CN114247485B - 一种用于微粒筛选分离的微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种可用于单个微粒筛选并形成液滴包裹导出的微流控芯片，该微流控芯片包括储油池、样品储存池，微通道、以及进样口。该微流控芯片与液体进样装置相连，可组成一种用于形成单个微粒包裹液滴的微流控芯片装置，该微流控芯片装置可进一步与微粒捕获装置组成可用于形成单个微粒包裹液滴的微流控操作系统。本发明还提供了一种在微流控芯片中形成目标单个微粒包裹液滴并分别导出的方法。

Description

一种用于微粒筛选分离的微流控芯片

技术领域

本发明涉及微流控技术领域，具体涉及一种利用微流控芯片形成单个微粒包裹液滴并导出的技术，可用于单细胞筛选、单细胞分离、单细胞测序、单细胞形态分析、单细胞培养、药物筛选等领域。

背景技术

微生物作为地球生物种最丰富的物种，在生态系统中起到举足轻重的作用，是生物质合成、降解、循环中不可缺少的一环。同时，微生物也与人类健康息息相关-人体中的微生物数量相当于人体自身细胞的十倍。然而，至今为止，超过百分之九十的微生物无法在实验室条件下培养。对单个活体细胞的表型识别、分选及基因型分析(即“单细胞技术”)，能够避免微生物冗长的孵育过程，解析生命体系最“深”层次的异质性和运作机制。一直以来，针对微生物的单细胞技术都面临着这一技术难题：如何无损地、精准地分离出单个微生物细胞。

目前能够实现微生物单细胞分离的技术主要有荧光流式技术(FACS)、微操纵技术(micromanipulator,eppendorf)。但是都存在各自的技术局限，如FACS需要对细胞进行荧光标记，通常会遇到标记困难或标记后影响细胞活性的问题，另外满足微生物分离的FACS价格高昂。微操纵技术单次操作复杂(需要精准调控毛细管尖位置，包括进针、退针)，并且通量较低。

国内外研究组报道过通过微流控方法或激光弹射策略分离得到微生物单细胞的方法。如F.Teng,et.al.,Nondestructive Identification and Accurate Isolation ofSingle Cells through a Chip with Raman Optical Tweezers,Anal.Chem.这篇文章，运用了光镊把细胞从细胞池拖拽到分选池，再用移液枪分选取出单细胞。但是单个细胞拖拽距离有数个毫米，需要较长的操纵时间，另外采用的分离通道结构较宽，无法在视野中将整个通道成像，容易忽视非目标细胞的存在。

Y.Wang,et.al.,Raman Activated Cell Ejection for Isolation of SingleCells,Anal.Chem.这篇文章提供了一种脉冲激光弹射的方法。但是弹射前需将细胞自然干燥在弹射基片上，加上脉冲激光在干燥基片上会产生强烈的光热现象，将严重影响分离后细胞的生理活性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种将目标单个微粒分离并导出的技术，本发明实现了单个目标微粒在微流控芯片内的检测和捕获，以及从微流控芯片到外试管的转移。

本发明所称的“微粒”，是指能够悬浮在非有机相溶液(例如水相)、并在本发明微流控芯片内通过的颗粒，包括生物体来源的和非生物体来源的颗粒，例如真核细胞、原核细胞、单细胞生物、病毒颗粒、细胞器、生物大分子形成的颗粒、药物颗粒、药物载体颗粒、脂质体、多聚物粒子等。

本发明的第一方面，提供了一种微流控芯片，所述微流控芯片包括储油池、样品储存池，微通道、以及进样口，所述微通道两端分别与储油池及进样口连通，所述样品储存池为密闭中空立体结构，样品储存池的出口通过微通道支路与微通道连通。

所述储油池为中空立体结构。

所述储油池的表面为疏水亲油表面。

所述储油池的顶上为开口结构。

在一优选例中，所述储油池的直径为4～14mm,深度0.5～2mm；优选地，所述储油池的直径为6～10mm,深度0.5～1.5mm；更优选地，所述储油池的直径为6～10mm,深度1～1.5mm。

所述微通道为柱体结构。

在一优选例中，所述微通道为柱体结构。

在另一优选例中，所述微通道的宽度为10～100um，深度为10～100μm。

在另一优选例中，所述微通道的宽度为10～30μm，深度为10～30μm。

在另一优选例中，所述微通道的宽度为30～50μm，深度为30～50μm。

在另一优选例中，所述微通道的宽度为50～100μm，深度为50～100μm。

在另一优选例中，所述微通道上下通道壁为透明光学镜面。

在另一优选例中，所述微通道支路的深度与微通道的深度相同。

在一优选例中，所述样品储存池为密闭柱体空腔。

在另一优选例中，所述样品储存池的直径为30～1000μm；优选地，所述样品储存池的直径为30～100μm。

在另一优选中，所述样品储存池的深度为300～500μm。

在另一优选例中，所述微流控芯片还包括至少一个空腔，所述空腔为密闭中空立体结构，分布在样品储存池的周围，与样品储存池不连通。

所述空腔体积为1～10μL(范围)。

在一优选中，所述空腔的数量为两个及两个以上。

在另一优选例中，所述空腔均匀分布在样品储存池周围。

所述微流控芯片的材质选自但不限于石英、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、硼硅玻璃、氟化钙。

本发明的另一方面，提供了一种用于形成单个微粒包裹液滴的微流控芯片装置，该装置包括本发明第一方面提供的微流控芯片和液体进样装置，所述液体进样装置与所述进样口连通。

所述液体进样装置选自但不限于：重力驱动调节进样装置、注射器、蠕动泵、注射泵。

在一优选例中，所述重力驱动调节进样装置包含高度可调样品架、样品容器、导管，所述样品容器通过所述导管与所述进样口连通，所述样品容器可在所述高度可调样品架上上下移动。

在另一优选例中，所述样品容器上下移动的方式为手动调节。

在另一优选例中，所述样品容器上下移动的方式为电动调节。

在另一优选例中，所述高度可调样品架为滑轨设计，滑轨上具有可电动移动的滑块，用于固定样品容器；更佳的，所述高度可调样品架还包括高度调节控制器，所述高度调节控制器控制所述滑块在所述滑轨上进行上下移动。

本发明的另一方面，提供了一种用于形成单个微粒包裹液滴的微流控操作系统，包含本发明所提供的微流控芯片或微流控芯片装置，以及微粒捕获装置，所述微粒捕获装置选自光镊。

本发明采用的光镊装置，为本领域的现有技术。

本发明所述的捕获，是指利用包括光镊在内的微粒捕获装置固定住目标微粒，从而实现在移动本发明微流控芯片时、目标微粒不随芯片移动。

在另一优选例中，所述微流控操作系统进一步包括样品检测装置，所述样品检测装置包括但不限于拉曼检测装置、光学显微镜、荧光显微镜。

在另一优选例中，所述微流控操作系统进一步包括将单个微粒包裹液滴导出的装置，所述将单个微粒包裹液滴导出的装置选自毛细管、移液枪枪头。

本发明的另一方面，提供了一种形成单个微粒包裹液滴并导出的方法，该方法利用本发明提供的微流控芯片或微流控芯片装置或微流控操作系统，并包括步骤：①将所述微流控芯片抽真空；②将微粒相溶液注入在与储油池连通的微通道出口处，依靠空腔提供的负压，微粒相溶液充满样品储存池；③将水相溶液通过微流控芯片的进样口注入到微通道中冲刷微，直至整个微通道部分没有残留微粒，所有芯片内的微粒都位于样品储存池内；④将储油池内流出的水相取走，替换成油相，调节液体进样装置高度，使微通道内的水相与储油池的油相达到平衡，水相与油相的界面停留在微通道靠近储油池的位置；⑤用微粒捕获装置捕获目标微粒拖拽到微通道中，升高液体进样装置高度，使微通道内水相向储油池内流动，释放微粒捕获装置，目标微粒随水相进入储油池并形成包裹有单个目标微粒的液滴；⑥将包裹有单个目标微粒的液滴导出。

所述调节微通道内液体流动的方式包括但不限于重力驱动调节法、注射泵驱动调节法、蠕动泵驱动调节法。

在一优选例中，所述微粒捕获装置从所述样品储存池中捕获目标微粒。

在另一优选例中，所述油相选自矿物油、硅油、氟碳油、植物油、石油醚的一种或多种。

在另一优选例中，所述微粒相含有微粒和与储油池中的油相液体互不相溶的液体；较佳的，所述微粒相为非有机相；更佳的，所述微粒相为水相或非有机缓冲液。

在另一优选例中，所述形成单个微粒包裹液滴并导出的方法还包括样品检测步骤，所述样品检测步骤位于步骤⑤之前，所述样品检测步骤采用的方法选自但不限于拉曼光谱分析、荧光检测、光学显微镜检测、电导检测；

在另一优选例中，所述将包裹有单个目标微粒的液滴导出的方法包括毛细管导出法、移液枪导出法；

在另一优选例中，所述形成单个微粒包裹液滴并导出的方法还包括对导出的目标微粒进行进一步操作，所述操作包含单细胞测序、单细胞形态分析、单细胞培养。

在另一优选例中，所述在样品通道内采集单个微粒的特征信号的方法选自拉曼信号采集、荧光检测、光学显微镜检测；更佳的，采集单个微粒的特征信号的位置为检测池。

在另一优选例中，所述光镊的激光波长为1064nm。

本发明的另一方面，提供了微流控芯片、微流控芯片装置或微流控操控系统的应用，包括单个微粒筛选、单个微粒包裹液滴的形成或单个微粒包裹液滴的导出。

在一优选例中，所述微粒为细胞，包括但不限于细菌、真菌、哺乳动物细胞。

本发明具有以下技术优势：

1.适用于各尺寸微粒，如数十微米的酵母细胞和1微米左右细菌细胞的富集检测。

2.实现了单个细胞的挑选并分离导出，该过程对细胞活性影响低，能成功与下游单细胞测序对接

3.单个微粒筛选移取速度快，单个微粒从芯片内到试管中移取操作时间为15秒左右。

4.芯片可重复利用，降低操作成本。

5.操作简便。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1微流控芯片设计示意图；

图2微流控芯片分选单细胞示意图。

A、待分选细胞悬液全部位于样品储存池(2)中。

B、目标细胞被光镊移动到微通道(3)中。

C、目标细胞随水相进入储油池(1)中，形成单细胞液滴。

主要附图标记：储油池(1)，样品储存池(2)，微通道(3)，进样口(4)，空腔(5)，微通道支路(6)。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。

实施例1微流控芯片的制备：

微流控芯片设计如附图1所示，其通道设计主要包括储油池(1)、样品储存池(2)、微通道(3)、进样口(4)，空腔(5)，微通道支路(6)。其中储油池(1)上层无盖片，为半开放式结构。微通道(3)、样品储存池(2)为封闭结构。样品储存池(2)周围有数个密闭空腔(5)，空腔(5)各个独立，与样品储存池不连通。整个芯片结构通过传统微流控领域光刻法制备，由一层带有通道结构的PDMS与一片双层镜面玻璃键合而成。进样装置为上下高度可调的样品支架，通过液面差将纯水向通入芯片微通道。光镊装置采用1064nm激光。

储油池(1)直径6～10mm,深度1mm左右；右边有微通道连通，微通道(3)的尺寸为10到100μm宽左右，深度为10到100μm(通道尺寸依据所分选细胞决定，细菌这种小尺寸细胞使用10～30μm通道，酵母这种中等尺寸细胞使用30～50μm通道，哺乳动物细胞一般使用50～100μm通道)；微通道支路(6)上连通是样品储存池(2)，样品储存池的体积依据需要分选的数量而定，一般设计为100～1000μm，如果将样品储存池作为单细胞培养用，则为30～100μm直径左右，样品储存池(2)周围分布有密封的空腔(5)；微通道(3)的另一端连通进样口(4)。

芯片制备方法参考传统PDMS微流控芯片制备方法：用CAD软件做出芯片结构图，打印出掩膜。按照软光刻的方法制备出SU-8芯片模具。将PDMS倒入模具，80摄氏度一小时，PDMS固化。将固化后的PDMS从模具上取下，这时PDMS上会留下设计好的通道结构。之后将PDMS层与玻璃通过氧等离子体轰击键合，完成芯片制备。

实施例2荧光大肠杆菌单细胞分选

1.分选开始前，需将荧光大肠杆菌悬液导入芯片的样品储存池(2)中。

利用了PDMS的透气性，首先将芯片置入真空腔同真空泵连接的干燥器内中抽真空，一定时间后取出芯片，将细胞悬液用移液枪点在储油池(1)中的微通道出口处，依靠PDMS残留的负压，尤其是空腔(5)提供的负压，细胞悬液会慢慢充满样品储存池(2)，如图2A所示。之后将纯水接入芯片进样口(4)，连续冲刷微通道(3)。最终，整个微通道(3)部分将没有残留细胞，所有芯片内的细胞都位于样品储存池(2)内。

2.将储油池(1)内的水相取走，替换成油相。此时通过调节液体进样装置高度，使微通道(3)内的水相与储油池(1)的油相达到平衡，界面停留在微通道(3)靠近储油池(1)的位置。

3.开始分选。

荧光大肠杆菌为绿色荧光蛋白，打开荧光光源，切换shutter至蓝光激发。可在视野中观察到发射绿色荧光的大肠杆菌大细胞。利用光镊装置将样品储存池(2)中的目标荧光大肠杆菌单细胞，捕获拖拽到微通道(3)中，如图2B所示。升高进样装置高度，光镊释放，细胞随纯水相流入储油池(1)，被产生的油包水液滴包裹，如图2C所示。用毛细管将所有产生的液滴取出，完成单细胞分离。

整个微流控芯片通过流体力学计算，微通道内纯水相的流动不会干扰到与之相连通的样品储存池，因此除光镊捕获拖拽的目标细胞外，无其他细胞被引入充满纯水相的微通道，保证里单细胞分离的成功率。

Claims (9)

1.一种微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括储油池、样品储存池，微通道、以及进样口，所述微通道两端分别与储油池及进样口连通，所述样品储存池为密闭中空立体结构，样品储存池的出口通过微通道支路与微通道连通；

所述微流控芯片还包括至少一个空腔，所述空腔为密闭中空立体结构，分布在样品储存池的周围，与样品储存池不连通，依靠空腔提供的负压，微粒相溶液充满样品储存池。

2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述储油池为中空立体结构，上层开口，其表面为疏水亲油表面。

3.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微通道为柱体结构，上下通道壁为透明光学镜面。

4.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述空腔的数量为两个或两个以上，均匀分布在样品储存池周围。

5.一种微流控芯片装置，其特征在于，所述微流控芯片装置包括如权利要求1所述的微流控芯片和液体进样装置，所述液体进样装置与所述进样口连通。

6.一种微流控操作系统，其特征在于，所述微流控操作系统包括如权利要求1所述的微流控芯片或权利要求5所述的微流控芯片装置，以及微粒捕获装置。

7.如权利要求6所述的微流控操作系统，其特征在于，所述微粒捕获装置为光镊。

8.如权利要求6所述的微流控操作系统，其特征在于，所述微流控操作系统进一步包括样品检测装置。

9.一种形成单个微粒包裹液滴并导出的方法，其特征在于，所述方法利用如权利要求1所述的微流控芯片或权利要求5所述的微流控芯片装置或权利要求6所述的微流控操作系统，包括步骤：①将所述微流控芯片抽真空；②将微粒相溶液注入在与储油池连通的微通道出口处，依靠空腔提供的负压，微粒相溶液充满样品储存池；③将水相溶液通过微流控芯片的进样口注入到微通道中冲刷微通道，直至整个微通道部分没有残留微粒，所有芯片内的微粒都位于样品储存池内；④将储油池内流出的水相取走，替换成油相，调节液体进样装置高度，使微通道内的水相与储油池的油相达到平衡，水相与油相的界面停留在微通道靠近储油池的位置；⑤用微粒捕获装置捕获目标微粒拖拽到微通道中，升高液体进样装置高度，使微通道内水相向储油池内流动，释放微粒捕获装置，目标微粒随水相进入储油池并形成包裹有单个目标微粒的液滴；⑥将包裹有单个目标微粒的液滴导出。

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