CN112063510A - 一种高通量细胞培养芯片的结构及其制作与使用方法 - Google Patents

一种高通量细胞培养芯片的结构及其制作与使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种高通量细胞培养芯片的结构及其制作与使用方法，包括培养层芯片和进样层芯片；培养层芯片包括若干主通道结构和与主通道结构对应连通的多个分支结构；每个分支结构包括培养层连接区；进样层芯片包括：多个通道结构；每个通道结构均包括：多个进样层连接区；每个进样层连接区均与分支结构上的一培养层连接区连通。本发明提供的高通量细胞培养芯片的结构，通过将培养层芯片中的培养层连接区与进样层芯片中的进样层连接区连通，通过不同功能流道的分层连接结构，大幅简化了针对不同环境培养的细胞样品进样流程，使多种标记的细胞能够直接通过进样层芯片被装载入不同培养环境的培养层芯片，实现高通量的定量研究细胞在不同环境下的检测。

Description

一种高通量细胞培养芯片的结构及其制作与使用方法
技术领域
本发明涉及微加工技术与细胞生物学领域，尤其涉及一种高通量细胞培养芯片的结构及其制作与使用方法。
背景技术
细胞在生长过程中，需要对外界环境的改变做出响应。针对不同的外界环境，细胞需要选择不同的策略来适应。在细胞因子，外界环境压力，物理压力等作用下，细胞会通过相关基因的转录翻译，实现细胞的增殖，分化，迁移等过程。
在酵母中，外界环境的变化是由转录因子的核定位动力学编码的。转录因子是一种特殊的蛋白质，它与RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)聚合酶形成转录起始复合体，共同参与转录起始的过程。当酵母收到外界环境胁迫时，相应的转录因子会转移到核内或从核中转移，从而启动下游基因的表达，达到适应环境的目的。因此，这些转录因子的运动被视为细胞对环境转变的内部表示。转录因子的易位是动态和随机的，其响应的整个时间序列中包含了丰富的可用信息。因此，为了研究细胞信号的编码、传递的动态过程以及细胞内的调控机制，需要获取高时空分辨率的细胞活动时序数据。
研究蛋白动力学的方法主要包括：流式细胞仪，定量PCR(Polymerase ChainReaction，聚合酶链式反应)等传统生物学方法，虽然通量很高，但是时空分辨率低，并且只能在群体水平进行检测。由于细胞对外界环境的响应非常迅速，并且不同细胞之间存在很大的异质性，所以高时空分辨率及单细胞水平的分析是必要的。
微流控技术是近几年飞速发展的前沿学科，凭借高通量、高时空分辨和单细胞水平的实时观测等优点，现已成为细胞动力学分析领域中一个强有力的研究手段。虽然实验目的不同，高通量细胞培养芯片的结构的设计细节千差万别，但是它们都是在二维情况下实现的。也就是说，如果需要检测m种蛋白在n种外界环境下的动力学行为，如图1所示，则需要进样m*n次。所以传统的高通量细胞培养芯片的结构操作繁复，很难做到真正的高通量检测(多种刺激环境及多种蛋白)。
发明内容
本发明实施例提供一种高通量细胞培养芯片的结构及其制作与使用方法，用以简化针对不同环境培养的细胞样品进样流程，实现高通量的定量研究细胞在不同环境下的检测。
本发明实施例提供一种高通量细胞培养芯片的结构，包括：
培养层芯片和进样层芯片；
所述培养层芯片包括：若干主通道结构和与所述主通道结构对应连通的多个分支结构；
其中，每个所述分支结构包括：培养层连接区；所述进样层芯片包括：多个通道结构；每个所述通道结构均包括：多个进样层连接区；每个所述进样层连接区均与所述分支结构上的一所述培养层连接区连通。
根据本发明一个实施例的高通量细胞培养芯片的结构，所述分支结构还包括：培养层观察区和培养层主通道区；
每个所述主通道结构均通过与其对应的多个所述分支结构中的所述培养层观察区和所述培养层主通道区与所述培养层连接区连通。
根据本发明一个实施例的高通量细胞培养芯片的结构，所述分支结构还包括：培养层栅栏区；所述主通道结构通过所述培养层栅栏区与所述培养层观察区连通。
根据本发明一个实施例的高通量细胞培养芯片的结构，所述培养层观察区的高度为3-5um，所述培养层连接区的高度为40-100um，所述培养层主通道区的高度为10-30um，所述培养层栅栏区的高度为1-2.5um。
根据本发明一个实施例的高通量细胞培养芯片的结构，所述主通道结构上设有培养液入口。
根据本发明一个实施例的高通量细胞培养芯片的结构，所述通道结构还包括：进样层主通道区；
每个所述进样层主通道区均与多个所述进样层连接区连通，所述进样层主通道区通过所述进样层连接区与所述分支结构上的一所述培养层连接区连通。
根据本发明一个实施例的高通量细胞培养芯片的结构，所述进样层主通道区上设有进样入口和废液出口；所述进样层主通道区的高度为20-60um，所述进样层连接区的高度为60-150um。
根据本发明一个实施例的高通量细胞培养芯片的结构，所述培养层芯片和所述进样层芯片的材料为聚二甲基硅氧烷。
本发明实施例还提供一种高通量细胞培养芯片的结构的制作方法，包括：
分别制备培养层芯片和进样层芯片的模具；
将制备材料涂布在模具上并进行固化处理；
将模具上培养层芯片的培养层连接区与进样层芯片的进样层连接区进行对位。
本发明实施例还提供一种的高通量细胞培养芯片的结构的使用方法，包括：
将不同细胞溶液通过进样层芯片中不同的通道结构导入；
将不同细胞溶液通过与其对应的进样层连接区和培养层连接区进入培养层芯片的不同分支结构中；
在培养层芯片的各主通道结构中加入不同培养液，并对不同分支结构中的细胞溶液进行检测。
本发明提供的高通量细胞培养芯片的结构及其制作与使用方法，通过将培养层芯片中的培养层连接区与进样层芯片中的进样层连接区连通，通过不同功能流道的分层连接结构，大幅简化了针对不同环境培养的细胞样品进样流程，使多种标记的细胞能够直接通过进样层芯片被装载入不同培养环境的培养层芯片，实现高通量的定量研究细胞在不同环境下的检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是现有技术中高通量细胞培养芯片的结构的概念示意图；
图2是本发明实施例提供的高通量细胞培养芯片的结构的概念示意图；
图3是本发明实施例提供的高通量细胞培养芯片的结构的结构示意图；
图4是本发明实施例提供的高通量细胞培养芯片的结构的制作方法的流程示意图；
图5是本发明实施例提供的高通量细胞培养芯片的结构的制作方法的示意图；
图6是本发明实施例提供的高通量细胞培养芯片的结构的使用方法的流程示意图；
图7是本发明实施例提供的高通量细胞培养芯片的结构的实物图；
图8是本发明实施例提供的高通量细胞培养芯片的结构注射入不同颜色的墨水时的示意图；
图9是本发明实施例提供的高通量细胞培养芯片的结构装载入不同酵母细胞时的荧光图；
图10是本发明实施例提供的高通量细胞培养芯片的结构在初始状态下酵母细胞的相差图及荧光图；
图11是本发明实施例提供的高通量细胞培养芯片的结构在3小时时对应的酵母细胞的相差图及荧光图；
附图标记：
1、培养层芯片；2、进样层芯片；11、主通道结构；12、分支结构；13、培养液入口；21、通道结构；120、培养层连接区；121、培养层观察区；122、培养层主通道区；123、培养层栅栏区；210、进样层连接区；211、进样层主通道区；212、进样入口。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合图3描述本发明实施例提供的高通量细胞培养芯片的结构，该高通量细胞培养芯片的结构为双层芯片，包括：培养层芯片1和进样层芯片2。培养层芯片1包括：若干主通道结构11和与主通道结构11对应的多个分支结构12。每个主通道结构11均与其对应的多个分支结构12连通。
本实施例中，分支结构12包括：培养层连接区120。进样层芯片2包括：多个通道结构21；每个通道结构21均包括：多个进样层连接区210。每个进样层连接区210均与分支结构12上的一培养层连接区120连通。本实施例中，进样层连接区210与培养层连接区120一一对应，且相互连通。
其中，主通道结构11上设有培养液入口13。培养层连接区120的高度为40-100um，一般为70um。对应地，进样层连接区210的高度为60-150um，可根据实验需求调整。
在一个具体的实施例中，如图2所示，需要检测m种蛋白在n种外界环境下的动力学行为。先将m种蛋白的细胞溶液通过进样层芯片中不同的通道结构21导入。将m种蛋白的细胞溶液通过与其对应的进样层连接区210和培养层连接区120进入培养层芯片1的n个分支结构12中。再将培养层芯片1中加入n种培养液，并对n个分支结构12中的细胞溶液进行检测。与传统单层芯片进相比，该高通量细胞培养芯片的结构只需要进样m次，大大简化了操作流程。
需要说明的是，在本实施例中，该高通量细胞培养芯片的结构用于定量蛋白动力学研究的高通量高通量细胞培养芯片的结构，其可以同时对4-24种蛋白在2-8种不同的培养环境中进行观测。
本发明实施例提供的高通量细胞培养芯片的结构，通过将培养层芯片中的培养层连接区与进样层芯片中的进样层连接区连通，通过不同功能流道的分层连接结构，大幅简化了针对不同环境培养的细胞样品进样流程，使多种标记的细胞能够直接通过进样层芯片被装载入不同培养环境的培养层芯片，实现高通量的定量研究细胞在不同环境下的检测。
基于上述实施例，如图3所示，分支结构12还包括：培养层观察区121和培养层主通道区122。每个主通道结构11均通过与其对应的多个分支结构12中的培养层观察区121和培养层主通道区122与培养层连接区120连通。
其中，培养层观察区121的高度为3-5um，一般为4um，主要用于酵母细胞群落单层生长。培养层主通道区122的高度为10-30um，一般为20um，主要用于提供培养液供给，并冲走多余的细胞，防止通道堵塞。
为了阻挡酵母细胞(4um)在不同同样通道之间的交叉污染。分支结构12设有培养层栅栏区123。培养层栅栏区123的高度为1-2.5um，一般为2um。主通道结构11通过培养层栅栏区123与培养层观察区121连通。
本实施例中，通道结构21还包括：进样层主通道区211。每个进样层主通道区211均与多个进样层连接区210连通，进样层主通道区211通过进样层连接区210与分支结构12上的一培养层连接区120连通，则在进样层主通道区211中的进样，可通过进样层连接区210进入培养层芯片中。
其中，进样层主通道区211的高度为20-60um。培养层芯片1和进样层芯片2的材料为聚二甲基硅氧烷，即芯片加工材料为PDMS(polydimethylsiloxane)。
本实施例中，为便于溶液的进出，进样层主通道区211上设有进样入口212，实验过程中进样入口212也可作为废液出口。
本发明还提供一种高通量细胞培养芯片的结构的制作方法，如图4所示，该制作方法主要包括如下步骤：
步骤S1：分别制备培养层芯片和进样层芯片的模具。
步骤S2：将制备材料涂布在模具上并进行固化处理。
步骤S3：将模具上培养层芯片的培养层连接区与进样层芯片的进样层连接区进行对位。
进行固化和对位处理后，还可对高通量细胞培养芯片的结构进行表面等离子体处理，并与玻璃进行封装。且为了能够顺利地将细胞装载入而不会在培养层观察区产生气泡，还可对高通量细胞培养芯片的结构进行改性，将其置于真空泵中抽真空10min以上。
在一个具体的实施例中，如图5所示，制作高通量细胞培养芯片的结构的步骤如下：
(1)模具的制备。用L-Edit绘图，将其打印在塑料胶片或光学掩膜上，作为曝光掩模，用于后续实验。总共需要两块硅片模具，一块用于制作培养层芯片，一块用于制作进样层芯片。两块模具制备过程基本一致，只是掩膜有差异，使用SU8光刻胶，匀胶时以500rpm的转速预甩10s，再根据不同高度要求设置不同转速甩60s。在95度电热板上烘30min后，放入曝光机进行曝光，曝光时间需要参照曝光机的帮助文档以及实际光强来确定。之后再在95度电热板上烘30min，显影就可以得到模具。
(2)芯片的制作。细胞进样层及培养层都是通过PDMS注模得到的，进样层芯片需要A胶(单体)与B胶(交联剂)的配比为15:1，混合均匀，抽真空去除气泡后，通过匀胶机(1500rpm，60s)将PDMS旋涂在模具上，可以得到厚度小于70um的PDMS薄膜。培养层芯片需要需要A胶(单体)与B胶(交联剂)7:1混合，真空去除气泡后，厚度在3mm以上。固化时先将两块模具放入70度烘箱中烘45min，之后取出两层芯片，此时PDMS已经初步固化。利用显微镜通过连通阵列处进行对位，放入烘箱中烘过夜，PDMS会继续固化，两层芯片会牢固的粘在一起。
(3)芯片改性。在装载细胞前，首先需要进行15min的抽真空处理，从而能够顺利地将细胞装载入而不会在观察区产生气泡。需要注意的是真空处理后，芯片内部会慢慢和外界气压平衡，所以进样操作需要在真空处理后30分钟内完成。
本发明提供的高通量细胞培养芯片的结构的制作方法，通过将培养层芯片中的培养层连接区与进样层芯片中的进样层连接区连通，通过不同功能流道的分层连接结构，大幅简化了针对不同环境培养的细胞样品进样流程，使多种标记的细胞能够直接通过进样层芯片被装载入不同培养环境的培养层芯片，实现高通量的定量研究细胞在不同环境下的检测。
本发明还提供一种高通量细胞培养芯片的结构的使用方法，如图6所示，该方法主要包括如下步骤：
步骤S1：将不同细胞溶液通过进样层芯片中不同的通道结构导入。
步骤S2：将不同细胞溶液通过与其对应的进样层连接区和培养层连接区进入培养层芯片的不同分支结构中。
步骤S3：在培养层芯片的各主通道结构中加入不同培养液，并对不同分支结构中的细胞溶液进行检测。
以需要检测m种蛋白在n种外界环境为例。如图2所示，先将m种蛋白的细胞溶液通过进样层芯片中不同的通道结构21导入。将m种蛋白的细胞溶液通过与其对应的进样层连接区210和培养层连接区120进入培养层芯片1的n个分支结构12中。再将培养层芯片1中加入n种培养液，并对n个分支结构12中的细胞溶液进行检测。
在一个具体的实施例中，通过该高通量细胞培养芯片的结构实现转录因子Msn2在外界不同的营养缺陷条件(低葡萄糖浓度)下的动力学研究。主要包括如下步骤：
(1)细胞装载。为使细胞能大概率进入观察腔室，首先对细胞进行离心浓缩，细胞的浓度大约控制在OD＝0.8-1.2，也可根据实际情况进行调整。利用移液枪吸取10μl细胞悬液插入进菌口，然后通过注射器提供压力，使细胞在外加压强下进入进样层芯片，然后通过进样层连接区和培养层连接区流入培养层芯片，并被装载在培养层观察区。
(2)培养液准备。使用1ml注射器吸取酵母正常培养基(2％葡萄糖)及不同浓度低糖培养基(0.5％，0.2％，0.1％，0.05％，0.02％)。用手轻弹注射器管壁去除管内气泡，连接软管备用。
(3)实验装置搭建。待细胞全部装载在培养层观察区后，将吸取正常培养基以及不同葡萄糖浓度营养缺陷培养基的注射器插入培养液入口，并架设在兰格注射泵上。通过编写matlab流量控制程序，设置注射时间，流速等参数，自动控制外界环境切换。
(4)数据拍摄及处理。利用Ti-E显微镜进行延时拍摄，得到的实验图像如图7、图8、图9、图10和图11所示。图7是本发明实施例提供的高通量细胞培养芯片的结构的实物图；图8是本发明实施例提供的高通量细胞培养芯片的结构注射入不同颜色的墨水时的示意图。不难发现在注入不同颜色的墨水后，在二维相交点不互相干扰。图9是本发明实施例提供的高通量细胞培养芯片的结构装载入不同酵母细胞时的荧光图，说明不同的细菌被布置在不同的区域之间不会发生污染。
可以看到细胞可以在观察区正常生长并且转录因子在低糖下会出现定位变化。图10是本发明实施例提供的高通量细胞培养芯片的结构在初始状态下(0时刻，2％葡萄糖环境)酵母细胞的相差图及荧光图。图11是本发明实施例提供的高通量细胞培养芯片的结构在一段时间后(3小时，0.02％葡萄糖限制环境)酵母细胞的相差图及荧光图。最后利用cellseg程序通过相差图识别细胞边界，并对细胞进行时序追踪得到单细胞轨迹。
本发明提供的高通量细胞培养芯片的结构的使用方法，由于采用了高通量细胞培养芯片的结构，通过将培养层芯片中的培养层连接区与进样层芯片中的进样层连接区连通，通过不同功能流道的分层连接结构，大幅简化了针对不同环境培养的细胞样品进样流程，使多种标记的细胞能够直接通过进样层芯片被装载入不同培养环境的培养层芯片，实现高通量的定量研究细胞在不同环境下的检测。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种高通量细胞培养芯片的结构，其特征在于，包括：
培养层芯片和进样层芯片；
所述培养层芯片包括：若干主通道结构和与所述主通道结构对应连通的多个分支结构；
其中，每个所述分支结构包括：培养层连接区；所述进样层芯片包括：多个通道结构；每个所述通道结构均包括：多个进样层连接区；每个所述进样层连接区均与所述分支结构上的一所述培养层连接区连通。
2.根据权利要求1所述的高通量细胞培养芯片的结构，其特征在于，所述分支结构还包括：培养层观察区和培养层主通道区；
每个所述主通道结构均通过与其对应的多个所述分支结构中的所述培养层观察区和所述培养层主通道区与所述培养层连接区连通。
3.根据权利要求2所述的高通量细胞培养芯片的结构，其特征在于，所述分支结构还包括：培养层栅栏区；所述主通道结构通过所述培养层栅栏区与所述培养层观察区连通。
4.根据权利要求3所述的高通量细胞培养芯片的结构，其特征在于，所述培养层观察区的高度为3-5um，所述培养层连接区的高度为40-100um，所述培养层主通道区的高度为10-30um，所述培养层栅栏区的高度为1-2.5um。
5.根据权利要求1所述的高通量细胞培养芯片的结构，其特征在于，所述主通道结构上设有培养液入口。
6.根据权利要求1所述的高通量细胞培养芯片的结构，其特征在于，所述通道结构还包括：进样层主通道区；
每个所述进样层主通道区均与多个所述进样层连接区连通，所述进样层主通道区通过所述进样层连接区与所述分支结构上的一所述培养层连接区连通。
7.根据权利要求6所述的高通量细胞培养芯片的结构，其特征在于，所述进样层主通道区上设有进样入口和废液出口；所述进样层主通道区的高度为20-60um，所述进样层连接区的高度为60-150um。
8.一种如权利要求1-7中任一项所述的高通量细胞培养芯片的结构的制作方法，其特征在于，包括：
分别制备培养层芯片和进样层芯片的模具；
将制备材料涂布在模具上并进行固化处理；
将模具上培养层芯片的培养层连接区与进样层芯片的进样层连接区进行对位。
9.一种利用如权利要求1-7中任一项所述的高通量细胞培养芯片的结构的使用方法，其特征在于，包括：
将不同细胞溶液通过进样层芯片中不同的通道结构导入；
将不同细胞溶液通过与其对应的进样层连接区和培养层连接区进入培养层芯片的不同分支结构中；
在培养层芯片的各主通道结构中加入不同培养液，并对不同分支结构中的细胞溶液进行检测。
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