CN113862151A - 一种用于细胞共培养的微流控芯片装置及一种细胞共培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于细胞共培养的微流控芯片装置及使用该装置的细胞共培养方法。本发明的装置包括微流控芯片，所述微流控芯片包括细胞培养层和盖板层；所述细胞培养层设置有至少两个细胞培养通道，所述细胞培养通道包括细胞培养腔和分别与所述细胞培养腔相接的试剂注入通道、细胞注入通道和代谢物排出通道；所述细胞注入通道的体积≤所述细胞培养腔体积的20％；所述盖板层盖合于所述细胞培养层之上，与所述细胞培养层共同形成供细胞培养所需的密封环境。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程以及细胞生物学研究领域，具体涉及一种用于细胞共培养的微流控芯片装置及一种细胞共培养方法。
背景技术
细胞培养是生命科学中多种研究的基础实验手段，长期以来为多个领域的生物学研究做出了巨大的贡献。随着研究的深入和拓展，许多研究对细胞的培养也有了越来越多新的要求。因此人们开始探究和发展新的细胞培养技术手段。
20世纪80年代后期，人们在细胞培养技术的基础上发展出了细胞共培养技术(Co-Culture System)。细胞共培养又称为复合培养或混合培养，是指将2种或2种以上细胞放在同一培养系统中培养。
与单层细胞培养技术相比，细胞共培养技术能弥补单层细胞培养的缺陷，有利于构建更接近人体状态的体外生理或病理模型。通过细胞共培养技术建立起来的培养体系就是共培养体系，可以很大程度地模拟体内环境，更好地观察细胞与细胞、细胞与培养环境之间的相互作用，通过检测不同细胞因子之间的关系，探讨药物的作用机制和可能的作用靶点。
细胞共培养技术被广泛应用于现代细胞研究中，主要用于研究诱导干细胞分化、提高代谢物产量、提高细胞生存能力、维持细胞功能和活性、体外组织的构建等。细胞共培养体系主要作用有：诱导细胞向另一种细胞分化、诱导细胞自身分化、维持细胞功能和活力、调控细胞增殖、促进早期胚胎发育和提高代谢产物产量。
按照细胞共培养的方式，细胞共培养可分为两类，直接共培养和间接共培养。直接共培养体系，即将2种或2种以上的细胞同时或分别接种于同一孔中，不同种类的细胞之间直接接触；间接共培养体系，即将2种或2种以上的细胞分别接种于不同的载体上，然后将这两种载体置于同一培养环境之中，使不同种类的细胞共用同一种培养体系而不直接接触。
然而，传统的细胞共培养技术多是基于传统细胞培养技术发展起来的，应用于生物学研究时仍存在一定缺陷：
1、传统的细胞共培养技术多是基于静态细胞培养建立的，故其培养的细胞是处于静态微环境之中的，而多细胞生物体内的细胞则处于由循环系统和多种细胞共同营造的动态微环境中，这种差别可能导致研究结果的不准确。
2、传统的细胞共培养技术无法使细胞进行原位操作。
3、传统的细胞共培养技术难以实现高通量研究。
4、传统的细胞共培养技术的试剂消耗量较大，尤其是对于某些珍贵样品的研究而言，研究者往往无法直接使用现有的细胞共培养技术进行研究。
此外，现有的细胞共培养技术中还存在由于清洗细胞注入通道和培养过程中流体对细胞产生的外力而导致的细胞迁移而产生的污染问题。
因此，开发一种具有微量、高通量、低污染且可使细胞进行原位操作的细胞共培养装置具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于细胞共培养的微流控芯片装置，进而提供一种细胞共培养方法。本发明的细胞共培养微流控芯片装置可以实现不同种类细胞在同一试剂、同一培养环境下的共培养和同一种类细胞在不同试剂、同一培养环境下的共培养，且可以通过控制流体以使细胞进行原位操作，具有低试剂消耗量、高通量、低污染的优点。
为此，本发明第一方面提供了一种用于细胞共培养的微流控芯片装置，其包括微流控芯片，所述微流控芯片包括细胞培养层和盖板层；
所述细胞培养层设置有至少两个细胞培养通道，所述细胞培养通道包括细胞培养腔和分别与所述细胞培养腔相接的试剂注入通道、细胞注入通道和代谢物排出通道；
所述细胞注入通道的体积≤所述细胞培养腔体积的20％；
所述盖板层盖合于所述细胞培养层之上，与所述细胞培养层共同形成供细胞培养所需的密封环境。
在一些实施方式中，所述试剂注入通道、细胞注入通道、代谢物排出通道和细胞培养腔均在所述细胞培养层上以凹槽形式设置。
本发明中，“试剂注入通道”为用于加入除细胞外的其他所需试剂的通道，包括但不限于细胞培养液或试验药物。“细胞注入通道”为用于注入待培养细胞等的通道。“代谢物排出通道”为用于排出细胞培养产生代谢物及废物的通道。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂注入通道和所述代谢物排出通道的近细胞培养室端各设置有两个拦截坝，用以阻挡细胞流至其他通道。
根据本发明，所述拦截坝由微米级的小柱构成，所述小柱之间形成空隙，所述空隙大小小于注入细胞的大小，从而使所述拦截坝可以阻挡细胞流至其他通道，但不影响注入试剂及代谢物的流通。例如，所述拦截坝可以为网状或栅栏状，当为网状时，所述网孔大小小于所述注入细胞的大小；当为栅栏状时，所述栅栏栏杆之间的距离小于所述细胞的直径。在本发明的一些实施方式中，所述网孔直径或所述栅栏栏杆之间的距离＜10μm，优选为8-10μm。
根据本发明的一些实施方式，所述两个拦截坝分为第一拦截坝和第二拦截坝，所述第一拦截坝距离所述细胞培养腔4-6mm，所述第二拦截坝距离所述第一拦截坝4-6mm。在一些实施例中，所述第一拦截坝距离所述细胞培养腔5mm，所述第二拦截坝距离所述第一拦截坝5mm。
根据本发明的一些实施方式，所述拦截坝与所述细胞培养层材质相同。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂注入通道、所述细胞注入通道和所述代谢物排出通道为直线通道。
根据本发明的一些实施方式，所述细胞培养层的各细胞培养通道的试剂注入通道和代谢物排出通道之间平行设置。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂注入通道和所述代谢物排出通道设置于细胞培养腔两侧且在一条直线上。根据本发明的一些实施方式，所述试剂注入通道和所述代谢物排出通道的深度与所述细胞培养腔室的深度相同或所述试剂注入通道和所述代谢物排出通道的深度≤所述细胞培养腔室的深度的1/5。
本发明的所述试剂注入通道、代谢物排出通道和细胞培养腔的设置适于流动培养，易于代谢物的排出收集。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂注入通道的宽度为50-1000μm。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂注入通道的深度为50-1000μm。
根据本发明的一些实施方式，所述代谢物排出通道的宽度为50-1000μm。
根据本发明的一些实施方式，所述代谢物排出通道的深度为50-1000μm。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂注入通道和所述代谢物排出通道的长度相同。
根据本发明的一些实施方式，所述细胞注入通道的宽度为100-1000μm。
根据本发明的一些实施方式，所述细胞注入通道的深度为100-1000μm。
根据本发明的一些实施方式，所述细胞培养腔为半圆孔形。
根据本发明的一些实施方式，所述细胞培养腔直径为500-5000μm。
根据本发明的一些实施方式，所述细胞培养腔的深度为50-1000μm。
根据本发明，本发明的细胞注入通道和细胞培养腔的设置可以满足注入细胞后对细胞注入通道三次以上的清洗，且总溶液不会外溢到培养腔之外的通道，从而可使注入细胞能尽可能进入细胞培养腔室而不对后期实验造成污染。
根据本发明，细胞注入通道的体积不宜过小，否则会造成压力过大，不易注入，经试验，以宽度为100-1000μm，深度为100-1000μm为宜。
根据本发明，通过在药物注入通道和代谢物排出通道设置拦截坝，不但能阻止注入的细胞外溢到其他通道，从而确保注入细胞近100％进入培养腔室，还可以防止在药物培养时因为外力而使细胞迁移至其他通道。
根据本发明，所述细胞注入通道的长度取决于芯片大小和培养腔的体积，以使细胞注入通道的体积不大于所述细胞培养腔室体积的20％为准。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂注入通道末端设置有试剂注入口，所述细胞注入通道末端设置有细胞注入口，所述代谢物排出通道上末端有代谢物排出口；所述末端指各通道的远细胞培养腔端。
所述盖板层上设置有与所述试剂注入口、细胞注入口和代谢物排出口一一对应的外接试剂注入口、外接细胞注入口和外接代谢物排出口，分别用于在盖板层外注入试剂、注入细胞和排出代谢物；
所述细胞培养层和所述盖板层对齐密封。在一些实施方式中，所述细胞培养层和所述盖板层通过紧固夹合密封或键合密封。
根据本发明的一些实施方式，所述细胞培养层和所述盖板层可以直接密封，无需紧固夹合。例如，当细胞培养层为玻璃材质，盖板层为PDMS时可以通过等离子键合实现密封；当细胞培养层和盖板层均为PMMA时，可以直接热键合密封。
根据本发明的一些实施方式，所述盖板层上设置有观察窗，所述观察窗对应于所述细胞培养层的细胞培养腔的位置设置，用以观察细胞培养情况等。
根据本发明的一些实施方式，所述盖板层还包括用于封堵盖板层上所述外接试剂注入口的密封堵头。
根据本发明的一些实施方式，所述细胞培养层和所述盖板层为透明材料，各自独立优选为PMMA、ABS、PVC、玻璃或者其他新型的透明材料。
根据本发明的一些实施方式，所述细胞培养层和所述盖板层材料相同。
根据本发明，本发明中所述注入孔、排出孔为圆孔，优选所述注入孔、排出孔的直径为1000-2000μm。
根据本发明的一些实施方式，所述细胞培养层的厚度为2000-3000μm。
根据本发明的一些实施方式，所述盖板层的厚度为2000-3000μm。
根据本发明的一些实施方式，所述微流控芯片的细胞培养层和所述盖板层之间还设有透气封闭层；所述透气封闭层设置有与所述试剂注入口、细胞注入口和代谢物排出口一一对应的穿孔。可以理解的，所述透气密闭层的孔洞也与盖板层上所述外接试剂注入口、外接细胞注入口和外接代谢物排出口一一对应，以便在盖板层外注入试剂、注入细胞和排出代谢物
根据本发明的一些实施方式，所述透气密闭层和所述细胞培养层紧密夹合。
根据本发明，所述透气密闭层为具有透气功能的有机物薄片，优选为PMMA、PDMS材料或者其他CO2透气材料。
根据本发明的一些实施方式，所述透气密闭层的厚度为500-1000μm。
根据本发明，透气密闭层的厚度设置为500-1000μm，盖板层的厚度为2000-3000μm，盖板层的观察窗口对应细胞培养层的细胞培养腔的位置，可使进行气体交换。
根据本发明的一些实施方式，所述细胞培养层、盖板层和透气密闭层的长度为5-8cm，在一些实施例中为6cm。
根据本发明的一些实施方式，所述细胞培养层、盖板层和透气密闭层的宽度为5-8cm，在一些实施例中为6cm。
根据本发明的一些实施方式，所述微流控芯片还包括将细胞培养层、盖板层和透气密闭层对齐紧密夹合的紧固装置，所述紧固装置包括紧固底座和紧固扣，所述紧固底座和紧固扣通过设置于细胞培养层、盖板层和透气密闭层的穿孔进行夹合。
根据本发明的一些实施方式，所述微流控芯片装置还包括用于注入试剂的微注射泵单元和用于收集代谢液的代谢液收集单元，所述微注射泵单元包括微注射泵，所述微注射泵与所述外接试剂注入口相连，所述代谢液收集单元与所述外接代谢物排出口相连。
本发明第二方面提供了一种细胞共培养方法，其使用本发明第一方面所述的微流控芯片进行细胞共培养。
根据本发明的一些实施方式，所述方法将相同或不同细胞培养液和/或药物通过所述试剂注入通道进入所述细胞培养腔室，使相同或不同种类的细胞通过细胞培养单元的细胞注入通道进入细胞培养腔室进行培养，产生的代谢产物经代谢物排出通道排出。
根据本发明的一些实施方式，所述方法中当需要进行低流速培养时设置透气密闭层来实现细胞培养的气体交换，所述低流速为小于15μL/h。
根据本发明，对于正常流速下新鲜的培养基足够提供细胞培养的气体环境，不需要透气密闭层来实现细胞培养的气体交换。而当在非常低流速下进行细胞培养，流体不能满足细胞培养所需的气体交换，则需要设置透气密闭层来实现气体交换。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1)本发明通过在一个芯片中提供多个细胞培养通道，可以实现不同种类细胞在同一试剂、同一培养环境下的共培养，可用于同一药物对不同种类细胞的代谢研究。
2)本发明通过在一个芯片中提供多个细胞培养通道，可以实现同一种类细胞在不同试剂、同一培养环境下的共培养。可用于不同药物对同一种类细胞的代谢研究。
3)本发明可以通过控制流体以使细胞进行原位操作，具有低试剂消耗量、高通量、低污染的优点。
附图说明
图1为实施例1的细胞共培养微流控芯片示意图。
图2为实施例1的细胞培养层示意图。
图3为实施例1的透气密闭层示意图。
图4为实施例1的盖板层示意图。
图5为实施例2的细胞共培养微流控芯片示意图。
图6为实施例3的细胞共培养微流控芯片装置示意图。
图7为实施例4中细胞共培养实验的倒置荧光显微镜下的细胞形貌图。
附图说明：1、细胞培养层；2、透气密闭层；3、盖板层；11、细胞培养通道1；12、细胞培养通道2；13、细胞培养通道3；14、细胞培养通道4；15、细胞培养通道5；16、细胞培养通道6；
101、试剂注入口；102、细胞注入口；103、细胞培养腔室；104、代谢物排出口；105、拦截坝；111、紧固底座；112、113、114：穿孔；115：紧固扣；201、透气密闭层上与试剂注入口对应的孔洞；202、透气密闭层上与细胞注入口对应的孔洞；203、透气密闭层上与代谢物排出口对应的孔洞；301、硅胶堵头；302、外接试剂注入口；303、外接细胞注入口；304、观察窗；305、外接代谢物排出口。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例仅用于说明本发明，而不应被视作对本发明的范围的限定。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
实施例1
用计算机辅助设计软件设计和绘制细胞培养层、盖板层两层芯片的微结构和微通道图形，利用数控CNC系统加工制备聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片的微结构和微通道。按照设计厚度，利用PDMS制作透气密闭薄片，芯片结构如图1，具体为：细胞培养层和盖板层长度为6cm，宽度为6cm，厚度为2mm；透气密闭层长度为6cm，宽度为6cm，厚度为1mm；细胞注入通道的长度为4mm，宽度1000μm，深度为500μm；试剂注入通道的长度为22mm，宽度为500μm，深度为250μm；代谢物排出通道的长度为22mm，宽度为500μm，深度为250μm；细胞培养腔为半圆孔形，其直径为5mm，深度为500μm；试剂注入口和代谢物排出口的直径为1mm，深度为250μm；细胞注入口的直径为1mm，深度为500μm。
分别用纯净水、乙醇清洗擦拭掉芯片上的指纹、油污等污渍，用紫外光固化胶或PMMA双面胶分别将细胞培养通道层、透气封闭层和盖板层对齐粘合，并用不锈钢螺丝紧固芯片。
细胞共培养步骤
(1)在上述准备好的微流控芯片上进行细胞共培养，首先对芯片进行灭菌处理。用75％乙醇、无菌水分别冲洗细胞注入通道、试剂注入通道和代谢物排出通道，并置于超净台紫外灭菌5分钟。
(2)用含0.1％的多聚赖氨酸的胎牛血清对各个微通道的表面进行修饰，有利于细胞贴壁，孵育10分钟后用无菌水冲洗微通道。
(3)使用移液枪吸取12uL浓度为1.0×104个每毫升的细胞通过细胞注入口注射至细胞注入通道中。细胞注射到微通道的过程中要避免气泡的产生，并将微流控芯片放于细胞培养箱中。
(4)2小时后用显微镜观察细胞状态。待细胞贴壁后，外接细胞注入口处装上硅胶堵头。外接试剂注入口处装上聚四氟乙烯软管，并与微注射泵连接，设定流速为15μL/h。外接代谢物排出口处装上聚四氟乙烯软管并导入代谢收集管中。
实施例2
芯片制作方法同实施例1，区别在于不含透气密闭层，如图5所示。
细胞共培养步骤同实施例1，区别在于流速为60μL/h。
实施例3
微流控芯片装置的搭建
微流控装置的搭建，如图6所示，该装置包括细胞培养单元、微注射泵单元和代谢液收集单元。细胞培养单元包括小型37°恒温箱和实施例1或者实施例2所述的芯片。通过微注射泵对芯片试剂注入口注入试剂溶液，代谢液收集单元从芯片代谢排出口提取。
实施例4
采用实施例1的装置进行活体细胞原位检测
将人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞L-02以104个每毫升种植在同一微流控芯片的不同培养通道中，保持37℃流动培养。将Calcein-AM/PI双重染色试剂通过细胞注入通道注射至细胞培养腔室，孵育15分钟。采用倒置荧光显微镜(日本，Nikon A1R HD25(波长488-561nm)下观察细胞形貌，结果如图7所示。图7中，(a-d)图像为L-02细胞，(e-h)图像为HepG2细胞。(a)和(e)图像为流动培养前活细胞和死细胞图像。(b)和(f)图像为流动培养24小时后，空白组中活细胞和死细胞图像。(c)和(g)图像为流动培养24小时后，低浓度药物刺激下活细胞和死细胞图像。(d)和(h)图像为流动培养24小时后，高浓度药物刺激下活细胞和死细胞图像。通过图像可以观察到L-02和HepG2细胞在微流控芯片上培养时具有很高的生存能力，这表明它们具有在芯片上重建其生长环境的能力。当L-02和HepG2细胞仅在提供培养基(空白组)24小时下，它们保持了生长。但是，在药物刺激下HepG2细胞的存活率下降到80％。增加药物浓度时，HepG2细胞的存活率逐渐降低至60％，远低于L-02细胞的90％。本实例中的细胞存活表现出明显变化，该方法可实现不同种类细胞在同一试剂、同一培养环境下的共培养和同一种类细胞在不同试剂、同一培养环境下的共培养。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (10)
1.一种用于细胞共培养的微流控芯片装置，其包括微流控芯片，所述微流控芯片包括细胞培养层和盖板层；
所述细胞培养层设置有至少两个细胞培养通道，所述细胞培养通道包括细胞培养腔和分别与所述细胞培养腔相接的试剂注入通道、细胞注入通道和代谢物排出通道；所述细胞注入通道的体积≤所述细胞培养腔体积的20％；
所述盖板层盖合于所述细胞培养层之上，与所述细胞培养层共同形成供细胞培养所需的密封环境。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片装置，其特征在于，所述试剂注入通道和所述代谢物排出通道的近细胞培养腔端各设置有两个拦截坝，用以阻挡细胞流至其他通道，优选所述拦截坝由微米级的小柱构成，所述小柱之间形成空隙，所述空隙大小小于注入细胞的大小；
优选地，所述两个拦截坝分为第一拦截坝和第二拦截坝，所述第一拦截坝距离所述细胞培养腔4-6mm，所述第二拦截坝距离所述第一拦截坝4-6mm。
3.根据权利要求1或2所述的微流控芯片装置，其特征在于，所述试剂注入通道、所述细胞注入通道和所述代谢物排出通道为直线通道，优选所述试剂注入通道和所述代谢物排出通道设置于所述细胞培养腔室两侧且在一条直线上，更优选所述细胞培养层的各细胞培养通道的试剂注入通道和代谢物排出通道之间平行设置。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的微流控芯片装置，其特征在于，所述试剂注入通道和所述代谢物排出通道的深度与所述细胞培养腔的深度相同或所述试剂注入通道和所述代谢物排出通道的深度≤所述细胞培养腔室的深度的1/5；
优选地，所述试剂注入通道的宽度为50-1000μm，深度为50-1000μm；和/或所述代谢物排出通道的宽度为50-1000μm，深度为50-1000μm；和/或所述细胞注入通道的宽度为100-1000μm，深度为100-1000μm；和/或所述细胞培养腔为半圆孔，所述细胞培养腔直径为500-5000μm，深度为50-1000μm；
更优选地，所述试剂注入通道和所述代谢物排出通道的长度相同。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的微流控芯片装置，其特征在于，所述试剂注入通道末端设置有试剂注入口，所述细胞注入通道末端设置有细胞注入口，所述代谢物排出通道末端设置有代谢物排出口；
所述盖板层上设置有与所述试剂注入口、细胞注入口和代谢物排出口一一对应的外接试剂注入口、外接细胞注入口和外接代谢物排出口；
所述细胞培养层和所述盖板层对齐密封，优选通过紧固夹合密封或键合密封。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的微流控芯片装置，其特征在于，所述细胞培养层和所述盖板层为透明材料，各自独立优选为PMMA、ABS、PVC或玻璃。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的微流控芯片装置，其特征在于，所述盖板层上设置有观察窗，所述观察窗对应于所述细胞培养层的细胞培养腔的位置设置；
和/或所述盖板层还包括用于封堵盖板层上所述外接试剂注入口的密封堵头；
优选微流控芯片装置还包括用于注入试剂的微注射泵单元和用于收集代谢液的代谢液收集装置，所述微注射泵单元包括微注射泵，所述微注射泵与所述外接试剂注入口相连，所述代谢液收集装置与所述外接代谢物排出口相连。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的微流控芯片装置，其特征在于，所述微流控芯片的细胞培养层和盖板层之间还设有透气封闭层，所述透气封闭层设置有与所述试剂注入口、细胞注入口和代谢物排出口一一对应的穿孔，优选所述透气封闭层为PMMA或PDMS材料，更优选所述透气封闭层的厚度为500-1000μm。
9.根据权利要求8所述的微流控芯片装置，其特征在于，所述微流控芯片装置还包括用于注入试剂的微注射泵单元和用于收集代谢液的代谢液收集单元，所述微注射泵单元包括微注射泵，所述微注射泵与所述外接试剂注入口相连，所述代谢液收集单元与所述外接代谢物排出口相连。
10.一种细胞共培养方法，其使用权利要求1-9中任一项所述的微流控芯片装置进行细胞共培养，其特征在于，使相同或不同的细胞培养液和/或药物通过不同细胞培养通道的试剂注入通道进入其细胞培养腔，使相同或不同种类的细胞通过不同细胞培养通道的细胞注入通道进入细胞培养腔室进行培养，产生的代谢产物经代谢物排出通道排出。
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