CN110476102B - 用于物体的显微成像的显微镜和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于对物体(12)成像的方法和显微镜(10)，所述显微镜包括：透镜组件(14)，所述透镜组件限定光学轴线和与其垂直的焦平面；和校正光学器件(32)，所述校正光学器件是可调节的以调节至一深度位置，并且所述校正光学器件校正在所述透镜组件(14)上的球面像差，所述球面像差在所述焦平面的某一深度位置处在所述物体(12)的成像期间发生。所述方法包括以下步骤：确定来自所述物体(12)的第一横向区域(40)和第二横向区域(42)的辐射的相位差；使用所述相位差与由此引起的球面像差的修改之间的先前已知连接，以便确定所述校正光学器件(32)的调节值，使得当对所述第二区域(42)成像时减小所述球面像差。

Description

用于物体的显微成像的显微镜和方法

发明领域

本发明涉及一种借助于显微镜对物体进行显微成像的方法，所述显微镜包括包含校正光学单元的物镜。物镜限定光学轴线和与其垂直的焦平面。该物镜的校正光学单元可调节到一深度位置，以便校正当在焦平面的该深度位置处对物体成像时发生的球面像差。此外，本发明涉及这样的显微镜。

背景技术

由于实施了非常不同类型的实验，显微镜在研究中通常需要具有高度的灵活性。这里，要观察的物体和物体载体中可能存在很大的变化。在具有高数值孔径的物镜的情况下，沿着从物体中的焦平面到物镜的光学路径的折射率的偏差对衍射限制的成像能力具有强烈影响。用于使与对物体成像相关联的球面像差适应不同的物体载体厚度(例如，从0.15mm到1.5mm的盖玻片厚度)的一种选择在于将物镜处的校正环设定为适当值，并且因此在成像期间减小球面像差。

焦平面位于物体中越深，这样的成像像差变得越来越明显。如果物体中存在折射率差，并且物镜的数值孔径相应地较高(例如，如在共焦显微术中传统的数值孔径为1.2)，则在几微米的深度处已经出现可见球面像差。无论是在3D检查细胞培养物的情况下，在球体的情况下，还是在较厚切片的情况下，三维成像(即，在较厚或较深的物体中成像)都正变得越来越重要。出色的成像质量对此变得越来越重要，因此不再接受由于球面像差造成的质量损失。

特别是在荧光显微术的情况下的应用以及因此对显微镜的要求变化很大。以示例方式，在一个实验中，可能仅需要从盖玻片表面观察前10μm，而在另一个实验中，目的是成像到物体中200μm的深度。类似的考虑适用于温度。一个实验在室温下实施，而另一个实验在37℃下执行。这对显微镜的光学行为具有影响，并且因此对其成像性能具有影响。

到目前为止，准确地设定校正光学单元一直很麻烦，校正光学单元通常是在物镜处匹配物体载体或物体的要求的所谓校正环。实验者必须尝试不同的设定，以便找到最佳值。此外，实际上排除了在实验期间改变设定。

现有技术公开了用于显微镜的各种方法或设计，其以自动或部分自动的方式操作并且含有用于校正球面像差的迭代过程。US 2008/310016A描述了考虑到盖玻片厚度来校正球面像差。US 2005/024718A和JP 2005/043624 A2要求用户输入光学参数，随后从所述光学参数导出球面像差的校正。US 2011/141260A和US2014/233094A描述了用于球面像差的迭代校正方法，其评估图像分析中的衬度或亮度。

在以下各文献中讨论了显微术的相位方面：在Humphry的“借助于相位聚焦虚拟透镜的光学传输模式成像(Optical transmission mode imaging with the Phase FocusVirtual Lens)”(《相位聚焦限制》(Phase Focus Limited)，第TB02期，2010年3月22日)中；在菲兹克斯公司(Phasics S.A.)的相位衬度相机“SID4bio”中；在Marquet等人的“定量相位-数字全息显微术综述：解决神经元网络活动和识别精神疾病的细胞生物标志物的有前途的新成像技术(Review of quantitative phase-digital holographic microscopy:promising novel imaging technique to resolve neuronal network activity andidentify cellular biomarkers of psychiatric disorders)”(《神经光子学》(Neurophotonics)，第1(2)卷，2014年10月到12月)中，以及在Rappaz等人的“借助于双波长数字全息显微术和灌注介质的染料增强分散同时进行细胞形态测量和折射率测量(Simultaneous cell morphometry and refractive index measurement with dual-wavelength digital holographic microscopy and dye-enhanced dispersion ofperfusion medium)”(《光学快报》(Optics Letters)，第33卷，第7期，2008年4月1日)中。

出于改进成像质量的目的，DE 102014002584 A1在很大费用的情况下借助于光学相干断层摄影术确认了物点的几何路径长度位置。WO2013/130077使用SLM进行照射和成像。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于对物体成像的方法和显微镜，借助于所述方法和显微镜可以在很少费用的情况下尽可能无像差地对所述物体成像。

在用于对物体成像的方法中，使用包括物镜和可调节校正光学单元的显微镜。所述物镜限定光学轴线和与其垂直的焦平面。所述校正单元校正所述物镜处的球面像差，所述球面像差在对所述物体成像时发生。所述校正单元的设定值适用于所述焦平面的一个某一深度位置。所述方法包括以下步骤：照射所述物体；捕获由所述物体反射或透射的辐射；执行定量相位衬度成像，以用于确定所述物体的第一横向区域与第二横向区域之间的辐射的相位差。对于所述第一区域，已知所述物体的成像的球面像差或所需的球面像差校正。相位差与由这个相位差引起的球面像差的改变之间的关系用于确认所述校正光学单元的设定值，使得所述球面像差在所述第二区域中也减小。将所述校正光学单元设定为所述设定值，并且然后对所述第二区域中的物体进行成像。

在所述方法中不需要知道所述球面像差的绝对值。所述方法涉及第一区域，对于所述第一区域，球面像差由所述校正光学单元校正或可由所述校正光学单元校正。借助于参考该第一区域，并且通过确认所述相位差，并且通过使用所述相位差与由此引起的球面像差的改变之间的关系，可以非常容易地设定所述校正光学单元，使得所述物体在第二区域中也以尽可能小的球面像差成像。在实施例中，首先设定所述校正光学单元，使得所述第一区域以尽可能小的球面像差成像。以示例方式，为此可以使用物体的下述区域，所述区域在其折射率或样本的容易接近的区域方面是已知的。因此，可以选择所述第一区域，使得以很少的费用并且快速地获得具有很小球面像差或完全补偿球面像差的图像。然后，在没有进一步费用的情况下，考虑到所述球面像差的改变与相位衬度之间的关系，通过首先执行所述相位衬度成像并且然后针对所述第二区域获得用于所述校正光学单元的适当设定，所述方法也供应所述第二区域的低像差或无像差图像。因此，相位衬度成像和再现所述球面像差的改变的关系的使用的组合允许特别简单的程序。在特别优选的实施例中，所述关系依据所述相位衬度指定所述校正光学单元的设定，更特定地说，所述设定中的改变。因此，所述球面像差的改变直接转换成所述校正光学单元的设定。

通过使用定量相位衬度成像确定所述相位差。用于定量相位衬度成像的装置可选地包括光源和用于确定所述相位差的检测器。以这种方式确定所述相位差在所反射光和所透射光显微术方法中同样是可能的。

一种用于对物体成像的显微镜包括物镜、可调节校正光学单元、驱动器、用于定量相位衬度成像的装置和控制装置。所述物镜限定光学轴线和与其垂直的焦平面。所述校正光学单元校正所述物镜处的球面像差，所述球面像差在所述物体的成像期间发生。所述校正光学单元的设定值适用于所述焦平面的一个某一深度位置。所述驱动器设定所述校正光学单元。用于定量相位衬度成像的装置被实施为用辐射照射所述物体，以捕获由所述物体反射或透射的辐射，并且确定第一横向区域与第二横向区域之间的辐射的相位差。预先存储在所述控制装置中的是所述相位差与由此引起的球面像差的改变之间的关系。基于这种关系，所述控制装置控制所述驱动器，使得所述焦平面中的球面像差在所述第二区域中也减小。

作为本发明的结果，基于“已知”第一区域，针对“新鲜”第二区域自动地校正当对所述物体成像时存在的球面像差。在实施例中，这通过在所述物体的成像之前或期间评估所述物体中的两个横向区域之间的相位差并且通过获得所述第二区域的球面像差的校正来完成。因此，实验者不需要考虑是否可接受地设定所述校正光学单元以校正相应物体的第二区域的球面像差。此外，即使在实验期间，现在也有可能针对沿其横向范围具有不同折射率并且因此导致不同的球面像差的物体适合地设定所述校正光学单元。以示例方式，所述校正光学单元可以根据其中在所述物体的扫描成像期间当前实施扫描的横向区域来设定，并且因此对于整个成像，球面像差被最小化。

另一个优点是通过定量相位衬度成像确定所述相位差对所述物体造成很小的损坏或没有损坏，因为被用于该目的的辐射不与所述物体相互作用，或者仅与其微弱地相互作用。

以示例方式，所述方法可以借助于所述显微镜的控制装置来实施。以示例方式，所述控制装置可以实施为微处理器、电路、计算机或任何其它可编程设备。

取决于实施例，用于所述方法的显微镜可以实施不同的成像方法。以示例方式，所述显微镜可以被实施用于宽视场成像和/或用于扫描成像技术，例如，共焦显微术。此外，可选地，有可能使用所述显微镜来捕获所述物体的荧光图像。

所述物体可选地包括实际上应该被成像的样本和围绕所述样本的安装介质或嵌入介质。以示例方式，所述物体包括待成像为样本的细胞培养物和其中嵌入所述细胞培养物作为介质的溶液。

所述物镜用于对所述物体成像，但也可以同时用于照射目的。所述物镜具有光学轴线。焦距设定所述焦平面的深度位置。可选地，所述物镜和/或物体载体设置有z驱动器，并且设定所述焦平面在所述物体中的位置。所述z驱动器可以连接到所述控制装置，使得所述控制装置能够设定所述焦平面的深度位置。此外，所述控制装置可选地举例来说借助于由所述z驱动器采用的位置捕获所述焦平面的当前位置。

所述校正光学单元用于校正在所述物体的成像期间发生的球面像差。所述校正光学单元可以是在所述物镜处的上述校正环；然而，也有可能使用距所述物镜一定距离的光学元件，所述光学元件促进借助于所述物镜修改所述成像的球面像差。以示例方式，所述校正光学单元可以布置在检测器侧部上。所述校正光学单元可以包括光学元件，所述光学元件取决于其相对于所述光学轴线的位置而不同地偏转辐射。

所述校正光学单元借助于驱动器来设定，所述驱动器通过线路或无线方式连接到所述控制装置。所述控制装置可以捕获所述驱动器的位置，并且因此捕获所述校正光学单元的当前设定值。

在每种情况下，由从所述第一区域和所述第二区域穿过所述物体的辐射引起的相位差与来自所述第一区域和所述第二区域的辐射行进到所述检测器的光学路径长度差成比例。该光学路径长度差是所述球面像差的原因。所述相位差满足以下等式(1)：

这里，

是所述相位差，λ是用于确定所述相位差的辐射的波长，n₂是所述第二区域中的折射率，n₁是所述第一区域中的折射率，并且d是路径长度。从等式(1)显现出的但没有前因子2π/λ的路径长度差类同于所述相位差

所述路径长度d是下述区域，来自该区域的辐射促成成像，例如，所述区域是样本的厚度。可以使用上文指定的等式从所述相位差测量确定所述样本的厚度或所述折射率。如果折射率恒定且已知，则可以从相位数据导出所述样本厚度。如果所述厚度已知(且恒定)，则可以导出所述折射率。在一些实施例中，具体来说，尤其是当所述样本比所述景深范围厚得多时，所述物镜的景深范围与这个目的相关。在其中所述样本比所述景深范围薄得多并且完全位于所述景深范围内的其它实施例中，所述样本厚度对于所述路径长度d是决定性的。如果波长和路径长度d是恒定的，则所述相位差仅取决于所述第一区域与第二区域之间的折射率的差。

所述关系将所述折射率与由此引起的球面像差之间的差与所述相位差或所述光学路径长度差联系起来。所述关系可以是公式或表格。所述关系可选地通过确定所述物体的非常不同的折射率确定一次，并且被存储为表格；对于所述显微镜，也可以定期重复这种校准。所述相位差的非常不同的值可以借助于插值非常好近似地确认。

在实施例中，所述路径长度d被包含作为所述关系中的常数因子。因此，在实施例中，出于执行所述显微术方法或显微镜的目的，使用关于该(恒定)路径长度d的说明。对于各种实施例，可以不同地获得该说明。在一些实施例中，如果所采用的物镜的景深范围大于所述样本厚度并且所述样本厚度完全位于所述景深范围内，则所述路径长度d等于所述样本厚度。在其中条件实际上反转并且所述样本比所述景深范围厚得多的其它实施例中，这不适用。然而，在这样的实施例中，所述样本厚度在所述物场上变化。以示例方式，所述厚度d可以在组织切片的情况下或通过微流体通道的尺寸来定义，要不然通过其它方法确定。这里，有可能举例来说用低倍率物镜确定所述样本的“平均”折射率，并且然后随后在用高分辨率物镜进行荧光测量的情况下，使用该参数来校正所述球面像差。另外，所述景深范围可以近似地假设为针对d的值。

在实施例中，还有可能在显微镜中在要通过显微术检查的生物样本与围绕后者的介质(举例来说，培养介质)之间的界面处执行相位差或路径长度差测量。相位差测量或路径长度差测量在显微术中是已知的(参见下文指定的出版物)，并且对于本领域技术人员来说，为这样的测量配置显微镜没有问题。这里，出于确定所述路径长度d(确认所述路径长度差与其等同)的目的，确认所述样本与周围介质之间的相位差。实施两次测量，其中所述相位差(或路径长度差)的不同之处在于所述周围介质的折射率不同。在第一变体中，这是通过为分散性(即，展现对所述折射率的波长依赖性)的周围介质和在不同波长下实施的两次测量来实施的。在第二变体中，所述介质由在所述两次测量之间具有不同折射率的介质代替。在两个变体中，在两次测量的每一次中，所述路径长度差(或相位差)从路径长度d和介质与样本之间的折射率差的乘积显现。因此，获得了具有两个未知数的两个方程；该方程组可以毫无问题地求解，并且可以确定所述样本的路径长度差和所述折射率(先验未知)。知晓所述路径长度d现在致使有可能在没有插值的情况下非常好近似地使用或确定所述相位差的各种值，甚至在被用于确认d的样本与介质之间的界面之外。

由于所述关系，所述控制装置确认用于适当地设定所述校正光学单元的设定值。所述设定值可选地取决于所述校正光学单元的当前位置和从所述关系确认的所期望位置。以示例方式，依据知道所述第一区域中的球面像差，已知所述校正光学单元的当前设定值。此外，所述设定值还可以指定所述校正光学单元的绝对位置。在设定所述校正光学单元之后，在所述第二区域中对所述物体成像。

在一个研发中，优选的是，考虑到穿透深度修改所述关系。所述穿透深度是所述焦平面位于所述样本表面下方的深度，如在成像方向上所见。这尤其在使用高穿透深度并且所述物镜的景深范围低(高数值孔径)时相关，因为所述球面像差随着穿透深度而增加。因此，优选测量所述穿透深度，其中测量所述穿透深度可选地包括检测物体载体与所述物体之间的界面并且捕获所述焦平面的位置。在实施例中，所述穿透深度与从所述界面到所述物镜的辐射的路径相关。可以设想各种选项，以用于确定所述穿透深度。以示例方式，如果所述物体载体与所述物镜之间的距离和所述物镜的焦距是已知的，则可以从该差确认所述穿透深度。此外，有可能基于所述物体确定所述穿透深度。然而，特别优选地，如果所述物镜的焦平面与所述界面一致，则举例来说通过捕获在所述界面处引起的辐射的反射来确定所述物体与所述物体载体之间的界面。由于所述控制装置可以优选地借助于z驱动器捕获所述物镜的焦距，因此所述界面的位置是可检测的。然后，通过借助于所述z驱动器记录的物镜的焦距的调节和因此已知的当前焦平面来捕获所述穿透深度。然后，所述穿透深度是所述当前焦平面与所述界面之间的差。还有可能举例来说借助于在不同的Z平面(焦平面)中测量的相位差获得断层摄影相位图像。因此，获得所述样本的xyz相位关系。由此，现在可以针对每个穿透深度确定Z平均折射率。以示例方式，如果意图是在20μm的穿透深度处实施荧光测量，则可以将前20μm上的折射率平均并且包含在所述球面像差的校正中。如果测量是位于所述样本内100μm深处，则有必要在100μm的范围内平均。

如果所述物体在不同的深度位置处成像，则优选地在彼此间隔开的多个物平面中确定多个相位差。以示例方式，通过所谓的Z堆叠在多个Z位置中捕获厚样本。如果在确定所述设定值时尚不知道用于对所述物体成像的焦平面的精确位置，则记录多个物平面中的相位差(即通过Z堆叠)是特别有用的。然而，对于要在所述物体中成像的每个焦平面，也有可能首先测量所述相位差，然后校正所述球面像差，并且随后对该焦平面成像。随后，所述焦平面移位，重新测量所述相位差，在必要时校正所述球面像差，并且在此之后，在所修改的焦平面中对所述物体成像。

在实施例中，使用称为数字全息显微术的全息定量相位衬度成像方法来确定所述相位差。相干或部分相干辐射可以用于所述相位衬度成像。此外，对于所述定量相位衬度成像有可能使用至少两个波长，所述物体(更特定来说，所述介质)在所述波长处具有预先已知的显著折射率差。所述定量相位衬度成像可选地是一种叠层方法。波前传感器被用于所述显微镜的研发中的定量相位衬度成像。另外，干涉测量结构可以被用于所述定量相位衬度成像。用于所述定量相位衬度成像的光源可以包括空间光调制器，或者可选地使被用于所述定量相位衬度成像的辐射的相位改变。此外，用于所述定量相位衬度成像的辐射可以从各种照射角度产生。在下述文献中描述了用于定量相位衬度成像的装置或用其实施的方法的示例：US7948632B2；Wang等人的：“空间光干涉断层扫描(Spatial lightinterference tomography)(SLIT)”，《光学快讯》(Optics Express)，第19卷，第21期，2011年10月10日；和Tian等人的“LED阵列显微镜中的定量微分相位衬度成像(Quantitativedifferential phase contrast imaging in an LED array microscope)”《光学快讯》，第23卷，第9期，2015年5月4日。

如已经所提到的，在物平面中测量在彼此间隔开的两个横向区域之间由所述物体引起的相位差。所述物平面与所述焦平面相同或者与其平行。所述物平面越靠近用于对所述物体成像的焦平面，校正所述球面像差就变得越精确。以示例方式，在所述物平面位于所述焦平面中的情况下，由同一物镜实施确定所述相位差和随后的物体的成像。然而，也有可能在特定物平面中确定所述相位差一次，并且随后在不同的焦平面中对所述物体成像。然而，在物平面中确定所述相位差一次非常好近似地表示所述焦平面中的相位差。特定来说是如果所述显微镜实施扫描成像方法，则在其之间确定所述相位差的横向区域可以近似为点状。如果成像方法被用于定量相位衬度成像，则有可能不仅同时捕获两个横向区域，而且同时捕获多个横向区域。

在实施例中，选择所述第一区域，使得其球面像差是已知的或补偿的。以示例方式，这包括用于从已经被最小化的第一区域中的焦平面对所述物体成像的球面像差。以示例方式，如果针对具有特定折射率作为标准值的物体的区域设定所述校正光学单元，则是这种情况；这尤其可以自动地实施。以示例方式，这样的标准值可适合用于围绕待成像的样本(例如，细胞或任何其它生物样本)的水或水溶液。知晓用于补偿所述第一区域中的球面像差的设定可选地包括知晓用于所述校正光学单元的设定值，举例来说，对于所述设定值，所述球面像差被最小化。为了确认所述第一区域，可选地在不进一步校正所述球面像差的情况下初始地对所述物体成像，以便识别具有已知折射率的区域存在的位置。此外，可以手动校正所述球面像差——也借助于所述控制装置和所述驱动器——直到所述物体的成像在所述第一区域中是最佳的为止。此外，所述第一区域也可以是这样的区域，其中要成像的样本不存在于所述物体中，并且然后针对空气测量第一区域。因此，所述物体可选地包括要成像的样本以及其周围环境。

特定来说，所述第二区域是对于要实施的检查感兴趣的物体的区域。通常，所述第二区域具有与所述第一区域中的折射率不同的折射率，因为否则将不需要校正所述球面像差。通常，所述第二区域中的折射率是未知的，并且因此纯粹地确定所述第一区域与所述第二区域之间的相位差有助于优化用于对整个物体成像的球面像差。

为了简化和/或加速球面像差的校正，一种研发倾向于要使用的物体的第三横向区域，对于所述第三横向区域，存在与所述第二区域相同的在公差范围内的折射率，其中用于所述第二区域的设定值也被用于对所述第三区域进行成像。以示例方式，所述第三横向区域可以是在所述物体的焦平面中的区域，对于所述区域，预期所述折射率实际上与所述第二区域中的折射率相同。以示例方式，所述第二区域和所述第三区域可以在细胞内，使得用于两个区域的折射率以及因此用于其成像的球面像差近似地相同。以示例方式，可以对各相关样本区域的折射率进行平均，以便校正用于所述样本区域的球面像差。因此，可以借助于减少确定相位差的次数来提供所述球面像差的可接受的校正。此外，这还允许增加用于对所述物体成像的测量速度，因为如果对于所述第三区域使用与所述第二区域相同的设定值，则在所述物体的成像期间省去所述校正光学单元的耗时调节。类似的声明适用于Z堆叠记录。如果在各个z平面中获得足够数量的类似相位差值或折射率(与位于其下方的z平面相比)，则不需要在每个z平面中校正所述球面像差。通过物体的相位差的z堆叠确认，类似的陈述适用于z堆叠。这意味着如果在各个z平面中获得类似的相位差值或折射率，则不需要在每个z平面中校正所述球面像差。可选地，仅在已经超过最大偏差时才执行附加校正。

为了更加精确地设计所述关系并且因此促进所述球面像差的更加准确的校正，优选地在研发中捕获至少一个参数，所述参数包括所述物体的温度、物体载体的材料、物体载体厚度、用于所述物镜的浸没介质或用于对所述物体成像的辐射的波长，其中考虑到所述至少一个参数修改所述关系。已知的是材料的折射率取决于其温度。因此，借助于所述物镜成像时的球面像差也取决于温度。通过举例来说借助于传感器或借助于入射捕获所述物体的温度，举例来说，如果实验的温度是固定预定的，则有可能修改所述关系，使得在不同温度的情况下出现不同的设定值。因此，所述校正光学单元以温度依赖的方式设定。这里也可以通过考虑到温度依赖性进行的校准来确定所述关系。在一个研发中，通过捕获用于照射所述物体的辐射的能量参数并且通过依据所述能量参数确认所述物体的温度来确定所述物体的温度。以示例方式，所述能量参数可以是照射辐射的强度或功率。这可以在所述物体本身中确认，或者通过输出耦合来自照射光束路径的照射辐射的测量部件来确定。为了这个目的，可以使用功率检测器或强度检测器。可以基于所述能量参数和所述物体对所述照射辐射的预期或已知吸收而计算所述物体中的温度。也可以使用所述物体类型来计算所述温度，即考虑到相应物体的吸收行为的强度来计算所述温度。以这种方式，可以考虑到所述温度自动地修改所述关系。

沿着从所述焦平面到所述物镜的辐射所行进的路径，所述辐射既通过物体载体或盖玻片，并且在特定情况下也通过浸没介质。这些结构具有促成所述物体的成像的球面像差的折射率。通过捕获物体载体厚度或盖玻片厚度和/或所述物体载体和/或所述浸没介质的折射率，在每种情况下，以示例方式，通过输入相关联的说明，可以考虑到由这些方面改变的球面像差来改进和修改所述关系。

由于所述球面像差取决于所述折射率，在色散材料的情况中取决于所述波长，因此所述球面像差同样是波长依赖性的。因此，用于对所述物体成像的辐射的波长是另一个参数，可以考虑到所述参数修改所述关系，以便改进所述球面像差的设定。可以手动输入所述波长；特别是在荧光成像的情况下，所感应荧光辐射的波长对于所述控制器和/或所述用户来说是已知的。此外，所述显微镜可以设置有波长传感器，借助于所述波长传感器可以以自动方式确定所述成像辐射的波长。可选地，可以考虑所述照射波长和/或滤波器设定。

在研发中，可以使用所述方法来确定所述第二区域中的物体的折射率。上文已经参考等式(1)对此进行了解释。因此，这种研发致使有可能确定所述样本中的折射率；以示例方式，如果细胞培养物周围的水性介质的折射率是已知的，则因此有可能确定所述细胞培养物本身中的折射率。然后，可以使用它来设定所述校正光学单元。

为了保护所述样本免受辐射损坏，优选地借助于定量相位衬度成像确定所述相位差，其中用于所述定量相位衬度成像的辐射可选地位于红外范围内。已知定量相位衬度成像在物体中引起很小的辐射损坏。如果使用红外辐射，自然这特别成功。此外，红外辐射的使用有利之处在于在荧光成像的范围内可以避免与一些荧光物质的相互作用。

不言而喻，在不脱离本发明的范围的情况下，前述特征和下文还要解释的特征不仅可以以指定的组合使用，而且可以以其它组合或单独使用。

附图说明

举例来说，下文参考附图更详细地解释本发明，所述附图还公开了对本发明必不可少的特征。在附图中：

图1示出了显微镜的示意图；

图2示出了图1中的显微镜的物镜和其上布置有物体的物体载体；

图3示出了具有物体的物体载体的实施例的放大图示；

图4图示了物体的示意性图示；并且

图5示出了图示用于对物体成像的方法的框图。

具体实施方式

显微镜10促进物体12的成像。由物体12反射或透射的辐射由物镜14收集，并且借助于成像光束路径18在成像检测器16上成像。物镜14、成像检测器16和/或成像光束路径18布置在显微镜10的壳体20内。成像光束路径18可以被实施用于物体12的各种类型的成像。以示例方式，物体12可以以宽场或借助于扫描成像方法来记录。此外，显微镜10可以被实施用于荧光测量。取决于所采用成像的类型，成像光束路径18包括各种光学元件和/或其它部件，例如，用于偏转辐射的扫描装置。在图1中未图示这些部件。物体12可以举例来说用反射光的光源或者用图1中所图示的透射光的光源22来照射。以示例方式，光源22可以产生白光或发射在适合荧光显微术的特定波长范围内的辐射。

成像检测器16被实施为借助于成像光束路径18将在其上产生的物体12的光学图像转换成电信号，所述电信号经由线路传输到控制装置24。依据由成像检测器16提供的电信号，控制装置24产生电子图像，所述电子图像举例来说在连接到控制装置24的显示装置26(例如，监视器)上显示给实验者。

物体12布置在物体载体28上，物体载体28具有特定物体载体厚度OD。以示例方式，物体载体28可以是玻璃板。此外，物体载体28可以是由玻璃或塑料制成的培养皿的基部。物体载体28可以相对于壳体20以可移动方式安装，使得物体12相对于物镜14可移动地安装。

可选地，显微镜10包括布置在旋转器30上的多个物镜14。旋转器30可以被用于使物镜14在内部枢转，物镜14意在被用于成像。旋转器30可以手动地调节或者由连接到控制装置24的旋转器驱动器移动。图1中既没有图示旋转器驱动器，也没有图示控制装置24的连接。物镜14中的至少一个设置有校正光学单元32。校正光学单元32是可调节的，并且用于修改物体12的成像的球面像差。取决于焦平面在物体中的深度位置，球面像差存在改变，并且因此，通过调节校正光学单元32可以最小化对物体12成像时的球面像差。图1中右侧所图示的物镜14和图2中所图示的物镜14包括作为校正光学单元32的校正环。它牢固地连接到物镜14并且可借助于驱动器34旋转。驱动器34借助于线路或经由无线电连接到控制装置24，其中在图1和2中未图示连接。因此，控制装置24能够致动驱动器34，并且能够影响物体12的成像的球面像差。可选地，控制装置24可以借助于驱动器34捕获校正光学单元32的当前设定。

可替选地，校正光学单元32可以以从物镜14拆卸的方式布置。在图1中左侧所图示的物镜14中，校正光学单元32布置在成像光束路径18中。它也设置有驱动器34。

此外，显微镜10包括用于定量相位衬度成像的装置36。用于定量相位衬度成像的装置36可以包括借助于其可以执行定量相位衬度成像的非常不同的类型。以示例方式，这里参考在上文进一步提到的参考文献中描述的方法。

用于定量相位衬度成像的装置36被实施为确定第一横向区域40与第二横向区域42之间的相位差；通常，这些横向区域位于物镜14的共同物场54内。这尤其在图2中图示了。用于定量相位衬度成像的装置36包括可选照射装置和相位检测器或相位相机44。以示例方式，照射装置产生白光或红外光，所述白光或红外光借助于物镜14和校正光学单元32在相位检测器44上成像。为了出于检测相位差的目的而从成像光束路径18向相位检测器44输出耦合辐射，提供了光束分离器46。相位检测器44检测来自第一区域40和第二区域42的辐射之间的相位差。优选地，用于定量相位衬度成像的装置36被实施为确定第一区域40和多个第二区域之间的相位差。

控制装置24连接到存储装置48，其中保存了相位差与由此引起的球面像差的改变之间的关系。该关系可以已经通过先前校准确定，并且表示举例来说表格。存储装置48可以实施为控制装置24的一部分，控制装置24可以包括微处理器、计算机或类似物；存储装置48可以是可写存储器，例如，RAM(随机存取存储器)。控制装置24从存储装置48调用关系，并且因此确定用于校正光学单元32的设定值，借助于所述设定值，减小了用于对物体12在第二区域42中的成像的球面像差。以示例方式，关系可以含有呈校正光学单元(举例来说，校正环)的设定的形式的球面像差的改变。这里，这可能指定改变。特定来说，关系可以通过使用具有已知折射率分布的样本的早期实验来确认。可替选地，其可以通过从校正光学单元的结构计算来获得。然后，控制装置24根据设定值致动驱动器34，使得物体12在第二区域42中的成像的球面像差减小，优选地最小化或甚至完全补偿。然后，在第二区域42中对物体12成像。

此外，显微镜10包括接口50，借助于接口50可以输入实验的多个参数，并且因此可以使控制装置24可用。以示例方式，接口50是键盘或鼠标，并且它连接到控制装置24。

图4示意性地示出了物体12，物体12在这种情况下由嵌入介质53中的生物样本52组成。此外，示意性地绘制了其中实施相位衬度测量的区域40和42。F1和F2标示物镜14可以设定在其上的两个不同的焦平面。虚线焦平面的厚度阐明了景深范围。如果假设样本52具有均匀折射率，则目标是如果焦平面F2存在，对于横向区域40实施与横向区域41不同的校正，因为横向区域40那里完全由样本及其折射率填充；相比之下，横向区域42不是。当应该通过显微术检查样本52时，这种情况可能总是发生，所述样本的高度H比景深范围大得多，并且此外，所述样本在其横向范围上不具有恒定的厚度。因此，在实施例中规定了，需要确认在物镜与所期望物平面(举例来说，对应于F1)之间的不同平面中的相位差，以及需要考虑在盖玻片28与借此捕获的物体中所期望的实际焦平面F1之间的插入层来进行校正。如果仅考虑焦平面F1，则可以看出，由于样本52的几何形状(假设样本52具有均匀折射率)，在横向区域40和42中没有出现相位差。相比之下，在焦平面F2中获得相位差。因此，在实施例中规定了，需要考虑物体12(物体12例如包括直径为例如150μm的球形样本52)的几何形状，并且在已知并且在校准样本52的折射率之后根据横向位置(40、42)和焦平面(F1、F2)的位置进行校正。

在图5中以框图示出了用于对物体12成像的方法。在可选步骤S1中，举例来说借助于接口50输入物体载体厚度OD。在步骤S2中，优化物体12在第一区域40中的成像的球面像差。为了这个目的，在控制装置24中保存适当的算法。该算法可以使用物体12的第一区域40中的折射率。以示例方式，第一区域40布置在物体12的一部分中，已知介质(例如，水或水溶液)位于所述部分中。以示例方式，这可以是细胞培养物或任何其它生物样本的介质。介质的折射率是已知的。在实施例中，自动地设定校正光学单元32，以用于借助于可选的物体载体厚度OD和物体12在第一区域40中的折射率来最小化球面像差。可替选地，可以举例来说通过调节校正光学单元32手动地实施物体12在第一区域40中的成像的球面像差的优化。然而，根据这些步骤，该最小化仅涉及由第一区域40(即，介质)引起的像差。

在步骤S3中，设定其中应该确认第一区域40与第二区域42之间的相位差的物平面。这也设定了物平面与物体载体28之间的距离。通常，物平面与焦平面一致。

在步骤S4中，设定物体的第二区域42。这涉及随后应该借助于显微镜10成像的区域，即，举例来说位于介质中的样本。以示例方式，为了这个目的，可以在可选地先前中间步骤中用未校正的球面像差对物体12成像，以便识别物体12的感兴趣的第二区域42位于何处。

在步骤S5中，记录第一区域40与第二区域42之间的相位差。可选地，可以在沿着光学轴线间隔开的多个物平面中确定相位差。

在可选步骤S6中，捕获关于物体12的附加参数。以示例方式，这些可以借助于控制装置24的接口50获得。以示例方式，输入物体12的温度、先前可选地输入的物体载体厚度OD、物体12的厚度、物体载体28的材料和/或第一区域40中或第二区域42中的折射率。以示例方式，温度可以借助于这里未图示的传感器来捕获，或者对于实验可以是已知的，举例来说，37℃。以示例方式，物体12的厚度可以在实验之前测量，或者举例来说在物体12呈区段的形式的情况下如传统上其是已知的。第一区域40的折射率同样可以是已知的，举例来说因为这涉及水溶液。此外，也可以知道物体12在第二区域42中的折射率。此外，还可以在步骤S6中测量指定焦平面与物体载体28的界面之间的距离的穿透深度。为了这个目的，举例来说，有可能调节焦平面的深度位置，直到在物体载体28与物体12之间的界面处反射变得可见为止。结果，对于焦平面的给定深度位置，捕获到物体载体28的距离，并且因此穿透深度是已知的。此外，物镜14与物体载体28之间的浸没介质可以被考虑作为参数。

如在上文的描述的概要部分中已经解释的，在可选步骤S7中，依据相位差确定第二区域42中的路径长度和/或折射率。

可替选地，如果样本的厚度小于物镜的景深范围，则可以使用样本的厚度代替d，或者如果样本完全覆盖景深范围，则可以使用可选地通过校正因子校正的景深范围尺寸代替d。也可以使用d来确定物体12在第二区域42中的折射率。在这个基础上可以同样地确认设定值。

在步骤S8中，基于所述关系确认校正光学单元32的设定值。可以通过先前建立的穿透深度来修改关系，使得设定值更加精确。特定来说，如果其中确定相位差的物平面与意在要成像的焦平面不一致，则考虑到穿透深度来修改关系。为了这个目的，尤其可以包含举例来说借助于使沿着光学轴线的折射率平均化确定来自在焦平面下方的不同物平面的折射率(在倒置显微镜的情况下)。然后，不仅考虑了焦平面中的折射率，而且还考虑了来自其它平面的信息。

在步骤S9中，根据调节值设定校正光学单元32。结果，在第二区域42中使用于对物体12成像的球面像差最小化。在随后的步骤S10中，物体12在第二区域42中成像。

在可选步骤S11中，在第一区域40与第二区域42之间确认的相位差也被用作第三区域与第一区域40之间的相位差。特定来说，如果期望第二区域42和第三区域的折射率相同或实际上相同，则实现这一点。因此，可以在随后的成像步骤中，物体12不仅可以在第二区域42中而且在第三区域中以校正的球面像差成像。类似的陈述适用于不同焦平面中的记录，其中折射率差(沿着光学轴线)足够类似。以示例方式，这可以借助于阈值来设定。

Claims (16)

1.一种用于物体的显微成像的方法，所述方法包括以下步骤：

提供包括物镜的显微镜，所述物镜限定光学轴线和与所述光学轴线垂直的焦平面，并且所述物镜包括校正光学单元，所述校正光学单元出于匹配目的能够调节到一深度位置，并且所述校正光学单元校正所述物镜处的球面像差，其中所述校正光学单元的设定适用于所述焦平面的某一深度位置，并且其中取决于焦平面在物体中的深度位置，所述球面像差存在改变；

照射所述物体；

捕获由所述物体反射或透射的辐射；

执行步骤，在所述执行步骤中，在所述物体的第一横向区域和第二横向区域中执行定量相位衬度成像，并且确定来自所述物体的第一横向区域的辐射和来自所述第二横向区域的辐射之间的相位差值；

提供所述相位差与球面像差的改变之间的关系；

确定步骤，在所述确定步骤中，通过利用所述关系和所述相位差值确定所述校正光学单元的设定值，和

将所述校正光学单元调节到所述设定值并且在所述第二横向区域中对所述物体成像。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述执行步骤包括：使用与针对所述物体的第一横向区域的以下参数中的一个有关的信息：成像的球面像差、所述物体的折射率和校正光学单元的用于校正所述第一横向区域中的球面像差所需的设定。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述确定步骤包括：确定路径长度，所述路径长度是物体深度区域，来自所述物体的所述物体深度区域的辐射促成在所述第一横向区域和所述第二横向区域中的成像。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述路径长度确认步骤包括：使所述物体在所述第一横向区域中的有效折射率变化，和针对所述物体在所述第一横向区域中的折射率的至少两个值测量所述相位差，和依据所测量的相位差确定所述路径长度。

5.根据权利要求4所述的方法，包括：通过在所述第一横向区域中使用色散介质使所述有效折射率变化，和在两个不同波长处测量所述相位差。

6.根据权利要求3所述的方法，包括：使用所述物体的厚度作为所述路径长度。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，确定所述相位差值包括：确定沿着所述光学轴线彼此间隔开的多个物平面中的多个相位差值。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，进一步对所述物体的第三横向区域成像，其中用于所述第二横向区域的设定值也被用于对所述第三横向区域成像。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，捕获以下参数值中的至少一个参数值：所述物体的温度、物体载体的材料、物体载体厚度、成像时利用的浸没介质和被用于对所述物体成像的辐射的波长，其中提供所述关系的步骤包括根据所述至少一个参数值而修改所述关系。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述定量相位衬度成像步骤包括在红外光谱范围内的定量相位衬度成像。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，基于在至少一个第一物平面中的相位差值而确定所述设定值，并且在另一个第二物平面中使用所述设定值对所述物体成像。

12.一种用于对物体成像的显微镜，包括：

物镜，所述物镜限定光学轴线和与所述光学轴线垂直的焦平面，并且所述物镜包括校正光学单元，所述校正光学单元出于匹配目的能够调节到一深度位置，并且所述校正光学单元校正所述物镜处的球面像差，其中所述校正光学单元的设定适用于所述焦平面的某一深度位置，并且其中取决于焦平面在物体中的深度位置，所述球面像差存在改变；

驱动器，所述驱动器针对所述焦平面的所述深度位置调节所述校正光学单元；

定量相位衬度成像装置，所述定量相位衬度成像装置被配置成照射所述物体，以捕获由所述物体反射或透射的辐射，并且确定来自第一横向区域和来自第二横向区域的辐射之间的相位差值；和

控制装置，所述控制装置被配置成控制所述定量相位衬度成像装置，并且包含相位差与球面像差的改变之间的预先存储的关系，

其中，所述控制装置进一步被配置成：

依据所述关系和所述相位差值来确定所述校正光学单元的设定值，使得所述第二横向区域中的球面像差减小，

控制所述驱动器以将所述校正光学单元调节到所述设定值，和

在所述第二横向区域中对所述物体成像。

13.根据权利要求12所述的显微镜，其中，所述定量相位衬度成像装置被配置成使用与在所述物体的第一横向区域中的以下参数中的一个有关的信息：成像的球面像差、所述物体的折射率和校正光学单元的用于校正所述第一横向区域中的球面像差所需的设定。

14.根据权利要求12所述的显微镜，其中，所述定量相位衬度成像装置被配置成确定沿着所述光学轴线彼此间隔开的多个物平面中的多个相位差值。

15.根据权利要求12所述的显微镜，包括确定单元，所述确定单元捕获以下参数值中的至少一个参数值：所述物体的温度、物体载体的材料、物体载体厚度、所述物镜的浸没介质和用于对所述物体成像的辐射的波长，其中所述关系取决于所述参数值中的所述至少一个参数值。

16.根据权利要求12所述的显微镜，其中，所述定量相位衬度成像装置被配置用于在红外光谱范围内进行定量相位衬度成像。

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