WO2018172161A1 - Mikroskop und verfahren zum abbilden eines objekts - Google Patents

Mikroskop und verfahren zum abbilden eines objekts Download PDF

Info

Publication number
WO2018172161A1
WO2018172161A1 PCT/EP2018/056434 EP2018056434W WO2018172161A1 WO 2018172161 A1 WO2018172161 A1 WO 2018172161A1 EP 2018056434 W EP2018056434 W EP 2018056434W WO 2018172161 A1 WO2018172161 A1 WO 2018172161A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
imaging
spherical aberration
region
phase difference
radiation
Prior art date
Application number
PCT/EP2018/056434
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Michael GÖGLER
Thomas OHRT
Markus Sticker
Original Assignee
Carl Zeiss Microscopy Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Microscopy Gmbh filed Critical Carl Zeiss Microscopy Gmbh
Priority to US16/495,748 priority Critical patent/US11061216B2/en
Priority to CN201880019526.0A priority patent/CN110476102B/zh
Publication of WO2018172161A1 publication Critical patent/WO2018172161A1/de

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01M—TESTING STATIC OR DYNAMIC BALANCE OF MACHINES OR STRUCTURES; TESTING OF STRUCTURES OR APPARATUS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • G01M11/00—Testing of optical apparatus; Testing structures by optical methods not otherwise provided for
    • G01M11/02—Testing optical properties
    • G01M11/0242—Testing optical properties by measuring geometrical properties or aberrations
    • G01M11/0257—Testing optical properties by measuring geometrical properties or aberrations by analyzing the image formed by the object to be tested
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/02—Objectives
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/14—Condensers affording illumination for phase-contrast observation
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
    • G02B27/0025—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00 for optical correction, e.g. distorsion, aberration

Definitions

  • the invention relates to a method for imaging an object by means of a microscope, which comprises a lens and a correction optics.
  • the objective defines an optical axis and a focal plane perpendicular thereto.
  • the correction optics can be adjusted to match a depth position and corrected on the lens a spherical aberration, which occurs when imaging the object with a certain depth of the focal plane.
  • the invention relates to such a microscope.
  • microscopes In research, microscopes often have a high degree of flexibility, since experiments of all kinds are carried out. Both the objects to be viewed and the slides can vary greatly. For high numerical aperture objectives, deviations of refractive index on an optical path from a focal plane in the object to the objective have a strong influence on the diffraction-limited
  • One way to adjust the spherical aberration of the image of the object to different slide thicknesses, such as cover glass thicknesses of 0.15 mm to 1.5 mm, is to set a correction ring on the lens to the appropriate value and thus the spherical aberration in the image to reduce.
  • US 2008/31001 6 A describes a correction of the spherical aberration with regard to the thickness of a cover glass.
  • US 2005/024718 A and JP 2005/043624 A2 propose that the user inputs optical parameters, from which a correction of the spherical aberration is derived.
  • US 201 1/141260 A and US 2014/233094 A describe iterative correction methods for spherical aberration, which evaluate the contrast or the brightness by image analysis.
  • DE 1 02014002584 A1 discloses a geometrical path length position of an object point consuming by optical coherence tomography in order to improve the imaging quality.
  • WO 2013/130077 uses SLMs for lighting and imaging.
  • the object of the invention is to provide a method and a microscope for imaging an object, by means of which the object can be imaged as little or no aberration as possible.
  • a microscope which comprises a lens and adjustable correction optics.
  • the objective defines an optical axis and a focal plane perpendicular thereto.
  • the correction optics corrected on the lens a spherical aberration, which occurs in a picture of the object.
  • a setting value applies to a specific depth of the focal plane.
  • the method comprises the following steps: illuminating the object with radiation; Detecting the radiation reflected or transmitted by the object; Performing a quantitative phase contrast map for determining a phase difference of radiation from a first lateral area and a second lateral area of the object, wherein the spherical aberration of the image of the object in the first area is known or the correction required for this purpose; Using a relationship between the phase difference and a change in the spherical aberration caused thereby to determine a set value of the correction optics so that the spherical aberration in the second region is reduced; and adjusting the correction optics to the set value and imaging the object in the second range.
  • the spherical aberration in absolute values need not be known.
  • the method relates to a first region for which the spherical aberration is corrected by the correction optics or is correctable.
  • the correction optics can be very easily adjusted so that the object is imaged in the second area with the least possible spherical aberration.
  • first the correction optics are adjusted such that the first region is imaged with the lowest possible spherical aberration.
  • the method then provides, without further effort, aberration-free or aberration-free imaging also of the second region by first performing the phase contrast imaging and then taking into account the relationship between spherical aberration variation and phase contrast, the appropriate adjustment of the second optic correction optics.
  • the combination of phase contrast imaging and use of a relationship that reflects the change in spherical aberration thus allows a particularly simple procedure.
  • the context indicates an adjustment of the correction optics as a function of the phase contrast, in particular the change of the setting.
  • the change in the spherical aberration is thus converted directly into a setting of the correction optics.
  • the phase difference is determined with a quantitative phase contrast image.
  • a quantitative phase contrast imaging device optionally has a light source and a detector for determining the phase difference. This determination of the phase difference is equally possible in reflected-light and transmitted-light methods.
  • a microscope for imaging an object includes a lens, an adjustable one
  • Correction optics a drive, a quantitative phase contrast imaging device and a control device.
  • the objective defines an optical axis and a focal plane perpendicular thereto.
  • the correction lens corrects a spherical aberration on the lens, which occurs when imaging the object.
  • a setting value of the correction optics applies to a specific depth position of the focal plane.
  • the drive adjusts the correction optics.
  • the quantitative phase contrast imaging device is designed to illuminate the object with radiation, to detect the radiation reflected or transmitted by the object, and to determine a phase difference of radiation from a first lateral area and a second lateral area.
  • In the control device is a relationship between the
  • the controller controls the drive based on the relationship such that the spherical aberration in the focal plane in the second region is reduced.
  • the correction optics can be adjusted according to the lateral area being scanned so that the spherical aberration is minimized for the entire image.
  • Another advantage is that the determination of the phase difference by the quantitative phase contrast imaging makes little or no damage to the object, since the radiation used for this purpose interacts only weakly or not with the object.
  • the method can be performed, for example, by means of the control device of the microscope.
  • the controller may be configured, for example, as a microprocessor, electrical circuit, computer, or any other programmable device.
  • the microscope used for the method can perform different types of imaging depending on the embodiment.
  • the microscope can be designed for wide field imaging and / or for scanning imaging techniques, such as confocal microscopy.
  • the object comprises the sample to be imaged and a mounting medium or embedding medium surrounding the sample.
  • the object has, for example as a sample, a cell culture to be imaged and, as a medium, the solution in which the cell culture is embedded.
  • the lens is used to image the object, but can also be used for lighting.
  • the lens has an optical axis.
  • the focal length determines the depth of the focal plane.
  • the lens and / or an object holder are optionally provided with a z-drive, which determine the position of the focal plane in the object.
  • the z-drive may be connected to the control device, so that the control device, the depth of the
  • control device optionally detects the current position of the focal plane, for example by means of the position assumed by the z-drive.
  • the correction optics are used to correct the spherical aberration that occurs when imaging the object.
  • the correction optics may be the correction ring on the objective as described above, but it is also possible for optical lenses spaced apart from the objective
  • the correction optics can be arranged, for example, on the detector side.
  • the correction optics may comprise optical elements which deflect radiation differently depending on their position relative to the optical axis.
  • the adjustment of the correction optics is carried out by means of a drive which is connected by cables or wirelessly with the control device.
  • the control device can detect the position of the drive and thus the current setting value of the correction optics.
  • phase difference that causes the radiation from the first region and the second region through the object is proportional to an optical path length difference that the radiation from the first region and from the second region respectively to the Travels detector.
  • This optical path length difference is responsible for the spherical aberration.
  • the phase difference satisfies the following equation (1):
  • ⁇ is the phase difference
  • ⁇ is the wavelength of the radiation for determining the phase difference
  • n2 is the refractive index in the second region
  • n1 is the refractive index in the first region
  • d is a path length.
  • the path length d is the range, e.g. the thickness of the sample from which radiation contributes to the image.
  • the phase difference measurement can be used to determine the thickness or refractive index of the sample. If the refractive index is constant and known, the sample thickness can be derived from the phase data. If the thickness is known (and constant), the refractive index can be derived.
  • the depth of field of the objective is relevant for this purpose, namely u. a. if the sample is much thicker than the depth of field.
  • the sample thickness is critical to the path length d. If the wavelength and path length d are constant, the phase difference depends only on the difference in refractive indices between the first region and the second region.
  • the relationship links the difference between the refractive index and a spherical aberration caused thereby with the phase difference or the optical path length difference.
  • the context can be a formula or a table.
  • the relationship is detected once by determining different refractive indices for the object and stored as a table; This calibration can also be repeated regularly for the microscope. By interpolation, the most different values of the phase difference can be determined in a very good approximation.
  • the path length d is used in embodiments as a constant factor in the context. For the implementation of the microscopy method or in the microscope is therefore in
  • Embodiments used an indication of this (constant) path length d.
  • the indication can be obtained differently for different embodiments.
  • the path length d is equal to the sample thickness when the depth of focus range of the objective used is greater than the sample thickness and the sample thickness is fully within the depth of focus range.
  • the sample thickness varies over the object field.
  • the thickness d may for example be defined in histological sections or by the dimensions of a microfluidic channel or determined by other methods.
  • it is possible to determine a "mean" refractive index of the sample for example, with a low-magnification objective and then later this parameter for a fluorescence measurement with a high-resolution
  • the depth of focus range can be assumed to be the value for d.
  • Path length difference measurement to be carried out at an interface between a biological sample to be microscoped and a surrounding medium, for example nutrient medium.
  • Phase difference measurements or path length difference measurements are known in microscopy (cf the publications mentioned below), and it is without problems possible for a person skilled in the art to set up a microscope for such a measurement.
  • the phase difference between sample and a surrounding medium for example nutrient medium.
  • Path length difference differs in that the refractive index of the surrounding medium is different.
  • this is done by the fact that the surrounding medium is dispersive, ie shows a wavelength dependence of the refractive index, and the two measurements are carried out at different wavelengths.
  • the medium is exchanged between the two measurements for a medium with a different refractive index.
  • the path length difference (or phase difference) in each of the two measurements results from the product of path length d and refractive index difference between medium and sample.
  • This system of equations can be solved without problems and both the path length difference and the (a priori unknown) refractive index of the sample can be determined.
  • the knowledge of the path length d now makes it possible, without interpolation, to use or determine the different values of the phase difference to a very good approximation outside the interface between sample and medium used for the determination of d.
  • the control device determines a setting value to set the correction optics accordingly.
  • the setting value optionally depends on the current position of the correction optics and the desired position determined from the relationship.
  • the current setting value of the correction optics is known, for example, from the knowledge of the spherical aberration in the first area. Further, the set value may also indicate an absolute position of the correction optics.
  • the object is displayed in the second area. It is preferred in a development that the relationship is modified with respect to a penetration depth.
  • the penetration depth is the depth at which the focal plane lies below the sample surface as seen in the imaging direction.
  • measuring the penetration depth comprises detecting an interface between a slide and the object and detecting a position of the focal plane.
  • the penetration depth is in
  • Embodiments relevant to the path of radiation from the interface to the lens are relevant to the penetration depth.
  • various possibilities are conceivable. If, for example, the distance between the object carrier and the objective and the focal length of the objective are known, the penetration depth can be determined from this difference.
  • the interface between the object and the slide is determined, for example by detecting the reflection of radiation caused at the interface if the focal plane of the objective coincides with the boundary surface. Since preferably the control device can detect the focal length of the objective via the z-drive, the position of the interface can be detected. The penetration depth is then detected by recording the adjustment of the focal length of the objective by means of the z-drive and thus the current focal plane is known.
  • the penetration depth is then the difference between the instantaneous focal plane and the interface. It is also possible to obtain a tomographic phase image, for example by measuring the phase differences in different z planes (focal planes). Thus one obtains an xyz phase relationship of the sample. From this it is now possible to determine a refraction index determined for each penetration depth. If, for example, one wishes to make a fluorescence measurement at 20 ⁇ m penetration depth, the refractive indices can be averaged over the first 20 ⁇ m and incorporated into the correction of the spherical aberration. If you find yourself 100 ⁇ deep in the sample you must over 100 ⁇ m ity.
  • phase differences are determined in a plurality of mutually spaced object planes.
  • a thick sample is z. B. detected in several z-layers by a so-called z-stack.
  • the recording of the phase differences in several object planes, ie by z-stack, is particularly helpful if the exact positions of the focal planes for imaging the object are not yet known when determining the setting values.
  • the phase difference is first measured, then the spherical aberration is corrected, and then this focal plane is corrected is shown.
  • phase difference is measured again, the spherical aberration is corrected if necessary and subsequently the object is imaged in the changed focal plane.
  • embodiments employ a holographic quantitative phase contrast imaging technique known as Digital Holography Microscopy.
  • phase contrast imaging coherent or partially coherent radiation may be used.
  • Phase contrast m at least two wavelengths to use for which the object, in particular the medium, a significant and known refractive index difference.
  • the quantitative phase contrast map is a ptychographic
  • the quantitative phase contrast imaging light source may comprise a spatial light modulator, or the phase of the radiation used for the quantitative phase contrast imaging is optionally varied. Furthermore, the radiation for the quantitative phase contrast imaging can be generated from different illumination angles. Examples of a quantitative phase contrast imaging device or methods performed therewith are disclosed in US Pat
  • the phase difference caused by the object is, as already mentioned, measured between two lateral areas, which are spaced apart in an object plane.
  • the object plane is identical to or parallel to the focal plane.
  • the correction of the spherical aberration is the more precise, the closer the object plane is to the focal plane for imaging the object.
  • determination of the phase difference and subsequent imaging of the object are performed by the same objective, wherein the object plane lies in the focal plane.
  • the phase difference is determined once in a certain object plane and subsequently the object is imaged in different focal planes.
  • the one-time determination of the phase difference in an object plane nevertheless represents a very good approximation for phase difference in the focal plane.
  • the lateral regions between which the phase difference is determined can be approximately punctiform, in particular when the microscope performs a scanning imaging process. Is an imaging procedure for quantitative
  • Phase contrast imaging used not only two lateral areas, but many lateral areas can be detected simultaneously.
  • the first region is chosen in embodiments such that the spherical aberration is known or compensated for it. This includes, for example, that the spherical aberration for imaging the object from the focal plane in the first region has already been minimized. This is the case, for example, if the correction optics is set as the default value for a region of the object with a specific refractive index, which, among other things, can take place automatically. Such a default may be appropriate, for example, for water or an aqueous solution surrounding samples to be imaged, such as a cell or other biological samples.
  • the knowledge of the setting for compensating the spherical aberration in the first area optionally includes the knowledge of the setting value for the correction optics, for which the spherical aberration is minimized, for example.
  • the object is first imaged without further correction of the spherical aberration to detect where regions of known refractive index are present. Further, it is possible for the spherical aberration to be corrected manually, also with the aid of the control device and the drive, until the imaging of the object in the first region is optimal.
  • the first region may also be such a region in which the sample to be imaged is not present in the object, and the first region is then measured for air.
  • the object thus optionally includes the sample to be imaged as well as its surroundings.
  • the second area is in particular the area of the object which is interesting for the examination to be carried out.
  • the second area has i.d.R. a refractive index, which differs from the refractive index in the first region, since otherwise a correction of the spherical aberration yes would not be necessary.
  • the refractive index is usually not known in the second region, so that the mere determination of the phase difference between the first region and the second region helps to optimize the spherical aberration for imaging the entire object.
  • a third lateral area of the object is used for which the same refractive index is present within a tolerance range as for the second area, wherein the setting value for the second area is also used to image the third area.
  • the third lateral region may be an area in the focal plane of the object for which the refractive index is expected to be nearly identical to the refractive index in the second region.
  • the second region and the third region may be within a cell, so that the refractive index for both regions and thus also the spherical aberration for their imaging are approximately equal.
  • the refractive indices of the various relevant sample areas can be, for example It is recommended to correct for a spherical aberration for the sample area.
  • L It is possible to provide an acceptable correction of spherical aberration with a reduced number of determinative phase differences.
  • the measurement speed for the imaging of the object can also be increased in this way since, if the same setting value is used for the third area as for the second area, a time-consuming adjustment of the correction optics during the imaging of the object is dispensed with. The same applies to z-stack shots.
  • At least one parameter is detected, which is a temperature of the object, a material of a slide, a slide thickness, an immersion medium for the objective or a wavelength of radiation for imaging the object, the relationship being modified with respect to the at least one parameter.
  • a temperature of the object a material of a slide, a slide thickness, an immersion medium for the objective or a wavelength of radiation for imaging the object, the relationship being modified with respect to the at least one parameter.
  • the spherical aberration in the imaging by means of the lens is temperature-dependent.
  • the temperature of the object is determined by detecting an energy parameter of a radiation for illuminating the object and determining the temperature of the object from the energy parameter.
  • the energy parameter can be, for example, the intensity or the power of the illumination radiation.
  • a power detector or an intensity detector can be used. Due to the energy parameter and the expected or known absorption of the illumination radiation by the object, the temperature in the object can be calculated. To calculate the temperature, the type of object can also be used, namely to what extent the absorption behavior of the respective object is. In this way, the relationship with regard to the temperature can be automatically modified.
  • the spherical aberration depends on the refractive index of dispersive materials on the wavelength, the spherical aberration is then also wavelength dependent.
  • the wavelength of the radiation for the imaging of the object is thus another parameter with respect to which the relationship can be modified to improve the setting of the spherical aberration.
  • the wavelength can be entered manually; especially in fluorescence imaging, the wavelength of the induced
  • Fluorescence radiation known to the controller and / or the user. Moreover, it is possible that the microscope is provided with a wavelength sensor, by means of which the wavelength of the imaging radiation can be determined automatically. Optionally, illumination wavelength and / or filter settings can be considered.
  • the method can be used to determine the refractive index of the object in the second region. This has already been explained above with reference to equation (1).
  • it is possible in this development to determine the refractive index in the sample for example, it is thus possible with knowledge of the refractive index of an aqueous medium surrounding a cell culture, to determine the refractive index in the cell culture itself. It can then be used to adjust the correction optics.
  • phase difference be determined by means of quantitative phase contrast imaging, optionally with the radiation for quantitative phase contrast imaging in the infrared range.
  • Phase contrast imaging is known to cause few radiation damage in the object. This works particularly well when infrared radiation is used. Furthermore, the use of infrared radiation has the advantage that an interaction with some fluorescent substances in fluorescence images can be avoided. It is understood that the features mentioned above and those yet to be explained not only in the specified combinations, but also in others
  • Fig. 1 is a schematic view of the microscope
  • FIG. 2 shows an objective and a slide with an object of the microscope of FIG. 1 arranged thereon;
  • Fig. 3 is an enlarged view of an embodiment of the slide with the
  • Fig. 4 is a schematic representation of the object.
  • Fig. 5 is a block diagram illustrating a method of imaging the object.
  • a microscope 10 permits imaging of an object 12.
  • the radiation reflected or transmitted by the object 12 is collected by an objective 14 and imaged onto an imaging detector 16 by means of an imaging beam path 18.
  • the objective 14, the imaging detector 16 and / or the imaging beam path 18 are arranged in the housing 20 of the microscope 10.
  • the imaging beam path 18 may be formed for various types of imaging of the object 12.
  • the object 12 can be recorded in the wide field or by means of a scanning imaging method.
  • the microscope 10 can be designed for fluorescence measurements.
  • the imaging beam path 18 has different optical elements and / or further components, such as a scanning device for deflecting radiation. These components are not shown in Fig. 1.
  • the object 12 can be illuminated, for example with an incident light source or with the transmitted light source 22 shown in FIG. 1.
  • the light source 22 can, for example, generate white light or emit radiation with a specific wavelength range that is suitable for fluorescence microscopy.
  • the imaging detector 16 is designed to convert an optical image of the object 12 produced thereon by means of the imaging beam path 18 into electrical signals which are transmitted via a line to a control device 24.
  • the control device 24 generates an electronic image from the electrical signals provided by the imaging detector 16, which is displayed, for example, on a display device 26 connected to the control device 24, such as a monitor, the experimenter.
  • the object 12 is arranged on a slide 28, which has a certain
  • the slide 28 may be, for example, a glass sheet. Further, the slide 28 may be the bottom of a glass or plastic petri dish. The slide 28 may be movably mounted with respect to the housing 20, so that the object 12 is mounted displaceably relative to the lens 14.
  • the microscope 10 optionally has a plurality of lenses 14, which are arranged on a revolver 30.
  • the lens 14, which is to be used for imaging are pivoted.
  • the turret 30 can be manually adjusted or moved via a turret drive which is connected to the control device 24.
  • Turret drive and the connection to the control device 24 are not shown in Fig. 1.
  • At least one of the lenses 14 is provided with a correction optics 32.
  • the correction optics 32 is adjustable and serves to change a spherical aberration of the image of the object 12. Depending on the depth of a focal plane in the object, the spherical aberration changes, so that by adjusting the correction optics 32, the spherical aberration in the imaging of the object 12 m are minimized can.
  • the objective 14 shown on the right in FIG. 1 and the objective 14 shown in FIG. 2 have a correction ring as correction optics 32. It is firmly connected to the lens 14 and rotated by a drive 34.
  • the drive 34 is connected to the control device 24 by means of a line or by radio, wherein in Fig. 1 and 2, the connection is not shown. Som it is
  • Controller 24 is able to drive the drive 34 and to influence the spherical aberration of the image of the object 12.
  • the control device 24 can detect the current setting of the correction optics 32 by means of the drive 34.
  • the correction optics 32 may be arranged detached from the objective 14. In the lens 14 shown on the left in FIG. 1, the correction optics 32 are arranged in the imaging beam path 18. It too is provided with a drive 34.
  • the microscope 10 further comprises a quantitative phase contrast imaging device 36.
  • the quantitative phase contrast imaging device 36 may comprise a wide variety of types by means of which quantitative phase contrast imaging can be performed. For example, reference is made here to the methods described above.
  • the quantitative phase contrast imaging device 36 is configured, a
  • the means for quantitative phase contrast imaging 36 comprises an optional illumination device and a phase detector or phase camera 44.
  • the illumination device generates, for example, white light or infrared light which is emitted by means of the objective 14 and the
  • Correction optics 32 is imaged on the phase detector 44. In order to detect the
  • phase detector 44 Phase difference to couple out radiation from the imaging beam path 18 to the phase detector 44, a beam splitter 46 is provided.
  • the phase detector 44 detects the
  • Phase difference between radiation from the first region 40 and the second region 42 is configured to determine phase differences between the first region 40 and a plurality of second regions.
  • the control device 24 is connected to a memory device 48, in which a relationship between the phase difference and a change in the spherical aberration caused thereby is stored.
  • This relationship may have been determined by prior calibration and represents, for example, a table
  • Memory device 48 may be formed as part of the controller 24, which may include a microprocessor, a computer, or the like; the memory device 48 may be a writable memory such as a random access memory (RAM).
  • RAM random access memory
  • Controller 24 retrieves the context from memory device 48 and thus determines a setting value for correction optics 32 with which the spherical aberration for the imaging of object 12 in second area 42 is reduced.
  • the connection can be, for example, the change of the spherical aberration in the form of an adjustment of the
  • Correction optics for example, the correction ring included. This can be the specification of a change. The relationship may in particular have been determined by previous experiments on a sample with a known refractive index distribution. Alternatively, he can be computed from the structure of the correction optics win.
  • the controller 24 then drives the actuator 34 in accordance with the set value so that the spherical aberration of the image of the object 12 in the second region 42 is reduced, preferably minimized or fully compensated. Then the object 12 is imaged in the second area 42.
  • the microscope 10 further has an interface 50, by means of which a plurality of parameters of the experiment can be entered and thus made available to the control device 24.
  • the interface 50 is for example a keyboard or a mouse and connected to the control device 24.
  • FIG. 4 schematically shows the object 12, which here consists of a biological sample 52 in an embedding medium 53. Further, the areas 40 and 42 are shown schematically, in where the phase contrast measurement takes place.
  • F1 and F2 denote two different ones
  • the thickness of the dashed focal planes illustrates the depth of field.
  • a homogeneous refractive index of the sample 52 it is necessary to correct for the lateral area 40 differently than for the lateral area 41 when the focal plane F2 is present, since there the lateral area 40 is completely filled by the sample and its refractive index, the lateral region 42, however, not. This situation can always occur when a sample is to be microscopically examined 52 m, whose height H is much larger than the depth of field and which at the same time has no constant thickness over its lateral extent.
  • phase differences in different planes between the objective and the desired object plane are determined and the intervening layers between the cover glass 28 and the focal plane F1 actually desired in the object are taken into account for the correction. If only the focal plane F1 is considered, it can be seen that no phase differences result in the lateral regions 40 and 42 due to the geometry of the sample 52 (homogeneous refractive index of the sample 52 assumed). In the focal plane F2, however, one obtains a phase difference. It is therefore envisioned in embodiments that the geometry of the object 12, e.g.
  • a spherical sample 52 having a diameter of, for example, 1 50 ⁇ comprises, taking into account and making knowledge and measurement of the refractive index of the sample 52, a correction depending on the lateral position (40, 42) and the position of the focal plane (F1, F2) make ,
  • a method of imaging the object 12 is shown in FIG. 5 in a block diagram.
  • a slide thickness OD for example with the aid of the interface 50, is entered.
  • the spherical aberration of the image of the object 12 in the first region 40 is optimized.
  • a corresponding algorithm is stored in the control device 24. This algorithm may use the refractive index in the first region 40 of the object 12.
  • the first area 40 is in one
  • Section of the object 12 is arranged, in which a known medium, for. As water or an aqueous solution is located. This can be z. B. be the medium of a cell culture or other biological sample. The refractive index of the medium is known. With the optional slide thickness OD and the refractive index of the object 12 in the first region 40, in embodiments, automatic adjustment of the correction optics 32 to minimize spherical aberration occurs. Alternatively, the optimization of the spherical aberration of the image of the object 12 in the first region 40 can be done manually, for example by
  • Adjustment of the correction optics 32 refers after these steps only to aberration caused by the first region 40, ie the medium.
  • a step S3 an object plane is defined in which a phase difference between the first region 40 and the second region 42 is to be determined. This also defines a distance between the object plane and the slide 28. As a rule, the object plane coincides with the focal plane.
  • the second area 42 of the object is determined. It is the area which is to be imaged later by means of the microscope 10, that is, for example. B. a sample that is in the medium.
  • the object 12 m can be imaged with uncorrected spherical aberration in order to detect where the interesting second region 42 of the object 12 is located.
  • phase difference between the first area 40 and the second area 42 is recorded.
  • the phase difference may be determined in a plurality of object planes spaced along the optical axis.
  • step S6 additional parameters relating to the object 12 are detected. These can be provided, for example, by means of an interface 50 of the control device 24.
  • the temperature of the object 12, the previously optionally entered slide thickness OD, a thickness of the object 12, a material of the slide 28 and / or the refractive index in the first area 40 or the second area 42 are input.
  • the temperature can be detected, for example, with a sensor, not shown, or may be known for the experiment, for example, 37 ° C.
  • the thickness of the object 12 can be measured, for example, before the experiment or is known, as z. B. is common in objects 12 in the form of cuts.
  • the refractive index for the first region 40 may also be known, since it is an aqueous solution, for example.
  • the refractive index of the object 12 in the second region 42 can also be known.
  • a penetration depth can be measured, which indicates the distance of the focal plane from an interface of the slide 28.
  • the depth of the focal plane can be adjusted until a reflection at the interface between the slide 28 and the object 12 is visible.
  • the distance to the slide 28 is detected for a given depth position of the focal plane, so that the penetration depth is known.
  • the immersion medium between the objective 14 and the slide 28 can be taken into account as a parameter.
  • the path length and / or the refractive index in the second region 42 are determined from the phase difference, as already explained above in the general part of the description.
  • the thickness of the sample if less than a depth of field range dt_lens, or optionally corrected for a correction factor
  • Depth of field range size can be used when the sample completely covers the depth of field, d can also be used to determine the refractive index of the object 12 in the second region 42. On this basis can be equally the
  • step S8 the setting value for the correcting optical system 32 is determined based on the relationship.
  • the relationship can be modified with the penetration depth previously proposed so that the setpoint is even more precise.
  • the modification of the relationship with regard to the penetration depth occurs in particular if the object plane in which the phase difference was determined does not coincide with the focal plane which is to be imaged.
  • the determination of the refractive indices from different object planes below the focal plane can be incorporated, e.g. via an averaging of the refractive indices along the optical axis. Not only the refractive index in the focal plane is considered, but also the information from other levels.
  • a step S9 the correction optical system 32 is set in accordance with the set value.
  • the spherical aberration for the imaging of the object 12 in the second region 42 m inim iert.
  • the object 12 is imaged in the second area 42.
  • step S1 1 the phase difference that has been detected between the first area 40 and the second area 42 is also used as the phase difference between a third area and the first area 40. This is done in particular when it is expected that the refractive index for the second region 42 and the third region is identical or nearly equal.
  • the object 12 may be imaged not only in the second region 42 but also in the third region with corrected spherical aberration. The same applies to images in different focal planes, in which the refractive index difference (along the optical axis) is similar enough. This can be determined, for example, via a threshold value.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Multimedia (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Geometry (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Mikroskop (10) zum Abbilden eines Objekts (12), welches ein Objektiv (14), welches eine optische Achse und eine dazu senkrecht stehende Fokalebene definiert, und eine zur Abstimmung auf eine Tiefenlage einstellbare Korrekturoptik (32) umfasst, welche am Objektiv (14) eine sphärische Aberration korrigiert, welche bei einer Abbildung des Objekts (12) mit einer bestimmten Tiefenlage der Fokalebene auftritt. Das Verfahren umfasst die Schritte: Bestimmen einer Phasendifferenz von Strahlung aus einem ersten lateralen Bereich (40) und einem zweiten lateralen Bereich (42) des Objekts (12); Verwenden eines vorbekannten Zusammenhangs zwischen der Phasendifferenz und einer dadurch verursachten Änderung der sphärischen Aberration, um einen Einstellwert der Korrekturoptik (32) zu ermitteln, so dass die sphärische Aberration bei Abbildung des zweiten Bereichs (42) reduziert wird.

Description

Mikroskop und Verfahren zum Abbilden eines Objekts
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abbilden eines Objekts mittels eines Mikroskops, welches ein Objektiv und eine Korrekturoptik umfasst. Das Objektiv definiert eine optische Achse und eine dazu senkrecht stehende Fokalebene. Die Korrekturoptik ist zur Abstimmung auf eine Tiefenlage einstellbar und korrigiert am Objektiv eine sphärische Aberration, welche bei einer Abbildung des Objekts mit einer bestimmten Tiefenlage der Fokalebene auftritt. Ferner betrifft die Erfindung ein solches Mikroskop.
In der Forschung m üssen Mikroskope häufig hohe Flexibilität besitzen, da Experimente unterschiedlichster Natur durchgeführt werden. Dabei können sowohl die zu betrachtenden Objekte als auch die Objektträger stark variieren. Bei Objektiven mit hoher numerischer Apertur haben Abweichungen des Brechungsindex auf einem optischen Weg von einer Fokalebene in dem Objekt zu dem Objektiv einen starken Einfluss auf das beugungsbegrenzte
Abbildungsvermögen. Eine Möglichkeit, die sphärische Aberration der Abbildung des Objekts an unterschiedliche Objektträgerdicken, wie beispielweise Deckgläserdicken von 0, 15 mm bis 1 ,5 mm , anzupassen, ist es, einen Korrekturring am Objektiv auf den entsprechenden Wert einzustellen und somit die sphärische Aberration bei der Abbildung zu reduzieren.
Solche Abbildungsfehler machen sich umso stärker bemerkbar, je tiefer eine Fokalebene im Objekt liegt. Bereits ab Tiefen von wenigen Mikrometern treten sichtbare sphärische
Aberrationen auf, wenn ein Brechungsindexunterschied im Objekt gegeben ist und die numerische Apertur des Objektivs entsprechend hoch ist (z. B. eine numerische Apertur von 1 ,2, wie sie bei konfokaler Mikroskopie üblich ist) . Abbildungen in drei Dimensionen, d . h. das Abbilden in dickeren oder tieferen Objekten, gewinnen immer mehr an Bedeutung, sei es bei der Untersuchung von Zellkulturen in 3D, bei Sphäroiden oder bei dickeren Schnitten. Eine ausgezeichnete Bildqualität wird hierfür immer wichtiger, so dass Qualitätseinbußen aufgrund von sphärischer Aberration nicht länger hingenommen werden.
Die Applikationen, insbesondere in der Fluoreszenzm ikroskopie, und damit die Anforderung an das Mikroskop variieren stark. So kann es beispielsweise bei einem Experiment notwendig sein, nur die ersten 10 μιη ab einer Deckglasoberfläche zu betrachten , in einem anderen Experiment möchte man jedoch 200 μιη tief in das Objekt hinein abbilden. Ähnliches gilt für die Temperatur. Das eine Experiment läuft bei Raumtemperatur ab, wohingegen ein anderes Experiment bei 37° C durchgeführt wird. Dies hat Einfluss auf das optische Verhalten des Mikroskops und dam it auf dessen Abbildungseigenschaften. Bisher ist es m ühsam , den Korrekturring des Objektivs exakt für den Objektträger bzw. das Objekt einzustellen. Der Experimentator muss verschiedene Einstellungen ausprobieren, um den optimalen Wert zu finden. Zudem ist eine Änderung der Einstellung während des
Experiments nahezu ausgeschlossen. Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Verfahren bzw. Aufbauten für Mikroskope bekannt, die entweder automatisiert oder teilautomatisiert durchgeführt werden und ein iteratives Vorgehen zur Korrektur einer sphärischen Aberration beinhalten . Die
US 2008/31001 6 A beschreibt eine Korrektur der sphärischen Aberration hinsichtlich der Dicke eines Deckglases. US 2005/024718 A und JP 2005/043624 A2 schlagen vor, dass der Nutzer optische Parameter eingibt, woraus dann eine Korrektur der sphärischen Aberration abgeleitet wird. US 201 1 /141260 A und US 2014/233094 A beschreiben iterative Korrekturverfahren für die sphärische Aberration, welche bildanalytisch den Kontrast oder die Helligkeit auswerten.
Phasenaspekte bei der Mikroskopie sind auch in Humphry:„Optical transm ission mode imaging with the Phase Focus Virtual Lens", Phase Focus Lim ited, Nr. TB02, 22. März 2010; bei der
Phasenkontrastkamera„SI D4bio" der Phasics S.A. ; in Marquet et al. :„Review of quantitative phase-digital holographic microscopy: promising novel imaging technique to resolve neuronal network activity and identify cellular biomarkers of Psychiatric disorders", Neurophotonics, Vol.
1 (2) , Oktober - Dezember 2014 und in Rappaz et al. :„Sim ultaneous cell morphometry and refractive index measurement with dual-wavelength digital holographic m icroscopy and dye- enhanced dispersion of perfusion medium", Optics Letters, Vol. 33, Nr. 7, 1 . April 2008, angesprochen.
Die DE 1 02014002584 A1 erm ittelt zur Verbesserung der Abbildungsgüte eine geometrische Weglängenposition eines Objektpunktes aufwändig per optischer Kohärenztomographie. Die WO 2013/130077 verwendet SLMs für Beleuchtung und Abbildung.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und ein Mikroskop zum Abbilden eines Objekts bereitzustellen , mittels welchen das Objekt aufwandsgering möglichst aberrationsfrei abgebildet werden kann.
Die Erfindung ist in den Ansprüchen 1 und 1 1 definiert. In einem Verfahren zum Abbilden eines Objekts wird ein Mikroskop verwendet, welches ein Objektiv und eine einstellbare Korrekturoptik umfasst. Das Objektiv definiert eine optische Achse und eine dazu senkrecht stehende Fokalebene. Die Korrekturoptik korrigiert am Objektiv eine sphärische Aberration, welche bei einer Abbildung des Objekts auftritt. Ein Einstellwert gilt für eine bestimmte Tiefenlage der Fokalebene. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: Beleuchten des Objekts mit Strahlung; Erfassen der von dem Objekt reflektierten oder transmittierten Strahlung; Durchführen einer quantitativen Phasenkontrastabbildung zum Bestimmen einer Phasendifferenz von Strahlung aus einem ersten lateralen Bereich und einem zweiten lateralen Bereich des Objekts, wobei die sphärische Aberration der Abbildung des Objekts im ersten Bereich bekannt oder der hierfür nötige Korrekturbedarf ist; Verwenden eines Zusammenhangs zwischen der Phasendifferenz und einer dadurch verursachten Änderung der sphärische Aberration, um einen Einstellwert der Korrekturoptik zu ermitteln, so dass die sphärische Aberration im zweiten Bereich reduziert wird; und Einstellen der Korrekturoptik auf den Einstellwert sowie Abbilden des Objekts im zweiten Bereich.
Im Verfahren muss die sphärische Aberration in absoluten Werten nicht bekannt sein. Das Verfahren bezieht sich auf einen ersten Bereich, für den die sphärische Aberration durch die Korrekturoptik korrigiert ist oder korrigierbar ist. Durch Bezug auf diesen ersten Bereich und die Ermittlung der Phasendifferenz und Hinzuziehung des Zusammenhangs zwischen
Phasendifferenz und dadurch verursachter Änderung der sphärischen Aberration kann die Korrekturoptik sehr einfach so eingestellt werden, dass das Objekt im zweiten Bereich mit möglichst geringer sphärischer Aberration abgebildet wird. In Ausführungsformen wird zuerst die Korrekturoptik so eingestellt, dass der erste Bereich mit möglichst geringer sphärischer Aberration abgebildet wird. Man kann dazu beispielsweise einen hinsichtlich Brechungsindex bekannten Bereich des Objektes oder einen gut zugänglichen Bereich einer Probe verwenden. Man kann sich somit den ersten Bereich so wählen, dass aufwandsgering und schnell eine Abbildung mit geringer oder völlig ausgeglichener sphärischer Aberration gewonnen wird. Das Verfahren liefert dann ohne weiteren Aufwand eine aberrationsgeringe oder aberrationsfreie Abbildung auch des zweiten Bereichs, indem zuerst die Phasenkontrastabbildung durchgeführt und dann unter Berücksichtigung des Zusammenhangs zwischen Änderung der sphärischen Aberration und Phasenkontrast die passende Einstellung der Korrekturoptik für den zweiten Bereich erhalten wird. Die Kombination aus Phasenkontrastabbildung und Verwendung eines Zusammenhangs, der die Änderung der sphärischen Aberration wiedergibt, erlaubt somit ein besonders einfaches Vorgehen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform gibt der Zusammenhang eine Einstellung der Korrekturoptik als Funktion des Phasenkontrasts an, insbesondere die Änderung der Einstellung. Die Änderung der sphärischen Aberration wird so direkt in eine Einstellung der Korrekturoptik umgesetzt. Die Phasendifferenz wird mit einer quantitativen Phasenkontrastabbildung ermittelt. Eine Einrichtung zur quantitativen Phasenkontrastabbildung weist optional eine Lichtquelle und einen Detektor zur Bestimmung der Phasendifferenz auf. Diese Bestimmung der Phasendifferenz ist im Auflicht- und Durchlichtverfahren gleichermaßen möglich.
Ein Mikroskop zur Abbildung eines Objekts umfasst ein Objektiv, eine einstellbare
Korrekturoptik, einen Antrieb, eine Einrichtung zur quantitativen Phasenkontrastabbildung und eine Steuereinrichtung. Das Objektiv definiert eine optische Achse und eine dazu senkrecht stehende Fokalebene. Die Korrekturoptik korrigiert am Objektiv eine sphärische Aberration, welche bei der Abbildung des Objekts auftritt. Ein Einstellwert der Korrekturoptik gilt für eine bestimmte Tiefenlage der Fokalebene. Der Antrieb stellt die Korrekturoptik ein. Die Einrichtung zur quantitativen Phasenkontrastabbildung ist ausgebildet, das Objekt mit Strahlung zu beleuchten, die von dem Objekt reflektierte oder transmittierte Strahlung zu erfassen, und eine Phasendifferenz von Strahlung aus einem ersten lateralen Bereich und einem zweiten lateralen Bereich zu bestimmen. In der Steuereinrichtung ist ein Zusammenhang zwischen der
Phasendifferenz und einer dadurch verursachten Änderung der sphärischen Aberration und die sphärische Aberration der Abbildung des Objekts für die Fokalebene in dem ersten Bereich hinterlegt. Die Steuereinrichtung steuert den Antrieb auf Grundlage des Zusammenhangs derart an, dass die sphärische Aberration in der Fokalebene im zweiten Bereich reduziert wird.
Durch diese Maßnahmen wird die bei der Abbildung des Objekts vorhandene sphärische Aberration des Objektivs automatisch korrigiert. Dies gelingt in Ausführungsformen dadurch, dass vor oder während der Abbildung des Objekts eine durch das Objekt hervorgerufene Phasendifferenz zwischen lateralen Bereichen in dem Objekt bestimmt wird und daraus eine Korrektur der sphärischen Aberration ermittelt wird. Der Experimentator muss sich demnach keine Gedanken machen, ob die Korrekturoptik für die sphärische Aberration des jeweiligen Objekts annehmbar eingestellt ist. Darüber hinaus ist es nun möglich, dass für Objekte, die in ihrer lateralen Ausdehnung unterschiedliche Brechungsindices aufweisen, und damit unterschiedliche sphärische Aberrationen verursachen, die Korrekturoptik auch während eines Experiments passend eingestellt werden kann. Beispielsweise kann bei einer scannenden Abbildung des Objekts die Korrekturoptik je nach lateralem Bereich, an dem gerade gescannt wird, eingestellt werden, so dass die sphärische Aberration für die gesamte Abbildung minimiert ist. Ein weiterer Vorteil ist es, dass die Bestimmung der Phasendifferenz durch die quantitative Phasenkontrastabbildung wenig bis keine Beschädigungen an dem Objekt vornimmt, da die dafür verwendete Strahlung nicht oder nur schwach mit dem Objekt wechselwirkt. Das Verfahren kann beispielsweise mit Hilfe der Steuereinrichtung des Mikroskops durchgefül werden. Die Steuereinrichtung kann beispielsweise als ein Mikroprozessor, elektrischer Schaltkreis, Computer oder jede andere programmierbare Vorrichtung ausgebildet sein. Das für das Verfahren verwendete Mikroskop kann je nach Ausführungsform unterschiedliche Abbildungsarten durchführen. Beispielsweise kann das Mikroskop für Weitfeldabbildungen und/oder für scannende Abbildungstechniken, wie konfokale Mikroskopie, ausgebildet sein. Ferner ist es optional mit dem Mikroskop möglich, Fluoreszenzabbildungen des Objekts zu erfassen.
Das Objekt umfasst optional die eigentlich abzubildende Probe sowie ein die Probe umgebendes Eindeckmedium oder das Einbettmedium. Das Objekt weist beispielsweise als Probe eine abzubildende Zellkultur sowie als Medium die Lösung auf, in welche die Zellkultur eingebettet ist.
Das Objektiv dient zur Abbildung des Objekts, kann aber gleichzeitig auch zur Beleuchtung verwendet werden. Das Objektiv hat eine optische Achse. Die Brennweite legt die Tiefenlage der Fokalebene fest. Das Objektiv und/oder eine Objekthalterung sind optional mit einem z- Antrieb versehen, welche die Lage der Fokalebene im Objekt festlegen. Der z-Antrieb kann mit der Steuereinrichtung verbunden sein, so dass die Steuereinrichtung die Tiefenlage der
Fokalebene einstellen kann. Darüber hinaus erfasst die Steuereirichtung optional die aktuelle Lage der Fokalebene, zum Beispiel mit Hilfe der von dem z-Antrieb eingenommenen Position.
Die Korrekturoptik dient zur Korrektur der sphärischen Aberration, die bei der Abbildung des Objekts auftritt. Die Korrekturoptik kann der zuvor beschriebene Korrekturring an dem Objektiv sein, wobei es jedoch auch möglich ist, dass von dem Objektiv beabstandete optische
Elemente verwendet werden, die es ermöglichen, die sphärische Aberration der Abbildung mittels des Objektivs zu verändern. Die Korrekturoptik kann beispielsweise detektorseitig angeordnet sein. Die Korrekturoptik kann optische Elemente aufweisen, welche Strahlung abhängig von ihrer Position gegenüber der optischen Achse unterschiedlich ablenken.
Die Einstellung der Korrekturoptik erfolgt mit Hilfe eines Antriebs, welcher durch Leitungen oder kabellos mit der Steuereinrichtung verbunden ist. Die Steuereinrichtung kann die Position des Antriebs erfassen und somit den momentanen Einstellwert der Korrekturoptik.
Die Phasendifferenz, die die Strahlung ausgehend von dem ersten Bereich und dem zweiten Bereich durch das Objekt verursacht, ist proportional zu einer optischen Weglängendifferenz, welche die Strahlung aus dem ersten Bereich und aus dem zweiten Bereich jeweils zu dem Detektor zurücklegt. Diese optische Weglängendifferenz ist für die sphärische Aberration verantwortlich. Die Phasendifferenz erfüllt folgende Gleichung (1 ) :
2π
Αφ =—{n2 - njd
Dabei ist Δφ die Phasendifferenz, λ die Wellenlänge der Strahlung zur Bestimm ung der Phasendifferenz, n2 der Brechungsindex in dem zweiten Bereich, n1 der Brechungsindex in dem ersten Bereich und d eine Weglänge. Analog zur Phasendifferenz Δφ ist eine
Weglängendifferenz, die sich aus der Gleichung (1 ) jedoch ohne den Vorfaktor 2π/λ ergibt. Die Weglänge d ist der Bereich , z.B. die Dicke der Probe, aus dem Strahlung zur Abbildung beiträgt. Mit der oben aufgeführten Gleichung lassen sich aus der Phasendifferenzmessung die Dicke oder der Brechungsindex der Probe bestimmen. Ist der Brechungsindex konstant und bekannt, lässt sich die Probendicke aus den Phasendaten ableiten. Ist die Dicke bekannt (und konstant) lässt sich der Brechungsindex ableiten. In einigen Ausführungsformen ist hierfür der Tiefenschärfebereich des Objektivs relevant, nämlich u. a. dann, wenn die Probe sehr viel dicker ist als der Tiefenschärfebereich. In anderen Ausführungsformen, in denen die Probe dünner ist als der Tiefenschärfebereich und vollständig im Tiefenschärfebereich liegt, ist die Probendicke entscheidend für die Weglänge d. Sind die Wellenlänge und Weglänge d konstant, hängt die Phasendifferenz nur von dem Unterschied der Brechungsindices zwischen dem ersten Bereich und dem zweiten Bereich ab.
Der Zusammenhang verknüpft den Unterschied zwischen dem Brechungsindex und einer dadurch verursachten sphärischen Aberration m it der Phasendifferenz bzw. der optischen Weglängendifferenz. Der Zusammenhang kann eine Formel sein oder eine Tabelle. Optional wird der Zusammenhang einmalig durch Bestimmen verschiedenster Brechungsindices für das Objekt erfasst und als Tabelle hinterlegt; diese Kalibration kann für das Mikroskop auch regelmäßig wiederholt werden. Durch Interpolation können die verschiedensten Werte der Phasendifferenz in sehr guter Näherung ermittelt werden. Die Weglänge d geht in Ausführungsformen als konstanter Faktor in den Zusammenhang ein. Für die Durchführung des Mikroskopieverfahrens bzw. im Mikroskop wird deshalb in
Ausführungsformen eine Angabe über diese (konstante) Weglänge d verwendet. Die Angabe kann für verschiedene Ausführungsformen unterschiedlich gewonnen werden. In einigen Ausführungsformen ist die Weglänge d gleich der Probendicke, wenn der Tiefenschärfebereich des verwendeten Objektivs größer als die Probendicke ist, und die Probendicke vollständig im Tiefenschärfebereich liegt. In anderen Ausführungsformen, in denen die Verhältnisse quasi invers sind und die Probe sehr viel dicker als der Tiefenschärfebereich ist, gilt dies nicht. In solchen Ausführungsformen variiert die Probendicke jedoch über dem Objektfeld. Die Dicke d kann z.B. bei histologischen Schnitten oder durch die Abmessungen eines Mikrofluidikkanals definiert sein oder über andere Verfahren bestimmt werden. Hier ist möglich, einen "mittleren" Brechungsindex der Probe bspw. mit einem niedrig vergrößernden Objektiv zu ermitteln und diesen Parameter dann später für eine Fluoreszenzmessung mit einem hochauflösenden
Objektiv für die Korrektur der sphärischen Aberration zu verwenden. Auch kann nährungsweise der Tiefenschärfebereich als Wert für d angenommen werden.
In Ausführungsformen ist es auch möglich, im Mikroskop eine Phasendifferenz- oder
Weglängendifferenzmessung an einer Grenzfläche zwischen einer zu mikroskopierenden, biologischen Probe und einem sie umgebenden Medium , beispielsweise Nährmedium durchzuführen. Phasendifferenzmessungen bzw. Weglängendifferenzmessungen sind in der Mikroskopie bekannt (vgl. die später genannten Publikationen), und es ist für einen Fachmann unproblematisch möglich, ein Mikroskop für eine solche Messung einzurichten. Für die Bestimmung der Weglänge d wird dabei die Phasendifferenz zwischen Probe und
umgebendem Medium ermittelt (die Ermittlung der Weglängendifferenz ist dazu äquivalent). Es werden zwei Messungen durchgeführt, bei denen sich die Phasendifferenz (oder
Weglängendifferenz) dadurch unterscheidet, dass der Brechungsindex des umgebenden Mediums unterschiedlich ist. In einer ersten Variante geschieht dies dadurch, dass das umgebende Medium dispersiv ist, also eine Wellenlängenabhängigkeit des Brechungsindex zeigt, und die zwei Messungen bei unterschiedlichen Wellenlängen durchgeführt werden. In einer zweiten Variante wird das Medium zwischen den beiden Messungen gegen ein Medium mit anderem Brechungsindex ausgetauscht. In beiden Varianten ergibt sich bei jeder der beiden Messungen die Weglängendifferenz (oder Phasendifferenz) aus dem Produkt aus Weglänge d und Brechzahldifferenz zwischen Medium und Probe. Man erhält somit zwei Gleichungen mit zwei Unbekannten; dieses Gleichungssystem ist unproblematisch lösbar und es kann sowohl die Weglängendifferenz als auch der (a priori unbekannte) Brechungsindex der Probe ermittelt werden. Die Kenntnis der Weglänge d erlaubt es nun, ohne Interpolation die verschiedenen Werte der Phasendifferenz in sehr guter Näherung auch außerhalb der für die Ermittlung von d herangezogenen Grenzfläche zwischen Probe und Medium zu verwenden bzw. festzustellen.
Aufgrund des Zusammenhangs ermittelt die Steuereinrichtung einen Einstellwert, um die Korrekturoptik entsprechend einzustellen. Der Einstellwert hängt optional von der aktuellen Position der Korrekturoptik sowie der gewünschten aus dem Zusammenhang ermittelten Position ab. Der aktuelle Einstellwert der Korrekturoptik ist beispielsweise aus der Kenntnis der sphärischen Aberration in dem ersten Bereich bekannt. Ferner kann der Einstellwert auch eine absolute Position der Korrekturoptik angeben. Nach dem Einstellen der Korrekturoptik wird das Objekt im zweiten Bereich abgebildet. Es ist in einer Weiterbildung bevorzugt, dass der Zusammenhang hinsichtlich einer Eindringtiefe modifiziert wird. Bei der Eindringtiefe handelt es sich um die Tiefe, in der die Fokalebene in Abbildungsrichtung gesehen unter der Probenoberfläche liegt. Sie ist besonders dann relevant, wenn eine hohe Eindringtiefe verwendet wird und der Tiefenschärfebereich des Objektivs gering ist (hohe numerische Apertur) , da die sphärische Aberration m it der Eindringtiefe steigt. Es ist deshalb bevorzugt, die Eindringtiefe zu messen, wobei optional das Messen der Eindringtiefe ein Detektieren einer Grenzfläche zwischen einem Objektträger und dem Objekt sowie ein Erfassen einer Lage der Fokalebene umfasst. Die Eindringtiefe ist in
Ausführungsformen relevant für den Weg der Strahlung von der Grenzfläche zum Objektiv. Zur Bestimm ung der Eindringtiefe sind verschiedene Möglichkeiten denkbar. Sind beispielsweise der Abstand des Objektträgers zu dem Objektiv und die Brennweite des Objektivs bekannt, lässt sich die Eindringtiefe aus dieser Differenz ermitteln. Darüber hinaus ist es möglich, die Eindringtiefe anhand des Objekts zu bestimmen. Besonders bevorzugt ist es jedoch, dass die Grenzfläche zwischen dem Objekt und dem Objektträger bestimmt wird, beispielsweise dadurch, dass die an der Grenzfläche hervorgerufene Reflexion von Strahlung, falls die Fokalebene des Objektivs m it der Grenzfläche zusammenfällt, erfasst wird. Da vorzugsweise die Steuerreinrichtung die Brennweite des Objektivs über den z-Antrieb erfassen kann, ist die Position der Grenzfläche detektierbar. Die Eindringtiefe wird dann dadurch erfasst, dass die Verstellung der Brennweite des Objektivs mittels des z-Antriebs aufgezeichnet wird und somit die momentane Fokalebene bekannt ist. Die Eindringtiefe ist dann die Differenz zwischen der momentanen Fokalebene und der Grenzfläche. Es ist ferner möglich ein tomografisches Phasenbild zu gewinnen, indem bspw. die Phasendifferenzen in verschiedenen z-Ebenen (Fokalebenen) gemessen werden. Somit erhält man einen xyz Phasenzusammenhang der Probe. Daraus lässt sich nun für jede Eindringtiefe ein über z gem ittelter Brechungsindex bestimmen. Will man bspw. eine Fluoreszenzmessung bei 20 μιη Eindringtiefe machen, können die Brechungsindizes über die ersten 20 μιη gemittelt werden und in die Korrektur der sphärischen Aberration einfließen. Befindet man sich 100 μιη tief in der Probe muss man über 100 μιη m ittein.
Wird das Objekt in verschiedenen Tiefenlagen abgebildet, ist es bevorzugt, dass mehrere Phasendifferenzen in mehreren, zueinander beabstandeten Objektebenen bestimmt werden. Eine dicke Probe wird z. B. in mehreren z-Lagen durch einen sogenannten z-Stapel erfasst. Die Aufnahme der Phasendifferenzen in mehreren Objektebenen, also per z-Stapel , ist insbesondere hilfreich, wenn bei der Bestimm ung der Einstellwerte die genauen Lagen der Fokalebenen zur Abbildung des Objekts noch nicht bekannt sind. Es ist jedoch auch möglich, dass für jede abzubildende Fokalebene in dem Objekt zuerst die Phasendifferenz gemessen wird, dann die sphärische Aberration korrigiert wird und anschließend diese Fokalebene abgebildet wird. Im Anschluss daran wird die Fokalebene verschoben, die Phasendifferenz erneut gemessen, die sphärische Aberration ggf. korrigiert und im Anschluss daran das Objekt in der veränderten Fokalebene abgebildet. Zur Bestimm ung der Phasendifferenz wird in Ausführungsformen ein holografisches quantitatives Phasenkontrastabbildungsverfahren verwendet, das als Digital Holographie Microscopy bekannt ist. Für die Phasenkontrastabbildung kann kohärente oder teilkohärente Strahlung verwendet werden. Ferner ist es möglich, für die quantitative
Phasenkontrastabbildung m indestens zwei Wellenlängen zu verwenden, für die das Objekt, insbesondere das Medium , einen deutlichen und vorbekannten Brechungsindexunterschied aufweist. Optional ist die quantitative Phasenkontrastabbildung ein ptychographisches
Verfahren. Für die quantitative Phasenkontrastabbildung wird in einer Weiterbildung des Mikroskops ein Wellenfrontsensor verwendet. Auch kann für die quantitative
Phasenkontrastabbildung ein interferometrischer Aufbau verwendet werden. Die Lichtquelle für die quantitative Phasenkontrastabbildung kann einen Spatial Light Modulator aufweisen oder die Phase der Strahlung, die für die quantitative Phasenkontrastabbildung verwendet wird, wird optional variiert. Ferner kann die Strahlung für die quantitative Phasenkontrastabbildung aus verschiedenen Beleuchtungswinkeln erzeugt werden. Beispiele für eine Einrichtung zur quantitative Phasenkontrastabbildung oder dam it durchgeführte Verfahren werden in
US 7948632 B2, Wang et al. :„Spatial light interference tomography (SLIT)", Optics Express, Vol. 19, Nr. 21 , 1 0. Oktober 201 1 , und Tian et al. :„Quantitative differential phase contrast imaging in an LED array m icroscope", Optics Express, Vol. 23, Nr. 9, 4. Mai 2015, beschrieben.
Die Phasendifferenz, die durch das Objekt verursacht wird, wird, wie bereits erwähnt, zwischen zwei lateralen Bereichen gemessen, die in einer Objektebene voneinander beabstandet sind. Die Objektebene ist zur Fokalebene identisch oder parallel dazu. Die Korrektur der sphärischen Aberration ist umso präziser, je näher die Objektebene an der Fokalebene für die Abbildung des Objekts liegt. Beispielsweise werden Bestimmung der Phasendifferenz und nachfolgende Abbildung des Objekts durch dasselbe Objektiv durchgeführt, wobei die Objektebene in der Fokalebene liegt. Allerdings ist es auch möglich, dass die Phasendifferenz einmalig in einer bestimmten Objektebene bestimmt wird und im Anschluss daran das Objekt in verschiedenen Fokalebenen abgebildet wird. Die einmalige Bestimm ung der Phasendifferenz in einer Objektebene stellt dennoch eine sehr gute Näherung für Phasendifferenz in der Fokalebene dar. Die lateralen Bereiche, zwischen welchen die Phasendifferenz bestimmt wird, können annähernd punktförmig sein, insbesondere dann, wenn das Mikroskop ein scannendes Abbildungsverfahren ausführt. Wird ein bildgebendes Verfahren zur quantitativen
Phasenkontrastabbildung verwendet, können nicht nur zwei laterale Bereiche, sondern viele laterale Bereiche gleichzeitig erfasst werden. Der erste Bereich wird in Ausführungsformen so gewählt, dass für ihn die sphärische Aberration bekannt oder ausgeglichen ist. Dies umfasst beispielsweise, dass die sphärische Aberration für die Abbildung des Objekts aus der Fokalebene in dem ersten Bereich bereits minimiert wurde. Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn die Korrekturoptik für einen Bereich des Objekts mit einem bestimmten Brechungsindex als Standardwert eingestellt ist, was unter anderem automatisch erfolgen kann. Ein solcher Standardwert kann beispielsweise für Wasser oder eine wässrige Lösung, die abzubildende Proben, wie eine Zelle oder andere biologische Proben, umgibt, passend sein. Die Kenntnis der Einstellung zum Ausgleich der sphärischen Aberration in dem ersten Bereich umfasst optional die Kenntnis des Einstellwerts für die Korrekturoptik, für den die sphärische Aberration beispielsweise minimiert ist. Um den ersten Bereich zu ermitteln, wird optional das Objekt zuerst ohne weitere Korrektur der sphärischen Aberration abgebildet, um zu erkennen, wo Bereiche mit bekanntem Brechungsindex vorhanden sind. Ferner ist es möglich, dass die sphärische Aberration manuell - auch mithilfe der Steuereinrichtung und des Antrieb - korrigiert wird, bis die Abbildung des Objekts in dem ersten Bereich optimal ist.
Darüber hinaus kann der erste Bereich auch ein solcher Bereich sein, in welchem die abzubildende Probe im Objekt nicht vorhanden ist, und der erste Bereich dann für Luft gemessen wird. Das Objekt umfasst somit optional die abzubildende Probe als auch dessen Umgebung.
Der zweite Bereich ist insbesondere der Bereich des Objekts, welcher für die durchzuführende Untersuchung interessant ist. Der zweite Bereich weist i.d.R. einen Brechungsindex auf, der sich vom Brechungsindex im ersten Bereich unterscheidet, da ansonsten eine Korrektur der sphärischen Aberration ja gar nicht notwendig wäre. Der Brechungsindex ist im zweiten Bereich meist nicht bekannt, so dass allein schon die Bestimmung der Phasendifferenz zwischen dem ersten Bereich und dem zweiten Bereich hilft, die sphärische Aberration für die Abbildung des gesamten Objekts zu optimieren.
Um die Korrektur der sphärischen Aberration zu vereinfachen und/oder zu beschleunigen, ist es in einer Weiterbildung bevorzugt, dass ein dritter lateraler Bereich des Objekts verwendet wird, für den innerhalb eines Toleranzbereichs der gleiche Brechungsindex wie für den zweiten Bereich vorliegt, wobei der Einstellwert für den zweiten Bereich auch zur Abbildung des dritten Bereichs verwendet wird. Der dritte laterale Bereich kann beispielsweise ein Bereich in der Fokalebene des Objekts sein, für den erwartet wird, dass der Brechungsindex nahezu identisch mit dem Brechungsindex im zweiten Bereich ist. Beispielsweise können der zweite Bereich und der dritte Bereich innerhalb einer Zelle sein, so dass der Brechungsindex für beide Bereiche und damit auch die sphärische Aberration für deren Abbildung ungefähr gleich sind. Die Brechungsindizes der verschiedenen relevanten Probenbereiche können beispielsweise gern ittelt werden , um eine sphärische Aberration für den Probenbereich zu korrigieren. Somit L . es möglich, m it einer verm inderten Anzahl der bestimmenden Phasendifferenzen eine annehmbare Korrektur der sphärischen Aberration bereitzustellen. Ferner lässt sich auf diese Weise auch die Messgeschwindigkeit für die Abbildung des Objekts erhöhen, da, wenn für den dritten Bereich der gleiche Einstellwert wie für den zweiten Bereich verwendet wird, eine Zeit in Anspruch nehmende Verstellung der Korrekturoptik während der Abbildung des Objekts entfällt. Ähnliches gilt für z-Stapel-Aufnahmen. Wenn man in verschiedenen z-Ebenen genügend ähnliche Phasendifferenzwerte bzw. Brechungsindizes erhält (im Vergleich zur darunter liegenden z-Ebene) , m uss nicht in jeder z-Ebene die sphärische Aberration korrigiert werden. Bei der z-stapelweisen Ermittlung der Phasendifferenz eines Objektes gilt ähnliches. Das bedeutet, wenn man in verschiedenen z-Ebenen ähnliche Phasendifferenzwerte bzw.
Brechungsindizes erhält, muss nicht in jeder z-Ebene die sphärische Aberration korrigiert werden. Optional erfolgt eine zusätzliche Korrektur erst, wenn eine Maximalabweichung überschritten wird.
Um den Zusammenhang noch präziser zu gestalten und damit eine noch genauere Korrektur der sphärischen Aberration zu ermöglichen, ist es in einer Weiterbildung bevorzugt, dass mindestens ein Parameter erfasst wird, welcher eine Temperatur des Objekts, ein Material eines Objektträgers, eine Objektträgerdicke, ein Immersionsmedium für das Objektiv oder eine Wellenlänge von Strahlung zur Abbildung des Objekts umfasst, wobei der Zusammenhang hinsichtlich des mindestens einen Parameters modifiziert wird. Bekanntlich hängt der
Brechungsindex eines Materials von dessen Temperatur ab. Somit ist auch die sphärische Aberration bei der Abbildung mittels des Objektivs temperaturabhängig. Durch Erfassen der Temperatur des Objekts, beispielsweise m ittels eines Sensors oder durch Eingabe, z. B. wenn die Temperatur des Experiments fest vorgegeben ist, kann der Zusammenhang modifiziert werden, so dass sich bei unterschiedlichen Temperaturen ein unterschiedlicher Einstellwert ergibt. Die Einstellung der Korrekturoptik erfolgt somit temperaturabhängig. Auch hier kann der Zusammenhang durch Kalibration hinsichtlich der Temperaturabhängigkeit bestimmt werden. In einer Weiterbildung wird die Temperatur des Objekts durch Erfassen eines Energieparameters einer Strahlung zur Beleuchtung des Objekts und durch Ermitteln der Temperatur des Objekts aus dem Energieparameter bestimmt. Der Energieparameter kann beispielsweise die Intensität oder die Leistung der Beleuchtungsstrahlung sein. Diese kann in dem Objekt selbst oder durch Auskoppeln eines Messanteils der Beleuchtungsstrahlung aus dem Beleuchtungsstrahlengang erm ittelt werden. Dazu kann ein Leistungsdetektor oder ein Intensitätsdetektor verwendet werden. Aufgrund des Energieparameters und der erwarteten oder bekannten Absorption der Beleuchtungsstrahlung durch das Objekt kann die Temperatur in dem Objekt errechnet werden. Zum Berechnen der Temperatur kann auch die Art des Objekts verwendet werden, näm lich dahingehend, wie stark das Absorptionsverhalten des jeweiligen Objekts ist. Auf diese Weise lässt sich der Zusammenhang hinsichtlich der Temperatur automatisch modifizieren.
Auf dem Weg, den die Strahlung von der Fokalebene bis zum Objektiv zurücklegt, passiert die Strahlung sowohl einen Objektträger oder ein Deckglas als auch u. U. ein Immersionsmedium . Diese Strukturen haben einen Brechungsindex, der zu der sphärischen Aberration der Abbildung des Objekts beiträgt. Durch Erfassen einer Objektträgerdicke oder Deckglasdicke und/oder des Brechungsindex des Objektträgers und/oder des Immersionsmediums, jeweils beispielsweise durch Eingabe einer zugehörigen Angabe, lässt sich der Zusammenhang hinsichtlich der durch diese Aspekte veränderten sphärischen Aberration verbessern und modifizieren.
Da die sphärische Aberration vom Brechungsindex bei dispersiven Materialien von der Wellenlänge abhängt, ist die sphärische Aberration dann ebenfalls wellenlängenabhängig. Die Wellenlänge der Strahlung für die Abbildung des Objekts ist somit ein weiterer Parameter, hinsichtlich dessen der Zusammenhang modifiziert werden kann, um die Einstellung der sphärischen Aberration zu verbessern. Die Wellenlänge kann manuell eingegeben werden; insbesondere bei Fluoreszenzabbildungen ist die Wellenlänge der induzierten
Fluoreszenzstrahlung dem Steuergerät und/oder dem Benutzer bekannt. Darüber hinaus ist es möglich, dass das Mikroskop mit einem Wellenlängensensor versehen ist, mittels welchem die Wellenlänge der Abbildungsstrahlung automatisch bestimmt werden kann. Optional können Beleuchtungswellenlänge und/oder Filtereinstellungen berücksichtigt werden.
In einer Weiterbildung kann das Verfahren dazu verwendet werden, den Brechungsindex des Objekts im zweiten Bereich zu bestimmen. Dies wurde oben mit Bezug auf Gleichung (1 ) bereits erläutert. Somit ist es in dieser Weiterbildung möglich, den Brechungsindex in der Probe zu bestimmen, beispielsweise ist es somit bei Kenntnis des Brechungsindex eines wässrigen Mediums, welches eine Zellkultur umgibt, möglich, den Brechungsindex in der Zellkultur selbst zu bestimmen. Er kann dann zur Einstellung der Korrekturoptik verwendet werden.
Um die Probe vor Strahlungsschäden zu schützen, ist es bevorzugt, dass die Phasendifferenz mittels quantitativer Phasenkontrastabbildung bestimmt wird, wobei optional die Strahlung für die quantitative Phasenkontrastabbildung im Infrarotbereich liegt. Die quantitative
Phasenkontrastabbildung ist bekannt dafür, dass sie wenige Strahlungsschäden in dem Objekt hervorruft. Dies gelingt besonders gut, wenn Infrarotstrahlung verwendet wird. Ferner hat die Verwendung von Infrarotstrahlung den Vorteil, dass eine Wechselwirkung mit manchen fluoreszierten Substanzen bei Fluoreszenzabbildungen vermieden werden kann. Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen
Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Ansicht des Mikroskops;
Fig. 2 ein Objektiv und einen Objektträger mit darauf angeordneten Objekt des Mikroskops von Fig. 1 ;
Fig. 3 eine vergrößerte Darstellung einer Ausführungsform des Objektträgers mit dem
Objekt;
Fig. 4 eine Schemadarstellung des Objektes; und
Fig. 5 ein Blockdiagramm zur Illustration eines Verfahrens zur Abbildung des Objekts.
Ein Mikroskop 10 ermöglicht eine Abbildung eines Objekts 12. Die von dem Objekt 12 reflektierte oder transmittierte Strahlung wird von einem Objektiv 14 gesammelt und auf einen Abbildungsdetektor 16 mittels eines Abbildungsstrahlengangs 18 abgebildet. Das Objektiv 14, der Abbildungsdetektor 16 und/oder der Abbildungsstrahlengang 18 sind im Gehäuse 20 des Mikroskops 10 angeordnet. Der Abbildungsstrahlengang 18 kann für verschiedene Arten der Abbildung des Objekts 12 ausgebildet sein. Beispielsweise kann das Objekt 12 im Weitfeld aufgenommen werden oder mittels eines scannenden Abbildungsverfahrens. Ferner kann das Mikroskop 10 für Fluoreszenzmessungen ausgebildet sein. Je nach Art der verwendeten Abbildung weist der Abbildungsstrahlengang 18 verschiedene optische Elemente und/oder weitere Bauteile, wie beispielsweise eine Scaneinrichtung zur Ablenkung von Strahlung, auf. Diese Bauteile sind in Fig. 1 nicht dargestellt. Das Objekt 12 kann beleuchtet werden, beispielsweise mit einer Auflicht-Lichtquelle oder mit der in Fig. 1 dargestellten Durchlicht- Lichtquelle 22. Die Lichtquelle 22 kann beispielsweise Weißlicht erzeugen oder Strahlung mit einem bestimmten Wellenlängenbereich emittieren, der für Fluoreszenzmikroskopie geeignet ist.
Der Abbildungsdetektor 16 ist ausgebildet, ein mittels des Abbildungsstrahlengangs 18 auf ihm erzeugtes optisches Bild des Objekts 12 in elektrische Signale umzuwandeln, welche über eine Leitung an eine Steuereinrichtung 24 übermittelt werden. Die Steuereinrichtung 24 erzeugt aus den von dem Abbildungsdetektor 16 zur Verfügung gestellten elektrischen Signalen ein elektronisches Bild, das beispielsweise auf einer mit der Steuereinrichtung 24 verbundenen Anzeigeeinrichtung 26, wie einem Monitor, dem Experimentator, dargestellt wird. Das Objekt 12 ist auf einem Objektträger 28 angeordnet, welcher eine gewisse
Objektträgerdicke OD aufweist. Der Objektträger 28 kann beispielsweise eine Glasscheibe sein. Ferner kann der Objektträger 28 der Boden einer Petrischale aus Glas oder Kunststoff sein. Der Objektträger 28 kann beweglich gegenüber dem Gehäuse 20 gelagert sein, so dass das Objekt 12 gegenüber dem Objektiv 14 verschiebbar gelagert ist.
Das Mikroskop 10 weist optional mehrere Objektive 14 auf, die auf einem Revolver 30 angeordnet sind. Mittels des Revolvers 30 kann das Objektiv 14, das zur Abbildung verwendet werden soll, eingeschwenkt werden . Der Revolver 30 kann manuell verstellt oder über einen Revolverantrieb bewegt werden, der mit der Steuereinrichtung 24 verbunden ist. Der
Revolverantrieb sowie die Verbindung mit der Steuereinrichtung 24 sind in Fig. 1 nicht dargestellt. Mindestens eines der Objektive 14 ist mit einer Korrekturoptik 32 versehen. Die Korrekturoptik 32 ist einstellbar und dient zur Veränderung einer sphärischen Aberration der Abbildung des Objekts 12. Je nach Tiefenlage einer Fokalebene im Objekt ändert sich die sphärische Aberration, so dass durch Verstellen der Korrekturoptik 32 die sphärische Aberration bei der Abbildung des Objekts 12 m inimiert werden kann. Das in Fig. 1 rechts dargestellte Objektiv 14 und das in Fig. 2 dargestellte Objektiv 14 weisen als Korrekturoptik 32 einen Korrekturring auf. Er ist fest mit dem Objektiv 14 verbunden und über einen Antrieb 34 verdrehbar. Der Antrieb 34 ist m it der Steuereinrichtung 24 mittels einer Leitung oder über Funk verbunden, wobei in Fig. 1 und 2 die Verbindung nicht dargestellt ist. Som it ist die
Steuereinrichtung 24 in der Lage, den Antrieb 34 anzusteuern und die sphärische Aberration der Abbildung des Objekts 12 zu beeinflussen. Optional kann die Steuereinrichtung 24 die momentane Einstellung der Korrekturoptik 32 mittels des Antriebs 34 erfassen.
Alternativ kann die Korrekturoptik 32 von dem Objektiv 14 losgelöst angeordnet sein. Bei dem in Fig. 1 links dargestellten Objektiv 14 ist die Korrekturoptik 32 im Abbildungsstrahlengang 18 angeordnet. Auch sie ist m it einem Antrieb 34 versehen. Das Mikroskop 10 umfasst ferner eine Einrichtung zur quantitativen Phasenkontrastabbildung 36. Die Einrichtung zur quantitativen Phasenkontrastabbildung 36 kann die verschiedensten Typen umfassen, m ittels welchen quantitative Phasenkontrastabbildung durchgeführt werden kann. Beispielsweise sei hier auf die weiter oben genannten Literaturstellen beschriebenen Verfahren verwiesen.
Die Einrichtung zur quantitativen Phasenkontrastabbildung 36 ist ausgebildet, eine
Phasendifferenz zwischen einem ersten lateralen Bereich 40 und einem zweiten lateralen Bereich 42 zu bestimmen, die in der Regel innerhalb eines gemeinsamen Objektfeldes 54 des Objektives 14 liegen. Dies ist unter anderem in Fig. 2 dargestellt. Die Einrichtung zur quantitativen Phasenkontrastabbildung 36 umfasst eine optionale Beleuchtungseinrichtung und einen Phasendetektor oder Phasenkamera 44. Die Beleuchtungseinrichtung erzeugt beispielsweise Weißlicht oder Infrarotlicht, welches mittels des Objektivs 14 und der
Korrekturoptik 32 auf den Phasendetektor 44 abgebildet wird. Um zur Detektion der
Phasendifferenz Strahlung aus dem Abbildungsstrahlengang 18 zum Phasendetektor 44 auszukoppeln, ist ein Strahlteiler 46 vorgesehen. Der Phasendetektor 44 detektiert die
Phasendifferenz zwischen Strahlung aus dem ersten Bereich 40 und dem zweiten Bereich 42. Vorzugsweise ist die Einrichtung zur quantitativen Phasenkontrastabbildung 36 ausgebildet, Phasendifferenzen zwischen dem ersten Bereich 40 und mehreren zweiten Bereichen zu bestimmen.
Die Steuereinrichtung 24 ist mit einer Speichereinrichtung 48 verbunden, in welcher ein Zusammenhang zwischen der Phasendifferenz und einer dadurch verursachten Änderung der sphärischen Aberration hinterlegt ist. Dieser Zusammenhang kann durch eine vorherige Kalibration bestimmt worden sein und stellt beispielsweise eine Tabelle dar. Die
Speichereinrichtung 48 kann als Teil der Steuereinrichtung 24 ausgebildet sein, welche einen Mikroprozessor, einen Computer oder dergleichen umfassen kann; die Speichereinrichtung 48 kann ein beschreibbarer Speicher, wie ein RAM (random access memory) sein. Die
Steuereinrichtung 24 ruft den Zusammenhang aus der Speichereinrichtung 48 ab und bestimmt so einen Einstellwert für die Korrekturoptik 32, mit dem die sphärische Aberration für die Abbildung des Objekts 12 im zweiten Bereich 42 reduziert ist. Der Zusammenhang kann beispielsweise die Änderung der sphärischen Aberration in Form einer Einstellung der
Korrekturoptik, beispielsweise des Korrekturrings enthalten. Dabei kann es sich um die Angabe einer Änderung handeln. Der Zusammenhang kann insbesondere durch vorherige Experimente an einer Probe mit bekannter Brechungsindexverteilung ermittelt worden sein. Alternativ lässt er sich rechnerisch aus dem Aufbau der Korrekturoptik gewinnen. Die Steuereinrichtung 24 steuert dann den Antrieb 34 gemäß dem Einstellwert an, so dass die sphärische Aberration der Abbildung des Objekts 12 im zweiten Bereich 42 reduziert, vorzugsweise minimiert oder vollständig ausgeglichen, wird. Dann wird das Objekt 12 im zweiten Bereich 42 abgebildet.
Das Mikroskop 10 weist ferner eine Schnittstelle 50 auf, mittels der mehrere Parameter des Experiments eingegeben werden können und somit der Steuereinrichtung 24 zur Verfügung gestellt werden. Die Schnittstelle 50 ist beispielsweise eine Tastatur oder eine Maus und mit der Steuereinrichtung 24 verbunden.
Fig. 4 zeigt schematisch das Objekt 12, welches hier aus einer biologischen Probe 52 in einem Einbettmedium 53 besteht. Weiter sind die Bereiche 40 und 42 schematisch eingetragen, in denen die Phasenkontrastmessung erfolgt. F1 und F2 bezeichnen zwei verschiedene
Fokalebenen, auf die das Objektiv 14 eingestellt werden kann. Die Dicke der gestrichelten Fokalebenen veranschaulicht den Tiefenschärfebereich. Nimmt man einen homogenen Brechungsindex der Probe 52 an, gilt es für den lateralen Bereich 40 anders zu korrigieren, als für den lateralen Bereich 41 , wenn die Fokalebene F2 vorliegt, da dort der laterale Bereich 40 vollständig von der Probe und deren Brechungsindex ausgefüllt wird , der laterale Bereich 42 hingegen nicht. Diese Situation kann immer eintreten, wenn eine Probe 52 m ikroskopiert werden soll, deren Höhe H sehr viel größer ist, als der Tiefenschärfebereich und die zugleich über ihre laterale Ausdehnung keine konstante Dicke hat. Es ist deshalb in Ausführungsformen vorgesehen, dass die Phasendifferenzen in verschiedenen Ebenen zwischen Objektiv und gewünschter Objektebene, beispielsweise entsprechend F1 , erm ittelt wird und die dadurch erfassten dazwischenliegenden Schichten zwischen dem Deckglas 28 und der eigentlich im Objekt gewünschten Fokalebene F1 für die Korrektur berücksichtigt werden. Betrachtet man nur die Fokalebene F1 , zeigt sich, dass in den lateralen Bereichen 40 und 42 sich durch die Geometrie der Probe 52 keine Phasendifferenzen ergeben (homogener Brechungsindex der Probe 52 unterstellt) . In der Fokalebene F2 erhält man hingegen eine Phasendifferenz. Es ist deshalb in Ausführungsformen vorgesehen, die Geometrie des Objektes 12, die z.B. eine kugelförm ige Probe 52 mit einem Durchmesser von beispielsweise 1 50 μιη umfasst, zu berücksichtigen und unter Kenntnis und Ermessung des Brechungsindex der Probe 52 eine Korrektur abhängig von der lateralen Lage (40, 42) und der Lage der Fokalebene (F1 , F2) vorzunehmen.
Ein Verfahren zur Abbildung des Objekts 12 ist in Fig. 5 in einem Blockdiagramm gezeigt. In einem optionalen Schritt S1 wird eine Objektträgerdicke OD, beispielsweise m ithilfe der Schnittstelle 50, eingegeben. In einem Schritt S2 wird die sphärische Aberration der Abbildung des Objekts 12 im ersten Bereich 40 optim iert. Dazu ist in der Steuereinrichtung 24 ein entsprechender Algorithm us hinterlegt. Dieser Algorithm us kann den Brechungsindex im ersten Bereich 40 des Objekts 12 verwenden. Beispielsweise ist der erste Bereich 40 in einem
Abschnitt des Objekts 12 angeordnet, in dem sich ein bekanntes Medium , z. B. Wasser oder eine wässrige Lösung, befindet. Dies kann z. B. das Medium einer Zellkultur oder einer anderen biologischen Probe sein. Der Brechungsindex des Mediums ist bekannt. Mithilfe der optionalen Objektträgerdicke OD und dem Brechungsindex des Objekts 12 im ersten Bereich 40 erfolgt in Ausführungsformen eine automatische Einstellung der Korrekturoptik 32 zur Minim ierung der sphärischen Aberration. Alternativ kann die Optim ierung der sphärischen Aberration der Abbildung des Objekts 12 in dem ersten Bereich 40 manuell erfolgen, beispielsweise durch
Verstellen der Korrekturoptik 32. Diese Minim ierung bezieht sich nach diesen Schritten aber nur auf Aberration, die durch den ersten Bereich 40, also das Medium verursacht wird. In einem Schritt S3 wird eine Objektebene festgelegt, in welcher eine Phasendifferenz zwischt dem ersten Bereich 40 und dem zweiten Bereich 42 ermittelt werden soll. Dies legt auch einen Abstand zwischen der Objektebene und dem Objektträger 28 fest. In der Regel fällt die Objektebene mit der Fokalebene zusammen.
In einem Schritt S4 wird der zweite Bereich 42 des Objekts festgelegt. Es handelt sich um den Bereich, der später m ittels des Mikroskops 10 abgebildet werden soll, also z. B. eine Probe, die sich in dem Medium befindet. Dazu kann beispielsweise in einem optional vorangegangenen Zwischenschritt das Objekt 12 m it nicht-korrigierter sphärischer Aberration abgebildet werden, um zu erkennen, wo sich der interessante zweite Bereich 42 des Objekts 12 befindet.
In einem Schritt S5 wird die Phasendifferenz zwischen dem ersten Bereich 40 und dem zweiten Bereich 42 aufgenommen. Optional kann die Phasendifferenz in mehreren entlang der optischen Achse beabstandeten Objektebenen bestimmt werden.
In einem optionalen Schritt S6 werden zusätzliche Parameter hinsichtlich des Objekts 12 erfasst. Diese können beispielsweise mittels einer Schnittstelle 50 der Steuereinrichtung 24 zur Verfügung gestellt werden. Beispielsweise wird die Temperatur des Objekts 12, die zuvor optional eingegebene Objektträgerdicke OD, eine Dicke des Objekts 12, ein Material des Objektträgers 28 und/oder der Brechungsindex in dem ersten Bereich 40 oder dem zweiten Bereich 42 eingegeben. Die Temperatur kann beispielsweise mit einem nicht dargestellten Sensor erfasst werden oder kann für das Experiment bekannt sein, beispielsweise 37°C. Die Dicke des Objekts 12 kann beispielsweise vor dem Experiment ausgemessen werden oder ist bekannt, wie dies z. B. bei Objekten 12 in Form von Schnitten üblich ist. Der Brechungsindex für den ersten Bereich 40 kann ebenfalls bekannt sein, da es sich beispielsweise um eine wässrige Lösung handelt. Ferner kann auch der Brechungsindex des Objekts 12 im zweiten Bereich 42 bekannt sein. Darüber hinaus kann im Schritt S6 auch eine Eindringtiefe gemessen werden, welche den Abstand der Fokalebene von einer Grenzfläche des Objektträgers 28 angibt. Dazu kann beispielsweise die Tiefenlage der Fokalebene so lange verstellt werden, bis eine Reflexion an der Grenzfläche zwischen dem Objektträger 28 und dem Objekt 12 sichtbar ist. Hierdurch wird für eine gegebene Tiefenlage der Fokalebene der Abstand zum Objektträger 28 erfasst, so dass die Eindringtiefe bekannt ist. Ferner kann das Immersionsmedium zwischen dem Objektiv 14 und dem Objektträger 28 als Parameter berücksichtigt werden. In einem optionalen Schritt S7 wird aus der Phasendifferenz, wie oben im allgemeinen Teil der Beschreibung bereits erläutert, die Weglänge und/oder der Brechungsindex im zweiten Bereich 42 bestimmt. Alternativ kann für d die Dicke der Probe, wenn sie geringer ist als ein Tiefenschärfebereich dt _ Objektivs, oder die gegebenenfalls um einen Korrekturfaktur korrigierte
Tiefenschärfebereichsgröße, verwendet werden, wenn die Probe den Tiefenschärfebereich vollständig abdeckt, d kann auch zur Bestimmung des Brechungsindex des Objekts 12 im zweiten Bereich 42 herangezogen werden. Auf dieser Basis kann gleichermaßen der
Einstellwert ermittelt werden.
In Schritt S8 wird der Einstellwert für die Korrekturoptik 32 aufgrund des Zusammenhangs erm ittelt. Der Zusammenhang kann mit der Eindringtiefe, die zuvor erm ittelt wurde, modifiziert werden, so dass der Einstellwert noch präziser ist. Die Modifizierung des Zusammenhangs hinsichtlich der Eindringtiefe erfolgt insbesondere dann, wenn die Objektebene, in welcher die Phasendifferenz bestimmt wurde, nicht m it der Fokalebene, die abgebildet werden soll, zusammenfällt. Dazu kann unter anderem die Bestimmung der Brechungsindizes aus verschiedenen Objektebenen unterhalb der Fokalebene (bei inversem Mikroskop) einfließen, z.B. über eine Mittelung der Brechungsindizes entlang der optischen Achse. Es wird dann nicht nur der Brechungsindex in der Fokalebene berücksichtigt, sondern auch die Information aus weiteren Ebenen .
In einem Schritt S9 wird die Korrekturoptik 32 gemäß dem Einstellwert eingestellt. Dadurch wird die sphärische Aberration für die Abbildung des Objekts 12 im zweiten Bereich 42 m inim iert. In einem anschließenden Schritt S10 wird das Objekt 12 im zweiten Bereich 42 abgebildet.
In einem optionalen Schritt S1 1 wird die Phasendifferenz, die zwischen dem ersten Bereich 40 und dem zweiten Bereich 42 erm ittelt wurde, auch als die Phasendifferenz zwischen einem dritten Bereich und dem ersten Bereich 40 verwendet. Dies erfolgt insbesondere dann, wenn erwartet wird, dass der Brechungsindex für den zweiten Bereich 42 und den dritten Bereich identisch oder nahezu gleich ist. Som it kann in einem nachfolgenden Abbildungsschritt das Objekt 12 nicht nur im zweiten Bereich 42, sondern auch im dritten Bereich mit korrigierter sphärischer Aberration abgebildet werden. Ähnliches gilt für Aufnahmen in verschiedenen Fokalebenen, in denen der Brechungsindexunterschied (entlang der optischen Achse) ähnlich genug ist. Dies kann bspw. über einen Schwellwert festgelegt sein.

Claims

Carl Zeiss Microscopy GmbH Anwaltsakte: PAT 4024/238-PCT Patentansprüche
1 . Verfahren zum Abbilden eines Objekts (12) , wobei ein Mikroskop (10) verwendet wird, welches ein Objektiv (14) , welches eine optische Achse und eine dazu senkrecht stehende Fokalebene definiert, und eine zur Abstimm ung auf eine Tiefenlage einstellbare Korrekturoptik (32) umfasst, welche am Objektiv (14) eine sphärische Aberration korrigiert, wobei die
Einstellung der Korrekturoptik (32) für eine bestim mte Tiefenlage der Fokalebene gilt und wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
Beleuchten des Objekts (12) m it Strahlung,
Erfassen der von dem Objekt (12) reflektierten oder transm ittierten Strahlung,
Durchführen einer quantitativen Phasenkontrastabbildung in einem ersten lateralen Bereich (40) und einem zweiten lateralen Bereich (42) des Objekts (12) und Bestimmen einer Phasendifferenz von Strahlung aus dem ersten lateralen Bereich (40) und dem zweiten lateralen Bereich (42) des Objekts (12) , wobei die sphärische Aberration der Abbildung des Objekts (12) für die Fokalebene im ersten Bereich (40) oder der Brechungsindex des Objektes (12) im ersten Bereich (40) oder die zur Korrektur der sphärischen Aberration nötige Einstellung der Korrekturoptik (32) bekannt ist,
- Verwenden eines vorbekannten Zusammenhangs zwischen der Phasendifferenz und einer dadurch verursachten Änderung der sphärischen Aberration, um einen Einstellwert der Korrekturoptik (32) zu erm itteln, so dass die sphärische Aberration im zweiten Bereich (42) reduziert wird, und
Einstellen der Korrekturoptik (32) auf den Einstellwert und Abbilden des Objekts (12) im zweiten Bereich (42) .
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Zusammenhang erm ittelt wird, wobei eine Weglänge (d) erm ittelt wird, die ein Objekttiefenbereich ist, aus dem Strahlung vom Objekt zur Abbildung beiträgt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Ermittlung der Weglänge (d) ein wirksamer Brechungsindex des Objekts (12) im ersten Bereich (40) variiert wird und die Phasendifferenz für mindestens zwei Werte des Brechungsindex des Objekts (12) im ersten Bereich (40) gemessen und daraus die Weglänge (d) bestimmt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der wirksame
Brechungsindex durch Verwenden eines dispersiven Mediums im ersten Bereich (40) variiert wird und die Messung der Phasendifferenz bei zwei Wellenlängen erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Weglänge (d) näherungsweise durch die Dicke des Objekts (12) angegeben wird.
6. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Phasendifferenzen in mehreren, zueinander beabstandeten Objektebenen bestimmt werden.
7. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein dritter lateraler Bereich des Objekts (12) bestimmt wird, wobei der Einstellwert für den zweiten Bereich (42) auch zur Abbildung des dritten Bereichs verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Parameter erfasst wird, welcher eine Temperatur des Objekts (12), ein Material eines Objektträgers (28), eine Objektträgerdicke (OD), ein Immersionsmedium für das Objektiv (14) oder eine Wellenlänge von Strahlung zur Abbildung des Objekts (12) umfasst, wobei der Zusammenhang hinsichtlich des mindestens einen Parameters modifiziert wird.
9. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Phasendifferenz mittels quantitativer Phasenkontrastabbildung, im Infrarotbereich bestimmt wird.
10. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die
Phasendifferenz in einer mindestens einer ersten Objektebene (F1 ) bestimmt wird und das Objekt (12) unter Verwendung des Einstellwertes in einer anderen, zweiten Objektebene (F2) abgebildet wird.
11 . Mikroskop zur Abbildung eines Objekts (12), umfassend
ein Objektiv (14), welches eine optische Achse und eine dazu senkrecht stehende Fokalebene definiert,
eine einstellbare Korrekturoptik (32), welche am Objektiv (14) eine sphärische Aberration korrigiert, die bei der Abbildung des Objekts (12) auftritt, wobei die Einstellung für eine bestimmte Tiefenlage der Fokalebene gilt,
einen Antrieb (34), welcher die Korrekturoptik (32) einstellt,
eine Einrichtung zur quantitativen Phasenkontrastabbildung (36), welche ausgebildet ist, das Objekt (12) mit Strahlung zu beleuchten, die von dem Objekt (12) reflektierte oder transmittierte Strahlung zu erfassen, und eine Phasendifferenz von Strahlung aus einem erste lateralen Bereich (40) und einem zweiten lateralen Bereich (42) zu bestimmen,
eine Steuereinrichtung (24), in welcher ein Zusammenhang zwischen der
Phasendifferenz und einer dadurch verursachten Änderung der sphärischen Aberration und welche zur Ausführung eines der Verfahren nach Anspruch 1 bis 10 ausgebildet ist.
PCT/EP2018/056434 2017-03-20 2018-03-14 Mikroskop und verfahren zum abbilden eines objekts WO2018172161A1 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/495,748 US11061216B2 (en) 2017-03-20 2018-03-14 Microscope and method for microscopic imaging of an object
CN201880019526.0A CN110476102B (zh) 2017-03-20 2018-03-14 用于物体的显微成像的显微镜和方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102017105928.8 2017-03-20
DE102017105928.8A DE102017105928B4 (de) 2017-03-20 2017-03-20 Mikroskop und Verfahren zum Abbilden eines Objektes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018172161A1 true WO2018172161A1 (de) 2018-09-27

Family

ID=61691484

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2018/056434 WO2018172161A1 (de) 2017-03-20 2018-03-14 Mikroskop und verfahren zum abbilden eines objekts

Country Status (4)

Country Link
US (1) US11061216B2 (de)
CN (1) CN110476102B (de)
DE (1) DE102017105928B4 (de)
WO (1) WO2018172161A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110132993A (zh) * 2019-06-19 2019-08-16 中国工程物理研究院激光聚变研究中心 一种快速检测光学膜层节瘤缺陷的装置及方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102017105926A1 (de) * 2017-03-20 2018-09-20 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Verfahren und Mikroskop zum Abbilden eines Objektes
DE102018126007B4 (de) 2018-10-19 2024-02-01 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren zur Korrektion eines sphärischen Abbildungsfehlers eines Mikroskops und Mikroskop
DE102018125997A1 (de) 2018-10-19 2020-04-23 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren zur digitalen Korrektion einer optischen Abbildung einer Probe mittels eines Mikroskops und Mikroskop
DE102018126000B4 (de) * 2018-10-19 2024-06-27 Leica Microsystems Cms Gmbh Objektiv für ein Mikroskop und Verfahren zum Korrigieren eines Abbildungsfehlers eines Mikroskops mit einem Objektiv
US20210149170A1 (en) * 2019-11-15 2021-05-20 Scopio Labs Ltd. Method and apparatus for z-stack acquisition for microscopic slide scanner
US11650405B2 (en) * 2019-11-15 2023-05-16 Scopio Labs Ltd. Microscope and method for computational microscopic layer separation
DE102020111715A1 (de) * 2020-04-29 2021-11-04 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Immersionsobjektiv und verfahren zur immersionsmikroskopie
DE102022126509A1 (de) 2022-10-12 2024-04-18 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Verfahren zur Bestimmung der Phase und/oder Brechzahl eines Bereiches eines Objektes und Mikroskop zur Bestimmung der Phase und/oder Brechzahl eines Bereiches eines Objektes

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020075458A1 (en) * 2000-12-18 2002-06-20 Nec Corporation Method for correcting spherical aberration of a projection lens in an exposure system
US20050024718A1 (en) 2003-07-28 2005-02-03 Nikon Corporation Microscope control apparatus, microscope apparatus and objective lens for microscope
US20080310016A1 (en) 2007-05-02 2008-12-18 Olympus Corporation Optical apparatus and imaging method
US7948632B2 (en) 2005-12-22 2011-05-24 Phase Holographic Imaging Phi Ab Method and apparatus for analysis of a sample of cells
US20110141260A1 (en) 2008-06-17 2011-06-16 Nikon Corporation Microscope apparatus and storage medium storing microscope apparatus control program
US20130130307A1 (en) * 2010-04-23 2013-05-23 Hamamatsu Photonics K.K. Cell observation device and cell observation method
WO2013130077A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Agilent Technologies, Inc. Software defined microscope
US20140233094A1 (en) 2013-02-20 2014-08-21 Olympus Corporation Microscope system and storage medium
DE102014002584A1 (de) 2014-01-23 2015-07-23 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag Verfahren zum Abbilden eines Obiektes und Optikvorrichtung

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5820012B2 (ja) * 1976-04-13 1983-04-21 オリンパス光学工業株式会社 顕微鏡対物レンズ
JP4441831B2 (ja) 1999-09-16 2010-03-31 株式会社ニコン 顕微鏡装置
TW514890B (en) * 1999-12-24 2002-12-21 Koninkl Philips Electronics Nv Optical scanning head
US6836373B2 (en) * 2000-11-16 2004-12-28 Jeol Ltd. Spherical aberration corrector for electron microscope
JP4296868B2 (ja) * 2003-07-17 2009-07-15 コニカミノルタオプト株式会社 光ピックアップ装置用の光学系、光ピックアップ装置及び光情報記録再生装置
US7489828B2 (en) * 2003-10-03 2009-02-10 Media Cybernetics, Inc. Methods, system, and program product for the detection and correction of spherical aberration
WO2006121153A1 (ja) * 2005-05-12 2006-11-16 Pioneer Corporation 光ピックアップ及び情報機器
JP4788887B2 (ja) * 2005-11-11 2011-10-05 独立行政法人物質・材料研究機構 透過電子顕微鏡
WO2009009081A2 (en) 2007-07-10 2009-01-15 Massachusetts Institute Of Technology Tomographic phase microscopy
JP5212382B2 (ja) 2008-02-01 2013-06-19 株式会社ニコン 顕微鏡および収差補正制御方法
JP5692969B2 (ja) * 2008-09-01 2015-04-01 浜松ホトニクス株式会社 収差補正方法、この収差補正方法を用いたレーザ加工方法、この収差補正方法を用いたレーザ照射方法、収差補正装置、及び、収差補正プログラム
JP4896106B2 (ja) * 2008-09-30 2012-03-14 株式会社日立ハイテクノロジーズ 電子顕微鏡
JP2011095685A (ja) * 2009-11-02 2011-05-12 Sony Corp 顕微鏡システム及び顕微鏡システムの制御方法
DE102011084562B4 (de) * 2011-10-14 2018-02-15 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Feststellung und Korrektur von sphärischen Abbildungsfehlern in einem mikroskopischen Abbildungsstrahlengang
TWI467226B (zh) * 2011-11-15 2015-01-01 Ind Tech Res Inst 相位物體顯微系統
JP6157364B2 (ja) * 2012-02-03 2017-07-05 シチズン時計株式会社 位相変調デバイス及びレーザ顕微鏡
US20140368904A1 (en) 2012-02-29 2014-12-18 Agilent Technologies, Inc. Software Defined Microscope
DE102012009836A1 (de) * 2012-05-16 2013-11-21 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Lichtmikroskop und Verfahren zur Bildaufnahme mit einem Lichtmikroskop
WO2014027694A1 (ja) * 2012-08-16 2014-02-20 シチズンホールディングス株式会社 収差補正光学ユニット及びレーザー顕微鏡
GB201302624D0 (en) * 2013-02-14 2013-04-03 Univ Antwerpen High-resolution amplitude contrast imaging
DE102014005880A1 (de) * 2014-04-17 2015-11-05 Carl Zeiss Ag Lichtrastermikroskop mit vereinfachter Optik, insbesondere mit veränderlicher Pupillenlage
US10921255B2 (en) * 2014-12-09 2021-02-16 Bioaxial Sas Optical measuring device and process
JP6555811B2 (ja) * 2015-07-16 2019-08-07 オリンパス株式会社 顕微鏡システム、特定方法、及び、プログラム
JP6552041B2 (ja) * 2015-07-16 2019-07-31 オリンパス株式会社 顕微鏡システム、屈折率算出方法、及び、プログラム
JP6562547B2 (ja) * 2015-07-16 2019-08-21 オリンパス株式会社 顕微鏡システム、算出方法、及び、プログラム
DE202016008115U1 (de) * 2016-07-01 2017-03-01 Carl Zeiss Ag Anordnung zur Mikroskopie und zur Korrektur von Aberrationen
US10634623B2 (en) * 2016-10-07 2020-04-28 Kla-Tencor Corporation Phase contrast monitoring for extreme ultra-violet (EUV) masks defect inspection

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020075458A1 (en) * 2000-12-18 2002-06-20 Nec Corporation Method for correcting spherical aberration of a projection lens in an exposure system
US20050024718A1 (en) 2003-07-28 2005-02-03 Nikon Corporation Microscope control apparatus, microscope apparatus and objective lens for microscope
JP2005043624A (ja) 2003-07-28 2005-02-17 Nikon Corp 顕微鏡制御装置、顕微鏡装置、及び顕微鏡対物レンズ
US7948632B2 (en) 2005-12-22 2011-05-24 Phase Holographic Imaging Phi Ab Method and apparatus for analysis of a sample of cells
US20080310016A1 (en) 2007-05-02 2008-12-18 Olympus Corporation Optical apparatus and imaging method
US20110141260A1 (en) 2008-06-17 2011-06-16 Nikon Corporation Microscope apparatus and storage medium storing microscope apparatus control program
US20130130307A1 (en) * 2010-04-23 2013-05-23 Hamamatsu Photonics K.K. Cell observation device and cell observation method
WO2013130077A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Agilent Technologies, Inc. Software defined microscope
US20140233094A1 (en) 2013-02-20 2014-08-21 Olympus Corporation Microscope system and storage medium
DE102014002584A1 (de) 2014-01-23 2015-07-23 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag Verfahren zum Abbilden eines Obiektes und Optikvorrichtung

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUMPHRY: "Optical transmission mode imaging with the Phase Focus Virtual Lens", 22 March 2010, PHASE FOCUS LIMITED
MARQUET ET AL.: "Review of quantitative phase-digital holographic microscopy: promising novel imaging technique to resolve neuronal network activity and identify cellular biomarkers of psychiatric disorders", NEUROPHOTONICS, vol. 1, no. 2, October 2014 (2014-10-01), XP060048044, DOI: doi:10.1117/1.NPh.1.2.020901
RAPPAZ ET AL.: "Simultaneous cell morphometry and refractive index measurement with dual-wavelength digital holographic microscopy and dyeenhanced dispersion of perfusion medium", OPTICS LETTERS, vol. 33, no. 7, 1 April 2008 (2008-04-01), XP007904931
TIAN ET AL.: "Quantitative differential phase contrast imaging in an LED array microscope", OPTICS EXPRESS, vol. 23, 4 May 2015 (2015-05-04)
WANG ET AL.: "Spatial light interference tomography (SLIT", OPTICS EXPRESS, vol. 19, no. 21, 10 October 2011 (2011-10-10)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110132993A (zh) * 2019-06-19 2019-08-16 中国工程物理研究院激光聚变研究中心 一种快速检测光学膜层节瘤缺陷的装置及方法
CN110132993B (zh) * 2019-06-19 2022-04-01 中国工程物理研究院激光聚变研究中心 一种快速检测光学膜层节瘤缺陷的装置及方法

Also Published As

Publication number Publication date
US11061216B2 (en) 2021-07-13
CN110476102B (zh) 2022-05-27
DE102017105928A1 (de) 2018-09-20
DE102017105928B4 (de) 2024-08-14
CN110476102A (zh) 2019-11-19
US20200110254A1 (en) 2020-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE102017105928B4 (de) Mikroskop und Verfahren zum Abbilden eines Objektes
EP2673671B1 (de) Mikroskop mit autofokuseinrichtung und verfahren zur autofokussierung bei mikroskopen
DE112011103187B4 (de) System und Verfahren zur 3D-Lokalisierungsmikroskopie
DE10319182B4 (de) Verfahren und Anordnung zur Bestimmung der Fokusposition bei der Abbildung einer Probe
DE112014002683B4 (de) Justierverfahren für adaptives Optiksystem, adaptives Optiksystem und Speichermedium, das ein Programm für ein adaptives Optiksystem speichert
DE102017105926A1 (de) Verfahren und Mikroskop zum Abbilden eines Objektes
DE102013218795A1 (de) Laserscanningmikroskop und Verfahren zur Korrektur von Abbildungsfehlern insbesondere in der hochauflösenden Scanning-Mikroskopie
EP3058414B1 (de) Scanmikroskop und verfahren zum bestimmung der punkt-spreiz-funktion (psf) eines scanmikroskops
DE202014011312U1 (de) Mikroskop, Fokussierungseinheit, Flüssigkeitshalteeinheit und optische Einheit
DE102007017598A1 (de) Verfahren und Anordnung zum Positionieren eines Lichtblattes in der Fokusebene einer Detektionsoptik
DE102012223128B4 (de) Autofokusverfahren für Mikroskop und Mikroskop mit Autofokuseinrichtung
EP2497412B1 (de) Laser-Scanning-Mikroskop und Verfahren zu seinem Betrieb
DE102011082756A1 (de) Autofokussierverfahren und -einrichtung für ein Mikroskop
DE102010036709A1 (de) Einrichtung und Verfahren zur mikroskopischen Bildaufnahme einer Probenstruktur
DE102017223014A1 (de) Verfahren zur Bestimmung der Dicke einer Probenhalterung im Strahlengang eines Mikroskops
DE102014107933B4 (de) Verfahren zur mikroskopischen Abbildung von Proben an Böden von mit Fluid befüllten Töpfchen einer Mikrotiterplatte
EP3345032B1 (de) Verfahren zur bestimmung einer höhenlage eines objekts
DE102016108226A1 (de) Mikroskop
DE102005036529A1 (de) Verfahren zur lagegetreuen Abbildung eines Objektes
DE102019109832B3 (de) Lichtblattmikroskop und Verfahren zum Erfassen einer Messgröße
DE102014003145A1 (de) Verfahren zur Korrektur der sphärischen Aberration bei mikroskopischen Anwendungen
DE102019102330B3 (de) Optisches System für ein Mikroskop, Mikroskop mit einem optischen System und Verfahren zur Abbildung eines Objekts unter Verwendung eines Mikroskops
WO2014147257A1 (de) Lichtmikroskopisches verfahren zur lokalisierung von punktobjekten
DE102018126002B4 (de) Verfahren und Mikroskop zur Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums
EP4042222B1 (de) Verfahren und vorrichtung zur aberrationskorrektur in der fluoreszenzmikroskopie

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18711899

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18711899

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1