CN111729700A - 一种采用dPCR集成芯片的液滴检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种采用dPCR集成芯片的液滴检测方法，通过液滴生成机构生成初始液滴；将所述初始液滴通过PCR扩增机构进行扩增，得到扩增液滴；将所述扩增液滴通过液滴检测机构排列处理后得到待检测液滴，并对所述待检测液滴进行光学检测；其中，通过分别控制进入液滴生成机构的油相和水相的流速控制待检测液滴通过液滴检测机构的速度。本发明通过在所述水相输送管道的始端设置有水相压力控制机构，在所述油相输送管道的始端设置有油相压力控制机构，实现了水相和油相压力的分别正压控制，水相和油相的压力各自调节，使得得到的初始液滴的尺寸可调节。

Description

一种采用dPCR集成芯片的液滴检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，并且更具体地，涉及到一种采用dPCR集成芯片的液滴检测方法。
背景技术
对于数字液滴PCR技术，主要包含三个单独的技术，即液滴生成技术、PCR热循环扩增技术与液滴检测技术。
现有技术中对于数字液滴PCR技术，Biorad仪器可以进行检测，Biorad的液滴生成方案是在液滴出口处加一个负压，水相和油相在该压力值的作用下流出，导致生成的液滴的结构和尺寸无法改变，且调节负压对液滴大小影响不大。检测精度较低。
基于此，现有技术仍然有待改进。
发明内容
本发明针对上述问题，目的在于提供一种采用dPCR集成芯片的液滴检测方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的实施例公开了一种采用dPCR集成芯片的液滴检测方法，通过液滴生成机构生成初始液滴；
将所述初始液滴通过PCR扩增机构进行扩增，得到扩增液滴；
将所述扩增液滴通过液滴检测机构排列处理后得到待检测液滴，并对所述待检测液滴进行光学检测；
其中，通过分别控制进入液滴生成机构的油相和水相的流速控制待检测液滴通过液滴检测机构的速度。
进一步地，通过控制进入液滴生成机构的油相和水相的流量比控制相邻两个待检测液滴之间的间距。
进一步地，在检测定位点处的检测流道的高度小于待检测液滴的直径，以保证每个液滴的检测厚度相同。
进一步地，将所述初始液滴通过PCR扩增机构进行扩增包括：
将初始液滴经过预热流道预热至第一预定温度后，进入循环流道，在循环流道内进行高温-低温……高温-低温的循环流动，得到扩增液滴。
进一步地，通过液滴生成机构生成初始液滴包括：
分别在油相入口和水相入口处加正压，使油相和水相在预定压力下在两相汇流节点处汇流，得到初始液滴。
进一步地，所述初始液滴在所述PCR扩增机构中的停留时间为20-30分钟。
进一步地，所述循环流道内高温的温度为80-99℃；和/或，
所述循环流道内，低温的温度为45-75℃。
进一步地，油相入口处的压力与所述水相入口处的压力比为(0.9-1.1)：1。
进一步地，所述水相入口处的压力范围为200mbar-1500mbar。
进一步地，所述循环流道包括依次首尾相接的多个单循环流道，每个所述单循环流道包括低温段和高温段，多个所述低温段形成低温区，多个所述高温段形成高温区；
通过第一温度控制装置控制高温区和预热流道的温度，通过第二温度控制装置控制低温区的温度。
本发明的有益效果是：
本发明通过在所述水相输送管道的始端设置有水相压力控制机构，在所述油相输送管道的始端设置有油相压力控制机构，实现了水相和油相压力的分别正压控制，水相和油相的压力各自调节，使得得到的初始液滴的尺寸可调节。
附图说明
图1为本发明一实施例的结构示意图；
图2为本发明又一实施例的结构示意图；
图3本发明一实施例中的两相汇流节点处的示意图；
图4为本发明一实施例中的液滴生成机构的示意图；
图5为本发明一实施例的液滴生成时的状态图；
图6为本发明一实施例的PCR扩增机构的流道示意图；
图7，图8为本发明一实施例的dPCR集成微流控芯片结构示意图；
图9为本发明一实施例的液滴检测机构处的结构示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如图1-图9所示，本发明一些实施例公开了一种dPCR集成微流控芯片，其包括依次顺序连接的液滴生成机构1、PCR扩增机构2和液滴检测机构3。本实施例通过将液滴生成机构、PCR扩增机构2和液滴检测机构3依次顺序连接，使得整个设备集成为一体，消除了因为检测样本在仪器之间的转移，而导致的检测误差，也减少了人工操作，并且大幅的缩短了检测所需要的时间。
在一些优选的实施例中，所述液滴生成机构1包括水相输送管道11、油相输送管道12和液滴输出管道13，所述水相输送管道11的末端、所述油相输送管道12的末端均连通至所述液滴输出管道13的始端，并在所述连通处形成两相汇流节点14，如图3所示；
并且，在所述水相输送管道11的始端设置有水相流速控制机构，在所述油相输送管道12的始端设置有油相流速控制机构，其中，所述水相流速控制机构和所述油相流速控制机构可以通过压力控制或流量控制来实现，如图4所示。
本发明通过在所述水相输送管道11的始端设置有水相压力控制机构，在所述油相输送管道12的始端设置有油相压力控制机构，实现了水相和油相压力的分别正压控制，水相和油相的压力各自调节，使得得到的初始液滴4的尺寸可调节。
本发明实施例得到的液滴尺寸可以在28-110微米之间，且可以根据需要对液滴尺寸进行调节。在同体积样本下，与现有技术相比，本发明可以产生约1-16倍数量的液滴，达到更高的检测精度，可以实现检测更低浓度的样本。以Biorad仪器(QX-200)为例，其实验得出的液滴尺寸为100-110μm，由于其液滴生成方案是在液滴出口处加一个负压，导致水相和油相的压力值就是一样的，当液滴生成的结构和尺寸确定之后，液滴尺寸就确定了，且调节负压大小对液滴大小影响不大无法做到液滴尺寸的调整。
本发明一些实施例所公开的一种dPCR集成微流控芯片，在上述实施例的基础上，液滴生成机构1中，所述水相输送管道11的压力与所述油相输送管道12的压力比值为(0.9-1.1)：1；和/或，所述水相输送管道11的压力范围为200mbar-1500mbar。初始液滴4的大小、生成速率和流动速度可以通过调控油相和水相流量的关系来调整。调控方案为：增加油相流量可以降低液滴大小和提高液滴流动速度；增加水相流量可以提高液滴生成速率；同步增加水相和油相可以实现保持液滴大小不变，提高流动速度。
本发明一些实施例所公开的一种dPCR集成微流控芯片，在上述实施例的基础上，液滴生成机构1中，所述水相输送管道11、油相输送管道12和液滴输出管道13一体成型。
本发明一些实施例所公开的一种dPCR集成微流控芯片，在上述实施例的基础上，液滴生成机构1中，为了实现精确的压力控制，所述油相压力控制结构和所述水相压力控制机构为气体加压控制机构。一些优选的实施方式中，所述油相压力控制机构包括油相气泵121，所述油相气泵121设置在所述油相输送管道12的始端；所述水相压力控制机构包括水相气泵111，所述水相气泵111设置在所述水相输送管路的始端。所述油相压力控制机构还包括油相气管122，所述油相气管122的两端分别连接所述油相气泵121和所述油相输送管道12的始端；所述水相压力控制机构还包括水相气管112，所述水相气管112的两端分别连接所述水相气泵111和所述水相输送管道11的始端。通过水相气泵111和油相气泵121分别对水相和油相的压力进行控制，从而实现水相和油相的流量和流速的分别单独控制，进而使液滴更能满足检测需求。进一步地，在水相气管和油相气管上分别设置气压控制器15，以精确控制气压。
本发明一些实施例所公开的一种dPCR集成微流控芯片，在上述实施例的基础上，液滴生成机构1中，所述两相汇流节点14处，所述水相输送管道11与所述液滴输送管道的中心线在同一直线上。所述两相汇流节点14处，所述油相输送管道12与所述液滴输送管道的中心线呈第一夹角。所述第一夹角优选为直角。液滴的产生机理为两个不相容的液相相互作用，其中一相进入另外一相被剪切或者由于不稳定而分裂成液滴。进行液体输送时，油相可由垂直方向切下，可更好地实现对水相的分割，从而获得尺寸更小的初始液滴4。
本发明一些实施例所公开的一种dPCR集成微流控芯片，在上述实施例的基础上，液滴生成机构1中，所述油相输送管道12包括油相输送总管和至少两个油相输送支管，至少两个所述油相输送支管的始端并联连接至所述油相输送总管的末端，至少两个所述油相输送支管的末端连通至所述液滴输出管道13的始端。即油相输送支管可以为多个，在一些优选的实施方式中，多个油相输送支管的末端可周向均匀地布置在两相汇流节点14处。
具体地，如图4所示，所述油相输送支管可包括第一油相输送支管124和第二油相输送支管125。所述两相汇流节点14处，所述水相输送管道11、所述第一油相输送支管124、所述第二油相输送支管125和所述液滴输送管道呈十字交叉连接，并且，所述水相输送管道11和所述液滴输送管道的中心线在同一直线上。所述油相压力控制机构可设置在油相输送总管，使得任一油相输送支管得到的压力相同。
本发明一些实施例所公开的一种dPCR集成微流控芯片，在上述实施例的基础上，液滴生成机构1中，为了使进入两相汇流节点14处的油相输送稳定，所述油相输送支管在靠近末端处设置有稳流流道123。
本发明一些实施例所公开的一种dPCR集成微流控芯片，如图1和图6至图8所示，所述PCR扩增机构2包括顺序连通的预热流道和循环流道22，
其中，所述预热流道用于使液滴加热至第一预定温度；
所述循环流道22包括间隔设置的多个高温段223和多个低温段224，使液滴在所述循环流道22内进行高温-低温……高温-低温的循环流动；
所述预热流道的始端连通所述液滴输出管道13的末端；
所述循环流道22的末端连通至液滴检测机构3。
PCR扩增机构2用于将包含样本溶液的液滴即初始液滴4进行循环升降温，从而达到PCR扩增所要求的温度要求与持续时间要求。本实施例通过使微小液滴先预热道第一预定温度，然后在所述循环流道22内进行高温-低温……高温-低温的循环流动，实现了液滴的快速扩增，可在20-30分钟内完成扩增。而现有技术中，标准的PCR流程通常需要几个小时的时间才能完成。
本发明一些实施例所公开的一种dPCR集成微流控芯片，在上述实施例的基础上，所述循环流道22包括依次首尾相接的多个单循环流道221，每个所述单循环流道221包括低温段224和高温段223。相邻的两个所述单循环流道221的首尾之间通过弯折流道222连接。
本发明一些实施例所公开的一种dPCR集成微流控芯片，在上述实施例的基础上，所述循环流道22一体成型。一些实施例中，所述预热流道和所述循环流道22一体成型。还有一些实施例中，水相输送管道11、油相输送管道12、液滴输出管道13、所述预热流道和所述循环流道22一体成型。
本发明一些实施例所公开的一种dPCR集成微流控芯片，在上述实施例的基础上，所述PCR扩增机构2还包括第一温度控制装置和第二温度控制装置，所述第一温度控制装置控制所述预热流道和所述高温段223的温度，所述第二温度控制装置控制所述低温段224的温度。通过第一温度控制装置和第二温度控制装置实现精确的温度控制，从而进一步保证扩增的顺利快速进行。
需要指出的是，本发明的dPCR集成微流控芯片，基于PCR扩增的需要，也可以设置多于两个温度控制区域，如可以设置为低温…中温…高温循环的方式进行流动来完成扩增。
本发明一些实施例所公开的一种dPCR集成微流控芯片，在上述实施例的基础上，所述PCR扩增机构2还包括垫板25，所述预热流道和所述循环流道22安置在所述垫板25上，并且，所述高温段223和所述预热流道与垫板25之间设置有第一加热片23，所述低温段224与垫板25之间设置有第二加热片24。即加热片位于垫板25和流道之间。在一些实施方式中，为了方便第一加热片23和第二加热片24的布置，预热流道与循环流道22一样，设置成蛇形流道，可以使蛇形流道中单个流道的长度不大于高温段223的长度，使得第一加热片23和第二加热片24可以设置为容易加工和控制的矩形，同时，还能尽可能地避免第一加热片23的加热区域与第二加热片24的加热区域互相干扰。
多个所述单循环流道221长度相同且平行布置在同一平面上，使多个所述低温段224形成低温区226，多个所述高温段223形成高温区225。
本发明一些优选的实施方式，在上述实施例的基础上，所述第一温度控制装置包括第一加热片23，所述第一加热片23贴装在所述预热流道和所述循环流道22的高温段223上；所述第二温度控制装置包括第二加热片24，所述第二加热片24贴装在所述循环流道22的低温段224上。
本发明一些优选的实施方式，在上述实施例的基础上，可将预热流道和循环流道22设置成可以在垫板25上进行横向位移的结构，使得高温段223和低温段224的长度可以根据需要进行调整，此时，预热流道的宽度应小于高温段223的长度，保证在移动过程中预热流道不会收到影响，满足更精确的扩增温度要求，从而实现更佳的扩增速度。
控制方案为：高低温区226的温度可以通过外部热板进行分别调控；液滴在每个温度下的保持时间可以通过液滴的流速与流道的长短来控制；循环数则可以通过改变流道的循环数即可调整。上述实施例提供的PCR扩增机构2，液滴的循环温度的高低、每个温度下的保持时间和循环数都可控。可以根据PCR扩增的要求通过调整流速和流道结构尺寸来调整。具体而言即需要增加保持时间时，可降低流速与增长流道尺寸，反之亦然。
本发明一些优选的实施方式，在上述实施例的基础上，所述液滴检测机构3在检测定位点处的检测流道的高度小于待检测液滴的直径，以保证每个液滴的检测厚度相同。所述检测定位点相对应的位置设置有光学检查系统。
本发明一些实施例还公开了一种采用dPCR集成芯片的液滴检测方法，
通过液滴生成机构生成初始液滴；
将所述初始液滴通过PCR扩增机构进行扩增，得到扩增液滴；
将所述扩增液滴通过液滴检测机构排列处理后得到待检测液滴，并对所述待检测液滴进行光学检测；
其中，通过分别控制进入液滴生成机构的油相和水相的流速控制待检测液滴通过液滴检测机构的速度。
本发明通过在所述水相输送管道的始端设置有水相压力控制机构，在所述油相输送管道的始端设置有油相压力控制机构，实现了水相和油相压力的分别正压控制，水相和油相的压力各自调节，使得得到的初始液滴的尺寸可调节。
本发明一些实施例公开的一种采用dPCR集成芯片的液滴检测方法，在上述实施例的基础上，通过控制进入液滴生成机构的油相和水相的流量比控制初始液滴的大小和相邻两个待检测液滴之间的间距。
本发明一些实施例公开的一种采用dPCR集成芯片的液滴检测方法，在上述实施例的基础上，在检测定位点处的检测流道的高度小于待检测液滴的直径，以保证每个液滴的检测厚度相同。
本发明一些实施例公开的一种采用dPCR集成芯片的液滴检测方法，在上述实施例的基础上，将所述初始液滴通过PCR扩增机构进行扩增包括：
将初始液滴经过预热流道预热至第一预定温度后，进入循环流道，在循环流道内进行高温-低温……高温-低温的循环流动，得到扩增液滴。
通过液滴生成机构生成初始液滴包括：
分别在油相入口和水相入口处加正压，使油相和水相在预定压力下在两相汇流节点处汇流，得到初始液滴。
所述初始液滴在所述PCR扩增机构中的停留时间为20-30分钟。所述预热流道和所述循环流道的尺寸由液滴在流道内需要的保持时间和流速决定，在使用中通过控制水相和油相的流量来进一步调节液滴在流道内需要的保留时间。
所述循环流道内，高温的温度为80-99℃或88-98℃；和/或，
所述循环流道内，低温的温度为45-75℃或60-65℃。
即液滴经过的区域分为三个区域，第一个区域是液滴预热区，液滴会从常温加热到95℃，然后进入温度循环区，包括高温区95℃和低温区60℃，液滴在流道中来回循环流动，进而实现了DNA的扩增。液滴在流道中流动即可快速在高低温下变化，突破了传统的加热方式中热板的加热与冷却的长耗时问题。每个温区液滴停留的时间可以根据需求调节气压泵的气压来控制，一些实施方式中，一个流道左右长度为53毫米，液滴通过的时间可以在5～60秒之间控制，一共30条流道，即1个循环可以控制在5～60秒之间(也可以更慢到准静态流动)，30个循环。其扩增速度远远高于采用单个温控板升降温(一个升降温循环最快需要180秒)的扩增速度。
本发明一些实施例公开的一种采用dPCR集成芯片的液滴检测方法，在上述实施例的基础上，初始液滴生成时，油相入口处的压力与所述水相入口处的压力比为(0.9-1.1)：1。所述水相入口处的压力范围为200mbar-1500mbar。
本发明一些实施例所公开的dPCR集成芯片及检测方法，所述循环流道包括依次首尾相接的多个单循环流道，每个所述单循环流道包括低温段和高温段，多个所述低温段形成低温区，多个所述高温段形成高温区；通过第一温度控制装置控制高温区和预热流道的温度，通过第二温度控制装置控制低温区的温度。
本发明一些实施例所公开的dPCR集成芯片及检测方法，如图9所示，在液滴检测阶段，检测流道用于将液滴排成单列且相互间隔一定距离后通过该流道，以便于光学检测系统来统计流过该流道的阳性液滴和阴性液滴的数量。
阳性液滴指的是液滴中包含目标DNA，然后经过循环扩增后液滴中包含了大量的DNA，双链DNA会与液滴中的荧光基团结合而产生荧光。阴性液滴则是没有荧光。
其结构与液滴生成机构相似，也是从侧部通入油相，该流道可以控制液滴的通过速度与液滴之间的间距，并且可以保证有荧光的液滴的信号强度都保持一致。目前市场上没有产品中使用过类似流道。
调控方案为：液滴通过检测区的速度可以通过控制油相的流速来调控，油相加入的速度越大，则液滴通过检测区的速度就越快；液滴之间的间距可以通过控制油相入口与液滴入口两相的流量比值来控制，油相入口处的流量越大，液滴的间距就越大；为了保持有荧光的液滴的信号都保持一致，我们把流道的高度设计为比液滴直径小，所以每一个液滴在经过该流道时都被压缩成和流道高度一样高，则液滴Z轴方向上的厚度一样，所以在Z轴方向上检测时，液滴的荧光强度不会受液滴厚度影响。
实施例
配置检测标准溶液：
每个样本液体积20μl，DNA浓度分别为以2倍梯度稀释，DNA浓度范围在1000-10copies/μl，另加一组空白对照组。
检测结果：与biorad的芯片相比，检测准确性相同，检测速度比biorad的芯片快12倍。
综上所述，采用本发明设计的芯片，检测速度可以提高12倍。现有技术中，例如型号Biorad品牌QX-200系列三台仪器做检测需要时间4小时，采用本发明的芯片和检测技术，同样的检测只需要20分钟。检测精度0.25copies/μl。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

Claims (10)

1.一种采用dPCR集成芯片的液滴检测方法，其特征在于，
通过液滴生成机构生成初始液滴；
将所述初始液滴通过PCR扩增机构进行扩增，得到扩增液滴；
将所述扩增液滴通过液滴检测机构排列处理后得到待检测液滴，并对所述待检测液滴进行光学检测；
其中，通过分别控制进入液滴生成机构的油相和水相的流速控制待检测液滴通过液滴检测机构的速度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过控制进入液滴生成机构的油相和水相的流量比控制相邻两个待检测液滴之间的间距。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在检测定位点处的检测流道的高度小于待检测液滴的直径，以保证每个液滴的检测厚度相同。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述初始液滴通过PCR扩增机构进行扩增包括：
将初始液滴经过预热流道预热至第一预定温度后，进入循环流道，在循环流道内进行高温-低温……高温-低温的循环流动，得到扩增液滴。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过液滴生成机构生成初始液滴包括：
分别在油相入口和水相入口处加正压，使油相和水相在预定压力下在两相汇流节点处汇流，得到初始液滴。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述初始液滴在所述PCR扩增机构中的停留时间为20-30分钟。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述循环流道内高温的温度为80-99℃；和/或，
所述循环流道内，低温的温度为45-75℃。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，油相入口处的压力与所述水相入口处的压力比为(0.9-1.1)：1。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述水相入口处的压力范围为200mbar-1500mbar。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述循环流道包括依次首尾相接的多个单循环流道，每个所述单循环流道包括低温段和高温段，多个所述低温段形成低温区，多个所述高温段形成高温区；
通过第一温度控制装置控制高温区和预热流道的温度，通过第二温度控制装置控制低温区的温度。
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