CN115505517A - 细菌耐药性mic值检测专用微流控芯片、制备及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细菌耐药性MIC值检测专用微流控芯片、制备及其应用，涉及微流控技术、微生物耐药性检测等领域，所述微流控芯片包括中心注菌孔、分离注菌孔、反应室。注菌孔连接四个独立的反应室，可同时支持4组独立实验，大大提高了检测效率；反应室四周分布三个独立注药通道，可在几小时之内获得单一药物MIC值检测或多种药物配方MIC值检测；结合显微镜成像系统记录细菌生长情况，从而快速获得药物对细菌的抑制特征曲线得出MIC值，为临床给药配方及剂量方案提供参考。本发明具有高通量、高精度、高效率、低成本、低消耗等优点，适合广泛应用于细菌耐药快速检测、耐药机制探究、耐药细菌流行传播防控等领域。

Description

细菌耐药性MIC值检测专用微流控芯片、制备及其应用
技术领域
本发明涉及微流控技术、微生物耐药性检测等领域，尤其涉及一种细菌耐药性MIC值检测专用微流控芯片、制备及其应用。
背景技术
自抗生素发明以来，种类多样的抗生素不断涌入市场，因抗生素滥用导致细菌突变成“超级细菌”的现象越来越凸显，已经成为国内外面临的重大公共卫生问题之一。为抑制“超级细菌”的传播，新型抗菌药物不断诞生，通过对细菌耐药性的检测、监测、评价，在众多抗菌药物中筛选出最佳治疗方案无疑是医务工作者面临的重要问题，也是抑制细菌再次变异的重要途径。但药物筛查及其最小抑菌浓度（MIC）检测费时费力，占用大量医疗资源的同时也存在延误病情的风险，给疾病治疗和防控带来了巨大困扰。
传统的药敏试验，如肉汤稀释法和琼脂稀释法可测定MIC值，但费时费力；自动化检测系统，如梅里埃VITEK 2全自动细菌鉴定及药敏分析系统是目前医院最常用的检测方法，它是将菌落种进孔板检测卡中，孵育到较高浓度，通过培养液的浑浊度进行检测，往往耗费数天时间。
所以，如何高效、快速地进行药物筛查和其MIC值检测是在众多抗菌药物中筛选出最佳治疗方案的迫切需求。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的一在于提供一种细菌耐药性MIC值检测专用微流控芯片，目的二在于提供所述微流控芯片的制备方法，目的三在于提供所述微流控芯片在细菌耐药性MIC值检测中的应用，目的四在于提供利用所述微流控芯片进行细菌耐药性MIC值检测的方法。利用所述微流控芯片不但可实现单一药物的MIC值或多种药物复合配方的MIC值检测，且可一次性完成4组独立实验。本发明实现了高通量、高精度、低成本、低消耗的细菌耐药性MIC值检测。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
第一方面，一种细菌耐药性MIC值检测专用微流控芯片，包括中心注菌孔、分离注菌孔和反应室；所述中心注菌孔位于芯片中心，在所述中心注菌孔上设有开关；所述微流控芯片整体呈中心对称结构，从中心注菌孔向四周通过放射状的注菌通道连接至少4个反应室各个反应室之间相互独立；
所述分离注菌孔位于中心注菌孔与反应室的连接通道中间；
每个反应室四周分布三个独立的注药通道，所述注药通道连接设有注药孔；所述注药通道与反应室之间由梯形微结构阵列隔开，所述梯形阵列既可阻挡菌样外漏、又不防碍药物向反应室渗透。
作为对上述微流控芯片的进一步优化，该微流控芯片为高分子材料与玻璃键合构建的复合式微流控芯片。
更优选地，所述高分子材料选用透光率高、生物相容性好、成本低的聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）或聚碳酸脂（polycarbonate，PC）作为基材。
第二方面，所述微流控芯片选用PDMS-玻璃作为基材，采用等离子键合制得，制备过程包括如下步骤：
（1）用SU-8光刻法刻蚀微流控芯片模具；
（2）配制聚二甲基硅氧烷混合溶液：将聚二甲基硅氧烷与固化剂以10：1的质量比例混合，通过搅拌使其充分混合，置于真空干燥箱中通过抽真空除去混合溶液中的气泡；
（3）将聚二甲基硅氧烷混合溶液倒在准备好的模具上，再次置于真空干燥箱中抽出气泡后放入60℃干燥箱中至少4h使其完全固化，固化后取出后打孔，形成PDMS微结构层，备用；
（4）芯片键合：将固化后的准备好的PDMS微结构层与玻璃片分别置于等离子清洗仪中，起辉后处理20s，处理后1分钟内将PDMS微结构层与玻璃片迅速贴合，并置于60℃干燥箱中加热10分钟使键合更充分，制得微流控芯片。
进一步地，所述微流控芯片选用PC-玻璃作为基材，采用真空-热压法键合封片制得，制备过程包括如下步骤：
（1）选用满足耐药性检测芯片实验需求的耐低温、高温的无色透明PC；
（2）用精雕机加工微流控芯片微结构，用0.2mm超细微粒钩钢铣刀雕刻而成。
第三方面，本发明还提供所述微流控芯片在细菌耐药性MIC值检测方面的应用。
第四方面，本发明另外还提供一种利用上述微流控芯片检测细菌耐药性MIC值的方法，包括如下步骤：
步骤一、将待测菌液与低温琼脂糖原液混匀，制成细菌-低温琼脂糖混合液，在低温环境下用移液枪将混合液从中心注菌孔注入微流控芯片，直至充满反应室；将微流控芯片放入37℃孵育箱中15min使低温琼脂糖固化；
步骤二、根据药物数目选择反应室和注药通道，然后将药物注入到反应室的注药通道内；注入药物后静置30min至反应室中药物浓度梯度达稳定；
步骤三、每5min显微镜拍摄一次，追踪记录各反应室细菌生长状况，连续记录2h；绘制各反应室中细菌的时间-位置-数量生长曲线，通过扩散浓度分布公式得到MIC值。
进一步地，步骤一中，若需注入不同菌样，将中心注菌孔关闭，启用分离注菌孔对每个反应室单独注菌即可。
进一步地，步骤二中，所述根据药物数目选择反应室和注药通道，具体如下：若测定单一药物MIC值时，注入反应室的一侧注药通道，待梯度稳定后记录细菌生长状态，绘制生长曲线，通过扩散浓度分布公式得到MIC值；若测定两种药物配方MIC值时，启用反应室对边的注药通道，待梯度稳定后记录细菌生长状态，绘制生长曲线，通过扩散浓度分布公式得到MIC值；若测定三种药物的MIC值，在各反应室的三个独立注药通道中分别注入三种药物，待梯度稳定后记录细菌生长状态，绘制生长曲线，通过扩散浓度分布公式得到MIC值。
进一步地，步骤三中，药物分子在低温琼脂糖介质中的扩散满足斐克定律：
Figure 447273DEST_PATH_IMAGE001
，其中，JA为A、B组成的混合物中组分A通过垂直于浓度梯度方向的单位截面扩散的物质量，DAB为扩散系数，CA为浓度，x为扩散距离；扩散系数DAB受介质的空隙率ε和曲折因数τ的影响，对扩散系数DAB进行修正，修正后的扩散浓度分布公式：
Figure 66473DEST_PATH_IMAGE002
。
相比于现有技术，本发明具有以下优点：
1、本发明微流控芯片设计4个独立的反应室可同时支持4组独立实验，每个反应室四周有三个独立注药通道可进行多种药物配方MIC值检测，具有高通量、低消耗等优点。
2、本发明微流控芯片与显微镜配合使用，可实现微生物的原位培养、实时观察，获得细菌对相应药物的耐药特性仅需2h，大大提高了检测效率。
3、本发明微流控芯片采用无色透明高分子材料和玻璃作为基材，成本低，结构简单，制备方便，可重复使用，适用于商业推广。
4、本发明提供的微流控芯片可以在短时间内测定细菌耐药性MIC值，可解决目前临床耐药检测周期长、自动化程度低、易受人为因素干扰等问题，适合广泛应用于临床实验室细菌耐药快速检测、耐药机制探究、耐药细菌流行传播防控等领域。
附图说明
图1是本发明微流控芯片结构示意图；图中：1、中心注菌孔；2、分离注菌孔；3、反应室；
图2是本发明微流控芯片的反应室结构示意图；图中：4注药孔；5、注药通道；6、梯形微结构阵列；
图3是三种药物配方浓度梯度扩散示意图。
具体实施方式
本发明提供一种细菌耐药性MIC值检测专用微流控芯片，所述芯片包括中心注菌孔、分离注菌孔、反应室；
所述中心注菌孔位于芯片中心，可根据需要打开或关闭。微流控芯片整体呈中心对称结构，从中心注菌孔向四周通过放射状通道连接4个反应室，中心注菌孔可将菌样一次性注入4个反应室；
所述分离注菌孔位于中心注菌孔与反应室的连接通道中间，若需注入不同菌样，则可关闭中心注菌孔，启用分离注菌孔，此时可支持4种菌样的独立实验；
所述反应室与中心注菌孔呈放射状连接，各个反应室独立。
进一步地，每个反应室四周分布三个独立通道，用于注药。注药通道与反应室之间由梯形微结构阵列隔开，梯形阵列既可阻挡菌样外漏，又不防碍药物向反应室渗透。
作为对上述微流控芯片的进一步优化，该微流控芯片选用高分子材料与玻璃键合，构建复合式微流控芯片。
优选地，高分子材料选用透光率高、生物相容性好、成本低的聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）或聚碳酸脂（polycarbonate，PC）作为基材。
所述微流控芯片选用PDMS-玻璃作为基材，采用等离子键合制得，制备过程包括如下步骤：
（1）用SU-8光刻法刻蚀出该微流控芯片模具；
（2）配制聚二甲基硅氧烷混合溶液：将聚二甲基硅氧烷与固化剂以10：1的质量比例混合，通过搅拌使其充分混合，置于真空干燥箱中通过抽真空除去混合溶液中的气泡；
（3）将聚二甲基硅氧烷混合溶液倒在准备好的模具上，再次置于真空干燥箱中抽出气泡后放入60℃干燥箱中至少4h使其完全固化，固化后取出后打孔，形成PDMS微结构层，备用；
（4）芯片键合：将固化后的准备好的PDMS微结构层与玻璃片分别置于等离子清洗仪中，起辉后处理20s，处理后1分钟内将PDMS微结构层与玻璃片迅速贴合，并置于60℃干燥箱中加热10分钟，使键合更充分。
进一步地，所述微流控芯片选用PC-玻璃作为基材，采用真空, 热压法健合封片制得，制备过程包括如下步骤：
（1）选用满足耐药性检测芯片的实验需求的耐低温、高温的无色透明PC；
（2）用精雕机加工微流控芯片微结构，用0.2mm超细微粒钩钢铣刀雕刻而成。
本发明还提供利用上述微流控芯片快速检测细菌耐药性MIC值的药物扩散浓度分布公式，所述微流控芯片的药物浓度梯度采用药物分子在多孔介质中的扩散性实现。
优选地，多孔介质选用低温琼脂糖（CAS：9000-70-8），该种低温琼脂糖低温（2-8℃）液态储存，37℃交联固化形成多孔三维结构，透光率高、生物相容性好，可用于细菌和细胞培养，且价格低廉；
进一步地，药物分子在多孔介质中的扩散，与孔道大小、形态以及流体的压强有关，由于药物分子远远小于低温琼脂糖孔隙，所以药物分子扩散满足斐克定律：
Figure 113932DEST_PATH_IMAGE003
JA为A、B组成的混合物中组分A通过垂直于浓度梯度方向的单位截面扩散的物质量，DAB为扩散系数，CA为浓度，x为扩散距离；
进一步地，由于是多孔结构，介质的空隙率ε和曲折因数τ也会影响扩散系数，由扫描电子显微镜（SEM）测得多孔介质的空隙率和曲折因数，通过荧光分子扩散实验对扩散系数进行修正。方法如下：
将低温琼脂糖配制成6mg / ml，低温（4℃）注入芯片反应室，放入37℃培养箱中使其固化，之后在反应室一侧通道注入Dapivirine（分子量：329.40）荧光分子溶液，置于荧光显微镜下追踪观察荧光分子在低温琼脂糖介质中的扩散状态，待其稳定后拍照，通过荧光强度分布修正扩散系数，得到修正后的扩散浓度分布公式：
Figure 109570DEST_PATH_IMAGE002
本发明另外还提供一种利用上述专用微流控芯片快速检测细菌耐药性MIC值检测的方法，包括如下步骤：
步骤一、将待测菌液与低温琼脂糖原液以特定比例混匀，制成细菌-低温琼脂糖混合液，用移液枪将混合液从中心注菌孔注入芯片，直至充满反应室；将芯片放入37℃孵育箱中15min使低温琼脂糖固化；
步骤二、在各反应室三个独立注药通道中分别注入三种药物，三种药物通过低温琼脂糖的多孔结构渗透扩散形成配方梯度；注入药物后静置30min至反应室中药物浓度梯度达稳定；
步骤三、之后每5min显微镜拍摄一次，追踪记录各反应室细菌生长状况，连续记录2h；绘制各反应室中细菌的时间-位置-数量生长曲线，通过扩散浓度分布公式得到MIC值。
进一步地，若需注入不同菌样，将中心注菌孔关闭，启用分离注菌孔对每个反应室单独注菌即可。
进一步地，测定单一药物MIC值时注入反应室的一侧注药通道，待梯度稳定后记录细菌生长状态，绘制生长曲线，通过扩散浓度分布公式得到MIC值；测定两种药物配方MIC值时，启用反应室对边的注药通道，待梯度稳定后记录细菌生长状态，绘制生长曲线通过扩散浓度分布公式得到MIC值；反应室的三个注药通道全部启用时可支持三种药物的MIC值测定，三种药物的注入位置可根据需要做相应分配。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1、一种细菌耐药性MIC值检测专用微流控芯片
如图1所示，本发明微流控芯片包括中心注菌孔1、分离注菌孔2、反应室3；
如图1所示，所述中心注菌孔位于芯片中心，可根据需要打开或关闭。微流控芯片整体呈中心对称结构，从中心注菌孔向四周通过放射状通道连接4个反应室，中心注菌孔可将菌样一次性注入4个反应室；
如图1所示，所述分离注菌孔位于中心注菌孔与反应室的连接通道中间，若需注入不同菌样，则可关闭中心注菌孔，启用分离注菌孔，此时可支持4种菌样的独立实验；
如图1所示，所述反应室与中心注菌孔呈放射状连接，各个反应室独立；
如图2所示，每个反应室四周分布三个独立注药通道5，用移液枪从注药孔4将药物注入注药通道。
如图2所示，注药通道与反应室之间由梯形微结构阵列6隔开，梯形微结构阵列既可阻挡菌样外漏，又不防碍药物向反应室渗透。
该微流控芯片选用高分子材料与玻璃构建复合式微流控芯片。高分子材料选用透光率高、生物相容性好、成本低的聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）或者聚碳酸脂（polycarbonate，PC）作为基材。
所述微流控芯片选用PDMS-玻璃作为基材，制备过程包括如下步骤：
（1）用SU-8光刻法刻蚀出该微流控芯片模具；
（2）配制聚二甲基硅氧烷混合溶液：将聚二甲基硅氧烷与固化剂以10：1的质量比例混合，通过搅拌使其充分混合，置于真空干燥箱中通过抽真空除去混合溶液中的气泡；
（3）将聚二甲基硅氧烷混合溶液倒在准备好的模具上，再次置于真空干燥箱中抽出气泡后放入60℃干燥箱中至少4h使其完全固化，固化后取出后打孔，形成PDMS微结构层，备用；
（4）芯片键合：将固化后的准备好的PDMS微结构层与玻璃片分别置于等离子清洗仪中，起辉后处理20s，处理后1分钟内将PDMS微结构层与玻璃片迅速贴合，并置于60℃干燥箱中加热10分钟，使键合更充分。
所述微流控芯片选用PC-玻璃作为基材，采用真空, 热压法健合封片制得，制备过程包括如下步骤：
（1）选用满足耐药性检测芯片的实验需求的耐低温、高温的无色透明PC；
（2）用精雕机加工微流控芯片微结构，用0.2mm超细微粒钩钢铣刀雕刻而成。
实施例2、以大肠杆菌为例，对利用上述专用微流控芯片快速检测药物MIC值的方法进行说明（如图3所示）：
1、首先，制备细菌-低温琼脂糖混合液：如图3（B）所示，将菌液与低温琼脂糖原液以特定比例混匀，制成细菌-低温琼脂糖混合液，用移液枪将混合液从中心注菌孔注入芯片，直至充满反应室；将芯片放入37℃孵育箱中15min使低温琼脂糖固化；
2、其次，注入药物：如图3（B）所示，选用左氧氟沙星、黏菌素、庆大霉素抗菌药，分别配成特定浓度的PBS溶液，分别注入四个反应室的三个独立注药通道，通过溶液在低温琼脂糖的多孔结构渗透扩散形成配方梯度；药物浓度梯度扩散效果如图3（C）所示，注入药物后静置30min至反应室中药物浓度梯度达稳定；
3、之后拍摄：每5min显微镜拍摄一次，追踪记录各反应室细菌生长状况，连续记录2h，绘制各反应室中细菌的时间-位置-数量生长曲线，通过扩散浓度分布公式得到MIC值。
需要指出的是，若需注入不同菌样，将中心注菌孔关闭，启用分离注菌孔对每个反应室单独注菌即可；
若测定两种药物配方MIC值时，启用反应室对边的注药通道，待梯度稳定后记录细菌生长状态，绘制生长曲线，通过扩散浓度分布公式得到MIC值；
若快速检测单一药物MIC值仅启用反应室的单边注药通道，待梯度稳定后记录细菌生长状态，绘制生长曲线，通过扩散浓度分布公式得到MIC值。
需要说明的是，以上所述的实施例应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种细菌耐药性MIC值检测专用微流控芯片，其特征在于：包括中心注菌孔、分离注菌孔和反应室；所述中心注菌孔位于微流控芯片中心，在所述中心注菌孔上设有开关；所述微流控芯片整体呈中心对称结构，从中心注菌孔向四周通过放射状的注菌通道连接至少4个反应室，各个反应室之间相互独立；
所述分离注菌孔位于中心注菌孔与反应室的连接通道中间；
在每个反应室四周分布三个独立的注药通道，所述注药通道连接设有注药孔；所述注药通道与反应室之间由梯形微结构阵列隔开，所述梯形阵列既可阻挡菌样外漏、又不防碍药物向反应室渗透。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片为高分子材料与玻璃键合构建的复合式微流控芯片。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于：所述高分子材料选用透光率高、生物相容性好、成本低的聚二甲基硅氧烷或聚碳酸脂。
4.根据权利要求3所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述微流控芯片选用PDMS-玻璃作为基材，采用等离子键合制得，制备过程包括如下步骤：
（1）用SU-8光刻法刻蚀微流控芯片模具；
（2）配制聚二甲基硅氧烷混合溶液：将聚二甲基硅氧烷与固化剂以10：1的质量比例混合，通过搅拌使其充分混合，置于真空干燥箱中通过抽真空除去混合溶液中的气泡；
（3）将聚二甲基硅氧烷混合溶液倒在准备好的模具上，再次置于真空干燥箱中抽出气泡后放入60℃干燥箱中至少4h使其完全固化，固化后取出后打孔，形成PDMS微结构层，备用；
（4）芯片键合：将固化后的准备好的PDMS微结构层与玻璃片分别置于等离子清洗仪中，起辉后处理20s，处理后1分钟内将PDMS微结构层与玻璃片迅速贴合，并置于60℃干燥箱中加热10分钟使键合更充分，制得微流控芯片。
5.根据权利要求3所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述微流控芯片选用PC作为基材，采用真空-热压法键合封片制得，制备过程包括如下步骤：
（1）选用满足耐药性检测芯片实验需求的耐低温、高温的无色透明PC；
用精雕机加工微流控芯片微结构，用0.2mm超细微粒钩钢铣刀雕刻而成。
6.根据权利要求1-3任意一种所述的微流控芯片在细菌耐药性MIC值检测方面的应用。
7.利用权利要求1-3任意一种所述的微流控芯片检测细菌耐药性MIC值的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一、将待测菌液与低温琼脂糖原液混匀，制成细菌-低温琼脂糖混合液，用移液枪将混合液从中心注菌孔注入微流控芯片，直至充满反应室；将微流控芯片放入37℃孵育箱中15min使低温琼脂糖固化；
步骤二、根据药物数目选择反应室和注药通道，然后将药物注入到反应室的注药通道内；注入药物后静置30min至反应室中药物浓度梯度达稳定；
步骤三、每5min显微镜拍摄一次，追踪记录各反应室细菌生长状况，连续记录2h；绘制各反应室中细菌的时间-位置-数量生长曲线，通过扩散浓度分布公式得到MIC值。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤一中，若需注入不同菌样，将中心注菌孔关闭，启用分离注菌孔对每个反应室单独注菌。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤二中，所述根据药物数目选择反应室和注药通道，具体如下：若测定单一药物MIC值时，注入反应室的一侧注药通道，待梯度稳定后记录细菌生长状态，绘制生长曲线，通过扩散浓度分布公式得到MIC值；若测定两种药物配方MIC值时，启用反应室对边的注药通道，待梯度稳定后记录细菌生长状态，绘制生长曲线，通过扩散浓度分布公式得到MIC值；若测定三种药物的MIC值，在各反应室的三个独立注药通道中分别注入三种药物，待梯度稳定后记录细菌生长状态，绘制生长曲线，通过扩散浓度分布公式得到MIC值。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤三中，药物分子在低温琼脂糖介质中的扩散满足斐克定律：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
，其中，JA为A、B组成的混合物中组分A通过垂直于浓度梯度方向的单位截面扩散的物质量，DAB为扩散系数，CA为浓度，x为扩散距离；扩散系数DAB受介质的空隙率ε和曲折因数τ的影响，对扩散系数DAB进行修正，修正后的扩散浓度分布公式：
Figure 911404DEST_PATH_IMAGE002
。
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