CN108459001B - 一种快速定量评价不同抗菌药物作用效果的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物筛选技术领域，具体的说是一种采用重水(D2O)标记结合活体单细胞拉曼光谱技术快速定量评价不同抗菌药物的方法。利用重水标记和待检测药物培养抗病菌，再通过拉曼光谱检测培养中单个细胞在一段时间下C‑D峰(1800‑2500cm‑1)变化，而后通过光谱C‑D峰(1800‑2500cm‑1)变化计算获得单个细胞C‑D‑ratio，再由C‑D‑ratio获得不同时间点的ΔC‑D‑ratio，进而获得待检测药物最小抑制代谢浓度MIC‑MA，即定量的判别待检测药物敏感性。本发明操作有操作简单、样品用量少、时间相对较短、成本低的优点，进而利用本发明采用的活体单细胞拉曼光谱技术结合重水标记技术可以用于评价并筛选对目标细胞造成不同代谢抑制程度的药物，并且可以在时间轴跨度上评价药物作用水平，在细菌，哺乳动物细胞等领域具有普适性，具有广阔的应用前景。

Description

一种快速定量评价不同抗菌药物作用效果的方法
技术领域
本发明涉及药物筛选技术领域，具体的说是一种采用重水(D2O)标记结合活体单细胞拉曼光谱技术快速定量评价不同抗菌药物作用效果的方法。
背景技术
随着抗菌药物包括抗生素等的不断普及，抗生素滥用以及细菌耐药性问题已经日趋明显，严重感染中对大多数常用抗生素具有耐药性的细菌的出现导致无药可用的情况已经成为21世纪所面临的全球重大卫生安全问题。传统的抗菌剂评价标准分为基于细胞生长的手段和不基于细胞生长的手段。其中基于细胞生长的药物评价体系包括琼脂扩散法、薄层色谱生物自显影、梯度稀释法等，这类方法依赖于细胞分裂增殖，因此通常需要较长时间(常大于16h)才能完成。同时采用最小抑制浓度(MIC) 作为评判指标，其定义为细胞暴露在药物18-24h后的无明显生长时的药物浓度，但是通常细胞不生长不代表细胞死亡，因此这类方法只能判断出细胞抑制效果，而不能判断药物的杀菌效果。
由于环境中的菌会存在一种不生长但依然有代谢活性(NGMA)的状态，这种状态下的菌无法通过上述基于细胞生长的方法鉴别出来，但他们在后期疾病复发过程中起着关键性作用，是需要重点关注的对象。因此，仅依赖于生长的方法对于药物作用效果评价还有很大欠缺。
另一方面，不基于细胞生长的药物评价体系主要包括ATP生物荧光检测和碘化丙啶(PI)等荧光染料染色来判定细胞膜完整性等技术，由于其并不依靠细胞增殖故较前者省时，但是由于药物作用机制不同，导致其内部ATP的变化趋势或者对于细胞膜破坏性有显著不同，甚至出现相反的结论，因此该类方法判断有时会出现错误。且上述方法多基于群体水平的细胞研究，忽略了细胞间的异质性，无法对细胞耐药性等问题作全面评价。综上所述，开发新型抗菌剂包括新抗生素以及快速评价药物作用的手段和标准变得尤为重要。
单细胞拉曼技术以其简单、快速、无需标记、可提供丰富的细胞组分信息等特点日益成为测量细胞表型的重要手段。通过观测细胞内部大分子物质的变化，单细胞拉曼图谱(SCRS)可用于区分细胞种类及生长状态，以及鉴别产物积累等。最近，一种基于拉曼组学(Ramanome)的新方法被提出并应用于单细胞水平上判定外界刺激物包括药物对于细胞表型的影响(Teng,L.；Wang,X.；Wang,X.；Gou,H.；Ren,L.；Wang, T.；Wang,Y.；Ji,Y.；Huang,W.E.；Xu,J.,Label-free,rapid and quantitative phenotyping of stress responsein E.coli via ramanome. Sci Rep 2016,6,34359)。该方法基于细胞指纹区全谱的统计学分析，通过观测特殊拉曼峰位的变化判定细胞对于外界刺激物的响应，从而在一定程度上评价刺激物作用机制。但由于细胞内部组分变化微弱，加上拉曼图谱对于其它因素如细胞种类、细胞生长状态、以及测试环境等的敏感性，使得分析过程变得复杂且不适用于所有微生物，更不能应用于不可培养微生物。因此需要寻找一个更为清晰的具有普适性的标志用于评价药物作用，进而获得快速定量评价不同抗菌药物作用效果及筛选耐药菌的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速定量评价不同抗菌药物作用效果的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种快速定量评价不同抗菌药物作用效果的方法，
利用重水标记和待检测药物培养抗病菌，再通过拉曼光谱检测培养中单个细胞在一段时间下C-D峰(1800-2500cm-1)变化，而后通过光谱 C-D峰(1800-2500cm-1)变化计算获得单个细胞C-D-ratio，再由 C-D-ratio获得不同时间点的ΔC-D-ratio，进而获得待检测药物最小抑制代谢浓度MIC-MA，即定量的判别待检测药物敏感性。
所述C-D-ratio＝C-D/(C-D+C-H)，其中，C-D为C-D峰(1800-2500 cm-1)面积，C-H为C-H峰(2600-3300cm-1)面积；
所述ΔC-D-ratio经每个时间点的C-D-ratio与0h的C-D-ratio 的平均值相减；
所述最小抑制代谢浓度MIC-MA为在药物暴露数小时后，细胞ΔC-D-ratio的中位数低于0时的最小药物浓度。
分别获取培养周期内不同时间点培养液单细胞的SCRS，利用细胞在不同待测药物和不同待测药物浓度下的代谢活性不同而产生含有不同高度C-D峰的拉曼光谱，从而进行判别待检测药物敏感性。
将培养至平台期抗病菌培养至含有重水标记和不同浓度下的待检测药物的培养基内，分别取培养周期内不同时间点的培养液细胞并采集该单细胞拉曼光谱，其中，采集单细胞拉曼光谱在能量为1-100mW的激光下，采集拉曼光谱的时间为0.01-100s。
所述不同浓度下的待检测药物为从低于最小抑制浓度到高于最小抑制浓度的浓度之内的梯度。
具体来说，将过夜培养至稳定期的病菌(如口腔中常见菌，具体为 Streptococcusmutans UA159)细胞按体积比1:10稀释至新鲜的含有不同浓度的待检测药物和30％重水的培养基(如脑心浸液肉汤(BHI)培养基)中培养8h，在0,0.5,1,1.5,2,3,4,6,8h分别取样进行拉曼测量并收集获得SCRS。其中C-D峰的变化趋势，包括其升高起始时间、饱和高度等可用于分析细胞对于药物的响应，从而判断药物的作用效果及机制。具体来说，在对照组无药物刺激的条件下，C-D峰迅速升高随即进入“对数增长期”，达到一定高度后C-D峰的高度变得稳定饱和，进入“平台期”；在低浓度药物刺激条件下，在刺激开始一段时间并未出现C-D峰，随后C-D峰呈现缓慢升高，最终C-D峰在到达一个相对较低的饱和水平后达到稳定；在高浓度药物刺激条件下，在观测时间范围内观测不到C-D峰的出现或者仅有极低的C-D峰形成。
所述Streptococcus mutans UA159是口腔中常见菌株，按照上述方式检测其在重水存在情况下SCRS中有明显C-D峰出现，且随重水浓度不同其饱和C-D比例不同，两者呈线性相关关系。
所述检测口腔中常见菌的药物包括氟化钠(NaF)，氯己定(CHX)以及氨苄西林(Amp)等但不局限于此。
(此处给出一些关于筛选耐药菌的过程)
本发明作用原理：在重水存在条件下，具有代谢活性的细胞会摄取重水用于合成内部大分子进行生命活动，从而使SCRS中C-H峰 (2600-3300cm-1)漂移，出现新的C-D峰(1800-2500cm-1)。漂移快慢可反应细胞大分子合成速度，对于同种细胞则可表征其代谢活性的变化。
因此，将目标细胞暴露在不同药物环境中，通过比较其C-D峰的产生速度与不含药物的对照可判断其对药物的敏感性，从而鉴定药物作用效果，并在一定程度上解析药物作用机制。
本发明的优点：简单、快速、成本低、基于代谢活性并可在单细胞层面反应细胞异质性。首先，该方法不依赖于细胞增殖，因此与传统基于生长的方法相比需时较短，0.5h即可看出区别；其次，该方法反应细胞活性，因此可鉴定不生长但具有活性的菌，从而给出更合适的药物浓度，对于后续的疾病复发控制有重要意义；此外，该方法可在单细胞水平对细胞的药物敏感性做全面检测，从而发现群体水平无法观测到的异质性现象，为理解细胞耐药性机制以及疾病控制提供更全面依据。
附图说明
图1.为本发明实施例提的在不同浓度NaF存在时，S.mutans UA159 的C-D-ratio随时间变化曲线；
图2.为本发明实施例提的在不同浓度NaF暴露8h情况下S. mutans UA159的ΔC-D-ratio分布；
图3.为本发明实施例提的在不同浓度CHX存在时，S.mutans UA159 的C-D-ratio随时间变化曲线；
图4.为本发明实施例提的在不同浓度CHX暴露8h情况下S. mutans UA159的ΔC-D-ratio分布；
图5.为本发明实施例提的在不同浓度Amp存在时，S.mutans UA159 的C-D-ratio随时间变化曲线；
图6.为本发明实施例提的在不同浓度Amp暴露8h情况下S. mutans UA159的ΔC-D-ratio分布；
图7.为本发明实施例提的S.mutans UA159和S.mutans C180-2FR 在不同浓度NaF存在时响应不同。
具体实施方式
本发明首先将活化的微生物细胞加入到含有一定浓度重水和相应药物浓度的培养基中培养一段时间，而后收集单细胞拉曼光谱，根据不同的药物对细菌细胞的作用原理、效果不同产生的拉曼重水峰形态面积的不同,从而在单细胞层面评价药物的作用效果。本发明操作有操作简单、样品用量少、时间相对较短、成本低的优点，进而利用本发明采用的活体单细胞拉曼光谱技术结合重水标记技术可以用于评价并筛选对目标细胞造成不同代谢抑制程度的药物，并且可以在时间轴跨度上评价药物作用水平，在细菌，哺乳动物细胞等领域具有普适性，具有广阔的应用前景。
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
实施例1.利用重水-拉曼技术评价氟化钠(NaF)对于S.mutans UA159的作用效果
NaF为常用的漱口水及牙膏添加剂，对于预防龋齿等口腔疾病有显著效果。S.mutans UA159对于NaF的MIC为0.4g/L。
1)细胞培养
将S.mutans UA159菌株从-80℃进行平板划线，37℃厌氧培养约36 h；而后选取单克隆转接入5～10ml的BHI液体培养基中，37℃过夜静置活化；
将活化后菌株离心后按体积比1:10的接种量转接入20mL含D2O和不同浓度NaF的BHI液体培养基中，37℃厌氧静置培养。其不同浓度NaF 为0,0.2,0.4,0.6,1.2g/L NaF，D2O浓度为30％。
2)拉曼测量
分别取500μL，在0,0.5,1,1.5,2,3,4,6,8h不同时间下的上述含D2O和不同浓度NaF的培养液，用ddH2O洗涤3次，离心转速为 2500×g，离心3min，用同体积ddH2O重悬，并做相应稀释使细胞终浓度达到～106/mL。取1.5μL稀释液点在CaF2玻片上，风干。
在拉曼显微镜下观察风干样品，将激光点定位到待测细胞，然后进行拉曼图谱采集。激光波长为532nm，样品上激光强度约为1-100mW，拉曼图谱采集时间为0.01-100s。每个浓度设有3个生物学平行，每个平行在每个时间点采集20个细胞图谱(参见图1)。
3)数据处理
采集到的拉曼光谱用LabSpec软件进行拉曼图谱的背景去除、基准线归一化和最大值标准化处理。
处理后可见其在重水存在情况下SCRS中有明显C-D峰出现，同时获得C-D峰(1800-2500cm-1)面积，而后计算C-D-ratio，以及ΔC-D-ratio。
其中，C-D-ratio由C-D峰(1800-2500cm-1)面积除以C-D峰 (1800-2500cm-1)和C-H峰(2600-3300cm-1)面积总和计算得到。ΔC-D-ratio经每个时间点的C-D-ratio与0h的C-D-ratio的平均值相减获得。
由上述可见，SCRS中有明显C-D峰出现，且随重水浓度不同其饱和 C-D比例不同，两者呈线性相关关系。
据上述实验结果，本发明提出新的药物浓度使用指导标准MIC-MA，即“最小抑制代谢浓度”。该新指标定义为在药物暴露8h后，细胞ΔC-D-ratio的中位数低于0时的最小药物浓度。
图1为不同浓度NaF处理后细胞的C-D-ratio的变化规律。与不加 NaF的对照相比，所有暴露在NaF中的细胞C-D峰的增长变得缓慢，且多数饱和C-D-ratio都比对照要低(0.2g/L NaF除外)。此外，随着NaF 浓度升高，C-D-ratio的升高呈规律性延迟，且饱和C-D-ratio值逐渐降低。在低于MIC即0.2g/L NaF下，C-D-ratio增加变迟缓，但最终饱和 C-D-ratio值仍升高至与对照相同水平；等于MIC即0.4g/L NaF下， C-D-ratio增加有显著延滞期出现，但在后期仍有增加，证明在细胞生长被抑制的条件下，其活性并未完全被抑制；高于MIC条件下，延滞期较长(0.6g/L NaF)或C-D-ratio始终未曾增加(1.2g/L NaF)，证明细胞活性被完全抑制。
通过8h时ΔC-D-ratio计算结果，可判断S.mutans UA159对于 NaF的MIC-MA为1.2g/L(图2)。该浓度远高于其MIC值(0.4g/L)。在MIC浓度下，虽细胞无明显生长，但其代谢活性未被完全抑制，因此药物去除后致病菌将会复活并导致疾病复发。而MIC-MA条件下的药物使用可大大降低这一风险。
实施例2.利用重水-拉曼技术评价洗必泰(CHX)对于S.mutans UA159的作用效果
洗必泰是常用的漱口水添加剂，是一种光谱杀菌剂，可干扰菌斑形成，降低细胞吸附，从而达到预防和减少牙周病及龋病的目的。S.mutans UA159对于CHX的MIC为2mg/L。
1)细胞培养
将S.mutans UA159菌株从-80℃进行平板划线，37℃厌氧培养约36 h；而后选取单克隆转接入5～10ml的BHI液体培养基中，37℃过夜静置活化；
将活化后菌株离心后按体积比1:10的接种量转接入20mL含D2O和不同浓度CHX的BHI液体培养基中，37℃厌氧静置培养。其不同浓度CHX 为0,1.2,2,4mg/L CHX，D2O浓度为30％。
2)拉曼测量分别取500μL，在0,0.5,1,1.5,2,3,4,6,8h 不同时间下的上述含D2O和不同浓度CHX的培养液，用ddH2O洗涤3次，离心转速为2500×g，离心3min，用同体积ddH2O重悬，并做相应稀释使细胞终浓度达到～106/mL。取1.5μL稀释液点在CaF2玻片上，风干。
在拉曼显微镜下观察风干样品，将激光点定位到待测细胞，然后进行拉曼图谱采集。激光波长为532nm，样品上激光强度约为1-100mW，拉曼图谱采集时间为0.01-100s。每个浓度设有3个生物学平行，每个平行在每个时间点采集20个细胞图谱(参见图1)。
3)数据处理
采集到的拉曼光谱用LabSpec软件进行拉曼图谱的背景去除、基准线归一化和最大值标准化处理。
处理后可见其在重水存在情况下SCRS中有明显C-D峰出现，同时获得C-D峰(1800-2500cm-1)面积，而后计算C-D-ratio，以及ΔC-D-ratio。
其中，C-D-ratio由C-D峰(1800-2500cm-1)面积除以C-D峰 (1800-2500cm-1)和C-H峰(2600-3300cm-1)面积总和计算得到。ΔC-D-ratio经每个时间点的C-D-ratio与0h的C-D-ratio的平均值相减获得。
由上述可见，SCRS中有明显C-D峰出现，且随重水浓度不同其饱和 C-D比例不同，两者呈线性相关关系。
据上述实验结果，本发明提出新的药物浓度使用指导标准MIC-MA，即“最小抑制代谢浓度”。该新指标定义为在药物暴露8h后，细胞ΔC-D-ratio的中位数低于0时的最小药物浓度。
图3为不同浓度CHX处理后细胞的C-D-ratio的变化规律。与不加 CHX的对照相比，所有暴露在CHX中的细胞C-D峰的增长都变缓慢，且饱和C-D-ratio都比对照要低。此外，随着CHX浓度升高，C-D-ratio的升高呈规律性延迟，且饱和C-D-ratio值逐渐降低。在低于MIC即1.2mg/L CHX下，C-D-ratio增加相对缓慢，且最终饱和C-D-ratio值约为对照水平的84％；等于MIC即2mg/L CHX下，C-D-ratio增加有显著延滞期出现，但在后期仍有增加，证明在细胞生长被抑制的条件下，其活性并未完全被抑制；高于MIC条件即4mg/L CHX下，C-D-ratio始终未曾增加，证明细胞活性被完全抑制。
通过8h时ΔC-D-ratio计算结果，可判断S.mutans UA159对于 CHX的MIC-MA为4mg/L(图4)。该浓度远高于其MIC值(2mg/L)。在 MIC浓度下，虽细胞无明显生长，但其代谢活性未被完全抑制，因此药物去除后致病菌将会复活并导致疾病复发。而MIC-MA条件下的药物使用可大大降低这一风险。
实施例3.利用重水-拉曼技术评价氨苄西林(Amp)对于S.mutans UA159的作用效果
氨苄西林是常用的抗生素，可以治理口腔炎症。S.mutans UA159对于Amp的MIC为0.8mg/L。
1)细胞培养
将S.mutans UA159菌株从-80℃进行平板划线，37℃厌氧培养约36 h；而后选取单克隆转接入5～10ml的BHI液体培养基中，37℃过夜静置活化；
将活化后菌株离心后按体积比1:10的接种量转接入20mL含D2O和不同浓度Amp的BHI液体培养基中，37℃厌氧静置培养。其不同浓度Amp 为0,0.4,0.8,1.6,4,50mg/L Amp，D2O浓度为30％。
2)拉曼测量
分别取500μL，在0,0.5,1,1.5,2,3,4,6,8h不同时间下的上述含D2O和不同浓度Amp的培养液，用ddH2O洗涤3次，离心转速为2500×g，离心3min，用同体积ddH2O重悬，并做相应稀释使细胞终浓度达到～106/mL。取1.5μL稀释液点在CaF2玻片上，风干。
在拉曼显微镜下观察风干样品，将激光点定位到待测细胞，然后进行拉曼图谱采集。激光波长为532nm，样品上激光强度约为1-100mW，拉曼图谱采集时间为0.01-100s。每个浓度设有3个生物学平行，每个平行在每个时间点采集20个细胞图谱(参见图1)。
3)数据处理
采集到的拉曼光谱用LabSpec软件进行拉曼图谱的背景去除、基准线归一化和最大值标准化处理。
处理后可见其在重水存在情况下SCRS中有明显C-D峰出现，同时获得C-D峰(1800-2500cm-1)面积，而后计算C-D-ratio，以及ΔC-D-ratio。
其中，C-D-ratio由C-D峰(1800-2500cm-1)面积除以C-D峰 (1800-2500cm-1)和C-H峰(2600-3300cm-1)面积总和计算得到。ΔC-D-ratio经每个时间点的C-D-ratio与0h的C-D-ratio的平均值相减获得。
由上述可见，SCRS中有明显C-D峰出现，且随重水浓度不同其饱和C-D比例不同，两者呈线性相关关系。
据上述实验结果，本发明提出新的药物浓度使用指导标准MIC-MA，即“最小抑制代谢浓度”。该新指标定义为在药物暴露8h后，细胞ΔC-D-ratio的中位数低于0时的最小药物浓度。
图5为不同浓度Amp处理后细胞的C-D-ratio的变化规律。与不加 Amp的对照相比，所有暴露在氨苄西林中的细胞C-D峰的增长变慢，且饱和C-D-ratio都比对照要低。此外，随着氨苄西林浓度升高，C-D-ratio 的升高基本呈规律性延迟，且饱和C-D-ratio值逐渐降低(0.4mg/L Amp 除外)。在低于MIC即0.4mg/L Amp下，C-D-ratio增加相对缓慢；等于 MIC即0.8mg/L Amp下，最终饱和C-D-ratio值约为对照水平的83％，证明在细胞生长被抑制的条件下，其活性并未完全被抑制；高于MIC条件下，C-D-ratio也升高显著，甚至在60倍MIC(50mg/L Amp)下，最终饱和C-D-ratio值仍达到对照水平的51％。在所有浓度下，C-D峰均在0.5h可观测到显著增加，未有延滞期存在，证明细胞活性在所有测试条件下未被完全抑制。造成该现象的原因推测为Amp的作用机理为抑制细胞转肽酶活性，从而影响分裂过程中细胞壁合成造成无法分裂，但对存活的细胞活性并未绝对抑制。
通过8h时ΔC-D-ratio计算结果，可判断S.mutans UA159对于 Amp在测试浓度下未能找到MIC-MA(图6)。在所测试MIC或高于MIC条件下，虽细胞不生长，但其始终保留一定水平代谢活性，因此其杀菌效果有待进一步检验。
实施例4.利用重水-拉曼技术评价S.mutans UA159和S.mutans C180-2FR对NaF的不同耐药性
S.mutans C180-2FR为NaF耐受菌，其对NaF的MIC为1.6g/L，远高于S.mutansUA159的0.4g/L。该类菌的存在可能导致低浓度的 NaF添加对于杀菌抑菌作用不显著。因此通过该方法筛选环境中存在的耐药菌也具有重要的临床意义。
1)细胞培养
将S.mutans UA159和S.mutans C180-2FR菌株从-80℃进行平板划线，37℃厌氧培养约36h；而后分别选取单克隆转接入5～10ml的BHI 液体培养基中，37℃过夜静置活化；
将活化后S.mutans UA159菌株离心后按体积比1:10的接种量转接入20mL含D2O和不同浓度NaF的BHI液体培养基中，37℃厌氧静置培养。其不同浓度NaF为0,0.4,1.2g/LNaF，D2O浓度为30％。
将活化后S.mutans C180-2FR菌株离心后按体积比1:10的接种量转接入20mL含D2O和不同浓度NaF的BHI液体培养基中，37℃厌氧静置培养。其不同浓度NaF为0,0.4,1.6g/L NaF，D2O浓度为30％。
2)拉曼测量
分别取500μL，0,0.5,1,1.5,2,3,4,6,8h不同时间下的上述含D2O和不同浓度NaF的培养液，用ddH2O洗涤3次，离心转速为 2500×g，离心3min，用同体积ddH2O重悬，并做相应稀释使细胞终浓度达到～106/mL。取1.5μL稀释液点在CaF2玻片上，风干。
在拉曼显微镜下观察风干样品，将激光点定位到待测细胞，然后进行拉曼图谱采集。激光波长为532nm，样品上激光强度约为1-100mW，拉曼图谱采集时间为0.01-100s。每个浓度设有3个生物学平行，每个平行在每个时间点采集20个细胞图谱(参见图1)。
3)数据处理
采集到的拉曼光谱用LabSpec软件进行拉曼图谱的背景去除、基准线归一化和最大值标准化处理。
处理后可见其在重水存在情况下SCRS中有明显C-D峰出现，同时获得C-D峰(1800-2500cm-1)面积，而后计算C-D-ratio，以及ΔC-D-ratio。
其中，C-D-ratio由C-D峰(1800-2500cm-1)面积除以C-D峰 (1800-2500cm-1)和C-H峰(2600-3300cm-1)面积总和计算得到。ΔC-D-ratio经每个时间点的C-D-ratio与0h的C-D-ratio的平均值相减获得。
由上述可见，SCRS中有明显C-D峰出现，且随重水浓度不同其饱和 C-D比例不同，两者呈线性相关关系。
据上述实验结果，本发明提出新的药物浓度使用指导标准MIC-MA，即“最小抑制代谢浓度”。该新指标定义为在药物暴露8h后，细胞ΔC-D-ratio的中位数低于0时的最小药物浓度。
图7为不同浓度NaF处理后两种细胞的C-D-ratio的不同变化规律。在无NaF存在条件下，C180-2FR的C-D-ratio在前3h均低于UA159，在4h后两者持平。该现象主要是C180-2FR相较UA159稍慢的生长速率造成。而在0.4g/L NaF(UA159的MIC)下，UA159的C-D-ratio增长出现显著延滞期，在2h后开始攀升，其饱和C-D-ratio值保持在对照 44％的水平；而C180-2FR的C-D-ratio增长基本未受影响。在1.2g/L NaF 下，UA159的C-D-ratio已完全不增长，代谢活性完全被抑制；另一方面，即使在1.6g/L NaF(C180-2FR的MIC)存在时，C180-2FR的C-D-ratio 增长在出现0.5h的延滞后仍缓慢攀升，最终保持在相当于对照62％的水平。因此通过使用重水-拉曼技术并比较在同样药物作用下，不同菌的代谢活性变化趋势，可将耐药菌与药物敏感菌快速区分鉴定。
本发明应用实施例采用常见口腔微生物作为模式体系，但重水本身可以被绝大多数微生物所代谢利用并能够被拉曼技术检测出来，即重水- 拉曼技术在不同微生物间具有普适性，该技术应用可延伸至不同人体乃至环境微生物，甚至人体和哺乳动物细胞。

Claims (5)

1.一种快速定量评价不同抗菌药物作用效果的方法，其特征在于：利用重水标记和待检测药物培养抗病菌，再通过拉曼光谱检测培养中单个细胞在一段时间下C-D峰1800-2500cm-1变化，而后通过光谱C-D峰1800-2500cm-1变化计算获得单个细胞C-D-ratio，再由C-D-ratio获得不同时间点的ΔC-D-ratio，进而获得待检测药物最小抑制代谢浓度MIC-MA，即定量的判别待检测药物敏感性。
2.按权利要求1所述的快速定量评价不同抗菌药物作用效果的方法，其特征在于：所述C-D-ratio＝C-D/(C-D+C-H)，其中，C-D为C-D峰1800-2500cm-1面积，C-H为C-H峰2600-3300cm-1面积；
所述ΔC-D-ratio经每个时间点的C-D-ratio与0h的C-D-ratio的平均值相减；
所述最小抑制代谢浓度MIC-MA为在药物暴露数小时后，细胞ΔC-D-ratio的中位数低于0时的最小药物浓度。
3.按权利要求1所述的快速定量评价不同抗菌药物作用效果的方法，其特征在于：分别获取培养周期内不同时间点培养液单细胞的单细胞拉曼图谱，利用细胞在不同待测药物和不同待测药物浓度下的代谢活性不同而产生含有不同高度C-D峰的拉曼光谱，从而进行判别待检测药物敏感性。
4.按权利要求1或3所述的快速定量评价不同抗菌药物作用效果的方法，其特征在于：将培养至平台期抗病菌培养至含有重水标记和不同浓度下的待检测药物的培养基内，分别取培养周期内不同时间点的培养液细胞并采集该单细胞拉曼光谱，其中，采集单细胞拉曼光谱在能量为1-100mW的激光下，采集拉曼光谱的时间为0.01-100s。
5.按权利要求4所述的快速定量评价不同抗菌药物作用效果的方法，其特征在于：所述不同浓度下的待检测药物为从低于最小抑制浓度到高于最小抑制浓度的浓度之内的梯度。
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