CN116355734A - 一种低剪切力微流控芯片及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低剪切力微流控芯片,所述微流控芯片的微通道设有至少1个微室,所述微室两侧各设有1个微柱结构;其中,所述微柱结构为倒U型;所述微室分为入口区和培养区;其中,所述入口区为方形,且内部设有十字形遮挡板。本发明通过制备基于涡旋流的低剪切力微流控芯片,用于高效捕获细菌,该芯片采用了独特的微柱结构,实现了更高效的细菌捕获,并最大限度地减少了剪切力对微室中细菌生长的影响。
Description
技术领域
本发明属于微生物培养设备制造技术领域,具体涉及一种低剪切力微流控芯片及其制备方法与应用。
背景技术
抗菌药物在治疗感染性疾病、防治动物疫病以及保障公共卫生安全中发挥着其他药物不可替代的作用。为方便对抗菌药物进行研究,研究者们设计出多种抗菌药物药敏性方法。传统抗菌药物药敏实验主要包括全基因测序、质谱法、PCR、肉汤稀释法、纸片扩散法和E-实验等这些方法一直被广泛使用;但是它们都有各自的不足,比如E-实验、纸片扩散法等需要肉眼观察菌落的形成或者用直尺测量抑菌圈的大小从而判断药物的抑菌效果,难免会造成一定的误差,且这些实验方法涉及繁琐的手工操作,非常耗时,通常在24到48小时之间,同时它们的工作量大,成本高,无论用于理论研究还是临床用药,都是一种无形的浪费。此外,当全基因检测接近检测极限时,继续提高测序深度反而可能会引入低频率的假阳性突变。同时,随着耐药病原体的增多和耐药机制的变异,传统药敏试验逐渐无法满足临床快速诊治的需求。因此,开发微型化,集成化,智能化和在线监测的生物传感器变得更加重要。
近年来,利用微流控芯片对细菌进行培养和药敏试验是当今新兴研究方向。微流控技术已被广泛应用于生物学领域,其具有体积小、自动化、高通量和精确的流体控制等特点。微流体中最常用的材料是聚二甲基硅氧烷(PDMS),其优点是易于微加工和成本低廉,表面具有良好的生物相容性。此外,PDMS还具有高弹性和透气性的特性,这对密封微通道中的细胞长期培养至关重要。与传统的培养皿相比,PDMS芯片能够提供更加可控的微环境,因此在细菌培养方面具有广泛的应用前景。使用PDMS芯片进行实验可以明显地缩短检测时间,并且能够实时地采用显微镜检测药物的抑菌作用。此外,PDMS芯片具有良好的封闭性能,在进行前期的保护工作后,可以避免杂菌污染。细菌培养室连接细菌与相邻的微通道,连续供应营养并去除代谢物,以实现细菌在芯片中的长期动态培养。长期动态培养不仅能够让细菌进入培养室后适应动态的生存条件,更好地模拟体内肠道环境,还可以让更多的药物与细菌接触,从而更真实地反映药物的实际抑菌作用。这些优势推动了各种用于细菌测试的微流控芯片的开发,以完成抗菌药物敏感性试验(AST)和耐药菌株耐药反应的研究。Zhang等利用梯度微流控芯片和MALDI-TOF质谱技术,探究了超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌等耐药细菌在氨苄青霉素和头孢曲松钠作用下成丝状变化的过程。Zhang等开发了一种基于3D打印技术的新型微流控芯片,用于检测大肠杆菌对临床代表性抗生素氨苄西林、氯霉素和卡那霉素的抗敏性,该芯片能够在5小时内快速实现药敏试验,进一步证明了微流控芯片在细菌AST方面的应用前景。然而,这些研究操作均没有进行灌注细菌后的长期动态培养,无法体现出细菌进入培养室后的生存状态。同时,也无法反映出后续细菌与药物作用的真实情况。此外,在长期动态培养过程中,细菌会承受一定的流体剪切力,导致细菌流失或受损。因此,构建低剪切力的细菌培养环境非常重要,而有关研究却鲜有报道。
因此,如何提供一种低剪切力微流控芯片及其制备方法与应用,构建低剪切力的细菌培养环境是亟需解决的一个问题。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种低剪切力微流控芯片及其制备方法与应用,通过制备基于涡旋流的低剪切力微流控芯片,用于高效捕获细菌,该芯片采用了独特的微柱结构,实现了更高效的细菌捕获,并最大限度地减少了剪切力对微室中细菌生长的影响。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种低剪切力微流控芯片,所述微流控芯片的微通道设有至少1个微室,所述微室两侧各设有1个微柱结构;
其中,所述微柱结构为倒U型。
本发明通过采用独特结构的惯性微流控芯片可以有效降低流体/细胞操控对流量的依赖性,优化了微流控装置用于评估绿原酸的抑菌作用。本发明提出了一种基于涡旋流的低剪切力微流控芯片,用于高效捕获细菌,该芯片采用了独特的微柱结构,实现了更高效的细菌捕获,并最大限度地减少了剪切力对微室中细菌生长的影响。同时,通过控制流速,可以对转导GFP的大肠杆菌TAc-IeGFP进行数小时动态培养,同时可以进行绿原酸的抑菌作用研究。
优选的,所述微柱结构的顶部与所述微通道顶部之间的宽度和所述微通道宽度的比为1:10。
优选的,所述微柱结构的顶部与所述微通道顶部之间的宽度和所述微通道宽度的比为20-100μm:200-1000μm。
优选的,所述微柱结构的宽度和所述微通道宽度的比为200μm:500μm。
优选的,所述微柱结构的顶部与所述微通道顶部之间的宽度和所述微通道宽度的比为50μm:500μm。
优选的,所述微室分为入口区和培养区;
其中,所述入口区的入口为方形,且内部设有十字形遮挡板。
优选的,所述十字形遮挡板的宽度小于所述方形各边的宽度。
优选的,所述培养区近圆形的正多边形结构,直径为300-800μm。
优选的,所述微流控芯片设有两个进料口和两个出料口,其中,所述进料口的管道中设有过滤柱。
优选的,所述微柱结构和所述微通道的宽度比为1:10,所述微柱结构之间的距离和所述微通道宽度的比例为1:2。
优选的,所述微柱结构之间的距离为100-500μm。
优选的,所述微流控芯片的厚度为20-200μm。
优选的,还包括细菌导出结构。
上述所述一种低剪切力微流控芯片的制备方法,具体包括以下步骤:
(1)模具加工:取阴性光刻甩涂硅片后,依次进行前烘、曝光、后烘以及显影得到模具,备用;
(2)称取聚二甲基硅氧烷预聚物和固化剂混匀后,放在所述模具上,加热固化;
(3)将固化好的所述模具切割、打孔后,放置在玻璃载玻片上,烘烤即可。
如上述所述的低剪切力微流控芯片在细菌培养中的应用。
如上述所述的低剪切力微流控芯片在抑菌作用实验中的应用。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明提供了一种低剪切力微流控芯片及其制备方法与应用,通过制备基于涡旋流的低剪切力微流控芯片,用于高效捕获细菌,该芯片采用了独特的微柱结构,实现了更高效的细菌捕获,并最大限度地减少了剪切力对微室中细菌生长的影响。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明一种微流控芯片的结构图;
图2为本发明微柱和微室的结构放大图;
图3为本发明微室入口区的放大图;
图4为本发明应用例不同流速下微室的数值模拟图;
图5为本发明应用例在3μL/min流速下培养基或药物的扩散效果模拟示意图;
图6本发明应用例大肠杆菌TAc-IeGFP的生长曲线图;
图7本发明应用例在微流控芯片中培养0h、24h、72h后结果图,其中,A为大肠杆菌TAc-IeGFP的明场图,B为倒置荧光显微镜下的荧光图,C为荧光量化分析图;
图8本发明应用例绿原酸(浓度为3mg/ml)分别在2h、4h、6h、6.5h时对大肠杆菌TAc-IeGFP的抑菌效果图,其中,A为明场图,B为倒置荧光显微镜下的荧光图,C为荧光量化分析图;
图9本发明应用例大肠杆菌TAC-leGF暴露在不同浓度的绿原酸中的生长曲线图;
图10本发明应用例在琼脂板上与不同浓度的绿原酸(1.25~10mg/ml),硫酸卡那霉素和氨苄青霉素培养24h后的大肠杆菌TAc-IeGFP抑菌圈图;
图11本发明实施例2一种微流控芯片的结构图;
其中,1微室、2微柱结构、3进料口、4出料口、5过滤柱、6入口区、7十字形遮挡板,8细菌导出结构。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
一种低剪切力微流控芯片结构,微流控芯片的微通道设有至少1个微室,微室两侧各设有1个微柱结构;
其中,所述微柱结构为倒U型,微柱结构的顶部与微通道顶部之间的宽度和微通道宽度的比为1:10;
微室分为入口区和培养区;其中,所述入口区的入口为方形,且内部设有十字形遮挡板,十字形遮挡板的宽度小于方形各边的宽度,培养区近圆形的正多边形结构;
微流控芯片设有两个进料口和两个出料口,其中,进料口的管道中设有过滤柱。
仪器与试剂
2X2-2型真空泵和DHG型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏试验设备有限公司);SW-CJ-2F型双人双面净化工作台(苏州净化设备有限公司);JA2003型电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司);KW-4型匀胶机(中国科学院微电子中心研究部);
75%乙醇溶液,河北康济药械有限公司;聚二甲基硅氧烷(PDMS,RTV615),美国Momentive公司;三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷,西格玛奥德里奇上海贸易有限公司;琼脂,B.R.级,北京索莱宝生物科技有限公司;胰蛋白胨和酵母提取物,B.R.级,北京奥博星生物技术有限责任公司;绿原酸,(质量分数>98%)购自合肥凯米克生化科技有限公司;
实施例1
如图1和2,一种低剪切力微流控芯片结构,具体结构为:
芯片厚度为25μm,包括的微通道设有一个微室和两个微柱结构,微室入口处设有十字形遮挡柱,微室位于两个微柱结构之间,微通道的宽度是500μm,微柱结构为倒U型,宽度为200μm,微柱结构之间的距离是390μm,微柱结构与微室之间的距离为150μm,微柱结构的顶部与微通道顶部之间的宽度为50μm;
微室分为入口区和培养区,培养区为近圆形的正多边形结构,直径为300μm,微室用于细菌培养,微柱则用于高流速灌注状态下形成涡漩流,保证菌液尽可能进入微室;如图3,入口区为150μm*90μm的长方形,上下口宽度为90μm,长方形内部设有十字形遮挡板,十字形遮挡柱的各边的长度均为30μm;
微流控装置有两个入口和两个出口,分别用于注射原溶液和排出废液等。进料口的管道中设有过滤柱,可以去除一些杂质。
微流控芯片的制作方法具体为以下步骤:
(1)模具加工:硅片清洗后,取15mL阴性光刻胶SU-82025置于硅片正中央,并用旋转涂膜仪甩涂硅片,将甩涂好的硅片分别进行前烘、曝光、后烘以及显影,最后在正置显微镜下进行观察,检查无误后备用;
(2)模子预处理:用TMSCl蒸汽熏模子3min,以利于PDMS聚合物与模子的剥离;
(3)配制PDMS:以一定质量比例,称取聚二甲基硅氧烷预聚物和固化剂,并将其混匀;
(4)脱气和固化:将上述混合均匀的PDMS混合物倾倒至模子上,抽真空脱气并放置在一定温度烘箱中加热固化;
(5)切割、打孔:将固化好的PDMS按设计的芯片结构切割、打孔,清理干净;
(6)PDMS微流控芯片的封接:将准备好的PDMS芯片平整地放置在载玻片PDMS薄膜上,置于烘箱中烘烤,使其牢固键合。
实施例2
如图11,一种低剪切力微流控芯片结构,微通道设有14个微室1和15个微柱结构2,其余参数与结构同实施例1,其中,还包括设置在微室2下方的米字型细菌导出结构6,用来导出细菌样品,做后期的电镜观察。
应用例(采用实施例1微流控芯片结构)
1、大肠杆菌在微流控芯片中的培养
1)菌种活化及培养
使用GFP转导的大肠杆菌TAc-IeGFP进行所有细菌实验,该大肠杆菌可发出绿色荧光可方便在荧光显微镜下观察;
冻存菌种的复苏:将冻存于-80℃冰箱的大肠杆菌TAc-IeGFP从冰箱中取出,放于常温下解冻,取解冻的细菌于制备的液态LB培养基中进行活化,而后均匀地涂布于固体LB培养基上,将所涂布的培养平板置于37℃的恒温培养箱中培养至出现单菌落;后于无菌环境下将平板上的单菌落接种至EP管(含液体LB培养基),并于37℃摇床进行振荡(180r/min)培养至适宜浓度后封管保藏。在灌注细菌之前对大肠杆菌进行培养,然后在无菌环境下取700μL贮存在EP管中的菌液到100mL LB液体培养基中,振荡培养,并测量其在600nm处的吸光度值(设多组重复),后绘制该大肠杆菌的生长曲线,选取培养12h进入稳定期的菌液进行实验;繁殖后的菌液放置时间不得超过一周,因为大肠杆菌此时已进入衰退期,活力下降,不适合进行实验;
2)大肠杆菌在微流控芯片中的培养
在无菌环境下完成对微流控试验平台的组装,用无菌注射器吸取75%酒精后与芯片组装,用酒精对芯片进行简单消毒,冲走杂物;再用超纯水对芯片进行清洗并冲走芯片中的酒精;最后在紫外光下对芯片进行灭菌;
在无菌环境下进行以下操作:吸取一定量的大肠杆菌菌液于10mL无菌注射器中;再取1个2.5mL无菌注射器,同样吸取一定量的大肠杆菌菌液,吸取的大肠杆菌的量能使其在注射泵上保持平衡,将以上两个注射器与已经灭菌的芯片装置相互连接,再将注射器放置在四进口注射泵上完成安装,设置流速将大肠杆菌菌液注入芯片;
具体灌菌步骤是先设置高流速500μL/min灌注10分钟,而后降低流速,使大肠杆菌稳定进入培养室,在灌菌后更换注射器灌注培养基,LB培养基分别吸取到2.5mL、10mL注射器中,将注射器与已灌注大肠杆菌的芯片相联通,设置流速为3μL/min,将芯片包裹好后置于37℃恒温培养箱,对大肠杆菌进行过夜培养;最后在荧光显微镜下观察大肠杆菌的生长情况,在相同照射间隔(通常是15min)与曝光时间(通常是3s)的条件下,拍摄一系列的相同微室的荧光图片,以此来研究细菌菌落生长情况;通过Image-Pro Plus 6.0software(IPP,Media Cyternetics,Lilver Spring,MD)来对图像进行分析。假设细菌总数正比于这个区域的总体荧光强度,将微室图片中的内部所有像素的总和减去背景值作为荧光强度值,通过Origin 2021(OriginLab Corporation,Northampton,MA)进行荧光量化分析,培养一定时间,待大肠杆菌在芯片中完全长开,铺满整个芯片,在荧光显微镜下能观察到稳定的荧光,即培养成功,可进行下一步的试验。
在不同流速条件下,通道内形成的迪恩流场不同,对于溶液的扩散和粒子的捕获会产生差异,本研究选择了两种流速,分别是500μL/min和3μL/min,用于进行灌注实验。其中高流速用于在微柱之间产生涡旋流以实现细菌的捕获,低流速则用于灌注培养基和药物。图4展示了不同流速条件下通道内涡旋流分布的模拟图,用于模拟管道与微室之间的分子扩散情况,500μL/min(左)和3μL/min(右)流速下通道内涡旋流的分布情况(黑色箭头代表捕获室内的细菌运动轨迹;白色箭头代表小培养室内细菌的运动轨迹),在高流速的500μL/min条件下,微柱之间会产生涡旋流,将细菌悬液注入微室时,可以逐步将细菌挤压到微室内,从而在较短的时间内提高细菌的捕获率;而在低流速的3μL/min条件下,不会出现涡旋流,微柱之间以及培养室之间的流速基本为零,这样微室中的细菌不会受到液流剪切力的影响,即不会受到物理伤害。因此,本研究选择在低流速的3μL/min条件下灌注培养基或药物,并模拟它们在微室中的扩散情况,经模拟结果如图5发现,在15s内,液流由主管道进入,65s后主管道开始逐渐充满,255s时,微室中的液流扩散到一半,1000s时液流已充满整个培养室,这表明在低剪切力条件下,培养基和药物能够得到充分灌注,为后续在低剪切力条件下对细菌动态培养的长期监测提供了理论基础和验证策略。此外,降低流速可以延长药物的作用时间,减缓对大肠杆菌的作用速度,以便在更长的时间内观察到更多的细节变化。微柱结构的距离不能无限制的增加,至少物质扩散时间应该少于细菌分裂一代所需的时间,根据小分子(如:氨基酸,蔗糖)的扩散公式:t=L2/D,t为扩散时间,L为扩散的距离,D为扩散常数3-10×10-6cm2/s。因此,在主管道与微室之间,物质交换的时间为200-800s,与模拟图的结果基本一致。
同时,本实验完成单克隆大肠杆菌TAc-IeGFP(E.coli TAc-IeGFP)菌液的制备后,绘制了荧光大肠杆菌的生长曲线,如图6,在0-27h时间内,对菌液光密度进行了记录(四组重复),由图6可知,生长阶段大致分为四个阶段:从开始培养到2h处于潜伏期,生长缓慢;从2h到12h之间,细菌生长处于指数期,细菌浓度呈直线增长的时间约为2小时;而12h到24h,细菌生长处于平衡期,细菌浓度保持在一个稳定的水平;从24h开始,细菌浓度略有下降的趋势,细菌生长进入衰亡期。在可控差异内,四条曲线的趋势及菌液光密度无明显差异。为了减小因菌密度变化导致的荧光强度误差,本实验在灌注时选用12h处于稳定期的菌液,使试验结果更可靠。
近来有研究证实采用60μL/min的流速实现单细胞聚焦,有利于保持细胞的原始形态,本研究参照计算机模拟结果,选择在500μL/min流速下灌注OD600=0.5的菌液,在3μL/min流速下灌注培养基和药物,虽然500μL/min的流速偏高,但整个持续时间较短,可以发现在进口处没有观察到剪切力对细菌造成伤害,菌液和药物也均可以在培养室周围分布均匀。另外,菌液在10分钟可以灌注完成,灌注时间和灌注效果明显优于文献研究结果。由图7中A和B 0h的数据可知,芯片内接种细菌后,菌密度相对较小,在灌注后采用低流速(3μL/min)动态灌注LB液体培养基,以保证在不影响芯片内细菌生长条件和位置的前提下,对细菌进行基本营养物质的补充和代谢废物的排出。动态培养72h时,菌群已充满整个培养室并纵向叠加排布,呈现出较强的荧光信号。这表明该培养芯片可以满足动态培养细菌、筛选药物和高通量富集等实验需求。我们进一步对大肠杆菌在芯片中的繁殖过程进行了荧光量化分析,由图7中C中可以看到,经过长期动态培养后,大肠杆菌长势良好。24h时培养室入口细菌分布最为密集,而动态培养72h后,培养室中间的细菌密度和活性均最高。实验结果进一步证明了本实验构建的低剪切力微流控芯片可以进行细菌的长期动态培养,为后续绿原酸的抑菌试验研究奠定了基础。
2、绿原酸对芯片中培养大肠杆菌的抑菌效果
将经过一段时间培养已经在芯片中稳定生长的大肠杆菌和绿原酸药物准备就绪,分别用2.5mL和10mL的注射器吸取相应体积的绿原酸后与微流控芯片相连;同时,为防止光照对绿原酸的影响,在注射器的外部包裹一层锡箔纸。将芯片包裹好后放入37℃培养箱内,设置灌注绿原酸(浓度为3mg/ml)的流速为3μL/min,进行大肠杆菌的抑菌实验。并每间隔一定时间在显微镜下观察并做拍照记录。
本实验采用微流控芯片平台,利用荧光强度的变化来评估荧光标记的大肠杆菌的生长状况,并研究3mg/ml质量浓度的绿原酸对其中培养的大肠杆菌的抑菌作用,结果如图8所示,在与绿原酸作用2h左右,处于培养室进口边缘区域的大肠杆菌的绿色荧光强度下降,表明其生长受到抑制;在与绿原酸作用4h时,培养室内的大肠杆菌绿色荧光强度继续下降,说明绿原酸持续抑制其生长;绿原酸作用6h后,培养室内的大肠杆菌荧光已非常微弱,表明其生长已被完全抑制;再经过约30min,培养室内绿色荧光全部消失。最终结果表明,绿原酸在6.5小时左右能够完全抑制大肠杆菌TAc-IeGFP的生长。大肠杆菌的荧光强度的逐步降低,说明绿原酸对其生长具有持续的抑制作用。
3、绿原酸对大肠杆菌最小抑菌浓度的测定
利用肉汤稀释法检测不同浓度绿原酸标准品溶液对大肠杆菌TAc-IeGFP的抑菌效果,本试验检测周期为16h;
具体步骤:(1)培养大肠杆菌TAc-IeGFP(挑单菌落接5ml试管),置于37℃,180r/min培养箱振荡培养4~6h,培养好后分别吸取1ml菌液加入到备好的3个EP管(1.5ml规格)中备用;
(2)配制绿原酸标准品原液(4ml,10mg/ml),微孔膜过滤除菌,然后用液体LB培养基稀释至不同浓度(8.75、7.5、6.25、5、3.75、2.5、1.25mg/ml)的溶液;
(3)取150μl做96孔板抑菌实验,每个孔加OD600=0.5~0.6的菌液(3μl,按2%的接种量),每个梯度均做3组重复;
(4)将96孔板封好放在37℃培养箱避光培养,间隔一定时间使用酶标仪测量其在波长600nm的吸光度值(OD600),所获得的数据绘制大肠杆菌TAc-IeGFP的生长曲线从而确定绿原酸溶液的最小抑菌浓度(当OD600的值为0.1时,细菌悬液的浓度视为1×108CFU·mL-1),结果见图9。
4、不同浓度绿原酸溶液对大肠杆菌的抑菌效果
采用纸片扩散法做琼脂平板上的抑菌圈实验,用记号笔和直尺在琼脂平板培养皿的背面划分三个区间,分别标记实验组(1.25~10mg/ml的绿原酸溶液)、阳性对照组(50mg/ml硫酸卡那霉素溶液)和阴性对照组(50mg/ml氨苄青霉素溶液),用打孔器将滤纸片裁剪为直径0.7mm的小圆片,将灭过菌的滤纸圆片放置在涂布有实验菌液的LB琼脂平板表面,将滤纸片分别置于划分好的三个区域,随后对应在每个滤纸片上滴加5μl的实验组以及对照组的药品,将琼脂平板用透气性封口膜封好后于37℃恒温培养箱倒置培养24h后观察抑菌圈,结果见图10。
作为对照实验,采用传统的肉汤稀释法和纸片扩散法来检测不同浓度绿原酸对大肠杆菌的抑菌效果。利用肉汤稀释法可以大致确定绿原酸的最小抑菌浓度(MIC),依次将不同浓度的绿原酸溶液以及培养至稳定期的菌液加入96孔板,紧接着放入37℃恒温培养箱静态培养,间隔2h通过酶标仪测其600nm处的吸光度值来定量细菌种群,使用前在培养管中生长时,OD600=0.5(经多次独立重复试验发现在2h时600nm处的吸光度值变化不显著,而在4h时测得的吸光度值变化显著,因此选择培养4h后的OD值)。实验结果表明,绿原酸在一定浓度下能够显著抑制大肠杆菌TAc-IeGFP的生长,且抑制作用会随绿原酸浓度的增加而增强,绿原酸在该稀释梯度下的MIC大致在2.5~3.75mg/ml之间,如图9,与报道文献中的结果一致。但该方法与微流控芯片法相比,需要在标准的96孔板中使用繁琐的稀释步骤,且非常耗时。
用纸片扩散法研究不同浓度绿原酸标准品溶液对大肠杆菌的抑菌效果发现,质量浓度为1.25~10mg/ml绿原酸溶液均未表现出抑菌效果如图10。因此,采用微流控芯片研究绿原酸的抑菌效果具有更高的灵敏度和更短的实验时间。Jain等人也得出了类似的实验结果,研究表明在不同的药敏性实验方法下结果存在差异,这进一步表明纸片扩散法用于药敏性检测时评价结果的不准确性。宏观和微观形态学观察存在差异,因此,运用微流控技术进行药敏性检测具有独特的优势。
综上,本发明结构的低剪切力微流控芯片,能够在高流速下产生涡旋流,对大肠杆菌进行高效捕获和培养。当液流处于低流速时,其低剪切力不会对微室中捕获的细菌产生扰动,因此适合长期动态培养及给药观察。利用流动的液体培养基对大肠杆菌进行培养,更好地模拟了大肠杆菌在体内的生长环境,使实验结果更具真实性。在荧光显微镜下通过微流控芯片观察不同时间段内大肠杆菌的整体数量和荧光强度的变化,从微观角度出发,可以更加直观和具体地分析药物的抑菌作用。此外,我们还通过传统抑菌方法研究了绿原酸对大肠杆菌TAc-IeGFP的抑菌作用。相较于传统实验,利用微流控芯片研究药物的抑菌作用有更多的好处。首先,它提高了结果的准确性并缩短了检测时间,可以在约6.5小时内完成药敏性检测。此外,传统抑菌实验耗费人力和材料,造成资源浪费。因此,利用微流控芯片进行抑菌试验具有极好的发展前景。
各个实施例采用递进的方式描述,每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处,各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种低剪切力微流控芯片,其特征在于,所述微流控芯片的微通道设有至少1个微室,所述微室两侧各设有1个微柱结构;
其中,所述微柱结构为倒U型。
2.根据权利要求1所述的一种低剪切力微流控芯片,其特征在于,所述微柱结构的顶部与所述微通道顶部之间的宽度和所述微通道宽度的比为1:10。
3.根据权利要求1所述的一种低剪切力微流控芯片,其特征在于,所述微室分为入口区和培养区;
其中,所述入口区为方形,且内部设有十字形遮挡板。
4.根据权利要求3所述的一种低剪切力微流控芯片,其特征在于,所述十字形遮挡板的宽度小于所述方形各边的宽度。
5.根据权利要求1所述的一种低剪切力微流控芯片,其特征在于,所述培养区近圆形的正多边形结构。
6.根据权利要求1所述的一种低剪切力微流控芯片,其特征在于,所述微流控芯片设有两个进料口和两个出料口,其中,所述进料口的管道中设有过滤柱。
7.根据权利要求1所述的一种低剪切力微流控芯片,其特征在于,所述微柱结构之间的距离和所述微通道宽度的比例为1:2。
8.如权利要求1-7任一项所述一种低剪切力微流控芯片的制备方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
(1)模具加工:取阴性光刻甩涂硅片后,依次进行前烘、曝光、后烘以及显影得到模具,备用;
(2)称取聚二甲基硅氧烷预聚物和固化剂混匀后,放在所述模具上,加热固化;
(3)将固化好的所述模具切割、打孔后,放置在玻璃载玻片上,烘烤即可。
9.如权利要求1-7任一项所述的低剪切力微流控芯片在细菌培养中的应用。
10.如权利要求1-7任一项所述的低剪切力微流控芯片在抑菌作用实验中的应用。
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