CN103071548B - 一种无动力源无阀型单分子检测芯片及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种无动力源无阀型单分子检测芯片，由反应层、修饰层、封接层、主通道、反应小室、进样口、出样口和耐热胶带构成，反应层由主通道串联反应小室组成，反应小室位于主通道上方或下方，进样口、出样口位于主通道两端，修饰层预先与封接层连接，反应层通过修饰层与封接层封接后组成微流控芯片组件，耐热胶带粘贴于反应层的上表面。本发明微型化，减少试剂和样品的消耗量，成本低；无需外接的驱动系统和阀门开关控制装置，便可使少量液体分配到成百上千个独立的小室中，减少了芯片制作和使用的复杂性。本发明操作简单，无需其他控制设备，应用成本低，可在实时荧光定量聚合酶链式反应和数字核酸扩增中应用。
Description
技术领域
本发明属生命科学、医学等多个领域检测装置，涉及一种用于核酸扩增的微流控芯片装置及其应用技术。
背景技术
癌症、心脑血管疾病、传染病等重大疾病每年夺去我国数以百万计人的性命。据卫生部2010年公布，我国每年癌症病人660万，死亡人数达180万。每年用于癌症病人的医疗费用高达上千亿元人民币。随着人口的老龄化，预计到2020年，癌症新发病例将达到300万，死亡300万。癌症已成为我国沉重的疾病负担，加强癌症的预防和早诊早治新方法和新技术的研究非常重要。目前，全球正面临着从医疗医学向预防医学转变的医疗模式的转换，我国更要求医疗工作的重心要转移到广大基层群众中去，同时要逐渐以健康管理替代昂贵的“诊断和治疗系统”并使其成为疾病防控的主流。疾病的发生一般都要经历从分子变异、到细胞病变、再到组织坏死的过程，如果能够早期在分子水平上发现已经发生的病变，则大多数情况下都将可以找到救治办法，使患者康复，或者延长其生存期。
核酸分子准确检测十分重要。目前常规的分子诊断手段是将靶核酸直接扩增实现信号放大。主要包括聚合酶链式扩增反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）、连接酶链式反应（Ligase Chain Reaction, LCR）、环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）等。这些方法具有较高的灵敏度，而且应用广泛。业已证明，核酸扩增技术可用于除外伤和营养缺乏症外的所有疾病的诊断。
常规核酸扩增实验是使用小试管、孔板等进行的，操作工作量很大，加样环节多，易发生杂质污染。此外，传统PCR需要进行开盖检测，产生的气溶胶污染，使得假阳性率很高（30~40%）。因此，常规核酸扩增进一步的发展方向是不开盖的技术，即把样品核酸进样、扩增及检测都在封闭的体系中进行。微流控芯片技术为这一设想提供了可能。
发明内容
本发明提供了一种无需外接驱动系统、无需阀门、制作工艺简便并且易于操作的用于核酸单分子扩增的微流控芯片装置。该装置由反应层、修饰层、封接层、主通道、反应小室、进样口、出样口和耐热胶带构成，反应层由主通道串联反应小室组成，反应小室位于主通道上方或下方，进样口、出样口位于主通道两端，修饰层先与封接层连接，反应层通过修饰层与封接层封接后组成微流控芯片组件，耐热胶带粘贴于反应层的上表面。主通道及其上的反应小室的大小可以根据需要来决定，主通道的宽度从100 nm至5 mm不等；主通道的深度范围在100 nm至1 mm之间；反应小室的体积为微升（ml）到皮升（pl）级别。反应小室的位置可以根据所采用的油相液体的性质不同来制作位于主通道上方的反应小室或位于主通道下方的反应小室。反应层的制作材料选用具有透气性质的聚合物材料，优选的材料为聚二甲基硅氧烷（PDMS）。
反应层的制作方法根据不同的透气性聚合物材料的性质采用不同的方法，比如激光刻蚀、化学刻蚀、光刻、热压、浇铸及注塑等方法。当优选材料为聚二甲基硅氧烷（PDMS）时，以采用多层软光刻技术制作的具有微通道结构的基板为模具，在模具上浇注固化形成。
封接层的材料根据反应小室相对主通道的位置的不同选用不同的材料。
若反应小室位于主通道上方，则选用导热性好的薄质材料作为基底，优选薄质玻璃和单晶硅片。
若反应小室位于主通道下方，则选用透明胶带、PET膜或氟膜等。
反应小室位于主通道上方时，封接层与反应层1封接前，预先在基底上铺展与反应层材料相同的具有透气性质的聚合物薄膜作为修饰层。
预先在基底上铺展的与反应层相同材料的具有透气性质的聚合物薄膜修饰层可采用匀胶机旋转涂覆形成。匀胶机甩胶的转速、时间可根据所需要的不同的聚合物薄膜修饰层的厚度来选择。获得的具有透气性质的聚合物薄膜的修饰层厚度约为10-50 μm。
作为封接层的基底上铺展与反应层相同材料的具有透气性质的聚合物薄膜修饰层之前，基底预先采用空气等离子体处理。反应层与封接层进行封接，封接方法可以利用具有透气性质的聚合物固有的化学性质而以化学方法粘合在一起。反应层和修饰层选用相同的聚合物材料，可采用均相粘合，其中，两层具有相同的化学性质，一层中相同的化学个体与另一层中相同的化学个体反应，反应层和修饰层的聚合物以将这两层粘合在一起，各层的聚合物链之间的连接可以由交联剂的活化产生。
反应小室位于主通道下方时，封接层与反应层1封合前，二者分别用空气等离子体进行处理。
与水不相容的油相液体根据反应小室与主通道的相对位置可以选用氟化油、石蜡油或硅油等。
芯片使用时，样品溶液的进样无需外接驱动系统，而是利用具有透气性质的聚合物本身的透气性质，预先将聚合物芯片置于真空泵中，进行抽真空除气处理，然后置于常压环境下，由于主通道和反应小室的气体优先再溶入经过脱气处理的聚合物块体，从而使主通道及反应小室与外界形成气压差，主通道和反应小室处于负压状态，进样口处的样品溶液利用此气压差自动分配进入各个反应小室，实现样品的无动力源进样，待串联的反应小室完全均匀充满样品溶液后，向进样口内加入与水不相容的油相液体，同样利用气压差使与水不相容的油相液体将主通道中的样品溶液冲入后续的反应小室，直至样品进入所有的反应小室，从而将反应样品封入反应小室内，使其在反应过程中彼此独立，实现样品的无阀隔离，从而将样品离散化。
样品的引入通过利用透气性的聚合物材料的透气性质，预先将微流控芯片置于抽气容器中，进行抽真空除气处理。抽真空除气的压强和时间，根据不同的主通道4和反应小室的尺寸参数选择不同的抽真空除气的压强和时间，1-20 kPa，0.5-12小时。
芯片抽真空除气操作完成后，将芯片取出置于常压，迅速在其上粘附透明耐热胶带备用。芯片进行抽真空除气处理结束后，透气性的聚合物块体内气压下降，将其置于常压下时，其内主通道和反应小室中的气体优先进入聚合物块体，导致主通道和反应小室中的气压相应下降，与外界环境形成气压差，此气压差驱动样品溶液均匀充满整个主通道和反应小室。
使用前取出芯片，刺破进样口处的胶带，将样品溶液加入进样口处。样品溶液在主通道和反应小室与外界的气压差的驱动下均匀充满整个主通道和反应小室。
待样品溶液均匀充满整个主通道和反应小室后，紧接着在样品的进样口处加入与水不相容的油相液体。
与水不相容的油相液体在内外气压差的驱动下进入主通道，将主通道中的样品溶液冲入后续的反应小室，直至样品进入所有的反应小室，从而将反应样品封入反应小室内，使其在反应过程中彼此独立，实现样品的离散化。
待与水不相容的油相液体完全充满整个主通道后，用耐热胶带等将进样口和出样口封闭。
本发明的另一个目的是提供一种利用上述装置进行实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）的方法，所述的方法包括以下步骤：
（1）将模板DNA/RNA核酸扩增试剂混合；
（2）预先将微流控芯片置于抽气容器中，进行抽真空除气处理；
（3）微流控芯片置于抽气容器中抽真空除气后，取出芯片，迅速粘附透明耐热胶带；
（4）刺破芯片进样口处的胶带，将样品溶液加入进样口处，样品溶液在主通道和反应小室与外界的气压差的驱动下均匀充满整个主通道和反应小室；
（5）待样品溶液均匀充满整个主通道和反应小室后，紧接着在样品的进样口处加入与水不相容的油相液体；
（6）与水不相容的油相液体在内外气压差的驱动下进入主通道，将主通道中的样品溶液冲入后续的反应小室，直至样品进入所有的反应小室，从而将反应样品封隔入反应小室内，使其在反应过程中彼此独立，实现样品的离散化；
（7）待与水不相容的油相液体完全充满整个主通道后，用耐热胶带将进样口和出样口封闭；
（8）将上述微流控芯片置于实时荧光定量PCR仪等核酸扩增装置上，采用电荷耦合元件（CCD）等图像传感器，在每一轮的PCR反应结束时，采集每个反应小室在该轮反应的荧光信号，并最终绘制成反应过程的荧光信号曲线，反应结束后，通过对反应过程中指数期荧光信号的分析对核酸进行定量。
本发明的再一个目的是提供一种利用上述装置进行数字核酸扩增的方法，所述的方法包括以下步骤：
（1）将模板DNA/RNA与带有荧光染料的核酸扩增反应试剂混合：
如果核酸扩增采用荧光定量PCR方法，则将模板DNA/RNA与Taqman探针核酸扩增试剂、SYBR核酸扩增试剂等混合；
如果核酸扩增采用等温扩增，则将模板DNA/RNA与等温扩增反应试剂及DNA荧光染料SYBR GreenⅠ、钙黄绿素、FITC等混合；
（2）预先将微流控芯片置于抽气容器中，进行抽真空除气处理；
（3）微流控芯片置于抽气容器中抽真空除气半小时后，暂停抽真空除气，将芯片迅速取出在其上粘附透明耐热胶带后，再将芯片迅速置于抽气容器中继续抽真空除气操作；
（4）芯片抽真空除气操作完成后，迅速取出芯片置于常压下，刺破进样口处的胶带，将样品溶液加入进样口处，样品溶液在主通道和反应小室与外界的气压差的驱动下均匀充满整个主通道和反应小室；
（5）待样品溶液均匀充满整个主通道和反应小室后，紧接着在样品的进样口处加入与水不相容的油相液体；
（6）与水不相容的油相液体在内外气压差的驱动下进入主通道，将主通道中的样品溶液冲入后续的反应小室，直至样品进入所有的反应小室，从而将反应样品封隔入反应小室内，使其在反应过程中彼此独立，实现样品的离散化；
（7）待与水不相容的油相液体完全充满整个主通道后，用耐热胶带将进样口和出样口封闭；
（8）将上述微流控芯片置于原位PCR仪或类似于原位PCR仪的温控装置上，进行核酸扩增；若对核酸进行等温扩增，将微流控芯片组件置于普通的热板上进行核酸扩增反应即可；
（9）反应结束后，采用CCD等图像传感器采集反应小室的荧光信号，每一个发出荧光强度大于阈值的小室代表一个阳性核酸扩增反应，通过对阳性反应小室的计数，就可以实现对所检测样品的原始拷贝数进行绝对定量。
本发明的应用范围包括：SNP的检测，单碱基突变的检测，拷贝数失衡的检测，单细胞基因表达谱的研究，癌症标志物的早期检测以及干细胞分化和鉴定的相关研究。
本发明的优点
1、与多孔板上进行数字PCR相比，本发明利用微流控芯片微型化的特点，试剂和样品的消耗量均减少，大大减小了实验成本。该发明装置利用制作芯片主体结构的聚合物块体的透气性质，在抽真空脱气处理后，利用主通道和反应小室与外界大气形成的气压差，并通过后续的油相封隔，使样品自动快速均匀的分散到成千上百个独立的反应小室，大大提高了实验速度。
2、本发明装置无需外接的驱动系统和阀门开关控制装置，大大减少了装置的复杂性，充分体现了当今分析设备微型化、便携化的发展趋势，在高通量、低消耗和大规模平行处理方面具有极大的优势。再者，由于样品和试剂的分配都在芯片内部完成，不与外界大气直接接触，可有效防止外界污染和交叉污染。
3、与现有的商品化数字PCR芯片相比，本发明不需要微阀便可使少量液体分配到成百上千个独立的小室中，大大减少了芯片制作和使用的复杂程度，为制作大规模微流控芯片提供了结构基础。
4、利用本发明可将单拷贝的核酸分子分配到独立的纳升级微室中并进行PCR扩增。可以快速对样品中核酸的起始拷贝数进行绝对定量。对SNP、单碱基突变、拷贝数失衡、早期癌症标志物的检测，单细胞基因表达谱的研究，以及干细胞分化和鉴定的相关研究具有广阔的应用前景。可应用于现场的医疗检验、疾病防控、食品安全、农业、林业、畜牧养殖、水产养殖、分子生物、法医鉴定、生命科研等诸多领域。
5、本发明结构及操作简单，芯片只需要一个配套的真空泵，或者使用真空包装将预先抽真空脱气的聚合物芯片封包，无需其他的控制设备，其应用成本比目前基于PDMS弹性微阀的数字PCR芯片大大减少，为数字PCR技术的推广与应用提供了一个良好的平台。
附图说明
图1是本发明装置的结构示意图。
图2是本发明装置实施例2的结构示意图。
图3是本发明装置制作的掩模图。
图4是实施例5中应用本发明装置进行数字PCR反应后的结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
参见图1，一种无需外接驱动系统、无需阀门、制作工艺简便并且易于操作的用于核酸扩增的微流控芯片装置。该装置由反应层1、修饰层2、封接层3、主通道4、反应小室5、进样口6、出样口7和耐热胶带8构成，反应层1由主通道4串联反应小室5组成，反应小室5位于主通道4上方，进样口6、出样口7位于主通道4两端，修饰层2预先与封接层3连接，反应层1通过修饰层2与封接层3封接后组成微流控芯片组件。耐热胶带8粘贴于反应层1的上表面。
反应层1采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）为材料，以采用多层软光刻技术制作的具有微通道结构的基板为模具，在模具上浇注具有透气性质的PDMS固化脱模形成。反应小室5的边长为100 μm，200 μm或300 μm的正方形，深50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm。根据不同的宽度和模具高度，反应小室5的体积可为200 pL, 1 nL, 2 nL, 4.5 nL, 8 nL, 18 nL, 60 nL等；反应小室5也可以为五边形、梯形或圆形。主通道4的宽度为50μm，100μm或500μm。
封接层3采用0.17mm厚的盖玻片玻璃作为材料,预先采用空气等离子体处理,以备与修饰层2的结合。
修饰层2采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）为材料，采用匀胶机旋转涂覆的方法均匀涂覆在预先经空气等离子体处理的作为封接层3的0.17mm厚的盖玻片玻璃上。
与水不相容的油相液体选用氟化油、石蜡油或硅油。
反应层1制作好后，将进样口6与出样口7用打孔器打孔，然后用涂覆有修饰层2的封接层3将反应层1封接闭合。封接方法可以通过将芯片置于热板上加热，利用具有透气性质的PDMS聚合物固有的化学性质而以化学方法粘合在一起。
制作完成的 微流控PDMS芯片置于容器中抽真空除气，取出后迅速在其整个上表面粘附透明耐热胶带8并且封闭进样口6和出样口7，之后再将芯片迅速真空密封包装。
PDMS芯片进行抽真空除气处理后，透气性的聚合物块体内气压下降，停止抽真空除气后并置于常压下时，其内主通道4和反应小室5中的气体优先进入聚合物块体，导致主通道4和反应小室5中的气压相应下降，与外界环境形成气压差，此气压差驱动样品溶液均匀充满整个主通道4和反应小室5。
将芯片迅速从经过真空除气的容器中取出置于常压环境下，刺破进样口6处的透明耐热胶带8，将样品溶液加入进样口6处，样品溶液在气压差的驱动下均匀充满主通道4和反应小室5。
待样品溶液均匀充满整个主通道4和反应小室5后，在样品的进样口6处加入与水不相容的油相液体，将主通道4中的样品溶液冲入后续的反应小室5，直至样品进入所有的反应小室5，从而将反应样品封隔入反应小室5内，使其在反应过程中彼此独立，实现样品的离散化。
待与水不相容的油相液体完全充满整个主通道4后，用耐热透明胶带将进样口6和出样口7封闭。
实施例2
参见图2，一种无需外接驱动系统、无需阀门、制作工艺简便并且易于操作的用于核酸扩增的微流控芯片装置。该装置由反应层1、修饰层2、封接层3、主通道4、反应小室5、进样口6、出样口7和耐热胶带8构成，反应层1由主通道4串联反应小室5组成，反应小室5位于主通道4下方，进样口6、出样口7位于主通道4两端，修饰层2预先与封接层3连接，反应层1通过修饰层2与封接层3封接后组成微流控芯片组件。耐热胶带8粘贴于反应层1的上表面。反应层1采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）为材料，以采用多层软光刻技术制作的具有微通道结构的基板为模具，先在模具上浇注一层1mm厚的具有透气性质的PDMS薄层，待该PDMS层经烘烤固化后，将其与氟膜一起用空气等离子体处理，然后将氟膜均匀粘附在该固化PDMS薄层上。同时在平整光滑的基板上浇注一层1cm厚的PDMS层。待上述氟膜与PDMS薄层稳定粘合后，通过氟膜将PDMS薄层脱模，与前述1cm厚的PDMS层粘合，打孔器对准打孔。
反应小室5的边长为100 μm，200 μm或300 μm的正方形，深50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm。根据不同的宽度和模具高度，反应小室5的体积可为500 pL, 1 nL, 2 nL, 4.5 nL, 8 nL, 9 nL, 18 nL；反应小室5也可以为五边形、梯形或圆形。主通道4的宽度为50μm，100μm或200μm。
与水不相容的油相液体选用氟化油、石蜡油或硅油等。
反应层1制作好后，将进样口6与出样口7用打孔器打孔，然后用涂覆有修饰层2的封接层3将反应层1封接闭合。
制作完成的 微流控PDMS芯片置于容器中抽真空除气，取出后迅速在其整个上表面粘附透明耐热胶带8并且封闭进样口6和出样口7，之后再将芯片迅速真空密封包装。
PDMS芯片进行抽真空除气处理后，透气性的聚合物块体内气压下降，停止抽真空除气后并置于常压下时，其内主通道4和反应小室5中的气体优先进入聚合物块体，导致主通道4和反应小室5中的气压相应下降，与外界环境形成气压差，此气压差驱动样品溶液均匀充满整个主通道4和反应小室5。
将芯片迅速从经过真空除气的容器中取出置于常压环境下，刺破进样口6处的透明耐热胶带8，将样品溶液加入进样口6处，样品溶液在气压差的驱动下均匀充满整个主通道4和反应小室5。
待样品溶液均匀充满整个主通道4和反应小室5后，在样品的进样口6处加入与水不相容的油相液体，将主通道4中的样品溶液冲入后续的反应小室5，直至样品进入所有的反应小室5，从而将反应样品封隔入反应小室5内，使其在反应过程中彼此独立，实现样品的离散化。
待与水不相容的油相液体完全充满整个主通道4后，用耐热透明胶带将进样口6和出样口7封闭。
实施例3
无动力源无阀型微流控PDMS芯片上的实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）。
本实施例采用实施例1的装置进样，并进行后续的实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）。具体步骤：
1、参见图3设计通道结构并制成掩膜。
2、反应层1采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）为材料，以采用多层软光刻技术制作的具有微通道结构的基板为模具，在模具上浇注具有透气性质的PDMS固化形成。反应小室5的边长为100 μm，200 μm或300 μm的正方形，深50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm。根据不同的宽度和模具高度，反应小室5的体积可为500 pL, 1 nL, 2 nL, 4.5 nL, 8 nL, 9 nL, 18 nL；反应小室5也可以为五边形、梯形或圆形。主通道4的宽度为50μm，100μm或200μm。
3、封接层3采用0.17mm厚的盖玻片玻璃作为材料,预先采用空气等离子体处理,以备与修饰层2的结合。
4、修饰层2采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）为材料，采用匀胶机旋转涂覆的方法均匀涂覆在预先经空气等离子体处理的作为封接层3的0.17mm厚的盖玻片玻璃上。
5、反应层1制作好后，将进样口6与出样口7用打孔器对准打孔，然后用涂覆有修饰层2的封接层3将反应层1封接闭合。
6、制作完成的 微流控PDMS芯片置于容器中抽真空除气，取出迅速在其上粘附透明耐热胶带8并且封闭进样口6和出样口7，之后再将芯片迅速真空密封包装。
7、PDMS芯片进行抽真空除气处理后，透气性的聚合物块体内气压下降，停止抽真空除气后并置于常压下时，其内主通道4和反应小室5中的气体优先进入聚合物块体，导致主通道4和反应小室5中的气压相应下降，与外界环境形成气压差，此气压差驱动样品溶液均匀充满整个主通道4和反应小室5。
8、采用商业化的β-actin cDNA作为反应模板考察芯片性能：将模板DNA稀释到适当的浓度并与适量的荧光定量PCR反应试剂混合：
（1）将500 ng/μL的β-actin cDNA溶液稀释为5 pg/μL、0.5 pg/μL、0.05 pg/μL、0.005 pg/μL，作为DNA模板各取1 μL进行PCR反应。
（2）进行PCR扩增反应，按照10 μL体积配制反应液，PCR缓冲液5 μL，PCR 正向引物 1 μL，PCR 反向引物 1 μL, 探针 1 μL, ddH2O 1 μL，DNA模板1 μL。反应条件：50℃ 2 min, 95℃ 10 min预变性，95℃ 15 sec，60℃ 1 min，共40个循环。所用β-actin cDNA的引物序列如下：
Actin F（上游引物）: 5’ACCGAGCGCGGCTACAG3’
Actin R（下游引物）: 5’CTTAATGTCACGCACGATTTCC3’
Actin-probe (5’→3’): FAM+TTCACCACCACGGCCGAGC+TAMRA
（3）PCR的扩增反应及检测还可以采用SYBR试剂来完成。按照50 μL体积配制反应液，SYBR缓冲液 (2×) 25 μL，PCR 正向引物 (10 μM) 1 μL，PCR 反向引物 (10μΜ) 1 μl, ddH2O 21 μL，DNA模板2.0 μL。反应条件：95℃ 30 sec 预变性，95℃ 5 sec，60℃ 30 sec，共30-40个循环。所用β-actin cDNA的引物序列如下：
Actin F（上游引物）: 5’ACCGAGCGCGGCTACAG3’
Actin R（下游引物）: 5’CTTAATGTCACGCACGATTTCC3’
9、将芯片迅速从抽过真空除气的容器中取出置于常压环境下，刺破进样口6处的透明耐热胶带8，将样品溶液加入进样口6处，样品溶液在气压差的驱动下均匀充满整个主通道4和反应小室5。
10、待样品溶液均匀充满整个主通道4和反应小室5后，在样品的进样口6处加入与水不相容的油相液体，将主通道4中的样品溶液冲入后续的反应小室5，直至样品进入所有的反应小室5，从而将反应样品封隔入反应小室5内，使其在反应过程中彼此独立，实现样品的离散化。
11、待与水不相容的油相液体完全充满整个主通道4后，用耐热胶带8将进样口6和出样口7封闭。
12、将微流控芯片组件置于实时荧光定量PCR仪等核酸扩增装置上，采用CCD等图像传感器，在每一轮的PCR反应结束时，采集每个反应小室5在该轮反应的荧光信号，并最终绘制成反应过程的荧光信号曲线。反应结束后，通过对反应过程中指数期荧光信号的分析对核酸进行定量。
实施例4 无动力源无阀型微流控PDMS芯片上的核酸等温扩增
本实施例采用实施例1的装置进样，并进行后续的数字核酸等温扩增反应。
具体步骤：
1、参见图3设计通道结构并制成掩膜。
2、反应层1采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）为材料，以采用多层软光刻技术制作的具有微通道结构的基板为模具，在模具上浇注具有透气性质的PDMS固化形成。反应小室5的边长为100 μm，200 μm或300 μm的正方形，深50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm。根据不同的宽度和模具高度，反应小室5的体积可为500 pL, 1 nL, 2 nL, 4.5 nL, 8 nL, 18 nL, 60 nL等；反应小室5也可以为五边形、梯形或圆形等。主通道4的宽度为50μm，100μm或500μm等。
3、封接层3采用0.17mm厚的盖玻片玻璃作为材料,预先采用空气等离子体处理,以备与修饰层2的结合。
4、修饰层2采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）为材料，采用匀胶机旋转涂覆的方法均匀涂覆在预先经空气等离子体处理的作为封接层3的0.17mm厚的盖玻片玻璃上。
5、反应层1制作好后，将进样口6与出样口7用打孔器打孔，然后用涂覆有修饰层2的封接层3将反应层1封接闭合。
6、制作完成的 微流控PDMS芯片置于容器中抽真空除气，取出后迅速在其上粘附透明耐热胶带8并且封闭进样口6和出样口7，之后再将芯片迅速真空密封包装。
7、PDMS芯片进行抽真空除气处理后，透气性的聚合物块体内气压下降，停止抽真空除气后并置于常压下时，其内主通道4和反应小室5中的气体优先进入聚合物块体，导致主通道4和反应小室5中的气压相应下降，与外界环境形成气压差，此气压差驱动样品溶液均匀充满整个主通道4和反应小室5。
8、采用商业化的E. coli 16s rRNA作为反应模板考察芯片性能：将模板DNA稀释到适当的浓度并与适量的LAMP反应试剂及DNA荧光染料SYBR GreenⅠ混合：
（1）将500 ng/μL的E. coli 16s rRNA溶液稀释为5 pg/μL、0.5 pg/μL、0.05 pg/μL、0.005 pg/μL，作为DNA模板各取1 μL进行PCR反应。
（2）按照50μL体系配制LAMP反应混合物：E. coli 16s rRNA模板1μL，引物FIP (40 μM) 2 μL，引物BIP (40 μM) 2 μL，引物F3 (5 μM) 2 μL，引物B3 (5 μM) 2 μL，dNTP (2.5 mM each) 8 μL，MgSO4 (50 mM) 6 μL, betaine (5 M) 10 μL，Bst酶2 μL，Bstbuffer 5 μL，SYBR GreenⅠ2 μL，ddH2O 8 μL。LAMP引物如下：
F3: 5’ GATGTGCCCAGATGGGATT3’
B3: 5’ GGCCTTCTTCATACACGCG3’
FIP: 5’ TGGTCATCCTCTCAGACCAGCTTTTTGCTAGTAGGTGGGGTAACGG3’
BIP: 5’ TGGAACTGAGACACGCTCCAGATTTTATGGCTGCATCAGGCTTG3’
9、将芯片迅速从抽过真空除气的容器中取出置于常压环境下，刺破进样口6处的透明耐热胶带8，将样品溶液加入进样口6处，样品溶液在气压差的驱动下均匀充满整个主通道4和反应小室5。
10、待样品溶液均匀充满整个主通道4和反应小室5后，在样品的进样口6处加入与水不相容的油相液体，将主通道4中的样品溶液冲入后续的反应小室5，直至样品进入所有的反应小室5，从而将反应样品封隔入反应小室5内，使其在反应过程中彼此独立，实现样品的离散化。
11、待与水不相容的油相液体完全充满整个主通道4后，用耐热胶带8将进样口6和出样口7封闭。
12、将芯片置于原位PCR仪、热板等装置上，按所需扩增样品不同的进行不同的恒温加热，对核酸进行等温扩增。由于SYBR GreenⅠ荧光染料只与双链DNA小沟结合，当它与DNA双链结合时，发出较原先强800~1000倍的荧光，因此，发生扩增反应的小室将呈现绿色荧光，阴性将无颜色变化。因此，如果有核酸分子被分配到某个独立的反应小室5，该小室在反应后将产生绿色的荧光；如果核酸的浓度足够低，使每个反应小室5最多能分到一个核酸分子，那么，通过对阳性孔的计数就可以对起始的核酸模板量进行精确定量。
13、反应结束后，采用CCD图像传感器采集反应小室5的荧光信号，每一个发出荧光强度大于阈值的小室代表一个阳性反应，通过对阳性反应小室5的计数，就可以实现对所检测样品的原始拷贝数进行绝对定量。
实施例5
无动力源无阀型微流控PDMS芯片上的数字聚合酶链式反应（Digital-PCR）
本实施例采用实施例1的装置进样，并进行后续的数字聚合酶链式反应（Digital-PCR）
具体步骤：
1、参见图3设计通道结构并制成掩膜。
2、反应层1采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）为材料，以采用多层软光刻技术制作的具有微通道结构的基板为模具，浇注1cm左右的PDMS，打孔器打孔。
3、反应小室5的边长为100 μm，200 μm或300 μm的正方形，深50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm。根据不同的宽度和模具高度，反应小室5的体积可为200 pL, 1 nL, 2 nL, 4.5 nL, 8 nL, 9 nL, 60 nL；反应小室5也可以为五边形、梯形或圆形。主通道4的宽度为50μm，100μm或500μm。
4、与水不相容的油相液体选用氟化油、石蜡油或硅油等。
5、反应层1制作好后，将进样口6与出样口7用打孔器打孔，然后用涂覆有修饰层2的封接层3将反应层1封接闭合。
6、制作完成的 微流控PDMS芯片置于容器中抽真空除气，取出后迅速在其整个上表面粘附透明耐热胶带8并且封闭进样口6和出样口7，之后再将芯片迅速真空密封包装。
7、PDMS芯片进行抽真空除气处理后，透气性的聚合物块体内气压下降，停止抽真空除气后并置于常压下时，其内主通道4和反应小室5中的气体优先进入聚合物块体，导致主通道4和反应小室5中的气压相应下降，与外界环境形成气压差，此气压差驱动样品溶液均匀充满整个主通道4和反应小室5。
8、采用商业化的β-actin cDNA作为反应模板考察芯片性能：将模板DNA稀释到适当的浓度并与适量的荧光定量PCR反应试剂混合：
（1）将500 ng/μL的β-actin cDNA溶液稀释为5 pg/μL、0.5 pg/μL、0.05 pg/μL、0.005 pg/μL，作为DNA模板各取1 μL进行PCR反应。
（2）使用TaqMan反应试剂盒进行PCR扩增反应，按照10 μL体积配制反应液，PCR缓冲液 5 μL，PCR 前向引物 1 μL，PCR 反向引物 1 μL, 探针 1 μL, ddH2O 1 μL，DNA模板1 μL。反应条件：50℃ 2 min, 95℃ 10 min预变性，95℃ 15 sec，60℃ 1 min，共30-40个循环。所用β-actin cDNA的引物序列如下：
Actin F（上游引物）: 5’ACCGAGCGCGGCTACAG3’
Actin R（下游引物）: 5’CTTAATGTCACGCACGATTTCC3’
Actin-probe (5’→3’): FAM+TTCACCACCACGGCCGAGC+TAMRA
（3）PCR的扩增反应及检测还可以采用SYBR反应试剂来完成。使用SYBR进行PCR扩增反应，按照50 μL体积配制反应液，SYBR 缓冲液 (2×) 25 μL，PCR 前向引物 1 μL，PCR 反向引物 1 μl, ddH2O 21 μL，DNA模板2.0 μL。反应条件：95℃ 30 sec 预变性，95℃ 5 sec，60℃ 30 sec，共40个循环。所用β-actin cDNA的引物序列如下：
Actin F（上游引物）: 5’ACCGAGCGCGGCTACAG3’
Actin R（下游引物）: 5’CTTAATGTCACGCACGATTTCC3’
9、将芯片迅速从抽过真空除气的容器中取出置于常压环境下，刺破进样口6处的透明耐热胶带8，将样品溶液加入进样口6处，样品溶液在气压差的驱动下均匀充满整个主通道4和反应小室5。
10、待样品溶液均匀充满整个主通道4和反应小室5后，在样品的进样口6处加入与水不相容的油相液体，将主通道4中的样品溶液冲入后续的反应小室5，直至样品进入所有的反应小室5，从而将反应样品封隔入反应小室5内，使其在反应过程中彼此独立，实现样品的离散化。
11、待与水不相容的油相液体完全充满整个主通道4后，用耐热胶带8将进样口6和出样口7封闭。
12、将芯片组件置于原位PCR仪上，根据不同的反应试剂设定不同的反应条件。
13、反应结束后，采用荧光成像系统采集反应小室5的荧光信号，每一个发出荧光强度大于阈值的小室代表一个阳性的PCR反应，通过对阳性反应小室5的计数，就可以实现对所检测样品的原始拷贝数进行绝对定量（图4）。
TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’末端，而淬灭剂则在 3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。实验中使用的是FAM标记的探针，当其水解时，发绿色荧光，因此，发生扩增反应的小室将呈现绿色荧光，阴性将无颜色变化。因此，如果有核酸分子被分配到某个独立的反应小室5，该小室在反应后将产生绿色的荧光；如果核酸的浓度足够低，使每个反应小室5最多能分到一个核酸分子，那么，通过对阳性孔的计数就可以对起始的核酸模板量进行精确定量。
SYBR GreenⅠ荧光染料只与双链DNA小沟结合，当它与DNA双链结合时，发出较原先强800~1000倍的荧光，因此，发生扩增反应的小室将呈现绿色荧光，阴性将无颜色变化。因此，如果有核酸分子被分配到某个独立的反应小室5，该小室在反应后将产生绿色的荧光；如果核酸的浓度足够低，使每个反应小室5最多能分到一个核酸分子，那么，通过对阳性孔的计数就可以对起始的核酸模板量进行精确定量。
<110>浙江大学
<120> 一种用于数字核酸扩增的高密度阵列芯片装置及应用
<160> 7
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据 E.coli 16s rRNA 序列设计的LAMP F3序列
<400>1
gatgtgccca gatgggatt 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据 E.coli 16s rRNA 序列设计的LAMP B3序列
<400>2
ggccttcttc atacacgcg 19
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据 E.coli 16s rRNA 序列设计的LAMP FIP序列
<400>3
tggtcatcct ctcagaccag ctttttgcta gtaggtgggg taacgg 46
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据 E.coli 16s rRNA 序列设计的LAMP BIP序列
<400>4
tggaactgag acacgctcca gattttatgg ctgcatcagg cttg 44
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据 β-actin cDNA 序列设计的 PCR 检测上游引物序列
<400>5
accgagcgcg gctacag 17
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据 β-actin cDNA 序列设计的 PCR 检测下游引物序列
<400>6
cttaatgtca cgcacgattt cc 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据 β-actin cDNA 序列设计的 PCR 检测探针序列
<400>7
Fam-ttcaccacca cggccgagc-Tamra 19
Claims (6)
1.一种无动力源无阀型单分子检测芯片，由反应层（1）、修饰层（2）、封接层（3）、主通道（4）、反应小室（5）、进样口（6）、出样口（7）和耐热胶带（8）构成，反应层（1）由主通道（4）串联反应小室（5）组成，反应小室（5）位于主通道（4）上方或下方，进样口（6）、出样口（7）位于主通道（4）两端，修饰层（2）与封接层（3）连接，反应层（1）通过修饰层（2）与封接层（3）封接后组成无动力源无阀型单分子检测芯片组件，耐热胶带（8）粘贴于反应层（1）的上表面，当反应小室（5）位于主通道（4）上方时，封接层（3）与反应层（1）封接前，预先在基底上铺展与反应层（1）材料相同的具有透气性质的聚合物薄膜作为修饰层（2）；当反应小室（5）位于主通道（4）下方时，封接层（3）与反应层（1）封合前，二者分别用空气等离子体进行处理；反应层（1）的制作材料选用透气性质的聚合物材料。
2.根据权利要求1所述的一种无动力源无阀型单分子检测芯片，其特征在于，主通道（4）的宽度100 nm-5 mm，主通道的深度范围100 nm-1 mm，反应小室（5）的体积为微升到皮升级别。
3.根据权利要求1所述的一种无动力源无阀型单分子检测芯片，其特征在于，反应层（1）的制作材料选用聚二甲基硅氧烷。
4.根据权利要求1所述的一种无动力源无阀型单分子检测芯片，其特征在于，反应小室（5）位于主通道（4）上方时，封接层（3）的材料选用玻璃和单晶硅片作为基底；反应小室（5）位于主通道（4）下方时，封接层（3）的材料选用透明胶带、PET膜或氟膜。
5.根据权利要求1所述的一种无动力源无阀型单分子检测芯片在进行实时荧光定量聚合酶链式反应中的应用，通过以下步骤实现：
（1）将模板DNA/RNA与核酸扩增试剂混合；
（2）预先将无动力源无阀型单分子检测芯片置于抽气容器中，进行抽真空除气处理；
（3）无动力源无阀型单分子检测芯片置于抽气容器中抽真空除气后，取出芯片，迅速粘附耐热胶带（8）；
（4）刺破芯片进样口（6）处的胶带，将样品溶液加入进样口（6）处，样品溶液在主通道（4）和反应小室（5）与外界的气压差的驱动下均匀充满整个主通道（4）和反应小室（5）；
（5）待样品溶液均匀充满整个主通道（4）和反应小室（5）后，紧接着在样品的进样口（6）处加入与水不相容的油相液体；
（6）与水不相容的油相液体在内外气压差的驱动下进入主通道（4），将主通道（4）中的样品溶液冲入后续的反应小室（5），直至样品进入所有的反应小室（5），从而将反应样品封隔入反应小室（5）内，使其在反应过程中彼此独立，实现样品的离散化；
（7）待与水不相容的油相液体完全充满整个主通道（4）后，用耐热胶带（8）将进样口（6）和出样口（7）封闭；
（8）将上述芯片置于实时荧光定量PCR仪核酸扩增装置上，采用电荷耦合元件图像传感器，在每一轮的PCR反应结束时，采集每个反应小室（5）在该轮反应的荧光信号，并最终绘制成反应过程的荧光信号曲线，反应结束后，通过对反应过程中指数期荧光信号的分析对核酸进行定量。
6.根据权利要求1所述的一种无动力源无阀型单分子检测芯片在进行数字核酸扩增中的应用，通过以下步骤实现：
（1）将模板DNA/RNA与带有荧光染料的核酸扩增反应试剂混合：
如果核酸扩增采用荧光定量PCR方法，则将模板DNA/RNA与Taqman探针核酸扩增试剂、SYBR核酸扩增试剂混合；
如果核酸扩增采用等温扩增，则将模板DNA/RNA与等温扩增反应试剂及DNA荧光染料SYBR GreenⅠ、钙黄绿素、FITC混合；
（2）预先将无动力源无阀型单分子检测芯片芯片置于抽气容器中，进行抽真空除气处理；
（3）无动力源无阀型单分子检测芯片置于抽气容器中抽真空除气半小时后，暂停抽真空除气，将芯片迅速取出在其上粘附耐热胶带（8）后，再将芯片迅速置于抽气容器中继续抽真空除气操作；
（4）无动力源无阀型单分子检测芯片抽真空除气操作完成后，迅速取出芯片置于常压下，刺破进样口（6）处的胶带，将样品溶液加入进样口（6）处，样品溶液在主通道（4）和反应小室（5）与外界的气压差的驱动下均匀充满整个主通道（4）和反应小室（5）；
（5）待样品溶液均匀充满整个主通道（4）和反应小室（5）后，紧接着在样品的进样口（6）处加入与水不相容的油相液体；
（6）与水不相容的油相液体在内外气压差的驱动下进入主通道（4），将主通道（4）中的样品溶液冲入后续的反应小室（5），直至样品进入所有的反应小室（5），从而将反应样品封隔入反应小室（5）内，使其在反应过程中彼此独立，实现样品的离散化；
（7）待与水不相容的油相液体完全充满整个主通道（4）后，用耐热胶带（8）将进样口（6）和出样口（7）封闭；
（8）将上述芯片置于原位PCR仪的温控装置上，进行核酸扩增；若对核酸进行等温扩增，将芯片组件置于普通的热板上进行核酸扩增反应即可；
（9）反应结束后，采用电荷耦合元件图像传感器采集反应小室（5）的荧光信号，每一个发出荧光强度大于阈值的小室代表一个阳性核酸扩增反应，通过对阳性反应小室（5）的计数，就可以实现对所检测样品的原始拷贝数进行绝对定量。
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