CN113740310A - 一种筛选或评价药物的方法 - Google Patents
一种筛选或评价药物的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113740310A CN113740310A CN202010478977.XA CN202010478977A CN113740310A CN 113740310 A CN113740310 A CN 113740310A CN 202010478977 A CN202010478977 A CN 202010478977A CN 113740310 A CN113740310 A CN 113740310A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- drug
- protein
- cells
- peak
- lipid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims abstract description 32
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 35
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 claims abstract description 17
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 64
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 32
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 claims description 19
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 claims description 19
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims description 13
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 9
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 claims description 3
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 claims description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 abstract 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 12
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 12
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 5
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 4
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 229910001634 calcium fluoride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 2
- 230000006677 mitochondrial metabolism Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 238000003841 Raman measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001530 Raman microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001237 Raman spectrum Methods 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 125000004431 deuterium atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000022558 protein metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/65—Raman scattering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种筛选或评价药物的方法，重水孵育细胞后，加入待检测药物继续培养细胞一段时间，再通过拉曼光谱检测培养中单个细胞在所述一段时间下C‑D峰及C‑H峰的变化，而后由MCR‑ALS对C‑D峰和C‑H峰进行分解，计算得出的数据用于评价药物对细胞脂质或蛋白代谢途径的影响，或用于筛选基于细胞脂质或蛋白代谢途径的药物。癌细胞对抗癌药物有不同的抵御能力，尤其是在代谢层面，如蛋白、脂类的合成等，本发明提供的基于代谢机制进行抗癌药物的高通量筛选或评估方法对于药物的开发具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及药物筛选技术领域，具体涉及一种利用重水探针拉曼光谱技术(重水-拉曼)与多元曲线分辨(MCR)-交替最小二乘法(MCR)算法相结合的方法，用于筛选或评价药物。
背景技术
癌细胞对抗癌药物有不同的抵御能力，尤其是在代谢层面，如蛋白、脂类的合成等。基于代谢机制进行抗癌药物的筛选至关重要，需要对代谢组数据进行分析才能了解隐含其下的机制，因此需要发展高通量的检测手段。
不同类型的体外细胞毒性试验通常用于评估细胞活力和对药物的细胞代谢反应。例如，基于四唑盐的试验，MTT、XTT、WST等，可简单、敏感和廉价的确定化合物对于细胞的毒性，但因无法区分细胞毒性导致的细胞死亡和细胞抑制效应导致的细胞无法增殖，因此无法评估影响线粒体代谢的药物。此外，代谢变化、氧化应激和氧化还原酶活性变化也会影响MTT结果。刃天青法作为一种荧光活力测定法，提供了基于细胞整体健康和增殖的信息，但它对培养基中的蛋白质敏感，对改变线粒体代谢的成分无效。另一方面，荧光技术需要外源性标记，且由于缺乏特征谱图，特异性较差。
由于单细胞拉曼光谱法(SCRS)具有无创、无标记、与培养物无关的特性，已被用于检测和表征细菌和酵母菌的应激反应。尤其是，稳定的同位素探测与拉曼光谱技术(SIP-Raman)结合已受到越来越多的关注。重水探针显微拉曼光谱技术(重水-拉曼)将CD峰作为单细胞代谢活力的生物标志物。其原理是单细胞在代谢时，利用了重水，新合成了大分子，如蛋白质、脂类、核酸等，C-Dx键逐渐取代C-Hx，因此，CD与CH的比值可以揭示细胞在给定状态下的代谢活力。然而，由于氘原子可以取代任何大分子中的氢原子，而无法解释药物到底抑制了什么代谢途径。因此，需要一种基于细胞代谢机制的方法来评估或筛选药物。
发明内容
有鉴于此，本发明首次提出将重水单细胞拉曼光谱技术应用于基于细胞代谢机制来评估或筛选药物的方法。
本发明提供了一种筛选或评价药物的方法，其特征在于，重水孵育细胞后，加入待检测药物继续培养细胞一段时间，再通过拉曼光谱检测培养中单个细胞在所述一段时间下脂质成分和蛋白成分的C-D峰及C-H峰的变化，而后根据以下公式计算由MCR-ALS分解产生的比率：
计算得出的数据用于评价药物对细胞脂质或蛋白代谢途径的影响，或用于筛选基于细胞脂质或蛋白代谢途径的药物，所述CDL为脂质的C-D峰(2147-2157cm-1)面积，CHL为脂质的C-H峰(2845cm-1)面积，CDp为蛋白的C-D峰(2180-2195cm-1)面积，CHp为蛋白的C-H峰(2940cm-1)面积，其中，CDL/CHL及CDP/CHP比例指标用于量化新合成的脂质(NSL)或新合成的蛋白质(NSP)在大分子中的比例；培养一段时间后的CDL/(CDL+CHL)及CDP/(CDP+CHP)的比率分别与起始时间0h的CDL/(CDL+CHL)及CDP/(CDP+CHP)的比率差值用于量化脂质和蛋白质的代谢活性。
在另一优选例中，所述待检测药物为抗癌药物，优选地，为雷帕霉素。
在另一优选例中，所述重水的终浓度为10％～100％，优选地，为20％-30％。
在另一优选例中，所述细胞为酵母细胞和/或癌细胞，优选地，所述癌细胞为人乳腺癌细胞MCF7。
在另一优选例中，所述一段时间为0.5～72h，优选地，为24h～72h，更优选地，为0.5h、24h或72h。
本发明中，SCRS代表单细胞拉曼光谱法。MCR-ALS指的是多元曲线分辨-交替最小二乘法。
本发明中，ΔC-D ratio与ΔCD ratio指代相同，均代表经每个时间点的C-D-ratio与起始时间0h的C-D-ratio的平均值相减之差，所述C-D ratio是指C-D峰面积/(C-D峰面积+C-H峰面积)。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1：30％、20％浓度的D2O孵育的人癌MCF-7细胞(A)和酵母(B)细胞的脂质体动态C-D ration。
图2：将MCR-ALS算法应用于重水孵育的酵母和MCF-7细胞的SCRS来解析纯大分子成分。
(A)从MCF-7细胞的脂质体中提取的第一和第二组分被分配为脂质和蛋白质；
(B)混合的C-D信号分解为特定的C-D脂质(CDL 2150cm-1)和C-D蛋白(CDP2185cm-1)信号；每个光谱代表三个生物学重复的平均值(每个重复中n＝30)。
图3：30％D2O培养的酵母细胞在不同雷帕霉素浓度下，SCRS中ΔC-D ration随时间的变化图。
对于(A)脂质和(B)蛋白质，绘制了表示经处理的BY4742细胞代谢动力学指标的各组分的ΔC-D ration。误差棒表示三个生物学重复之间的标准偏差。
图4：在雷帕霉素治疗的不同持续时间和剂量下，MCF-7细胞脂质体、细胞核和细胞质中脂质和蛋白质的动态代谢活性。
(A)24小时的脂质(B)72小时的脂质(C)24小时的蛋白质(D)72小时的蛋白质
该值表示来自三个生物学重复的组分的平均ΔCDL比和ΔCDp比，误差线表示标准偏差。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1单细胞拉曼光谱检测酵母和癌细胞中氘的插入
野生型酿酒酵母BY4742被用作微生物部分。BY4742的单个菌落在5mL优化基本培养基(OMM)中预培养过夜。将预培养的细胞接种到20mL OMM中，在有氧条件下于30℃摇动孵育，然后每2/4h监测生长直至稳定期。为了计算生长速率，将培养液等分试样(100μL)转移到96孔板中，并使用Synergy HT微孔板读数器(BioTek，USA)每2/4小时记录595nm的光密度。进行了三个生物学重复。为了测试D2O的掺入，将指数期的预培养肉汤以1：100稀释，并接种到含有0％，10％，20％，30％，40％“重水”(D2O，99.9原子％D，在进行拉曼测量之前，将其孵育5到10小时(美国Sigma-Aldrich)。另外，确定了氘短期掺入BY4742细胞中。细胞在OMM中生长，最终浓度为30％的重水，并在1、4、10和24小时取样以进行拉曼检测。
在补充有1％青霉素/链霉素(每毫升10000单位)和10％胎牛血清(ThermoFisher)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Thermo Fisher)中培养HeLa和MCF-7细胞，并在5％的CO2中在37℃下。每三天将细胞传代培养以维持60-70％的融合度。为了检查D2O毒性，将HeLa和MCF-7细胞接种在96孔板上进行重复测量，并过夜生长。然后除去培养基，并用含0％，15％，20％，30％和40％D2O(99.9原子％D，Sigma-Aldrich，美国)的DMEM替换10天。通过MTT分析每24小时监测细胞的活力。在含有纯DMEM培养基的孔中培养的细胞用作对照。生存力(％)＝实验孔的吸光度/对照孔的吸光度×100％。进行了三个重复。
首先，将细胞接种在CaF2芯片上，并浸入H2O制成的DMEM中24小时。然后，将培养基更换为20％D2O DMEM，将细胞孵育8天，同时每2天更换一次培养基。然后将培养基更换为含有雷帕霉素的20％D2O DMEM，雷帕霉素的浓度范围为0至100ng/mL。暴露24和72小时后，将细胞用4％多聚甲醛固定10分钟，并在4℃的PBS中保存。固定后24小时内完成拉曼检测。对于这些实验进行了三个生物学重复。在这项研究中，由于长期暴露于药物中，因此需要将细胞与D2O一起孵育更长的时间。因此，我们必须使用低浓度的D2O(20％)来防止对细胞的毒性作用，与最近研究中使用高浓度的重水相比，C–D信号的出现需要更多的时间。
为了探究D2O-拉曼方法在评估细胞代谢活性中的潜力，首先对酵母，酿酒酵母BY4742和人癌细胞系MCF-7的氘掺入进行了分析，然后进行了比较。由于以前尚未报道过用D2O探测拉曼光谱来跟踪酵母代谢的过程，因此以D2O浓度和时间变化方式(图1A)监视此过程。具体而言，酵母细胞在10％，20％，30％和40％D2O的存在下生长，然后在24小时内采集样品的SCRS。在所有D2O水平的SCRS中，在CD区(2070至2300cm-1)中出现了一个明显的峰，在2800至3030cm-1之间的CH峰出现了减少。C-D峰的强度与介质中D2O的含量直接相关。没有D2O的培养物中没有观察到C-D峰，随着D2O浓度的增加C-D峰强度随之增加。
在D2O低于20％时，C-D谱带的时间动态表明，由于D2O掺入细胞并标记了新合成的大分子，在D2O孵育培养8天后出现了C-D峰，这代表了新生脂肪形成和蛋白质合成，并在第11天急剧增加(图1B)。
实施例2MCR-ALS算法结合重水-拉曼技术检测酵母和MCF-7细胞的药物反应
由于抑制代谢的药物最终会改变细胞大分子的代谢，因此在药物治疗后检测或区分大分子特异性代谢动力学的方法将是有价值的。因此，使用酵母和MCF-7细胞的药物反应作为模型，测试了MCR-ALS算法和D2O探测的SCRS的潜力。作为多变量分析方法，MCR能够从原始光谱中提供具有生化意义的成分，而无需任何有关样品性质的先验信息，这比其他类似的因式分解分析技术具有很大的优势。
两成分MCR算法产生两个大分子纯成分，成分1归因于酵母中的脂质以及MCF-7光谱数据的脂质体和细胞质光谱，而第二成分归因于蛋白质。由于双组分MCR算法产生两个纯组分而没有混合组分，因此我们选择采用双组分MCR来分析脂质和蛋白质这两个大分子对雷帕霉素的响应变化(图2A)。
值得注意的是，在原始SCRS中，CD区位于静默区，没有与其他峰重叠，这表示氘在D2O处理过程中在主要生化化合物结构中的整合。有趣的是，在酵母细胞和MCF-7细胞中，CD和CH键都可以通过计算反褶积，并分为脂质和蛋白质特异性CD和CH频率。脂质成分中C-D的主峰位于2147-2157cm-1，与2180-2195cm-1的蛋白C-D峰区分开来(图2B)。同样，在2940cm-1处的峰代表蛋白质的CH伸展，而与脂质相关的CH 2伸展在2845cm-1处。因此，对于酵母细胞和人细胞，可以从产生的成分中推断出不同的大分子特异性CD和CH。
实施例3单细胞拉曼及MCR法结合检测雷帕霉素对酵母代谢活性的影响
为了定量评估特定大分子的细胞代谢变化，计算了以下由MCR分解产生的比率：
在本发明中，我们提出了C-D ration的新概念，其特别地追踪响应于应激源的细胞大分子的变化。CDL和CDP比率分别定义了脂质和蛋白质特异性的代谢活性。为了在亚细胞水平上定量模拟响应药物的细胞大分子代谢，将SCRS中的ΔCD比率指定为默认参数。此外，将ΔC-D ratio低于无药物控制的区域(零)，这意味着未检测到代谢活性，被认为是“代谢静止区”。此外，CDL/CHL和CDP/CHP用作比例指标，用于量化新合成的脂质(NSL)和蛋白质(NSP)在大分子中的比例。
实验上，将生长于30％D2O的酵母细胞在不同时间点暴露于不同浓度的雷帕霉素下，并获得每种处理的(约40×3)细胞的SCRS。通过应用MCR算法，提取每种治疗条件下的脂质和蛋白质成分。绘制了ΔCDL和ΔCDP比值作为处理过的BY4742细胞代谢动力学的指标(图3)。暴露1h后，脂质(MAL)的代谢活性随雷帕霉素浓度的增加而增加，而在下一个时间点，其代谢水平降至无药水平(0μg/mL)以下(图3A)。同样，蛋白质代谢动力学降低，并且在所有时间过程中细胞中都没有代谢活性，而雷帕霉素的剂量则增加(图3B)。结果表明，在处理过的细胞中没有新合成的脂质和蛋白质，因此，雷帕霉素即使在最小剂量(0.5×IC50)和短时间治疗下也能抑制蛋白质和脂质合成代谢。值得注意的是，即使在5.7e-4×MIC下，雷帕霉素处理后BY4742细胞也已进入“代谢静止区”。这意味着代谢活性受到抑制，但不一定导致抑制其生长。
实施例4单细胞拉曼及MCR法结合检测雷帕霉素对MCF-7细胞代谢活性的影响
对于MCF-7细胞，在CaF2基质上20％-D2O孵育8天后，将细胞暴露于0至100ng/mL的雷帕霉素下，短时间(24小时)和长期暴露(72小时)治疗。从每个细胞的三个细胞器，细胞核，细胞质和脂质体中获得处理过的细胞的SCRS。然后根据去卷积的相应成分计算脂质和蛋白质的代谢活性。可视化暴露于不同浓度的雷帕霉素24小时和72小时后，脂质体，细胞质和细胞核中脂质(MAL)的代谢活性变化(图4A，B)。在三个细胞器中，MAL的变化是不同的，表明每个细胞器对药物应激的反应都不同。处理24小时后，细胞质和脂质体内的脂质代谢动力学在对照(无药)水平附近波动，但在最大浓度(100ng/mL)下急剧上升。相比之下，波动后细胞核中的MAL在最高浓度下达到零(对照水平)(图4A)。尽管最大雷帕霉素浓度最大，但细胞质和脂质体内72h处理细胞的MAL遵循相同的趋势，尽管MAL明显高于对照(图4B)。值得注意的是，暴露72小时后，细胞核中脂质的代谢活性在所有浓度下均处于对照水平。
对于24小时治疗后MCF-7中的蛋白质动力学(图4C)，雷帕霉素剂量的增加通常会导致三个细胞器中每一个的MAP升高。一个例外是最大剂量的暴露，细胞质MAP低于对照水平。值得注意的是，在细胞核中，暴露72小时后的蛋白质代谢活性高于对照水平，尽管暴露于高雷帕霉素浓度后会降低(图4D)。相反，对于低浓度处理，脂质体和细胞质中的MAP降低至低于对照，然后升高至高于对照的水平。这些观察结果表明，雷帕霉素诱导的代谢活性改变在大分子和细胞器水平上是明显的。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种筛选或评价药物的方法，其特征在于，重水孵育细胞后，加入待检测药物继续培养细胞一段时间，再通过拉曼光谱检测培养中单个细胞在所述一段时间下脂质成分和蛋白成分的C-D峰及C-H峰的变化，而后根据以下公式计算由MCR-ALS分解产生的比率：
计算得出的数据用于评价药物对细胞脂质或蛋白代谢途径的影响，或用于筛选基于细胞脂质或蛋白代谢途径的药物，所述CDL为脂质的C-D峰(1800-2500cm-1)面积，CHL为脂质的C-H峰(2600-3300cm-1)面积，CDp为蛋白的C-D峰(1800-2500cm-1)面积，CHp为蛋白的C-H峰(2600-3300cm-1)面积，其中，CDL/CHL、CDP/CHP比例指标用于量化新合成的脂质(NSL)或新合成的蛋白质(NSP)在大分子中的比例；培养一段时间后的CDL/(CDL+CHL)及CDP/(CDP+CHP)的比率分别与起始时间0h的CDL/(CDL+CHL)及CDP/(CDP+CHP)的比率差值用于量化脂质或蛋白质的代谢活性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物为抗癌药物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗癌药物为雷帕霉素。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重水的浓度为10％-100％。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为酵母细胞或癌细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述癌细胞为人乳腺癌细胞MCF7。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一段时间为0.5h～72h。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述一段时间为0.5h或72h。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010478977.XA CN113740310A (zh) | 2020-05-29 | 2020-05-29 | 一种筛选或评价药物的方法 |
| PCT/CN2021/096846 WO2021239121A1 (zh) | 2020-05-29 | 2021-05-28 | 一种筛选或评价药物的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010478977.XA CN113740310A (zh) | 2020-05-29 | 2020-05-29 | 一种筛选或评价药物的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113740310A true CN113740310A (zh) | 2021-12-03 |
Family
ID=78722773
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010478977.XA Pending CN113740310A (zh) | 2020-05-29 | 2020-05-29 | 一种筛选或评价药物的方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113740310A (zh) |
| WO (1) | WO2021239121A1 (zh) |
Citations (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070087401A1 (en) * | 2003-10-17 | 2007-04-19 | Andy Neilson | Analysis of metabolic activity in cells using extracellular flux rate measurements |
| US20070177143A1 (en) * | 2003-12-22 | 2007-08-02 | Joseph Chaiken | Process and device for determination of cell viability |
| CN101993911A (zh) * | 2009-08-25 | 2011-03-30 | 陈松源 | 一种活性小分子核素探针平台及其在生物医学中的应用 |
| CN102473208A (zh) * | 2009-07-02 | 2012-05-23 | 百奥科瑞茨生命科学公司 | 在代谢物组学分析方法中使用内源参比代谢物进行归一化的方法 |
| CN105181670A (zh) * | 2015-08-26 | 2015-12-23 | 福建师范大学 | 一种利用细胞分泌蛋白sers光谱检测药物细胞毒性方法 |
| CN107167617A (zh) * | 2017-05-26 | 2017-09-15 | 山东师范大学 | 鉴定ic50剂量维生素c对raw264.7和k562细胞差异标志物的方法 |
| CN107202810A (zh) * | 2017-05-26 | 2017-09-26 | 山东师范大学 | 一种分析IC50剂量δ‑生育酚对RAW264.7和K562细胞的影响方法 |
| CN107304437A (zh) * | 2016-04-23 | 2017-10-31 | 瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司 | 一种评价药物代谢及相关毒性的方法 |
| CN107643390A (zh) * | 2016-07-21 | 2018-01-30 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于代谢组学技术的有机污染物细胞毒性作用机制的研究方法 |
| CN107741417A (zh) * | 2017-09-28 | 2018-02-27 | 上海合森生物科技有限公司 | 一种原位快速检测细胞生物过程的方法 |
| CN108267436A (zh) * | 2018-02-09 | 2018-07-10 | 中国科学院城市环境研究所 | 一种基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法和判断合理用药的方法 |
| CN108459001A (zh) * | 2017-02-20 | 2018-08-28 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种快速定量评价不同抗菌药物作用效果的方法 |
| US20190049299A1 (en) * | 2017-08-10 | 2019-02-14 | Jiangnan University | Method for Rapidly Detecting Salmonella Typhimurium in Milk by Raman Microspectroscopy Based on Incorporation of Heavy Water |
| CN110231330A (zh) * | 2019-05-31 | 2019-09-13 | 南方科技大学 | 一种单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法 |
| WO2020023966A1 (en) * | 2018-07-27 | 2020-01-30 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | System, method and computer-accessible medium for use of heavy water as a probe for imaging metabolic activities |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0611981D0 (en) * | 2006-06-16 | 2006-07-26 | Renishaw Plc | Spectroscopic analysis methods |
| CN108572166A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-09-25 | 上海理工大学 | 雨生红球藻类胡萝卜素及虾青素可视化分析方法 |
| CN109971649A (zh) * | 2019-04-28 | 2019-07-05 | 哈尔滨师范大学 | 一种用于培养雨生红球藻的培养基及智能检测系统 |
| CN110643675A (zh) * | 2019-10-31 | 2020-01-03 | 上海氘峰医疗器械有限公司 | 一种快速检测细菌耐药性的方法 |
| CN111912826B (zh) * | 2020-06-22 | 2024-03-01 | 上海氘峰医疗科技有限公司 | 一种在细胞水平上进行抗肿瘤药物药效评估的方法 |
-
2020
- 2020-05-29 CN CN202010478977.XA patent/CN113740310A/zh active Pending
-
2021
- 2021-05-28 WO PCT/CN2021/096846 patent/WO2021239121A1/zh active Application Filing
Patent Citations (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070087401A1 (en) * | 2003-10-17 | 2007-04-19 | Andy Neilson | Analysis of metabolic activity in cells using extracellular flux rate measurements |
| US20070177143A1 (en) * | 2003-12-22 | 2007-08-02 | Joseph Chaiken | Process and device for determination of cell viability |
| CN102473208A (zh) * | 2009-07-02 | 2012-05-23 | 百奥科瑞茨生命科学公司 | 在代谢物组学分析方法中使用内源参比代谢物进行归一化的方法 |
| CN101993911A (zh) * | 2009-08-25 | 2011-03-30 | 陈松源 | 一种活性小分子核素探针平台及其在生物医学中的应用 |
| CN105181670A (zh) * | 2015-08-26 | 2015-12-23 | 福建师范大学 | 一种利用细胞分泌蛋白sers光谱检测药物细胞毒性方法 |
| CN107304437A (zh) * | 2016-04-23 | 2017-10-31 | 瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司 | 一种评价药物代谢及相关毒性的方法 |
| CN107643390A (zh) * | 2016-07-21 | 2018-01-30 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种基于代谢组学技术的有机污染物细胞毒性作用机制的研究方法 |
| CN108459001A (zh) * | 2017-02-20 | 2018-08-28 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种快速定量评价不同抗菌药物作用效果的方法 |
| CN107202810A (zh) * | 2017-05-26 | 2017-09-26 | 山东师范大学 | 一种分析IC50剂量δ‑生育酚对RAW264.7和K562细胞的影响方法 |
| CN107167617A (zh) * | 2017-05-26 | 2017-09-15 | 山东师范大学 | 鉴定ic50剂量维生素c对raw264.7和k562细胞差异标志物的方法 |
| US20190049299A1 (en) * | 2017-08-10 | 2019-02-14 | Jiangnan University | Method for Rapidly Detecting Salmonella Typhimurium in Milk by Raman Microspectroscopy Based on Incorporation of Heavy Water |
| CN107741417A (zh) * | 2017-09-28 | 2018-02-27 | 上海合森生物科技有限公司 | 一种原位快速检测细胞生物过程的方法 |
| CN108267436A (zh) * | 2018-02-09 | 2018-07-10 | 中国科学院城市环境研究所 | 一种基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法和判断合理用药的方法 |
| WO2020023966A1 (en) * | 2018-07-27 | 2020-01-30 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | System, method and computer-accessible medium for use of heavy water as a probe for imaging metabolic activities |
| CN110231330A (zh) * | 2019-05-31 | 2019-09-13 | 南方科技大学 | 一种单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021239121A1 (zh) | 2021-12-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tricò et al. | Elevated α-hydroxybutyrate and branched-chain amino acid levels predict deterioration of glycemic control in adolescents | |
| Dikalov et al. | EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines | |
| McNaughton et al. | Probing in vivo Mn2+ speciation and oxidative stress resistance in yeast cells with electron-nuclear double resonance spectroscopy | |
| Beger et al. | Metabolomics approaches for discovering biomarkers of drug-induced hepatotoxicity and nephrotoxicity | |
| Choi et al. | Do food and stress biomarkers work for wastewater-based epidemiology? A critical evaluation | |
| Grivet et al. | NMR and microbiology: from physiology to metabolomics | |
| Boyd et al. | A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals | |
| Alshamleh et al. | Real‐time NMR spectroscopy for studying metabolism | |
| Bertucci et al. | Advantages of electronic circular dichroism detection for the stereochemical analysis and characterization of drugs and natural products by liquid chromatography | |
| CN107167617B (zh) | 鉴定ic50剂量维生素c对raw264.7和k562细胞差异标志物的方法 | |
| Knebl et al. | Fiber-enhanced Raman gas spectroscopy for the study of microbial methanogenesis | |
| Smith et al. | Dihydroxyacetone exposure alters NAD (P) H and induces mitochondrial stress and autophagy in HEK293T cells | |
| Romek et al. | A retro-biosynthetic approach to the prediction of biosynthetic pathways from position-specific isotope analysis as shown for tramadol | |
| Du et al. | Metabolic profiling of femoral muscle from rats at different periods of time after death | |
| Bayle et al. | Internal referencing for 13C position-specific isotope analysis measured by NMR spectrometry | |
| Leippe et al. | Bioluminescent assays for glucose and glutamine metabolism: High-throughput screening for changes in extracellular and intracellular metabolites | |
| Jin et al. | Sensing cytochrome P450 1A1 activity by a resorufin-based isoform-specific fluorescent probe | |
| Liu et al. | An “off− on” NIR fluorescence probe for visualization of H2S in food spoilage, living cells and zebrafish | |
| Hua et al. | Variable effects of LDL subclasses of cholesterol on endothelial nitric oxide/peroxynitrite balance–the risks and clinical implications for cardiovascular disease | |
| Zhuo et al. | Segmental hair analysis for flunitrazepam and 7-aminoflunitrazepam in users: a comparison to existing literature | |
| Li et al. | Portable hydrogel test kit integrated dual-emission coordination polymer nanocomposite for on-site detection of organophosphate pesticides | |
| Luginbühl et al. | Fully automated correction for the hematocrit bias of non-volumetric dried blood spot phosphatidylethanol analysis | |
| Wang et al. | 3-tert-Butyl-4-hydroxyanisole perturbs renal lipid metabolism in vitro by targeting androgen receptor-regulated de novo lipogenesis | |
| Cunha et al. | An overview of New Psychoactive Substances (NPS) in northeast Brazil: NMR-based identification and analysis of ecstasy tablets by GC-MS | |
| CN113740310A (zh) | 一种筛选或评价药物的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20211203 |