JP2012517035A - レーザ走査顕微鏡法における信号取得の方法及びデバイス - Google Patents

Abstract

本発明は、
集束された光学的励起ビームを測定すべき対象物に対して移動させて、前記ビームの焦点が前記対象物の容積内の既定の経路の少なくとも１つを進むようにする段階と；
取得パラメータの少なくとも１つに従って前記経路に沿って光学的測定信号を取得する段階と；
を含む、レーザ走査顕微鏡法による信号の取得方法であって、
連続的な取得の間、前記励起ビームによる通過を受ける媒体の少なくとも一部の光学的特性の変化が実質的に最小化されるように励起ビームの経路を決定すること、及び
前記励起ビームの移動の間に、前記取得パラメータのうちの少なくとも１つの取得パラメータを調節すること、
を特徴とする前記方法に関する。本発明は、前記方法を実施するデバイスにも関する。

Description

発明の詳細な説明

《技術分野》
本発明は、測定すべき対象物に応じて取得の最適化を可能にする光学走査顕微鏡法における信号取得の方法及びデバイスに関する。

本発明の分野は、更に詳しくは、限定的でなく、共焦点顕微鏡法、蛍光顕微鏡法及び非線形又は多光子顕微鏡法の分野である。

《従来技術》
光学走査顕微鏡法又はレーザ走査顕微鏡法という用語は、集束された光線束（faisceau de lumiere）による対象物の容積（volume）の走査に基づいて対象物の構造についての情報を得るという共通した特徴を有する一連のイメージング技術を含む。これらの技術は、特に、共焦点顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、及び非線形又は多光子顕微鏡法を含む。

レーザ走査顕微鏡法の技術は、拡散性媒体（milieux diffusants）、特に、生物学的な媒体のイメージングによく適しているが、それは前記レーザ走査顕微鏡法が、その容積内のどこか他所に拡散された光子に対してほとんど全く感受的でないと同時に、高い選択性をもって、励起ビームの集束（focalisation）の範囲内に生ずる励起光子と媒体との間の相互作用を検出することができるからである。

従って、信号の取得は、励起ビームの焦点によって測定すべき対象物の容積を走査すること及びこの焦点において蛍光により拡散又は放射される光を集光することを本質的に含んでいる。従来技術のデバイスにおいて最も頻繁に用いられている走査モードは、「ラスター走査」と呼ばれる通常は線ごとの経路に従う平面又は一連の平面に沿った測定の取得からなる。測定ビームの側方走査は、最も頻繁にはミラースキャナのような迅速な素子（elements rapides）によって実施される。

例えば、ＤｅｎｋらのＵＳ５，０３４，６１３が知られているが、それによれば、励起ビームが２つのミラースキャナによって偏向されて系の軸に対して垂直な平面において点の格子を走査し、一方でこの平面の深度は集束手段によって調整される。

或る用途、特に、生物学的用途においては、例えば、測定が移動によって妨げられることなく又は測定が変化する現象を追跡することができるようにするために、データの容積の取得時間を最小化することが特に重要である。この場合に、より高速の走査速度を達成することを可能にする音響光学素子がしばしば用いられる。

例えば、ＳａｇｇａｕらのＵＳ７，２２７，１２７が知られているが、そこには、容積内のあらゆる位置で迅速に点を取得することを可能にする、音響光学素子に基づいた３次元走査デバイスが記載されている。このデバイスの用途は、更に詳細には神経科学に、特に、非線形顕微鏡法による固有の測定部位における時間的な変化の同時モニタリングに関する。

拡散性媒体又は複合媒体のイメージングは、試料中の測定状態がとても変化しやすいという別の困難に直面している。特に、以下のことが挙げられる：
−測定深度につれて指数関数的に増加する、試料中の光子の吸収及び拡散による光学的損失。これらの損失は変動するものであり、検出の力学的（dynamique）要件を相当に増加させることがある；
−特に、試料と集束レンズの浸漬媒体との間の屈折率の差異に関連づけられる、試料中の測定深度につれた収差の変化を含む、励起ビームの空間的散逸（degradations spatiales）。これらの空間的散逸はビームの集束範囲の大きさを実質的に広げるので、測定の分解能及び非線形顕微鏡法プロセスの効果に無視できない影響を及ぼすことがある；
−イメージングされる範囲又は深度によって変化することがある、検出信号の原点における媒体の局在的な光学的又は分光学的特性。

励起ビームのジオメトリーを修正し、そして、試料の測定位置及び構造に応じて取得パラメータを適合させる補正デバイスを導入することによって、前記媒体のイメージングを実質的に改良することができる。ＫｎｅｂｅｌらのＵＳ６，７４０，８６８が知られており、そこには、励起ビームの経路に挿入された音響光学素子によって、取得の間にレーザ光源の出力を調節する方法が記載されている。測定が行われる平面の深度に応じて音響光学素子の減衰を予めプログラムすることにより、例えば、予め見積もられていたであろう試料中の損失を補正することができる。

あらゆる形状の対象物、特に、生物学における球状の対象物のイメージングの場合に、ＵＳ６，７４０，８６８に記載のように単に深度Ｚに対応するだけでなく、Ｘ−Ｙ面内の測定点の位置に応じても励起ビームの修正又は適合を行うことができるということは大変に有用なことであろう。しかしながら、固定された一定のパターンに従って測定点のサンプリングを行うであろうデバイス上で実施される前記のような修正は、例えば、ビームの空間的成形に対して用いることができる素子（液晶デバイス、変形ミラー、マイクロミラーデバイス、液体レンズ、可変焦点レンズ等）の応答が比較的遅いために、そして特に、試料のトポグラフィーに依存して１つの測定点と別の測定点では補正が大きく変わることがあるために、過度に長い取得時間に至ることがある。

従って、本発明の目的は、測定すべき対象物に応じた取得の最適化を可能にする、レーザ走査顕微鏡における信号を取得するための方法及びデバイスを提供することである。

《発明の開示》
本発明の目的は、以下の段階：
−集束された光学的励起ビームと測定すべき対象物との相対的移動を行なって、前記ビームの焦点が前記対象物の容積内の規定の経路の少なくとも１つを進む（parcoure）ようにする段階と；
−取得パラメータの少なくとも１つに従って前記経路に沿って光学的測定信号を取得する段階と；
を含むレーザ走査顕微鏡法における信号の取得方法であって、
−連続的な取得の間に、前記励起ビームによる通過を受ける媒体の少なくとも一部の光学的特性の変化が実質的に最小化されるように励起ビームの経路を決定すること、及び
−前記励起ビームの移動の間に、前記取得パラメータのうちの少なくとも１つの取得パラメータを調節すること、
を特徴とする、前記方法により達成される。

通過を受ける媒体の光学的特性の変化の前記最小化は、前記媒体の分光学的特性、すなわち、光スペクトルに影響を与える特性の変化の最小化を含んでいることができる。

本発明による方法の特に有利な特徴によれば、取得を妨げる可能性のある、光学系及び測定すべき対象物に関連した物理的パラメータが、走査の間、対象物に適合しない従来の走査の場合より実質的にゆっくり変化するように励起ビームの経路が決定される。

このことは、かなり遅い応答時間を有する場合でさえ、大域的な取得時間を最小化しながら、測定の間、取得パラメータの適合手段をより効果的に実行できるようにする。更に、より良い向上の結果、修正の精度を実質的に改善することができる。

本発明による方法の別の有利な特徴によれば、不要で、特に、時間のかかるデータの取得を避けるために、励起ビームの経路並びに信号及びデータの取得を試料の容積に限定することができる。

特定の態様によれば、
−励起ビームは、定系の軸に対して実質的に垂直な平均平面に位置した経路の少なくとも１つに沿って進む（parcourir）ことができ、そして測定すべき対象物の表面の等高線（courbes de niveau）が、前記平均平面に投射される（projetees）ように前記等高線に実質的に従うように前記経路を決定することができる。このようにして、連続的な取得の間に、対象物内のビームの焦点の深度の変化を実質的に低減し又は最小化さえして、特に、測定の間、前記深度に依存する取得パラメータを適合させることができる；
−励起ビームの経路は、前記励起ビームのコンディショニングの光学系の対称性に実質的に従うように決定することができる。このようにして、連続的な取得の間に、ビームによって受けた光学的収差の変化を実質的に低減し又は最小化さえして、特に、測定の間、前記光学的収差に依存する取得パラメータを適合させることができる；
−測定信号の原点（origine）において通過を受ける媒体の光学的特性及び特に分光学的特性の分布に実質的に従うように励起ビームの経路を決定することができる。このようにして、例えば、連続的な取得の間に蛍光信号の変化を最小化して、特に、測定の間、前記蛍光信号に依存する取得パラメータを適合させることができる；
−励起ビームの経路の決定は、測定すべき対象物の形状についての先験的知識（connaissances a priori）の利用を含むことができる；
−励起ビームの経路の決定は、測定すべき対象物の形状を決定するために得られた予備データの利用を含んでいることができる；
−励起ビームの経路の決定は、測定すべき対象物の光学的特性及び特に分光学的特性の分布を決定するために得られた予備データの利用を含んでいることができる；
−励起ビームの経路は実質的に螺旋状の形状であることができる；
−調節される取得パラメータは：励起出力、励起ビームの空間的成形、励起ビームのスペクトル的成形、励起ビームの時間的成形、励起ビームの偏光（polarisation）、励起ビームの移動速度、及び測定の取得時間、のうちの少なくとも１つのパラメータを含むことができる；
−励起出力、励起ビームの移動速度、励起ビームの時間的成形及び測定の取得時間のうちの少なくとも１つの取得パラメータを調節して、測定すべき対象物における光学的損失を実質的に補正することができる；
−励起ビームの空間的成形を調節して、励起ビームによって受けた収差を実質的に補正することができる；
−空間的成形、スペクトル的成形及び時間的成形のうちの少なくとも１つの取得パラメータを調節して、通過を受ける媒体の光学的特性及び特に分光学的特性の局在的変化を実質的に補正することができる。

本発明の別の観点に従って、以下の手段：
−光学的励起ビームを生成する手段と；
−対象物内部に前記ビームを集束させる手段と；
−規定の経路の少なくとも１つに従って前記集束されたビームを移動させる手段と；
−取得パラメータの少なくとも１つに従って、前記経路に沿って光学的測定信号を取得する手段と；
を含むレーザ走査顕微鏡法における信号を取得するデバイスであって、更に：
−前記励起ビームの移動の間に、前記取得パラメータのうちの少なくとも１つのパラメータを調節する手段と；
−連続的な取得の間に、前記励起ビームによる通過を受ける媒体の少なくとも一部の光学的特性の変化が実質的に最小化されるように決定される前記励起ビームの経路と；
を含むことを特徴とする、前記デバイスを提供する。

特定の観点によれば、
−ビームの移動手段は、少なくとも１つの方向に励起ビームを偏向させる手段を含むことができる；
−励起ビームの前記偏向手段は、ミラースキャナ及び音響光学素子のうちの少なくとも１つの素子を含むことができる；
−本発明によるデバイスは、少なくとも１つの方向に従って測定すべき対象物を移動させる手段を更に含むことができる；
−本発明によるデバイスは、測定すべき対象物に対する励起ビームの位置及び瞬間速度のうちの少なくとも１つのパラメータを測定する手段を更に含むことができる；
−本発明によるデバイスは、励起ビームを成形する手段を更に含むことができる；
−励起ビームを成形する手段は、液晶デバイス、変形ミラー、空間光モジュレータ（modulateur spatial de lumiere）、マイクロミラーデバイス、液体レンズ及び可変焦点レンズのうちの少なくとも１つの素子を含むことができる。

好ましいが限定的ではない態様によれば、本発明による方法は、有利には、例えば、以下：
−光学系内に挿入される空間フィルタの活用によって高い空間解像度が得られる、蛍光を用いない又は用いた、共焦点顕微鏡；及び
−測定原理が、いくつかの光子と試料構造との同時相互作用によって引き起こされる放射又は拡散の現象に基づく、非線形又は多光子顕微鏡；
のレーザ走査顕微鏡に統合させることができる。

レーザ走査顕微鏡法において、及び、特に、生物学的試料のような嵩高く（volumineux）拡散性の対象物の測定のために、測定条件は測定が行われる試料の深度によって、及び、特に、以下のために実質的に影響を受けることがある：
−試料による吸収又はインコヒーレントな拡散。これは、焦点での励起ビームの強度における、深度に応じた指数関数的な減少をもたらすことがある。その結果、検出の力学的問題そして更に非線形顕微鏡法の場合には伝達された強度の不足を生ずることがある；
−試料内部の又は試料と浸漬媒体との間の屈折率の不均一性（heterogeneities）。これは、集束ビームの波の前面に収差を引き起こし、そして、このようにして集束範囲の拡大を惹起することがある。その結果、測定における空間分解能の損失を生じさせ、そして、更に、非線形顕微鏡法の場合には伝達される強度の不足を生じさせることもある。

測定条件は、他の作用、例えば、走査の間の励起ビームの位置に応じた光学系自体の収差の変化によっても実質的に影響を受けることがある。

有利なことに、本発明による方法を実施するデバイスにおいて、特に、試料中の励起ビームの位置に応じて及び／又は光学系自体に対して、走査の間で取得パラメータを調節し又は変化させることによって測定の質を有意に改善することができる。

取得パラメータの適合は、特に、限定的ではなく、以下を対象とすることができる：
−励起及び検出の連鎖の光子バランス。これに対して、例えば：光源出力の調節、光パルスの速度（cadence）の調節、可変光学素子（例えば、液晶デバイス）の伝達の調節、ビームの走査速度の調節、又は測定の集積時間、のうちの１つ又は２つ以上の方法を用いることができる；
−受けた光学的収差を修正するための、励起ビームの空間的成形。この空間的成形は、例えば、以下のデバイス：変形ミラー、マイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）、液晶マトリックス又は光空間モジュレータ（ＳＬＭ）、液体レンズ、可変焦点レンズ、の１種又は２種以上を用いて実施することができる；
−励起ビームのスペクトル的成形、
−測定ビームの成形。

更に、本発明によるデバイスにおける取得パラメータの適合は、例えば、励起ビームの波の前面又は放射若しくは反射された光度（intensite lumineuse）を測定するセンサから得られる情報を用いた、クローズドループ操作とオープンループ操作とを含んでいることができる。

局在的な測定条件に取得パラメータ（特に、励起ビームの成形）を適合させるのに用いることができる現行の素子（composants）は、レーザ走査顕微鏡法における通常の取得速度に対して極めて遅い反応時間を有するという欠点をしばしば持っている。例えば、画素（pixel d'image）ごと数マイクロ秒のオーダーの取得速度を有しているのが通常であるのに対して、変形マトリックス又は液晶マトリックスは、ミリ秒又はそれ以上のオーダーの応答時間を有する。従って、注意せずに前記素子を用いる場合には、許容することのできない取得時間に至ることがある。

本発明による方法の特に有利な特徴によれば、励起ビームの経路を最適化することで、取得パラメータの適合手段に求められる性能を最小化し、そして、このようにして取得時間とその適合手段についての制約との間の最適性を得ることができる。特に、合致した（conforme）経路、すなわち、試料の形状に適合された経路を用いてこの結果を得ることができる。

本発明による方法によれば、経路及び取得パラメータ適合の戦略の選択は、例えば：
−特に生物学において全体的な性質及び形状がしばしば周知である、試料についての先験的知識に基づいて；
−例えば、対象物の形状を決定するための、場合によっては限定された数の点における、先行する測定の１つ又は２つ以上の結果、他のパラメータ（例えば、吸光係数等）に基づいて；
−先験的知識及び測定値の組合せに基づいて、
行うことができる。

本発明による方法は、もちろん、球状又は円柱状の対象物のイメージングに限定されない。実際、有利なことに、鋭角を有する形状を含む多様な試料形状に、合致した走査の原理を適用することができる。

本発明による方法は、有利なことに、光学系自体の、特に放射状の対称性による、収差を修正することもできる。実際、円柱状の対称性による走査、例えば、円形状又は螺旋状の走査では、波の前面を成形するデバイス（例えば、変形ミラー又は光空間モジュレータ（ＳＬＭ））を用いてより容易にこの収差を修正することができる。

本発明の他の利点及び特徴は、決して限定的ではない実施及び実施態様の詳細な記載、及び添付の図面を見ることにより明白となるであろう。
本発明によるデバイスの概略図を示す図である。 球状対象物に対して最適化された適合の走査の例を示す図である。 異なる走査モードについての球状対象物内の測定深度の時間的変化を示す図である。 非線形顕微鏡法により生物学的試料について行われた実際の測定例を示す図である。

図１を参照するに、本発明によるデバイスは、例えば、フェムト秒レーザパルスの励起ビーム２を発する光源１を含む。この光源１は、特に、強度において又は時間的に（パルスの幅、持続時間、速度及びスペクトル相等）調整することができる。

コンディショニング手段３によって励起ビーム２を空間的に成形し、前記コンディショニング手段３は、以下の：
−励起ビーム２を空間的に成形しそしてその集束距離を調整することができる、光学素子（例えば、固定又は可動レンズ）；及び
−例えば、その波の前面を成形するために、光学的収差を制御するために、その強度を変えるために、そのスペクトルの内容を制御するために、そして、それを時間的に調節するために、励起ビーム２のコンディショニングを場合によっては測定の間で可能にする素子；
を限定的でなく含んでいることができる。これらの素子は、特に、液晶デバイス、変形ミラー、マイクロミラーデバイス、液体レンズを含んでいることができる。

本発明によるデバイスは、励起ビーム２を用いて試料を少なくとも側方から（lateralement）、そして場合によっては深度によっても、走査することができる走査手段５を含む。これらの走査手段は、例えば、レゾナントでない（non resonnants）ミラースキャナ及び／又は音響光学素子を含む。試料７の移動手段によってそれらを補完又は置換することができる。

本発明によるデバイスは、更に、以下：
−測定すべき試料７の範囲内に励起ビームの光を集光し、そして、拡散又は放射された光８を集める、集束モジュール６；
−スペクトル分離及び／又は偏光の手段を場合により含む、測定ビームの分離モジュール８；及び
−検出モジュール９；
も含む。

特定の態様において、デバイスは、試料を通過する伝達の間の捕集及び測定の手段を含んでいることができる。

本発明によるデバイスは、「コンフォーマルスキャニングコントローラ」又はＣＳＣとも呼ばれる、走査制御ユニット１０を更に含む。例えば、マイクロコントローラ又はＦＰＧＡを含む電子モジュールによって、コンピュータ上の作動プログラムに統合されたソフトウェア機能によって、又はそれら２つの組み合わせによって、この走査制御ユニット１０を実行することができる。

制御ユニット１０の機能は、走査手段５及び場合によりコンディショニング手段３を作動させることによる、規定の経路の少なくとも１つに沿った励起ビームによる試料の走査の制御を含む。この経路は、例えば、点列の形又は数学的モデルの形態でＣＳＣに記憶させることができる。

ＣＳＣ１０の機能は、走査手段５、コンディショニング手段３、光源１及び検出手段９のうちの少なくとも１つを作動させることによる、測定位置に応じた励起ビームのコンディショニングも含むことができる。コンディショニング方法も、例えば、運転の点列の形又は数学的モデルの形態でＣＳＣに記憶させることができる。

ＣＳＣは更に、走査モジュール５、コンディショニングモジュール３、光源１及び検出モジュール９の種々のモジュールに由来する情報を利用して、走査の制御及び励起ビームのコンディショニングの制御を行うことができる。

図１に示すようなデバイスは、もちろん、好ましいが決して限定的ではない本発明による方法の態様に対応している。

生物学的試料について２光子によるイメージングを行うことができる非線形走査顕微鏡に関して本発明による方法を実施する。走査手段５はレゾナントでない２つのミラースキャナを含む。ＣＳＣ１０は予めプログラムされた経路に沿ってこれらのスキャナを作動させ、そして、光源１の励起出力を調節することができる。

このデバイスは、典型的な球状の対象物７（例えば、胚又は卵）の場合に、図２に示すような合致した経路を実行する。

連続のＸ−Ｙ切断面２１に沿ってデータの取得を行い、前記切断面の各々はデバイスの光軸に沿って距離Ｚ２２に対応する。

所定の深度Ｚの各Ｘ−Ｙ面において、励起ビームは、試料の表面の水準線（lignes de niveaux）に実質的に従うように計算された経路を走査して、前記水準線がこの平面２１内の放射に現れるようにする。このようにして、連続的な取得点の間における試料の深度Ｈ２５の変化は実質的に低減され又は最小化される。

走査デバイスについての力学的制約（contraintes dynamiques）を実質的に低減し又は最小化さえすることもできる経路を探し出すように、特に、その精度を改善するように、本発明による取得デバイスをプログラムすることができる。このようにして、球状の対象物７の分析のために螺旋状の経路２６の選択に到達する。

大域的な取得時間を最適化するために、例えば、図１の場合に、平面２１ａ内の２７の経路及び平面２１ｂ内の２６の経路を実行することにより、試料の有効なサイズに取得範囲を限定することも可能である。

図３は、取得パラメータの適合手段を実行するために試料７に適合される合致した経路の利点を示す：
−考慮対象の試料は図１の球状の試料７のままであり、
−表示の切断面は平面２１ｂであり、そして、
−考慮される影響の大きさは、例えば、励起ビームによって受ける吸収に特に強い影響を及ぼす、対象物内の測定すべき点の深度Ｈである。

図３ａは、従来技術の典型的な格子型の走査（「ラスター走査」）の間の深度Ｈの時間的変化を示しており、一方で図３ｂは、螺旋状の合致した走査２６の間のその同じ深度Ｈの時間的変化を示している。合致した走査の場合には、パラメータＨがずっとゆっくりとかつ単調に変化し、このことは、Ｈの変化に従うであろう取得パラメータの適合手段の力学的仕様に関する要件をかなり緩めることになることが理解されよう。

図４は、実質的に球形である魚の胚についての、本発明によるデバイスにより実施された画像の取得の例を示す。

図４ａは、ラスター型の走査を用い且つ取得パラメータの適合を使用しない従来の方法により実施される、深度による光学的断面図を示す。外周に対して視界の中央において信号はだいぶ弱まり、このことは集められる情報の質をかなり低下させる。

図４ｂは、走査の間にビームの走査速度が中央から縁に向かって連続的に調節される螺旋状の走査に従い、本発明による方法によって実施された深度による光学的断面図を示す。このようにして、取得時間を増やすことなく、又は、励起強度の増大のために周辺領域を弱めることなく、観察の視界の全体を正確にイメージングすることができる。このような結果は、特に、走査システムに課されるであろう力学的制約のために、ラスター走査によっては得ることができない。

本発明による方法は、限定的でなく、特に：
−一般に、走査顕微鏡法による焦点容積（volume focal）の空間的および時間的な形状の制御のために；
−特に、平面ではない対象物（例えば、胚、球状の腫瘍（tumeurs spheroides）等）の３次元画像を用いた、生物学及び医学（厚い組織の観察）に関する非線形又は共焦点顕微鏡法の従来的用途の分野に；
−更に一般には、別の分野（例えば、材料の特徴づけ）に、
適用することができる。

特定の態様によれば、外科学又はレーザ微細加工（microusinage laser）に関係して、本発明による方法は、平面ではない対象物の深度による切除の際のビームの成形及び収差の修正にも用いることができる。

もちろん、本発明は、記載してきた例に限定されることはなく、そして本発明の範囲を逸脱することなくこれらの例に対して多くの修正を行うことができる。

Claims (20)

1. 以下の段階：
   −集束された光学的励起ビーム（２）と測定すべき対象物（７）との相対的移動を行なって、前記ビーム（２）の焦点が前記対象物（７）の容積内の規定の経路（２６）の少なくとも１つに沿って進むようにする段階と；
   −取得パラメータの少なくとも１つに従って前記経路（２６）に沿って光学的測定信号を取得する段階と；
   を含むレーザ走査顕微鏡法における信号の取得方法であって、
   −前記光学的測定信号の取得の間、前記励起ビームの伝達に影響を与える前記励起ビーム（２）による通過を受ける媒体の少なくとも一部の光学的特性の変化が実質的に最小化されるように、励起ビーム（２６）の経路を決定すること、及び
   −前記励起ビーム（２）の移動の間に、前記取得パラメータのうちの少なくとも１つの取得パラメータを調節すること、
   を特徴とする、前記方法。
2. 通過を受ける媒体の光学的特性の変化の最小化が、前記媒体の分光学的特性の変化の最小化を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. −励起ビームが測定系の軸（２２）に実質的に垂直な平均平面（２１）に位置している経路（２６）の少なくとも１つに沿って進むこと；及び
   −測定すべき対象物（７）の表面の等高線が前記平均平面（２１）に投射されるように実質的に従うように前記経路（２６）を決定すること；
   を特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記励起ビームのコンディショニングの光学系の対称性に実質的に従うように、励起ビームの経路（２６）を決定することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 測定信号の原点において通過を受ける媒体の光学的特性及び特に分光学的特性の分布に実質的に従うように、励起ビームの経路（２６）を決定することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 励起ビームの経路（２６）の決定が、測定すべき対象物（７）の形状についての先験的知識の利用を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 励起ビームの経路（２６）の決定が、測定すべき対象物（７）の形状を決定するために得られた予備データの利用を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
8. 励起ビームの経路（２６）の決定が、測定すべき対象物（７）の光学的特性及び特に分光学的特性の分布を決定するために得られた予備データの利用を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 励起ビームの経路（２６）が実質的に螺旋状の形状であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 調節される取得パラメータが、以下のパラメータ：
    −励起出力；
    −励起ビームの空間的成形；
    −励起ビームのスペクトル的成形；
    −励起ビームの時間的成形；
    −励起ビームの偏光；
    −励起ビームの移動速度；
    −測定の取得時間；
    の少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 励起出力、励起ビームの移動速度、励起ビームの時間的成形、及び測定の取得時間のうちの少なくとも１つの取得パラメータを調節して、測定すべき対象物（７）における光学的損失を実質的に補正することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
12. 励起ビーム（２）の空間的成形を調節して、前記励起ビームによって受けた収差を実質的に補正することを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の方法。
13. 励起ビーム（２）の空間的成形、スペクトル的成形及び時間的成形のうちの少なくとも１つの取得パラメータを調節して、通過を受ける媒体の光学的特性及び特に分光学的特性の局在的変化を実質的に補正することを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 以下の手段：
    −光学的励起ビーム（２）を生成する手段（１）と；
    −対象物（７）の内部に前記ビーム（２）を集束させる手段（６）と；
    −既定の経路（２６）の少なくとも１つに沿って前記集束されたビーム（２）を移動させる手段（５）と；
    −取得パラメータの少なくとも１つに従って、前記経路に沿って光学的測定信号（８）を取得する手段（９）と；
    を含む、レーザ走査顕微鏡法における信号の取得デバイスであって、更に：
    −前記の励起ビームの移動の間、前記取得パラメータのうちの少なくとも１つのパラメータを調節する手段（３，１０）と；
    −前記光学的測定信号の取得の間に、前記励起ビームの伝達に影響を与える前記励起ビームによる通過を受ける媒体の少なくとも一部の光学的特性の変化を実質的に最小化するように決定される前記励起ビーム（２）の経路（２６）と；
    を含むことを特徴とする前記デバイス。
15. ビーム（２）の移動手段が、少なくとも１つの方向に励起ビームを偏向させる手段（５）を含むことを特徴とする、請求項１４に記載のデバイス。
16. 励起ビーム（２）の偏向手段が、ミラースキャナ及び音響光学素子のうちの少なくとも１つの素子を含むことを特徴とする、請求項１５に記載のデバイス。
17. 少なくとも１つの方向に測定すべき対象物（７）を移動させる手段を更に含むことを特徴とする、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のデバイス。
18. 測定すべき対象物（７）に対する励起ビーム（２）の位置及び瞬間速度のうちの少なくとも１つのパラメータの測定手段を更に含むことを特徴とする、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のデバイス。
19. 励起ビーム（２）の成形手段（３）を更に含むことを特徴とする、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載のデバイス。
20. 励起ビーム（２）の成形手段（３）が、液晶デバイス、変形ミラー、光空間モジュレータ、マイクロミラーデバイス、液体レンズ、可変焦点レンズのうちの少なくとも１つの素子を含むことを特徴とする、請求項１９に記載のデバイス。

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