina, debido al diferente mecanismo de resistencia como en VRSA. En la Tabla 4 pueden encontrarse más detalles.

En la presente invención, el microorganismo particular en su forma no resistente puede emplearse como una referencia para determinar si la cantidad de marcador detectable está alterada (disminuida o incrementada). El microorganismo particular en su forma no resistente puede añadirse a la muestra, o puede presentarse en una preparación separada. El microorganismo particular en su forma no resistente puede portar al menos un marcador adicional. Puede emplearse cualquier marcador como se describe en la presente memoria, siempre que sea adecuado para discriminación del marcador del antibiótico o/y otros microorganismos presentes en el ensayo de la presente invención. La cantidad de marcador detectable en un microorganismo particular en su forma no resistente también puede proporcionarse en la forma de valores o intervalos específicos de la cantidad de marcador detectable para una o más combinaciones del microorganismo, un antibiótico y un grupo marcador, por ejemplo en la forma de una hoja de cálculo. En particular, un kit de la presente invención puede comprender dicho microorganismo particular en su forma no resistente o/y dicha hoja de cálculo.

El método de la presente invención también puede emplear el microorganismo particular en su forma resistente como un control adicional, o valores o intervalos específicos de la cantidad de marcador detectable en un microorganismo particular en su forma resistente para una o más combinaciones del microorganismo, un antibiótico y un grupo marcador, por ejemplo en la forma de una hoja de cálculo. El microorganismo particular en su forma resistente puede portar al menos un marcador adicional. Puede emplearse cualquier marcador como se describe en la presente memoria, siempre que sea adecuado para la discriminación del marcador del antibiótico o/y otros microorganismos presentes en el ensayo de la presente invención. En particular, un kit de la presente invención puede comprender dicho microorganismo particular en su forma resistente o/y dicha hoja de cálculo.

La disminución de la cantidad de marcador detectable puede ser al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, o al menos 90% respecto a la cantidad de marcador detectable en el microorganismo particular en su forma no resistente. En particular, un microorganismo que se va a identificar puede ser un microorganismo que esencialmente no porta el marcador.

El incremento de la cantidad de marcador detectable puede ser al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 100%, al menos 150%, o al menos 200% respecto a la cantidad de marcador detectable en el microorganismo particular en su forma no resistente.

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En la etapa (c) del método de la presente invención, el método comprende la identificación del microorganismo en la muestra biológica. "Identificación" en el contexto de la presente invención se refiere a la identificación de células microbianas individuales como pertenecientes a una categoría taxonómica particular, tal como especie, género, familia, clase o/y orden, etc. La identificación puede llevarse a cabo tomando como base las clasificaciones morfológicas o/y bioquímicas.

Puede emplearse una sonda para identificar el microorganismo. Se prefiere identificar el microorganismo particular con un ácido nucleico marcado, en particular un oligonucleótido marcado, capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico en el microorganismo en condiciones in-situ. El oligonucleótido marcado puede tener una longitud de hasta 50 nucleótidos. Lo más preferido es la identificación del microorganismo por hibridación fluorescente in-situ (FISH). Estas realizaciones preferidas y más realizaciones preferidas permiten la detección del fenotipo de antibiótico a nivel molecular mientras se mantienen las condiciones de hibridación in-situ para permitir la identificación simultánea e inequívoca mediante hibridación in-situ y la detección de un fenotipo de resistencia a antibiótico en la misma célula - incluso si está en una población mixta.

Puede aplicarse un protocolo de hibridación in-situ como se describe en la solicitud de patente EP 06 021 267.7. La incubación con un antibiótico marcado puede llevarse a cabo a temperaturas por debajo de la Tm de la sonda hibridada. En una realización preferida la temperatura es entre aproximadamente 25 y aproximadamente 65°C, en una realización más preferida la temperatura es entre aproximadamente 35°C y aproximadamente 59°C. En una realización incluso más preferida, la temperatura es a aproximadamente 52°C. El tiempo de incubación es preferiblemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30 minutos. En una realización más preferida la incubación se hace durante aproximadamente 15 minutos. Después de la incubación el portaobjetos puede sumergirse en 50% etanol seguido de un baño en etanol puro. Ambas etapas pueden realizarse durante entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 minutos. La duración preferida de la incubación es entre aproximadamente 2 y aproximadamente 6 minutos. Es más preferido incubar aproximadamente 4 minutos. Los portaobjetos pueden secarse al aire (por ejemplo, en una placa caliente) y las células pueden incluirse en un medio de montaje salino equilibrado.

El microorganismo puede detectarse por cualquier método adecuado conocido en la técnica. La lectura del ensayo puede requerir una resolución de hasta la célula individual. En particular, el microorganismo se detecta mediante microscopía de epifluorescencia, citometría de flujo, dispositivos de escaneo con láser, fluorometría de tiempo resuelto, detección por luminiscencia, detección por isótopos, escáner de visualización hiper espectral, Resonancia de Plasmón Superficial o/y otra tecnología de lectura basada en evanescencia.

Preferiblemente, la hibridación in-situ se combina con la detección de resistencia a antibiótico. Más preferiblemente, FISH se combina con detección de resistencia a antibióticos.

Se prefiere que la identificación del microorganismo y la detección del antibiótico marcado en el microorganismo se realicen subsecuentemente.

En una realización preferida alternativa, la identificación del microorganismo y la detección del antibiótico marcado en el microorganismo se realizan concurrentemente. En esta realización, el antibiótico marcado puede añadirse al tampón de hibridación. Después de la incubación, se lleva a cabo el tratamiento adicional como se describe en la presente memoria para la detección del microorganismo. Lo más preferiblemente, la hibridación in-situ y FISH, respectivamente, y la detección de la resistencia a antibióticos se llevan a cabo simultáneamente.

Preferiblemente, puede emplearse el mismo método de detección, tal como microscopía de epifluorescencia, citometría de flujo, dispositivos de escaneo con láser u otro método descrito en la presente memoria, tanto para la identificación del microorganismo como la detección del antibiótico marcado en el microorganismo.

Los ensayos de hibridación in-situ y de enzima o receptor exigen convencionalmente entornos específicos para sus ensayos respectivos del estado de la técnica. Por lo tanto, fue sorprendente que fuera posible

1.

preparar las células para hibridación in-situ con poros con un tamaño suficiente para permitir el paso de oligonucleótidos de hasta 50-mer

2.

hacer que las proteínas de membrana sean accesibles para los antibióticos marcados

3.

mantener la integridad tanto de dichas proteínas como de ribosomas para permitir la unión específica de antibióticos marcados con fluoróforos

4.

Encontrar sitios de unión suficientes para generar una señal visible bajo un microscopio de epifluorescencia, en particular bajo condiciones uniformes.

Se prefiere usar en el método de la presente invención un oligonucleótido con un fluoróforo que emite en un intervalo de longitud de onda predeterminado junto con un antibiótico marcado con otro fluoróforo que emite en un intervalo de longitud de onda, de manera que los dos fluoróforos pueden discriminarse por detección de luminiscencia. Por ejemplo, uno de los fluoróforos, tal como Fluoresceína, puede emitir una señal verde, y el otro fluoróforo puede emitir una señal roja. Una lista de antibióticos modificados con un fluoróforo se recopila en la Tabla I.

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La muestra biológica que comprende los microorganismos particulares puede pretratarse con el fin de facilitar la unión del antibiótico marcado y opcionalmente la identificación del microorganismo.

La muestra biológica puede fijarse con calor en un portaobjetos según sus sondas designadas (antibiótico marcado y opcionalmente una sonda para detectar el microorganismo), por ejemplo a aproximadamente 45 a aproximadamente 65°C, preferiblemente a aproximadamente 50 a aproximadamente 55°C, más preferiblemente a aproximadamente 52°C.

Si el microorganismo es una bacteria Gram positiva, puede perforarse con un tampón adecuado. Las células Gram positivas pueden perforarse con una bacteriocina o/y un detergente. En una realización preferida se combina un antibiótico con un detergente biológico, y una realización especialmente preferida NISINA se combina con Saponina. Además, pueden aplicarse enzimas líticas tales como Lisozima y Lisostafina. Las enzimas líticas pueden estar equilibradas en la ecuación. Si la muestra se trata con etanol, la concentración de los ingredientes activos puede equilibrarse respecto a su tratamiento posterior en etanol. En una realización más preferida, la concentración de Lisozima, Lisostafina, Nisina y Saponina se equilibra para abarcar todos los organismos Gram positivos con la excepción de Mycobacteria.

Un ejemplo de un Tampón de Perforación de Gram Positivas más preferido se proporciona en la Tabla 2. Se contempla que variaciones de las cantidades y concentraciones, y temperaturas de aplicación y tiempos de incubación están en la experiencia de la técnica.

Si el microorganismo es una levadura o un hongo, puede perforarse con un tampón adecuado. Sorprendentemente, se encontró que las paredes celulares de levaduras y hongos no formaban poros reproducibles cuando se tratan según procedimientos muy conocidos en la técnica. Estos procedimientos dan lugar frecuentemente a resultados tanto positivos falsos como negativos falsos. Una solución fiable es un tampón preferido que comprende una combinación de un antibiótico peptídico, detergente, agente acomplejante, y agente reductor. Un tampón más preferido comprende la combinación de una sal monovalente que genera una presión osmótica específica, una bacteriocina, una combinación de detergentes biológicos y sintéticos, un agente acomplejante para cationes divalentes, y un agente capaz de reducir puentes disulfuro. Una mejora sorprendente adicional se consiguió añadiendo enzimas proteolíticas específicas para procariotas. En un tampón incluso más preferido, se combinaron Saponina, SDS, Nisina, EDTA, DTT con Lisozima y una sal, por ejemplo en una concentración de aproximadamente 150 a aproximadamente 250 mM, más preferiblemente aproximadamente 200 a aproximadamente 230 mM, lo más preferiblemente aproximadamente 215 mM.

Un ejemplo de un Tampón de Perforación de Levaduras más preferido se proporciona en la Tabla 2. Se contempla que variaciones de las cantidades y concentraciones, y temperaturas de aplicación e incubación están en la experiencia de la técnica.

En otra realización preferida más, el método de la presente invención es un método de diagnóstico.

La presente invención se ilustra adicionalmente con los ejemplos siguientes y las tablas siguientes.

La Tabla 1 describe los antibióticos y ejemplos de marcaje adecuados en el método de la presente invención.

La Tabla 2 describe la composición de tampones de perforación empleados en la presente invención.

Tabla 3: Resistencia a antibióticos debida a mutaciones en el ARNr 23S.

Tabla 4: Mecanismo de resistencia a antibióticos en microorganismos y alteración en la cantidad de antibióticos marcados en microorganismos resistentes.

Ejemplo 1

Los antibióticos de la Tabla I se marcaron con FITC y se purificaron como es muy conocido en la técnica. La Clindamicina se modificó sustituyendo el grupo metilo unido al X'-S con cisteína mediante un enlace S-S. La cisteína unida se marcó con Fluorescamina bien mediante un éster de N-hidroxi-succinimida o FITC y se purificó con métodos muy conocidos en la técnica.

Ejemplo 2

Una resistencia a antibióticos, tal como una resistencia frente a penicilina, puede detectarse en un protocolo que comprende las etapas:

1 Aplicar la muestra biológica a portaobjetos, por ejemplo, 10 µl

2 Secar, por ejemplo a 52°C

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3 Añadir tampón de perforación, por ejemplo 10µl 4 Secar 5 Añadir mezcla de sonda reconstituida (por ejemplo, 9 µl) 6 Añadir antibiótico (por ejemplo, FITC-penicilina)

5 7 Incubar, por ejemplo durante 15 min a 52°C 8 EtOH/Mezcla de parada (por ejemplo, 50%:50%), por ejemplo durante 5 min a RT 9 Etanol, por ejemplo 99% etanol durante 5 min 10 Secar 11 Medio de Montaje Salino Equilibrado (por ejemplo, una gota pequeña)

10 12 Leer

Ejemplo 3

La Tabla 4 indica la alteración de la cantidad de antibióticos marcados detectables en microorganismos clínicamente relevantes en su forma resistente respecto a su forma no resistente. La cantidad se expresa en % de cambio de fluorescencia (disminución e incremento, respectivamente) de un antibiótico que porta un marcador fluorescente.

15 Tabla 1

Antibióticos

Nombre Genérico

Ejemplos de agente marcador

Aminoglicósidos

Amicacina

FITC Atto-495-NSI

Gentamicina

FITC Atto-495-NSI

Kanamicina

FITC Atto-495-NSI

Neomicina

FITC Atto-495-NSI

Netilmicina

FITC Atto-495-NSI

Estreptomicina

FITC Atto-495-NSI

Tobramicina

FITC Atto-495-NSI

Carbacefem

FITC Atto-495-NSI

Loracarbef

FITC Atto-495-NSI

Carbapenemos

Ertapenem

FITC Atto-495-NSI

Imipenem

FITC Atto-495-NSI

Cilastatina

FITC Atto-495-NSI

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Tampón de Perforación de Gram-Positivas

50 µg/ml Saponina

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5 µg/ml Nisina

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20 mM Tris pH 8

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100 µg/m Lisozima

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50 µg/ml Lisostafina

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imagen35 H2O

Disol. de trabajo

Tampón de Perforación de Levaduras

500 µg/ml Saponina

10

µg/ml Nisina

50

mM Tris pH 8,3

215

mM NaCl

0,1

% SDS

5

mM EDTA

10

mM DTT

100

µg/ml Lisozima

H2O

Tabla 3: Recopilación de resistencia a antibióticos debida a mutaciones en el ARNr 23S

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

2059 A a C Clr-R Helicobacter pylori Debets-Ossenkopp, Y. J., A. B. Brinkman, E. J. Kuipers, C. M. Vandenbroucke-Grauls, y J. G. Kusters. 1998. Explaining the bias in the 23S rRNA gene mutations associated with clarithromycin resistance in clinical isolates of Helicobacter pylori. Antimi

23S

2059 A a G Clr-R Helicobacter pylori Versalovic, J., D. Shortridge, K. Kibler, M. V. Griffy, J. Beyer, R. K. Flamm, S. K. Tanaka, D. Y. Graham, y M. F. Go. 1996. Mutations in 23S rRNA are associated with clarithromycin resistance in Helicobacter pylori. Antimicrob. Agents Chemother. 40:4

23S

2059 A a G Mac-R, Lin-R Helicobacter pylori Occhialini, A., M. Urdaci, F. Doucet-Populaire, C. M. Bébéar, H. Lamouliatte, y F. Mégraud. 1997. Macrolide resistance in Helicobacter pylori: rapid detection of point mutations and assays of macrolide binding to ribosomes. Antimicrob. Agents Chemothe

23S

2059 A a G Mac-R, Lin-R, SB-S Helicobacter pylori Wang, G., y D. E. Taylor. 1998. Site-specific mutations in the 23S rRNA gene of Helicobacter pylori confer two types of resistance to macrolide-lincosamide-streptogramin B antibióticos. Antimicrob. Agents Chemother. 42:1952-1958.

23S

2059 A a G Cla-R Helicobacter pylori Debets-Ossenkopp, Y. J., A. B. Brinkman, E. J. Kuipers, C. M. Vandenbroucke-Grauls, y J. G. Kusters. 1998. Explaining the bias in the 23S rRNA gene mutations associated with clarithromycin resistance in clinical isolates of Helicobacter pylori. Antimi

23S

754 "U a A" Resistente a bajas concentraciones de quetólido HMR3647; resistente a eritromicina b. E. coli Xiong L, Shah S, Mauvais P, Mankin AS. 1999. A ketolide resistance mutation in domain II of 23S rRNA reveals the proximity of hairpin 35 to the peptidyl transferase center. Molecular Microbiology 31 (2): 633-639.

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

754 "U a A" Confiere resistente a macrólido y quetólido. E. coli Hansen L.H., Mauvais P, Douthwaite S. 1999. The macrolideketolide antibiotic binding site is formed by structures in domain II y V of 23S ribosomal RNA. Molecular Microbiology 31 (2): 623-631.

23S

754 U a A Ery-LR, Tel-LR Escherichia coli Xiong, L., S. Shah, P. Mauvais, y A. S. Mankin. 1999. A ketolide resistance mutation in domain II of 23S rRNA reveals the proximity of hairpin 35 to the peptidyl transferase centre. Mol. Microbiol. 31:633-639.

23S

1005 C a G Crecimiento lento bajo el promotor natural; (con 2058G y eritromicina) retraso grave en el crecimiento. A E. coli 1) Rosendahl, G. y Douthwaite, S. (1995) Nucleic Acids Res. 23, 2396-2403. 2) Rosendahl, G., Hansen, L.H., y Douthwaite, S. (1995) J. Mol. Biol. 249, 59-68.

23S

1005 C a G Crecimiento lento bajo el promotor pL; (con 2058G y eritromicina) Erys. a Doble mutante (C1005G/C1006U) E. coli 1) Rosendahl, G. y Douthwaite, S. (1995) Nucleic Acids Res. 23, 2396-2403. 2) Rosendahl, G., Hansen, L.H., y Douthwaite, S. (1995) J. Mol. Biol. 249, 59-68.

23S

1006 C a U Crecimiento lento bajo el promotor pL; (con 2058G y eritromicina) Erys. a Doble mutante (C1005G/C1006U) E. coli 1) Rosendahl, G. y Douthwaite, S. (1995) Nucleic Acids Res. 23, 2396-2403. 2) Rosendahl, G., Hansen, L.H., y Douthwaite, S. (1995) J. Mol. Biol. 249, 59-68.

23S

1006 C a U Letal bajo el promotor natural; bajo el promotor pL; (con 2058G y eritromicina) Erys. A E. coli 1) Rosendahl, G. y Douthwaite, S. (1995) Nucleic Acids Res. 23, 2396-2403. 2) Rosendahl, G., Hansen, L.H., y Douthwaite, S. (1995) J. Mol. Biol. 249, 59-68.

23S

1056 G a A La unión tanto de L11 y tiostreptona se debilita en fragmentos de ARN. B E. coli Ryan, P.C. y Draper, D.E. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6308-6312.

23S

1056 G a A Unión estequiométrica de L11.b (con 2058G y eritromicina) Velocidad de crecimiento reducida. a E. coli 1) Douthwaite, S.y Aagaard, C. (1993) J. Mol. Biol. 232, 725731. 2) Rosendahl, G. y Douthwaite, S. (1995) Nucleic Acids Res. 23, 2396-2403.

23S

1056 G a C La unión de tiostreptona se debilita en fragmentos de ARN. B E. coli Ryan, P.C. y Draper, D.E. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6308-6312.

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

1064 C a U Unión estequiométrica de L11.b (con 2058G y eritromicina) Velocidad de crecimiento reducida. a E. coli 1) Douthwaite, S.and Aagaard, C. (1993) J. Mol. Biol. 232, 725731. 2) Rosendahl, G. y Douthwaite, S. (1995) Nucleic Acids Res. 23, 2396-2403.

23S

1067 A a U Crecimiento normal E. coli 1) Spahn, C., Remme, J., Schafer, M. y 1) Remme, Schafer, Nierhaus, K. (1996). J. Biol. Chem. 271: 32849-32856. 2) Spahn, C., Remme, J., Schafer, M. y Nierhaus, K. (1996). J. Biol. Chem. 271: 32857-32862.

23S

1067 A a G Resistencia a tiostreptona en Halobacterium sp. Halobacteri um Hummel, H., y A. Bock. (1987) Biochimie 69:857-861.

23S

1067 A a U Resistencia a tiostreptona en Halobacterium sp. Halobacterium Hummel, H., y A. Bock. (1987) Biochimie 69:857-861.

23S

1067 A a U A a C o U confiere nivel alto de resistencia a tiostreptona, mientras A a G confiere nivel intermedio de resistencia; la afinidad de unión a fármacos se reduce de manera similar. a, b La expresión por la ARN polimerasa del huésped resulta en la formación de subunidades ribosomales activas in vivo. A E. coli 1) Thompson, J. y Cundliffe, E. (1991) Biochimie 73: 11311135. 2) Thompson, J., Cundliffe, E. y Dahlberg, A.E. (1988) J. Mol. Biol. 203: 457-465. 3) Lewicki, B.T.U., Margus, T., Remme, J. y Nierhaus, K.H. (1993) J. Mol. Biol. 231, 581-593. 4) LAST

23S

1067 A a C A a C o U confiere nivel alto de resistencia a tiostreptona, mientras A a G confiere nivel intermedio de resistencia; la afinidad de unión a fármacos se reduce de manera similar. a, b La expresión por la ARN polimerasa del huésped resulta en la formación de subunidades ribosomales activas in vivo. A E. coli 1) Thompson, J. y Cundliffe, E. (1991) Biochimie 73: 11311135. 2) Thompson, J., Cundliffe, E. y Dahlberg, A.E. (1988) J. Mol. 203: 457-465. 3) Lewicki, B.T.U., Margus, T., Remme, J. y Nierhaus, K.H. (1993) J. Mol. Biol. 231, 581-593. 4) LAST

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

1067 A a G A a C o U confiere nivel alto de resistencia a tiostreptona, mientras A a G confiere nivel intermedio de resistencia; la afinidad de unión a fármacos se reduce de manera similar. a, b La expresión por la ARN polimerasa del huésped resulta en la formación de subunidades ribosomales activas in vivo. A E. coli 1) Thompson, J. y Cundliffe, E. (1991) Biochimie 73:1131-1135. 2) Thompson, J., Cundliffe, E. y Dahlberg, A.E. (1988) J. Mol. Biol. 203: 457-465. 3) Lewicki, B.T.U., Margus, T., Remme, J. y Nierhaus, K.H. (1993) J. Mol. Biol. 231, 581-593. 4) LAST

23S

1067 "A a U" El 30% constituido del combinado total de ARNr 23S en los ribosomas, presentó 30% de resistencia a tiostreptona en traducción poli (U) b. E. coli Liiv A, Remme J. 1998. Base-pairing of 23S rRNA ends is essential for ribosomal large subunit assembly. J. Mol. Biol. 285: 965-975.

23S

1068 G a A Unión reducida de L11. b (con 2058G) Letal cuando se expresa a partir del promotor rrnB o pL en presencia de eritromicina. A E. coli 1) Rosendahl, G. y Douthwaite, S. (1995) Nucleic Acids Res. 23, 2396-2403. 2) Douthwaite, S.y Aagaard, C. (1993) J. Mol. Biol. 232, 725731.

23S

1068 G a A Supresión de 1068A; letalidad sólo en ausencia de eritromicina. a Doble mutante (G1068A/G1099A) E. coli Rosendahl, G. y Douthwaite, S. (1995) Nucleic Acids Res. 23, 2396-2403.

23S

1072 C a U Letal cuando se expresa a partir del promotor rrnB o pL en presencia de eritromicina. a E. coli Rosendahl, G. y Douthwaite, S. (1995) Nucleic Acids Res. 23, 2396-2403.

23S

1137 G a A Con 2058G y eritromicina, letal cuando se expresa a partir del promotor rrnB. E. coli Rosendahl, G., Hansen, L.H., y Douthwaite, S. (1995) J. Mol. Biol. 249, 59-68.

23S

1137 G a A Restaura el crecimiento normal bajo el promotor pL; (Con 2058G y eritromicina) Eryr. Doble mutante (G1137A/C1006U) E. coli Rosendahl, G., Hansen, L.H., y Douthwaite, S. (1995) J. Mol. Biol. 249, 59-68.

23S

1137 G a A Con 2058G y eritromicina, letal cuando se expresa a partir del promotor rrnB. Doble mutante (G1137A/G1138C) E. coli Rosendahl, G., Hansen, L.H., y Douthwaite, S. (1995) J. Mol. Biol. 249, 59-68.

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

1138 G a C Con 2058G y eritromicina, letal cuando se expresa a partir del promotor rrnB. E. coli Rosendahl, G., Hansen, L.H., y Douthwaite, S. (1995) J. Mol. Biol. 249, 59-68.

23S

1138 G a C Con 2058G y eritromicina, letal cuando se expresa a partir del promotor rrnB. Doble mutante (G1138C/G1137A) E. coli Rosendahl, G., Hansen, L.H., y Douthwaite, S. (1995) J. Mol. Biol. 249, 59-68.

23S

1207 C a U Resistente a eritromicina. a Doble mutante (C1207U/C1243U) E. coli Dam, M., Douthwaite, S., Tenson, T. y Mankin, A.S. (1996) J. Mol. Biol. 259, 1-6.

23S

1208 C a U Resistente a eritromicina. a Doble mutante (C1208U/C1243U) E. coli Dam, M., Douthwaile, S., Tenson, T. y Mankin, A.S. (1996) J. Mol. Biol. J. Mol. Biol. 259, 1-6

23S

1211 C a U Sensible a eritromicina. a Doble mutante (C1211U/C1208U) E. coli Dam, M., Douthwaite, S., Tenson, T. y Mankin, A.S. (1996) J. Mol. Biol. 259, 1-6.

23S

1220 G a A Resistente a eritromicina. a Doble mutante (G1220A/G1239A) E. coli Dam, M., Douthwaite, S., Tenson, T. y Mankin, A.S. (1996) J. Mol. Biol. 259, 1-6.

23S

1221 C a U Resistente a eritromicina. a Doble mutante (C1221U/C1229U) E. coli Dam, M., Douthwaite, S., Tenson, T. y Mankin, A.S. (1996) J. Mol. Biol. 259, 1-6.

23S

1221 C a U Resistente a eritromicina. a Doble mutante (C1221 U/C1233U) E. coli Dam, M., Douthwaite, S., Tenson, T. y Mankin, A.S. (1996) J. Mol. Biol. 259, 1-6.

23S

1230 1230 Sensible a eritromicina. a Doble deleción (1230/1231) E. coli Douthwaite, S., Powers, T., Lee, J.Y., y Noller, H.F. (1989) J. Mol. Biol. 209, 655-665.

23S

1231 1231 Sensible a eritromicina. a Doble deleción (1231/1230) E. coli Douthwaite, S., Powers, T., Lee, J.Y., y Noller, H.F. (1989) J. Mol. Biol. 209, 655-665.

23S

1232 G a A Sensible a eritromicina. a Doble mutante (G1232A/G1238A) E. coli Dam, M., Douthwaite, S., Tenson, T. y Mankin, A.S. (1996) J. Mol. Biol. 259, 1-6.

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

1233 C a U Sensible a eritromicina. a E. coli Dam, M., Douthwaite, S., Tenson, T. y Mankin, A.S. (1996) J. Mol. Biol. 259, 1-6.

23S

1234 "del1234/del 1235" Sensible a eritromicina. a Doble mutante (U1234C/del1235) E. coli Douthwaite, S., Powers, T., Lee, J.Y., y Noller, H.F. (1989) J. Mol. Biol. 209, 655-665.

23S

1234 U a C Sensible a eritromicina. a E. coli Douthwaite, S., Powers, T., Lee, J.Y., y Noller, H.F. (1989) J. Mol. Biol. 209, 655-665.

23S

1243 C a U Resistente a eritromicina. a Doble mutante (C1243U/C1208U) E. coli Douthwaite, S., Powers, T., Lee, J.Y., y Noller, H.F. (1989) J. Mol. Biol. 209, 655-665.

23S

1243 C a U Resistente a eritromicina. a Doble mutante (C1243U/C1221U) E. coli Douthwaite, S., Powers, T., Lee, J.Y., y Noller, H.F. (1989) J. Mol. Biol. 209, 655-665.

23S

1243 "C a U" Resistente a eritromicina. a Doble mutante (C1243U/C1207). E. coli Douthwaite, S., Powers, T., Lee, J.Y., Douthwaite, T., y Noller, H.F. (1989) J. Mol. Biol. 209, 655-665.

23S

1262 A a G Con eritromicina; letal E. coli Aagaard, C., y Douthwaite, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993.

23S

1262 A a C Con eritromicina; letal E. coli Aagaard, C., y Douthwaite, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993.

23S

1262 A a U Con eritromicina; velocidad de crecimiento reducida E. coli Aagaard, C., y Douthwaite, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993.

23S

1262 A a C Con eritromicina; velocidad de crecimiento reducida Doble mutante (A1262C/U2017G) E. coli Aagaard, C., y Douthwaite, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993.

23S

1262 A a G Supresión de los efectos en el crecimiento; Crecimiento de tipo salvaje en eritromicina Doble mutante (A1262G/U2017C) E. coli Aagaard, C., y Douthwaite, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993.

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

1262 A a U Supresión de los efectos en el crecimiento; Crecimiento de tipo salvaje en eritromicina Doble mutante (A1262U/U2017A) E. coli Aagaard, C., y Douthwaite, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993.

23S

1262 A a U Con eritromicina; velocidad de crecimiento reducida Doble mutante (A1262U/U2017G) E. coli Aagaard, C., y Douthwaite, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993.

23S

1423 G a A Requerimiento suprimido para ARNr 4.5S en la traducción de ARNm naturales por extractos celulares c E. coli O'Connor, M., Brunelli, C. A., Firpo, M.A., Gregory, S.T., Lieberman, K.R., Lodmell, J.S., Moine, H., Van Ryk, D.I. y Dahlberg, A.E. (1995) Biochem. Cell Biology 73, 859-868.

23S

1698 A a G Suprime 2555 mutaciones E. coli O'Connor y Dahlberg, no publicado

23S

2017 "U a G" Velocidad de crecimiento reducida en eritromicina. E. coli Aaagard, C. y Douthwaite, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993.

23S

2017 "U a C" Velocidad de crecimiento reducida en eritromicina. E. coli Aaagard, C. y Douthwaite, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993.

23S

2017 "U a A" Velocidad de crecimiento reducida en eritromicina. E. coli Aaagard, C. y Douthwaite, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993.

23S

2017 "U a C" Velocidad de crecimiento reducida en eritromicina. Doble mutación (U2017C/A1262G) E. coli Aaagard, C. y Douthwaite, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993.

23S

2017 "U a G" Velocidad de crecimiento reducida en eritromicina. Doble mutación (U2017G/A1262C) E. coli Aaagard, C. y Douthwaite, S. (1994) Proc. Matl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993.

23S

2017 "U a G" Velocidad de crecimiento reducida en eritromicina. Doble mutación (U2017G/A1262U) E. coli Aaagard, C. y Douthwaite, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993.

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

2032 "G a A" Resistencia a lincomicina. Cloroplastos de tabaco Cseplö, A., Etzold, T., Schell, J., y Schreier, P.H. (1988) Mol. Genet. 214, 295-299.

23S

2032 "G a A" EryS, Cds, Cms. Double mutation (G2032A/A2058G) E. coli 1. Douthwaite, S. (1992) J. Bacteriol. 174, 1333-1338. 2. Aaagard, C. y Douthwaite, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993. 3. Vester, B., Hansen, L.H., y Douthwaite, S. (1995) RNA 1, 501-509.

23S

2032 "G a A" Eryhs, Cds, Cms. Doble mutación (G2032A/A2058U) E. coli 1. Douthwaite, S. (1992) J. Bacteriol. 174, 1333-1338. 2. Aaagard, C. y Douthwaite, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993. 3. Vester, B., Hansen, L.H., y Douthwaite, S. (1995) RNA 1, 501-509.

23S

2032 "G a A" Eryr, Cdr, Cmr. Doble mutación (G2032A/G2057A) E. coli 1. Douthwaite, S. (1992) J. Bacteriol. 174, 1333-1338. 2. Aaagard, C. y Douthwaite, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993. 3. Vester, B., Hansen, L.H., y Douthwaite, S. (1995) RNA 1, 501-509.

23S

2032 AG a GA Clr/Azm/Ery-R Helicobacter pylori Húlten, K., A. Gibreel, O. Sköld, y L. Engstrand. 1997. Macrolide resistance in Helicobacter pylori: mechanism and stability in strains from clarithromycin-treated patients. Antimicrob. Agents Chemother. 41:2550-2553.

23S

2051 "del A" Previene la metilación de ErmE. c E. coli Vester B, Nielsen AK, Hansen LH, Douthwaite S. 1998. ErmE Methyltransferase Recognition Elements in RNA Substrates. J. Mol. Biol. 282: 255-264.

23S

2052 "A a C" Previene la metilación de ErmE. c E. coli Vester B, Nielsen AK, Hansen LH, Douthwaite S. 1998. ErmE Methyltransferase Recognition Elements in RNA Substrates. J. Mol. Biol. 282: 255-264.

23S

2052 "A a G" Como A2052C c E. coli Vester B, Nielsen AK, Hansen LH, Douthwaite S. 1998. ErmE Methyltransferase Recognition Elements in RNA Substrates. J. Mol. Biol. 282: 255-264.

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

2052 "A a U" Como A2052C. c E. coli Vester B, Nielsen AK, Hansen LH, Douthwaite S. 1998. ErmE Methyltransferase Recognition Elements in RNA Substrates. J. Mol. Biol. 282: 255-264.

23S

2057 "G a A" Eryr, Clinidamicina (Cd)s, Cloranfemicol (Cm)r; reduce la metilación de ARNr 23S por ErmE. E. coli 1. Ettayebi, M., Prasad, S.M., y Morgan, E.A. (1985) J. Bacteriol. 162, 551-557 2. Aaagard, C. y Douthwaite, S. (1994) Pro. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993. 3. Vester, B., Hansen, L.H., y Douthwaite, S. (1995) RNA 1, 501-509.

23S

2057 "G a A" Eyrr. Chlamydomonas reinhardtii Harris, E.H., Burkhart, B.D., Gilham, N.W., y Boynton, J.E. (1989) Genetics 123, 281-292.

23S

2057 "G a A" Ligeramente Eryr; metilación reducida. Doble mutación (G2057A/C2661U) E. coli Vester, B., Hansen, L.H., y Douthwaite, S. (1995) RNA 1, 501509.

23S

2057 "G a A" Eryr, Cdr, Cmr. Doble mutación (G2057A/G2032A) E. coli 1. Douthwaite, S. (1992) J. Bacteriol. 174, 1333-1338. 2. Aaagard, C. y Douthwaite, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993. 3. Vester, B., Hansen, L.H., y Douthwaite, S. (1995) RNA 1, 501-509.

23S

2057 G a A Ery-R, Lin-S Chlamydomonas reinhardtii chl. Harris, E. H., B.D. Burkhart, N. W. Gillham, y J. E. Boynton. 1989. Antibiotic resistance mutations in the chloroplast 16S and 23S rRNA genes of Chlamydomonas reinhardtii: correlation of genetic and physical maps of the chloroplast genome. Genetics.

23S

2057 G a A Ery-R, M16-S, Lin-S, SB-S Escherichia coli Ettayebi, M., S. M. Prasad, y E. A. Morgan. 1985. Chloramphenicol-erythromycin resistance mutations in a 23S rRNA gene of Escherichia coli. J. Bacteriol. 162:551-557.

23S

2057 G a A Ery-LR, M16-S Propionibacterias Ross, J. I., E. A. Eady, J. H. Cove, C. E. Jones, A. H. Ratyal, Y W. Miller, S. Vyakrnam, y W. J. Cunliffe. 1997. Clinical resistance to erythromycin and clindamycin in cutaneous propionibacteria isolated from acne patients is associated with mutatio

imagen58

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

2057 GG a AA Ery-R, Lin-R Escherichia coli Douthwaite, S. 1992. Functional interactions within 23S rRNA involving the peptidyltransferase center. J. Bacteriol. 174:13331338.

23S

2058 "A a G" Eryr, resistencia a Lincomicina y clindamicina. Chlamydomonas reinhardtii Harris, E.H., Burkhart, B.D., Gilham, N.W., y Boynton, J.E. (1989) Genetics 123, 281-292.

23S

2058 "A a G" Resistencia a claritromicina Helicobacter pylori Versalovic, J., Shortridge, D., Kibler, K., Griffy, M.V., Beyer, J., Flamm, R.K., Tenaka, S.K., Graham, D.Y., y Go, M.F. (1996) Antimicrob. Agents Chemother. 40, 477-480.

23S

2058 "A a G" Eryr, Cdr, Cms; suprime metilación de ARNr 23S por ErmE. E.coli 1. Vester, B. y Garrett, R.A. (1988) EMBO J. 7, 3577-3587. 2. Aaagard, C. y Douthwaite, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993. 3. Vester, B., Hansen, L.H., y Douthwaite, S. (1995) RNA 1, 501-509.

23S

2058 "A a G" Resistencia a eritromicina. Mitocondrias de levadura Sor, F. y Fukuhara, H. (1982) Nucleic Acids Res. 10, 65716577.

23S

2058 "A a G" Resistencia a lincomicina. Solanum nigrum Kavanagh, T.A., O'Driscoll, K.M., McCabe, P.F., y Dix, P.J. (1994) Mol. Gen. Genet. : 242, 675-680.

23S

2058 "A a G" Resistencia a lincomicina. Cloroplastos de tabaco Cseplö, A., Etzold, T., Schell, J., y Schreier, P.H. (1988) Mol. Genet. 214, 295-299.

23S

2058 "A a G" EryS, Cds, Cms. Doble mutación (A2058G/G2032A) E. coli 1. Douthwaite, S. (1992) J. Bacteriol. 174, 1333-1338. 2. Aaagard, C. y Douthwaite" S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993. 3. Vester, B., Hansen, L.H., y Douthwaite, S. (1995) RNA 1, 501-509.

23S

2058 "A a U" Eryhs, Cds, Cms. Doble mutación (A2058U/G2032A) E. coli 1. Douthwaite, S. (1992) J. Bacteriol. 174, 1333-1338. 2. Aaagard, C. y Douthwaite, S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2989-2993. 3. Vester, B., Hansen, L.H., y Douthwaite, S. (1995) RNA 1, 501-509.

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

2058 "A a C" Confiere resistencia a los fármacos MLS y cloranfenicol. E. coli Hansen LH, Mauvais P, Douthwaite S. 1999. The macrolidekelotide antibiotic binding site is formed by structures in domains II and V of 23S ribosomal RNA. Molecular Microbiology 31 (2): 623-631.

23S

2058 "A a G" Como A2058C E. coli Hansen LH, Mauvais P, Douthwaite S. 1999. The macrolidekelotide antibiotic binding site is formed by structures in domains II and V of 23S ribosomal RNA. Molecular Microbiology 31 (2): 623-631.

23S

2058 "A a U" Como A2058C E. coli Hansen LH, Mauvais P, Douthwaite S. 1999. The macrolidekelotide antibiotic binding site is formed by structures in domains II and V of 23S ribosomal RNA. Molecular Microbiology 31 (2): 623-631.

23S

2058 A a G/U Ery-R, Tyl-R, Lin-R Brachyspira hyodysenteriae Karlsson, M., C. Fellstrom, M. U. Heldtander, K. E. Johansson, y A. Franklin. 1999. Genetic basis of macrolide and lincosamide resistance in Brachyspira (Serpulina) hyodysenteriae. FEMS Microbiol. Lett. 172:255-260.

23S

2058 A a G Ery-R, Lin-R Chlamydomonas reinhardtii chl. Harris, E. H., B. D. Burkhart, N. W. Gillham, y J. E. Boynton. 1989. Antibiotic resistance mutations in the chloroplast 16S and 23S rRNA genes of Chlamydomonas reinhardtii: correlation of genetic and physical maps of the chloroplast genome. Genetics

23S

2058 A a G Ery-R, Lin-R Escherichia coli Douthwaite, S. 1992. Functional interactions within 23S rRNA involving the peptidyltransferase center. J. Bacteriol. 174:13331338. Vester, B., y R. A. Garrett. 1987. A plasmid-coded and site-directed mutation in Escherichia coli 23S RNA that confers

23S

2058 A a U MLSB-R Escherichia coli Sigmund, C. D., M. Ettayebi, y E. A. Morgan. 1984. Antibiotic resistance mutations in 16S and 23S ribosomal RNA genes of Escherichia coli. Nucl Acids Res. 12:4653-4663.

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

2058 A a C Clr-R Helicobacter pylori Stone, G. G., D. Shortridge, R. K. Flamm, J. Versalovic, J. Beyer, K. Idler, L. Zulawinski, y S. K. Tanaka. 1996. Identification of a 23S rRNA gene mutation in clarithromycinresistant Helicobacter pylori. Helicobacter. 1:227-228.

23S

2058 A a C Mac-R, Lin-R Helicobacter pylori Occhialini, A., M. Urdaci, F. Doucet-Populaire, C. M. Bébéar, H. Lamouliatte, y F. Mégraud. 1997. Macrolide resistance in Helicobacter pylori: rapid detection of point mutations and assays of macrolide binding to ribosomes. Antimicrob. Agents Chemothe

23S

2058 A a C MLSB -R Helicobacter pylori Wang, G., y D. E. Taylor. 1998. Site-specific mutations in the 23S rRNA gene of Helicobacter pylori confer two types of resistance to macrolide-lincosamide-streptogramin B antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 42:1952-1958.

23S

2058 A a C Cla-R Helicobacter pylori Debets-Ossenkopp. Y. J., A. B. Brinkman, E. J. Kuipers, C. M. Vandenbroucke-Grauls, y J. G. Kusters. 1998. Explaining the bias in the 23S rRNA gene mutations associated with clarithromycin resistance in clinical isolates of Helicobacter pylori. Antimi

23S

2058 A a G Cla-R Helicobacter pylori Versalovic, J., D. Shortridge, K. Kibler, M. V. Griffy, J. Beyer, R. K. Flamm, S. K. Tanaka, D. Y. Graham, y M. F. Go. 1996. Mutations in 23S rRNA are associated with clarithromycin resistance in Helicobacter pylori. Antimicrob. Agents Chemother. 40:4

23S

2058 A a G Mac-R, Lin-R Helicobacter pylori Occhialini, A., M. Urdaci, F. Doucet-Populaire, C. M. Bébéar, H. Lamouliatte, y F. Mégraud. 1997. Macrolide resistance in Helicobacter pylori: rapid detection of point mutations and assays of macrolide binding to ribosomes. Antimicrob. Agents Chemothe

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

2058 A a G MLSB -R Helicobacter pylori Wang, G., y D. E. Taylor. 1998. Site-specific mutations in the 23S rRNA gene of Helicobacter pylori confer two types of resistance to macrolide-lincosamide-streptogramin B antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 42:1952-1958.

23S

2058 A a G Cla-R Helicobacter pylori Debets-Ossenkopp, Y. J., A. B. Brinkman, E. J. Kuipers, C. M. Vandenbroucke-Grauls, y J. G. Kusters. 1998. Explaining the bias in the 23S rRNA gene mutations associated with clarithromycin resistance in clinical isolates of Helicobacter pylori. Antimi

23S

2058 A a U MLSB -R Helicobacter pylori Wang, G., y D. E. Taylor. 1998. Site-specific mutations in the 23S rRNA gene of Helicobacter pylori confer two types of resistance to macrolide-lincosamide-streptogramin B antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 42:1952-1958.

23S

2058 A a U Cla-R Helicobacter pylori Debets-Ossenkopp, Y. J., A. B. Brinkman, E. J. Kuipers, C. M. Vandenbroucke-Grauls, y J. G. Kusters. 1998. Explaining the bias in the 23S rRNA gene mutations associated with clarithromycin resistance in clinical isolates of Helicobacter pylori. Antimi

23S

2058 A a G Clr-R Mycobacterium abscessus Wallace, R. J., Jr., A. Meier, B. A. Brown, Y. Zhang, P. Sander, G. O. Onyi, y E. C. Böttger. 1996. Genetic basis for clarithromycin resistance among isolates of Mycobacterium chelonae and Mycobacterium abscessus. Antimicrob. Agents Chemother. 40:1676

23S

2058 A a C/G/U Clr-R Mycobacterium avium Nash, K. A., y C. B. Inderlied. 1995. Genetic basis of macrolide resistance in Mycobacterium avium isolated from patients with disseminated disease. Antimicrob. Agents Chemother. 39:26252630.

23S

2058 A a C/G/U Clr-R Mycobacterium avium Nash, K. A., y C. B. Inderlied. 1995. Genetic basis of macrolide resistance in Mycobacterium avium isolated from patients with disseminated disease. Antimicrob. Agents Chemother. 39:2625

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

imagen68

imagen69 imagen70 imagen71 imagen72 2630.

23S

2058 A a C/G Clr-R Mycobacterium chelonae Wallace, R. J., Jr., A. Meier, B. A. Brown, Y. Zhang, P. Sander, G. O. Onyi, y E. C. Böttger. 1996. Genetic basis for clarithromycin resistance among isolates of Mycobacterium chelonae and Mycobacterium abscessus. Antimicrob. Agents Chemother. 40:1676

23S

2058 A a C/G/U Clr-R Mycobacterium intracellulare Meier, A., P. Kirschner, B. Springer, V. A. Steingrube, B. A. Brown, R. J. Wallace, Jr., y E. C. Böttger. 1994. Identification of mutations in 23S rRNA gene of clarithromycin- resistant Mycobacterium intracellulare. Antimicrob. Agents Chemother. 38:38

23S

2058 A a U Clr-R Mycobacterium kansasii Burman, W. J., B. L. Stone, B. A. Brown, R. J. Wallace, Jr., y E. C. Böttger. 1998. AIDS-related Mycobacterium kansasii infection with initial resistance to clarithromycin. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 31:369-371.

23S

2058 A a G Clr-R Mycobacterium smegmatis Sander, P., T. Prammananan, A. Meier, K. Frischkorn, y E. C. Böttger. 1997. The role of ribosomal RNAs in macrolide resistance. Mol. Microbiol. 26:469-480.

23S

2058 A a G Ery-HR, Spi-MR, Tyl-S, Lin-HR Mycoplasma pneumoniae Lucier, T. S., K. Heitzman, S. K. Liu, y P. C. Hu. 1995. Transition mutations in the 23S rRNA of erythromicin-resistant isolates of Mycoplasma pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. 39:2770-2773.

23S

2058 A a G MLSB -R Propionibacteria Ross, J. I., E. A. Eady, J. H. Cove, C. E. Jones, A. H. Ratyal, Y. W. Miller, S. Vyakrnam, y W. J. Cunliffe. 1997. Clinical resistance to erythromycin and clindamycin in cutaneous propionibacteria isolated from acne patients is associated with mutatio

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

2058 A a G MLSB -R Streptococcus pneumoniae Tait-Kamradt, A., T. Davies, M. Cronan, M. R. Jacobs, P. C. Appelbaum, y J. Sutcliffe. 2000. Mutations in 23S rRNA and L4 ribosomal protein account for resistance in Pneumococcal strains selected in vitro by macrolide passage. Antimicrobial Agents and

23S

2058 A a G MLSB -R Streptomyces ambofaciens Pernodet, J. L., F. Boccard, M. T. Alegre, M. H. Blondelet-Rouault, y M. Guérineau. 1988. Resistance to macrolides, lincosamides and streptogramin type B antibiotics due to a mutation in an rRNA operon of Streptomyces ambofaciens.EMBO J. 7:277-282.

23S

2058 A a G Ery-R Saccharomyces cerevisiae mit. Sor, F., y H. Fukuhara. 1982. Identification of two erythromycin resistance mutations in the mitochondrial gene coding for the large ribosomal RNA in yeast. Nucleic Acids Res. 10:65716577.

23S

2058 A a G Ery-R Treponema pallidum Stamm, L. V., y H. L. Bergen. 2000. A point mutation associated with bacterial macrolide resistance is present in both 23S rRNA genes of an erythromycin-resistant Treponema pallidum clinical isolate [carta]. Antimicrob Agents Chemother. 44:806-807.

23S

2059 "A a G" Resistencia a claritomicina. Helecobacter pylori Versalovic, J., Shortridge, D., Kibler, K., Griffy, M.V., Beyer, J., Flamm, R.K., Tanaka, S.K., Graham, D.Y., y Go, M.F. (1996) Antimicrob. Agents and Chemother. 40, 477-480.

23S

2059 "A a G" Resistencia a lincomicina. Cloroplastos de tabaco Cseplö, A., Etzold, T., Schell, J., y Schreier, P.H. (1988) Mol. Genet. 214, 295-299.

23S

2059 "A a C" Resistencia conferida a los fármacos MLS y cloranfenicol. E. coli Hansen LH, Mauvais P, Douthwaite S. 1999. The macrolidekelotide antibiotic binding site is formed by structures in domains II and V of 23S ribosomal RNA. Molecular Microbiology 31 (2): 623-631.

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

2059 "A a G" Como A2059C E. coli Hansen LH, Mauvais P, Douthwaite S. 1999. The macrolidekelotide antibiotic binding site is formed by structures in domains II and V of 23S ribosomal RNA. Molecular Microbiology 31 (2): 623-631.

23S

2059 "A a U" Como A2059C E. coli Hansen LH, Mauvais P, Douthwaite S. 1999. The macrolidekelotide antibiotic binding site is formed by structures in domains II and V of 23S ribosomal RNA. Molecular Microbiology 31 (2): 623-631.

23S

2059 A a C Mac-R, Lin-R, SB-S Helicobacter pylori Wang, G., y D. E. Taylor. 1998. Site-specific mutations in the 23S rRNA gene of Helicobacter pylori confer two types of resistance to macrolide-lincosamide-streptogramin B antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 42:1952-1958.

23S

2059 A a C Clr-R Helicobacter pylori Debets-Ossenkopp, Y. J., A. B. Brinkman, E. J. Kuipers, C. M. Vandenbroucke-Grauls, y J. G. Kusters. 1998. Explaining the bias in the 23S rRNA gene mutations associated with clarithromycin resistance in clinical isolates of Helicobacter pylori. Antimi

23S

2059 A a G Clr-R Helicobacter pylori Versalovic, J., D. Shortridge, K. Kibler, M. V. Griffy, J. Beyer, R. K. Flamm, S. K. Tanaka, D. Y. Graham, y M. F. Go. 1996. Mutations in 23S rRNA are associated with clarithromycin resistance in Helicobacter pylori. Antimicrob. Agents Chemother. 40:4

23S

2059 A a G Mac-R, Lin-R Helicobacter pylori Occhialini, A., M. Urdaci, F. Doucet-Populaire, C. M. Bébéar, H. Lamouliatte, y F. Mégraud. 1997. Macrolide resistance in Helicobacter pylori: rapid detection of point mutations and assays of macrolide binding to ribosomes. Antimicrob. Agents Chemothe

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

2059 A a G Mac-R, Lin-R, SB-S Helicobacter pylori Wang, G., y D. E. Taylor. 1998. Site-specific mutations in the 23S rRNA gene of Helicobacter pylori confer two types of resistance to macrolide-lincosamide-streptogramin B antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 42:1952-1958.

23S

2059 A a G Cla-R Helicobacter pylori Debets-Ossenkopp, Y. J., A. B. Brinkman, E. J. Kuipers, C. M. Vandenbroucke-Grauls, y J. G. Kusters. 1998. Explaining the bias in the 23S rRNA gene mutations associated with clarithromycin resistance in clinical isolates of Helicobacter pylori. Antimi

23S

2059 A a C/G Clr-R Mycobacterium abscessus Wallace, R. J., Jr., A. Meier, B. A. Brown, Y. Zhang, P. Sander, G. O. Onyi, y E. C. Böttger. 1996. Genetic basis for clarithromycin resistance among isolates of Mycobacterium chelonae y Mycobacterium abscessus. Antimicrob. Agents Chemother. 40:1676

23S

2059 A a G Clr-R Mycobacterium chelonae Wallace, R. J., Jr., A. Meier, B. A. Brown, Y. Zhang, P. Sander, G. O. Onyi, y E. C. Böttger. 1996. Genetic basis for clarithromycin resistance among isolates of Mycobacterium chelonae y Mycobacterium abscessus. Antimicrob. Agents Chemother. 40:1676

23S

2059 A a C Clr/Azm-R Mycobacterium intracellulare Meier, A., P. Kirschner, B. Springer, V. A. Steingrube, B. A. Brown, R. J. Wallace, Jr., y E. C. Böttger. 1994. Identification of mutations in 23S rRNA gene of clarithromycin- resistant Mycobacterium intracellulare. Antimicrob. Agents Chemother. 38:38

23S

2059 A a C Clr/Azm-R Mycobacterium avium Meier, A., P. Kirschner, B. Springer, V. A. Steingrube, B. A. Brown, R. J. Wallace, Jr., y E. C. Böttger. 1994. Identification of mutations in 23S rRNA gene of clarithromycin- resistant Mycobacterium intracellulare. Antimicrob. Agents Chemother. 38:38

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

2059 A a G Clr-R Mycobacterium smegmatis Sander, P., T. Prammananan, A. Meier, K. Frischkorn, y E. C. Böttger. 1997. The role of ribosomal RNAs in macrolide resistance. Mol. Microbiol. 26:469-480.

23S

2059 A a G Ery-MR, Spi-HR, Tyl-LR, Lin-MR Mycoplasma pneumoniae Lucier, T. S., K. Heitzman, S. K. Liu, y P. C. Hu. 1995. Transition mutations in the 23S rRNA of erythromycin-resistant isolates of Mycoplasma pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. 39:2770-2773.

23S

2059 A a G Mac-R Streptococcus pneumoniae Tait-Kamradt, A., T. Davies, M. Cronan, M. R. Jacobs, P. C. Appelbaum, y J. Sutcliffe. 2000. Mutations in 23S rRNA and L4 ribosomal protein account for resistance in Pneumococcal strains selected in vitro by macrolide passage. Antimicrobial Agents and

23S

2059 A a G Mac-HR, Lin-LR Propionibacteria Ross, J. I., E. A. Eady, J. H. Cove, C. E. Jones, A. H. Ratyal, Y. W. Miller, S. Vyakrnam, y W. J. Cunliffe. 1997. Clinical resistance to erythromycin y clindamycin in cutaneous propionibacteria isolated from acne patients is associated with mutatio

23S

2060 "A a C" imagen81 E. coli Vester, B. y Garrett, R.A. (1988) EMBO J. 7, 3577-3587.

23S

2061 "G a A" Resistencia a cloranfenicol Mitocondrias de rata Vester, B. y Garrett, R.A. (1988) EMBO J. 7, 3577-3587.

23S

2062 "A a C" Resistencia a cloranfenicol. Halobacterium halobium Mankin, A.S. y Garrett, R.A. (1991) J. Bacteriol. 173, 35593563. i

23S

2251 "G a A" Letal dominante; Suprimida tanto la unión de ARNt como la actividad peptidil transferasa. E. coli Green, R., Samaha, R., y Noller, H. (1997).J. Mol. Biol. 266, 4050.

23S

2251 "G a A" Letal dominante; defecto de asociación de subunidades. E. coli Gregory, S.T. y Dahlberg, A.E. (no publicado).

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

2251 "G a C" Letal dominante; defecto de asociación de subunidades. E. coli Gregory, S.T. y Dahlberg, A.E. (no publicado).

23S

2251 "G a U" Letal dominante; defecto de asociación de subunidades. E. coli Gregory, S.T. y Dahlberg, A.E. (no publicado).

23S

2251 "G a U" Letal dominante; Suprimida tanto la unión de ARNt como la actividad peptidil transferasa. E. coli Green, R., Samaha, R., y Noller, H. (1997). J. Mol. Biol. 266, 40-50.

23S

2251 "G a A" Letal dominante; altera la actividad peptidil transferasa; induce reactividad DMS; induce reactividad quetoxal en G2238, G2409, G2410, G2529, y G2532; aumenta la reactividad CMCT en G2238; induce reactividad quetoxal y CMCT en G2269 y G2271; induce reactividad CMCT en U2272 y U2408; aumenta la reactividad quetoxal en G2253. E. coli Gregory ST, Dahlberg AE, 1999. Mutations, in the Conserved P Loop Perturb the Conformation of Two Structural Elements in the Peptidyl Transferase Center of 23 S Ribosomal RNA. J. Mol. Biol. 285: 1475-1483.

23S

2252 "G a A" Menos de 5% del nivel control de actividad peptidil transferasa. E. coli Porse, B.T., Thi-Ngoc, H.P., y Garrett, R.A. (1996) J. Mol. Biol. 264: 472-486.

23S

2252 "G a C" Menos de 5% del nivel control de actividad peptidil transferasa. E. coli Porse, B.T., Thi-Ngoc, H.P., y Garrett, R.A. (1996) J. Mol. Biol. 264: 472-486.

23S

2252 "G a U" Menos de 5% del nivel control de actividad peptidil transferasa. E. coli Porse, B.T., Thi-Ngoc, H.P., y Garrett, R.A. (1996) J. Mol. Biol. 264: 472-486.

23S

2252 "G a C" Velocidad reducida de formación de enlaces por la peptidil transferasa in vitro; perjucio grave para el crecimiento celular. Doble mutación (G2252C/G2253C). E. coli 1. Lieberman, K.R. y Dahlberg, A.E. (1994) J. Biol. Chem. 269, 16163-16169. 2. Samaha, R.R., Green R., y Noller, H.F. (1995) Nature 377, 309-314. 3.O'Connor, M., Brunelli, C.A., Firpo, M.A., Gregory, S.T., Lieberman, K.R., Lodmell, J.S., Moine, H., Van Ryk, D.I., y Dahlberg, A.E. (1995) Cell Biol. 73, 859-868.

23S

2252 "G a A" Perjuicio grave para el crecimiento celular; estimulación de desplazamiento de marco y E. coli 1. Gregory, S.T., Lieberman, K.R., y Dahlberg, A.E. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 279-284. 2. Lieberman, K.R. y Dahlberg,

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

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imagen87 imagen88 lectura de codones sin sentido. imagen89 A.E. (1994) J. Biol. Chem. 269, 16163-16169.

23S

2252 "G a C" Perjuicio grave para el crecimiento celular; estimulación de desplazamiento de marco y lectura de codones sin sentido. E. coli 1. Gregory, S.T., Lieberman, K.R., y Dahlberg, A.E. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 279-284. 2. Lieberman, K.R. y Dahlberg, A.E. (1994) J. Biol. Chem. 269, 16163-16169.

23S

2252 "G a U" Perjuicio grave para el crecimiento celular; estimulación de desplazamiento de marco y lectura de codones sin sentido. E. coli 1. Gregory, S.T., Lieberman, K.R., y Dahlberg, A.E. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 279-284. 2. Lieberman, K.R. y Dahlberg, A.E. (1994) J. Biol. Chem. 269, 16163-16169.

23S

2252 "G a A" Letal dominante; altera la actividad peptidil transferasa; induce reactividad DMS; induce reactividad quetoxal en G2238, G2409, G2410, G2529, y G2532; aumenta la reactividad CMCT en G2238; induce reactividad quetoxal y CMCT en G2269 y G2271; induce reactividad CMCT en U2272 y U2408; aumenta reactividad quetoxal en G2253. E. coli Gregory ST, Dahlberg AE, 1999. Mutations in the Conserved P Loop Perturb the Conformation of Two Structural Elements in the Peptidyl Transferase Center of 23 S Ribosomal RNA. J. Mol. Biol. 285: 1475-1483.

23S

2252 "G a A" Interfiere con la acumulación de peptidil-ARNt en el sitio P de la subunidad 50S. E. coli Bocchetta M, Xiong L, Mankin AS. 1998. 23S rRNA positions essential for tRNA binding in ribosomal functional sites. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 3525-3530.

23S

2252 "G a C" Interfiere con la unión de peptidil-ARNt en el sitio P de la subunidad 50S E. coli Bocchetta M, Xiong L, Mankin AS. 1998. 23S rRNA positions essential for tRNA binding in ribosomal functional sites. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 3525-3530.

23S

2252 "G a U" Interfiere con la unión de peptidil-ARNt en el sitio P de la subunidad 50S E. coli Bocchetta M, Xiong L, Mankin AS. 1998. 23S rRNA positions essential for tRNA binding in ribosomal functional sites. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 3525-3530.

23S

2252 "G a U" Letal dominante; suprimida la formación de AcPhe-Phe; suprimida la formación de enlaces peptídicos. c E. coli Nitta I, Ueda T, Watanabe K. 1998. Possible involvement of Escherichia coli 23S ribosomal RNA in peptide bond formation. RNA 4: 257-267.

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

2253 "G a C" 42% del nivel control de actividad peptidil transferasa. E. coli Porse, B.T., Thi-Ngoc, H.P., y Garrett, R.A. (1996) J. Mol. Biol. 264: 472-486.

23S

2253 "G a C" Velocidad de crecimiento lenta. E. coli Gregory, S.T., Lieberman, K.R., y Dahlberg, A.E. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 279-284.

23S

2253 "G a C" Estimulación de desplazamiento de marco y lectura de codones sin sentido. E. coli 1. Lieberman, K.R. y Dahlberg, A.E. (1994) J. Biol. Chem. 269, 16163-16169. 2. Samaha, R.R., Green R., y Noller, H.F. (1995) Nature 377, 309-314. 3.O'Connor, M., Brunelli, C.A., Firpo, M.A., Gregory, S.T., Lieberman, K.R., Lodmell, J.S., Moine, H., Van Ryk, D.I., y Dahlberg, A.E. (1995) Cell Biol. 73, 859-868.

23S

2253 "G a A" Estimulación de desplazamiento de marco y lectura de codones sin sentido. E. coli 1. Lieberman, K.R. y Dahlberg, A.E. (1994) J. Biol. Chem. 269, 16163-16169. 2. Samaha, R.R., Green R., y Noller, H.F. (1995) Nature 377, 309-314. 3.O'Connor, M., Brunelli, C.A., Firpo, M.A., Gregory, S.T., Lieberman, K.R., Lodmell, J.S., Moine, H., Van Ryk, D.I., y Dahlberg, A.E. (1995) Cell Biol. 73, 859-868.

23S

2253 "G a U" Estimulación de desplazamiento de marco y lectura de codones sin sentido. E. coli 1. Lieberman, K.R. y Dahlberg, A.E. (1994) J. Biol. Chem. 269, 16163-16169. 2. Samaha, R.R., Green R., y Noller, H.F. (1995) Nature 377, 309-314. 3.O'Connor, M., Brunelli, C.A., Firpo, M.A., Gregory, S.T., Lieberman, K.R., Lodmell, J.S., Moine, H., Van Ryk, D.I., y Dahlberg, A.E. (1995) Cell Biol. 73, 859-868.

23S

2253 "G a A" 19% del nivel control de actividad peptidil transferasa. E. coli Porse, B.T., Thi-Ngoc, H.P., y Garrett, R.A. (1996) J. Mol. Biol. 264: 472-486.

23S

2253 "G a C" Perjuicio grave para el crecimiento celular; velocidad reducida de la formación de enlaces peptídicos in vitro. Dobles mutaciones (C2253C/2252C). E. coli 1. Lieberman, K.R. y Dahlberg, A.E. (1994) J. Biol. Chem. 269, 16163-16169. 2. Samaha, R.R., Green R., y Noller, H.F. (1995) Nature 377, 309-314. 3.O'Connor, M., Brunelli, C.A., Firpo, M.A., Gregory, S.T., Lieberman, K.R., Lodmell, J.S., Moine, H., Van Ryk, D.I., y Dahlberg, A.E. (1995) Cell Biol. 73, 859-868.

23S

2253 "G a U" Menos de 5% del nivel control de actividad peptidil transferasa. E. coli Porse, B.T., Thi-Ngoc, H.P., y Garrett, R.A. (1996) J. Mol. Biol. 264: 472-486.

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

2253 "G a A" Reactividad DMS inducida; reactividad CMCT aumentada en G2238; reactividad quetoxal y CMCT inducida en G2269 y G2271; reactividad CMCT inducida en U2272; reactividad quetoxal inducida en G2409 y G2410. E. coli Gregory ST, Dahlberg AE, 1999. Mutations in the Conserved P Loop Perturb the Conformation of Two Structural Elements in the Peptidyl Transferase Center of 23 S Ribosomal RNA. J. Mol. Biol. 285: 1475- 1483.

23S

2253 "G a C" Reactividad DMS inducida; reactividad CMCT aumentada en G2238; reactividad quetoxal y CMCT inducida en G2269 y G2271; reactividad CMCT inducida en U2272; reactividad quetoxal inducida en G2409 y G2410. E. coli Gregory ST, Dahlberg AE, 1999. Mutations in the Conserved P Loop Perturb the Conformation of Two Structural Elements in the Peptidyl Transferase Center of 23 S Ribosomal RNA. J. Mol. Biol. 285: 1475- 1483.

23S

2438 "U a A" Resistencia a amicetina y velocidad de crecimiento reducida. Halobacterium halobium Leviev, I.G., Rodriguez-Fonseca, C., Phan, H., Garrett, R.A., Heliek, G., Noller, H.F., y Mankin, A.S (1994) EMBO J. 13, 1682-1686.

23S

2438 "U a C" Resistencia a amicetina. Halobacterium halobium Leviev, I.G., Rodriguez-Fonseca, C., Phan, H., Garrett, R.A., Heliek, G., Noller, H.F., y Mankin, A.S (1994) EMBO J. 13, 1682-1686.

23S

2438 "U a G" Inestable en presencia o ausencia de amicetina Halobacterium halobium Leviev, I.G., Rodriguez-Fonseca, C., Phan, H., Garrett, R.A., Heliek, G., Noller, H.F., y Mankin, A.S (1994) EMBO J. 13, 11682-1686.

23S

2447 "G a A" Resistencia a cloranfenicol. Mitocondrias de levadura Dujon, B. (1980) Cell 20, 185-197.

23S

2447 "G a C" Resistencia a anisomicina. Halobacterium halobium Hummel, H. y Bock, A. (1987) Biochimie 69, 857-861.

23S

2450 "A a C" Letal. E. coli Vester, B. y Garrett, R.A. (1988) EMBO J. 7, 3577-3587.

23S

2451 "A a U" Resistencia a cloranfenicol. Mitocondrias de ratón Kearsey, S.E. y Craig, I.W. (1981) Nature (Londres) 290: 607608.

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Tipo de ARN

Posición Alteración/ Alteraciones Fenotipo Organismo Referencia

23S

2492 "U a C" Supresores de desplazamiento de marco. E. coli O'Connor, M. y Dahlberg, A.E. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 2701-2705.

23S

2493 "del U" (Con A2058G y eritromicina) Efectos letales en el crecimiento. Supresores de desplazamiento de marco. E. coli O'Connor, M. y Dahlberg, A.E. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 2701-2705.

23S

2493 "U a A" (Con A2058G y eritromicina) Efectos letales en el crecimiento. Supresores de desplazamiento de marco E. coli 1. Porse, B.T. y Garrett, R.A. (1995) J. Mol. Biol. 249, 1-10. 2. O'Connor, M., Brunelli, C.A., Firpo, M.A., Gregory, S.T., Lieberman, K.R., Lodmell, J.S., Moine, H., Van Ryk, D.I., y Dahlberg, A.E. (1995) Biochem. Cell Biology 73, 859-868.

23S

2493 "U a C" (Con A2058G y eritromicina) Efectos letales en el crecimiento. Supresores de desplazamiento de marco E. coli 1. Porse, B.T. y Garrett, R.A. (1995) J. Mol. Biol. 249, 1-10. 2. O'Connor, M., Brunelli, C.A., Firpo, M.A., Gregory, S.T., Lieberman, K.R., Lodmell, J.S., Moine, H., Van Ryk, D.I., y Dahlberg, A.E. (1995) Biochem. Cell Biology 73, 859-868. 13.O'Connor, M. y Dahlberg, A.E. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 2701-2705

23S

2493 "U a C" (Con A2058G y eritromicina) Efectos letales en el crecimiento. Supresores de desplazamiento de marco E. coli O'Connor, M. y Dahlberg, A.E. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 2701-2705

23S

2493 "U a G" (Con A2058G y eritromicina) Efectos letales en el crecimiento. Supresores de desplazamiento de marco E. coli O'Connor, M. y Dahlberg, A.E. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 2701-2705

23S

2493 "U a A" (Con A2058G y eritromicina) Efectos letales en el crecimiento. Supresores de desplazamiento de marco E. coli O'Connor, M. y Dahlberg, A.E. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 2701-2705

23S

2493 "U a C" Lectura errónea incrementada. Doble mutación (U2493C/G2458A) E. coli O'Connor, M. y Dahlberg, A.E. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 2701-2705

23S

2493 "U a C" Lectura errónea incrementada. Doble mutación "(U2493C/G2458C) E. coli O'Connor, M. y Dahlberg, A.E. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 2701-2705

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Tabla 4

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Resistencia

Patógeno Etest Recomendado Mecanismo Efecto de resistencia en fluorescencia % de Cambio en Fluorescencia

VRSA

SA Resistente a vancomicina Staphylococcus aureus Vancomicina; Teicoplanina Características fenotípicas modificadas, sin embargo, incluyen velocidades de crecimiento lentas, una pared celular engrosada, y niveles incrementados de PBP2 y PBP2' (aunque el grado de entrecruzamiento con la pared celular gruesa parece estar reducido) [58]. Las cepas resistentes a Vancomicina también parecen tener una mayor capacidad para absorber el antibiótico desde el medio exterior, lo que puede ser una consecuencia de la mayor disponibilidad de péptidos madre en la pared celular gruesa. Además, las cantidades incrementadas de dos PBPs pueden competir con el antibiótico para los sustratos peptídicos madre, agravando así el perfil de resistencia Unión incrementada de Vancomicina imagen129

VRS

Staph Resistente a vancomicina Staphylococci (CNS) Vancomicina Unión incrementada de Vancomicina >50% >50%

VISA

SA Intermedia para Vancomicina Staphylococcus aureus Vancomicina imagen130 Unión incrementada de Vancomicina 20 50% 20 - 50%

hVISA

hetero-(resistentes) Vancomicina Staphylococcus aureus Vancomicina muy raros, pero pueden ser susceptibles a meticilina y resistentes a vancomicina Unión de penicilina y vancomicina imagen131

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imagen133 imagen134 imagen135 imagen136 imagen137 imagen138

VRE

Resistente a Vancomicina Enterococci Vancomicina; Teicoplanina Afinidad reducida para Van por 3 órdenes de magnitud Reducción de la unión de vancomicina >80% de reducción

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Claims (12)

1. imagen1

   REIVINDICACIONES

   imagen2

   1. Método para la detección de una resistencia a antibióticos en un microorganismo particular en una muestra biológica, que comprende las etapas:

   (a)

   proporcionar un antibiótico marcado,

   (b)

   poner en contacto el antibiótico marcado con una muestra biológica que comprende el microorganismo en condiciones que permitan la unión del antibiótico marcado a su sitio de unión en el microorganismo,

   (c)

   detectar el antibiótico marcado en el microorganismo e identificar este microorganismo en la misma muestra biológica, y

   (d)

   determinar si la cantidad de marcador detectable está alterada respecto a la cantidad de marcador detectable en el microorganismo particular en su forma no resistente,

   en el que los microorganismos en los que la cantidad de marcador detectable está alterada respecto a la cantidad de marcador detectable en el microorganismo particular en su forma no resistente son microorganismos resistentes frente al antibiótico.

2. 2.

   El método según la reivindicación 1, en el que el antibiótico se selecciona del grupo que consiste en aminoglicósidos, carbacefemos, carbapenemos, cefalosporinas, glicopéptidos, macrólidos, monobactamas, antibióticos beta-lactama, quinolonas, bacitracina, sulfonamidas, tetraciclinas, estreptograminas, cloranfenicol, clindamicina, y lincosamida.

3. 3.

   El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el antibiótico se marca con un grupo marcador luminiscente, en particular con un grupo marcador fluorescente.

4. 4.

   El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sitio de unión está localizado en el lumen celular, en el citoplasma, en la pared celular, o/y en una proteína secretada.

5. 5.

   El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el antibiótico es un antibiótico betalactama, que se une preferiblemente a la proteína de unión PBP2 y no a PBP2a.

6. 6.

   El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el marcador en la etapa (c) se detecta mediante microscopía de epifluorescencia, citometría de flujo, dispositivos de escaneo por láser, fluorometría de tiempo resuelto, detección por luminiscencia, detección por isótopos, escáner de visualización hiper espectral, Resonancia de Plasmón Superficial o/y otra tecnología de lectura basada en evanescencia.

7. 7.

   El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el microorganismo particular se identifica con un ácido nucleico marcado capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico en el microorganismo en condiciones in-situ.

8. 8.

   Método según la reivindicación 7, en el que el microorganismo particular se identifica por FISH.

9. 9.

   El método según la reivindicación 7 u 8, en el que el microorganismo se detecta mediante microscopía de epifluorescencia, citometría de flujo, dispositivos de escaneo por láser, fluorometría de tiempo resuelto, detección por luminiscencia, detección por isótopos, escáner de visualización hiper espectral, Resonancia de Plasmón Superficial o/y otra tecnología de lectura basada en evanescencia.

10. 10.

    El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en bacterias, levaduras y hongos, en particular de bacterias Gram positivas y Gram negativas.

11. 11.

    El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el microorganismo es una bacteria Gram positiva que se perfora por la formulación Tampón de Perforación de Gram Positivas en la Tabla 2, o en el que el microorganismo es una levadura u hongo, que se perfora por la formulación Tampón de Perforación de Levaduras en la Tabla 2.

12. 12.

    El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es un método de diagnóstico.

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