CN102473208A - 在代谢物组学分析方法中使用内源参比代谢物进行归一化的方法 - Google Patents

在代谢物组学分析方法中使用内源参比代谢物进行归一化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及内源参比代谢物的应用，以及将对应于哺乳动物对象的生物样品中所选靶代谢物的量和/或浓度的强度数据进行归一化的方法，其中所述强度数据使用一种或多种内源参比代谢物通过代谢物组学分析方法获得，所述方法包含对所述生物样品中的所述所选靶代谢物执行至少一种体外代谢物组学分析方法，同时在同一样品中执行一种或多种内源参比代谢物或其衍生物的定量分析，其中所述内源参比代谢物是生物样品中以基本上恒定的水平存在于对象中的化合物；并且其中所述内源参比代谢物或其衍生物具有小于1500Da的分子质量。

Description

在代谢物组学分析方法中使用内源参比代谢物进行归一化的方法
本发明涉及权利要求1的将对应于哺乳动物对象的生物样品中所选靶代谢物的量和/或浓度的强度数据进行归一化的方法，其中所述强度数据使用一种或多种内源参比代谢物通过代谢物组学分析方法获得，并涉及权利要求13的一种或多种化合物或其衍生物在代谢物组学分析方法中作为内源参比代谢物的应用，所述化合物具有小于1500Da的分子质量。
技术领域
本发明涉及代谢物组学领域。跟具体来说，本发明涉及用于对代谢物测定法中待比较的信号进行归一化的方法。这种新方法依赖使用内源代谢物浓度作为内标，并允许测定浓度和相对丰度以及在任何样品之间进行直接比较。
因此，本发明涉及代谢物浓度的应用和不同物种、组织之间和不同细胞之间代谢物水平的比较。本发明提供了参比、对照或归一化代谢物的身份和应用，所述代谢物的水平即使在不同条件下也在个体细胞中以及不同样品、物种和来源的体液、细胞和组织之间保持一致。
背景技术
在代谢物组学中，术语归一化是指在信号提取与加工之后和数据分发与随后的统计学处理之前的数据调整步骤(使用流动注射电喷雾质谱代谢物指纹数据进行预处理、分类建模和特点选择(Preprocessing，classification modeling and feature selection using flow injectionelectrospray mass spectrometry metabolite fingerprint data)，D.P.Enot，W.Lin，M.Beckmann，D.Parker，D.P.Overy和J.Draper：Nature Protocols，2008，3，446-470；依靠数字的代谢物组学：获取和理解整体代谢物数据(Metabolomics by numbers：acquiring and understanding globalmetabolite data)，R.Goodacre，S.Vaidyanathan，W.B.Dunn，.G.Harrigan和D.B.Kell：TRENDS in Biotechnology 2004，22(5)245-252)。对代谢物组学数据进行归一化以比较在不同天、不同机器上、各种稀释度下等产生的数据的方法仍然有许多争论，远远达不到黄金标准或甚至达不到一致推荐。
由于代谢物组学的首要目标是研究代谢物对环境和遗传改变做出响应而发生的变化，因此归一化是使测量值可比较的关键步骤，其中排除了含糊和不相关的变差来源。典型情况下，样品间变化性源于样品浓度和均质性差异、灵敏度的丧失和分析系统的漂移或样品随时间的降解。当考虑多个实验并且当代谢物测量值源于几个实验程序和不同分析平台时，这种变化性变成了真正的挑战(Enot等，2008)。
取决于实验设计，存在一些用于计算归一化因子的有用方法。例如，人们可以在化学衍生之前或之后向样品添加多种增加但等摩尔浓度的对照，并且这些点的强度总和应该相等。可选地，可以添加含有恒定量化合物的混合物或提取物，例如来自于一批血浆的样品。对于添加的等摩尔对照来说，测量到的强度应该表现相似。
更通用的方法利用板上的对照样品控制整个板质量的变差(例如标准制备物的标准批次和方法)或测量差异。
可采用的归一化策略是基于关于每个实验所使用的数据和策略的一些潜在假设。因此必须对这些策略进行调整以反映出所研究的系统和实验设计这两方面。首要假设是对于一些添加的对照组来说，在整个组中平均的测定浓度比应该接近单一值。
可以将用于对代谢物组学数据进行归一化的现有技术概括成三个主要类别：
1-第一类策略包括从数据本身推断逐个样品的偏差系数、也称为稀释或定标系数(scaling factor)(关于生物流体1D 1H-NMR数据归一化的意见(A note on normalization of biofluid 1D 1H-NMR data)，R.J.O.Torgrip，K.M.
Figure BDA0000128596270000031
E.Alm，I.Schuppe-Koistinen和J.Lindberg：Metabolomics，20084(2)，114-121)。
这种最简单的方法是全局归一化，其中定标系数是跨样品的所有测量值的和(或与其相关)(也称为常和、整和(integrale)、总io计数归一化(total io count normalisation))。这种初级方法的局限性已被广泛讨论(Torgrip等，2008；概率商数归一化作为说明复杂生物混合物稀释的强有力方法，在1H NMR代谢物组学中的应用(Probabilisticquotient normalization as robust method to account for dilution of complexbiological mixtures.Application in 1H NMR metabolomics)，F.Dieterle，A.Ross，G.Schlotterbeck，H.Senn：Anal Chem.，2006，78(13)，4281-90)，并且已提出了通过引入类型信息(Enot等，2008)、峰/信号的次选择(用于尿样代谢物组学分析的归一化策略(Normalization strategies formetabolomic analysis of urine samples)，B.M.Warrack，S.Hnatyshyn，K.-H.Ott，M.D.Reily，M.Sanders，H.Zhang和D.M.Drexler：Journal ofChromatography B，2009，877(5-6)，547-552；关于高通量质谱数据中非随机丢失值的归一化(Normalization Regarding Non-Random MissingValues in High-Throughput Mass Spectrometry Data)，P.Wang，H.Tang，H.Zhang，J.Whiteaker，A.G.Paulovich和M.Mcintosh：PacificSymposium on Biocomputing，2006，11：315-326)或通过将强度分布对参比样品情况进行作图(Torgrip等，2008，Dieterle等，2006)，来产生更充分的定标系数估算值的可替选方法。许多这样的方法属于NMR领域(美国专利号7,277,807B2，Dieterle等，2006)。不论所使用的技术的精密性及其解决具体生物学问题的效用如何，产生的数据仍然采取无量纲和实验依赖性数量的形式，不能在不同实验设置或应用领域之间有效转移和比较。
2-第二种归一化类型使用来自生物背景的信息来调整样品浓度(Warrack等，2009)。就此而言，在基于尿液的研究中通常使用取样时的肌酸酐、尿液体积或重量摩尔渗透压浓度，并且植物提取物或组织重量也可用于标度样品测量值。除了这样的信息在实践中的可用性以及与它们的测量相关的固有误差之外，当研究致力于可能诱导实验/临床参数估算值的急剧变化的生物化学过程(例如肾损伤)时，不能保证这些参数适用于归一化。
3-最后，利用针对单一或多种内标的校准进行化合物浓度的绝对定量，是既能使个体间变差降到最低、又能对源于多个位点和实验的数据集进行比较的最可靠的方法(使用多种内标的最优选择对代谢物组学数据进行归一化的方法(Normalization method for metabolomics datausing optimal selection of multiple internal standards)，M.Sysi-Aho，M.Katajamaa，L.Yetukuril和M.
Figure BDA0000128596270000041
BMC Bioinformatics 2007，8：93)。然而，在高通量代谢物情况分析的情形中，由于化学多样性，它的执行可能变成令人畏惧的任务：
i)使用单一内标不保证其对于广泛收集化合物的效能
ii)大量内标的成本和商业可用性，以及
iii)需要专用分析步骤的矩阵效应(matrix effect)。
生物样品的定量代谢物组学情况分析中的其他选项需要分离-分子ID方法，例如气相色谱-质谱(“GC-MS”)和原始样品的衍生。(WO/2007/008307)。在原始代谢物衍生后，数据校正和验证策略提供了代谢物衍生物的权重平均值。在这种情况分析方法中，将样品与衍生试剂合并以产生衍生物，并在衍生物上执行分离-分子ID和定量方法以获得相应的峰面积，包含测量衍生物的峰面积。
参考文献：
依靠数字的代谢物组学：获取和理解整体代谢物数据(Metabolomics by numbers：acquiring and understanding globalmetabolite data)
R.Goodacre，S.Vaidyanathan，W.B.Dunn，.G.Harrigan和D.B.KellTRENDS in Biotechnology 2004，22(5)245-252
关于高通量质谱数据中非随机丢失值的归一化(NormalizationRegarding Non-Random Missing Values in High-Throughput MassSpectrometry Data)
P.Wang，H.Tang，H.Zhang，J.Whiteaker，A.G.Paulovich和M.Mcintosh
Pacific Symposium on Biocomputing，2006，11：315-326
使用多种内标的最优选择对代谢物组学数据进行归一化的方法(Normalization method for metabolomics data using optimal selection ofmultiple internal standards)
M.Sysi-Aho，M.Katajamaa，L.Yetukuri1和M.
Figure BDA0000128596270000051
BMC Bioinformatics 2007，8：93
大规模人类代谢物组学研究：用于数据(预)处理和验证的策略(Large-Scale Human Metabolomics Studies：A Strategy for Data(Pre-)Processing and Validation)
S.Bijlsma，I.Bobeldijk，E.R.Verheij，R.Ramaker，S.Kochhar，I.A.Macdonald，B.van Ommen和A.K.Smilde
Anal.Chem.，2006 78(2)，567-574
关于生物流体1D 1H-NMR数据归一化的意见(A note onnormalization of biofluid 1D 1H-NMR data)
R.J.O.Torgrip，K.M.
Figure BDA0000128596270000052
E.Alm，I.Schuppe-Koistinen和J.Lindberg
Metabolomics，2008 4(2)，114-121
用于尿样代谢物组学分析的归一化策略(Normalization strategiesfor metabolomic analysis of urine samples)
B.M.Warrack，S.Hnatyshyn，K.-H.Ott，M.D.Reily，M.Sanders，H.Zhang和D.M.Drexler
Journal of Chromatography B，2009，877(5-6)，547-552
概率商数归一化作为说明复杂生物混合物稀释的强有力方法，在1H NMR代谢物组学中的应用(Probabilistic quotient normalization asrobust method to account for dilution of complex biological mixtures.Application in 1H NMR metabolomics)
F.Dieterle，A.Ross，G.Schlotterbeck，H.Senn
Anal Chem.，2006，78(13)，4281-90
使用流动注射电喷雾质谱代谢物指纹数据进行预处理、分类建模和特点选择(Preprocessing，classification modeling and feature selectionusing flow injection electrospray mass spectrometry metabolite fingerprintdata)
D.P.Enot，W.Lin，M.Beckmann，D.Parker，D.P.Overy和J.DraperNature Protocols，2008，3，446-470
(WO/2007/008307)用于定量高通量代谢物组学情况分析的数据校正、归一化和验证(Data correction，normalization and validation forquantitative high-throughput metabolomic profiling)
发明内容
概括来说，现有技术目前没有在代谢物组学分析方法中提出可靠的归一化方法。
因此，本发明的目的是为代谢物组学分析方法提供可靠的归一化。
这个目的通过权利要求1的归一化方法和权利要求13的内源参比代谢物的应用得以实现。
具体来说，本发明涉及：
用于将对应于哺乳动物对象的生物样品中所选靶代谢物的量和/或浓度的强度数据进行归一化的方法，其中所述强度数据使用一种或多种内源参比代谢物通过代谢物组学分析方法获得，所述方法包含
对所述生物样品中的所述所选靶代谢物执行至少一种体外代谢物组学分析方法；
同时在同一样品中执行一种或多种内源参比代谢物或其衍生物的定量分析，其中所述内源参比代谢物是生物样品中以基本上恒定的水平存在于对象中的化合物；其中所述内源参比代谢物或其衍生物具有小于1500Da的分子质量，并且选自：
氨基酸，特别是精氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、犬尿氨酸；
苯硫基氨甲酰基氨基酸(PTC-氨基酸)，特别是PCT-精氨酸、PTC-谷氨酰胺、PTC-组氨酸、PTC-甲硫氨酸、PTC-鸟氨酸、PTC-苯丙氨酸、PTC-脯氨酸、PTC-丝氨酸、PTC-色氨酸、PTC-酪氨酸、PTC-缬氨酸；
二甲基精氨酸，特别是N，N-二甲基-L-精氨酸；
羧酸，即15(S)-羟基-5Z，8Z，11Z，13E-二十碳四烯酸[(5Z，8Z，11Z，13E，15S)-15-羟基二十碳-5，8，11，13-四烯酸]、琥珀酸；
肉毒碱类；在酰基残基中具有1至20个碳原子的酰基肉毒碱；在酰基残基中具有3至20个碳原子并且在酰基残基中具有1至4个双键的酰基肉毒碱；在酰基残基中具有1至20个碳原子并且在酰基残基中具有1至3个OH基的酰基肉毒碱；在酰基残基中具有3至20个碳原子并在酰基残基中具有1至4个双键和1至3个OH基的酰基肉毒碱；
磷脂类，特别是
在酰基残基中具有1至30个碳原子的溶血磷脂酰胆碱(单酰基磷脂酰胆碱)；在酰基残基中具有3至30个碳原子并在酰基残基中具有1至6个双键的溶血磷脂酰胆碱；
在酰基残基中具有总共1至50个碳原子的磷脂酰胆碱(二酰基磷脂酰胆碱)；在酰基残基中具有总共3至50个碳原子并在酰基残基中具有总共1至8个双键的磷脂酰胆碱；
鞘磷脂类，特别是
在酰基链中总碳原子数为10至30的神经鞘磷脂；在酰基链中总碳原子数为10至30并具有1至5个双键的神经鞘磷脂；在酰基残基中总碳原子数为10至30的羟基神经鞘磷脂；在酰基残基中总碳原子数为10至30并具有1至5个双键的羟基神经鞘磷脂；
前列腺素类，即6-酮基-前列腺素F1α、前列腺素D2；
腐胺；
并且其中
每种所述所选靶代谢物的所述检测到的强度与所述内源参比代谢物的所述强度相关。
在本发明的优选方法中，对靶和内源参比代谢物的多个强度进行数学预处理，特别是变换例如使用算法、广义化算法、幂变换。
在本发明的优选实施方案中，将所述内源参比代谢物的多个强度归并成一个参比值。
在后一种情况下，通过计算几何平均值、算术平均值、中位数值、权重算数平均值将内源参比代谢物的多个强度归并成一个参比值，可能是优选的。
优选情况下，在线性强度的情况下形成靶代谢物的每个强度与测定到的参比值的比率，或者在对数强度的情况下从每个靶代谢物强度中减去测定到的参比值。
一般来说，出于本发明的目的，所述代谢物组学分析方法包含通过质谱术(MS)、特别是MS技术例如基质辅助激光解吸/电离(MALDI)、电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、任选与MS偶联的1H-、13C-和/或31P-核磁共振波谱(NMR)产生用于为内源代谢物定量的强度数据，通过使用与分离技术、特别是液相色谱(LC-MS)、气相色谱(GC-MS)或毛细管电泳(CE-MS)偶联的MS技术和/或方法来测定代谢物浓度，所述技术对于专业技术人员来说是公知的。
本发明的优选实施方案在于内源参比代谢物，其选自：
15(S)-羟基-5Z，8Z，11Z，13E-二十碳四烯酸
6-酮基-前列腺素F1α
不对称二甲基精氨酸
精氨酸
PTC-精氨酸
天冬氨酸
肉毒碱(游离)
癸酰基肉毒碱(反丁烯二酰基肉毒碱)
癸烯酰基肉毒碱
癸二烯酰基肉毒碱
十二酰基肉毒碱[月桂酰肉毒碱]
十二烯酰基肉毒碱
十二烷二酰基肉毒碱
十四酰基肉毒碱
十四烯酰基肉毒碱[肉豆蔻酰基肉毒碱]
3-羟基十四烯酰基肉毒碱[3-羟基肉豆蔻酰基肉毒碱]
3-羟基十四碳二烯酰基肉毒碱
3-羟基十四酰基肉毒碱[羟基肉豆蔻酰基肉毒碱]
十六烯酰基肉毒碱[棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六烯酰基肉毒碱[3-羟基棕榈油酰基肉毒碱]
十六碳二烯酰基肉毒碱
3-羟基十六碳二烯酰基肉毒碱
3-羟基十六碳酰基肉毒碱[3-羟基棕榈酰基肉毒碱]
十八碳酰基肉毒碱[硬脂酰基肉毒碱]
十八碳烯酰基肉毒碱[油酰肉毒碱]
3-羟基十八碳烯酰基肉毒碱[3-羟基油酰肉毒碱]
乙酰肉毒碱
丙烯酰肉毒碱
羟基丙酰肉毒碱
丁烯酰肉毒碱
3-羟基丁酰肉毒碱/丙二酸单酰肉毒碱
异戊酰基肉毒碱/2-甲基丁酰肉毒碱/戊酰基肉毒碱
甲基巴豆酰基肉毒碱/3-甲基-巴豆酰基肉毒碱
戊二酸单酰基肉毒碱/羟基己酰基肉毒碱
戊二酸单酰基肉毒碱/羟基己酰基肉毒碱
甲基戊二酸单酰基肉毒碱
3-羟基异戊酰基肉毒碱/3-羟基-2-甲基丁酰基肉毒碱
己酰基肉毒碱
己烯酰基肉毒碱
庚二酰基肉毒碱
辛酰基肉毒碱
辛烯酰基肉毒碱
壬酰基肉毒碱
瓜氨酸
肌酸酐
谷氨酰胺
PTC-谷氨酰胺
谷氨酸
组氨酸
PTC-组氨酸
犬尿氨酸
亮氨酸
酰基残基为C14:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C16:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C16:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C18:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C18:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C18:2的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C20:3的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C20:4的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C24:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C6:0的溶血磷脂酰胆碱
PTC-甲硫氨酸
鸟氨酸
PTC-鸟氨酸
二酰基残基总和为C24:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C26:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C28:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C30:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C30:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:6的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:6的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C40:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C40:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C40:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C40:6的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C30:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C30:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:2的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:2的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:2的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:2的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C44:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C44:6的磷脂酰胆碱
前列腺素D2
苯丙氨酸
PTC-苯丙氨酸
脯氨酸
PTC-脯氨酸
腐胺
丝氨酸
PTC-丝氨酸
酰基残基总和为C14:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C22:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C22:2的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C18:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C18:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C20:2的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C22:3的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C26:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C26:1的神经鞘磷脂
琥珀酸
总二甲基精氨酸：ADMA+SDMA的总和
色氨酸
PTC-色氨酸
酪氨酸
缬氨酸
PTC-缬氨酸
亮氨酸+异亮氨酸
其中名称“残基Cn:m”或“残基总和Cn:m”表示酰基/烷基残基的链长，n表示酰基/烷基残基中的总碳原子数，且m表示残基中的总双键数。
此外，特别优选情况下使用这样的代谢物作为根据统计学稳定性量度显示出稳定性的内源参比代谢物，所述统计学稳定性量度选自原始强度数据的变差系数(CV)、对数强度数据的标准偏差(SD)、geNorm算法的稳定性量度(M)或NormFinder算法的稳定性量度值(rho)。
此外，使用这样的代谢物作为根据至少2种统计学稳定性量度显示出稳定性的内源参比代谢物，可能是优选的，所述统计学稳定性量度选自原始强度数据的变差系数(CV)、对数强度数据的标准偏差(SD)、geNorm算法的稳定性量度(M)或NormFinder算法的稳定性量度值(rho)，和/或这样的内源参比代谢物具体来说选自：
PTC-精氨酸
肉毒碱(游离)
癸烯酰基肉毒碱
癸酰基肉毒碱(反丁烯二酰基肉毒碱)
十二烯酰基肉毒碱
十二烷二酰基肉毒碱
十二酰基肉毒碱[月桂酰肉毒碱]
十四酰基肉毒碱
3-羟基十四酰基肉毒碱[羟基肉豆蔻酰基肉毒碱]
十六烯酰基肉毒碱[棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六烯酰基肉毒碱[3-羟基棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六碳二烯酰基肉毒碱
3-羟基十六碳酰基肉毒碱[3-羟基棕榈酰基肉毒碱]
3-羟基十八碳烯酰基肉毒碱[3-羟基油酰肉毒碱]
丙烯酰肉毒碱
羟基丙酰肉毒碱
3-羟基丁酰肉毒碱/丙二酸单酰肉毒碱
甲基戊二酸单酰基肉毒碱
3-羟基异戊酰基肉毒碱/3-羟基-2-甲基丁酰基
己烯酰基肉毒碱
己酰基肉毒碱
庚二酰基肉毒碱
辛烯酰基肉毒碱
辛酰基肉毒碱
谷氨酰胺
PTC-谷氨酰胺
PTC-组氨酸
酰基残基为C14:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:1的溶血磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C24:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C26:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C30:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C30:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C30:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C44:6的磷脂酰胆碱
苯丙氨酸
PTC-苯丙氨酸
脯氨酸
酰基残基总和为C16:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C18:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C18:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C20:2的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C14:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C22:2的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的羟基神经鞘磷脂
琥珀酸
PTC-色氨酸
缬氨酸
PTC-缬氨酸
亮氨酸+异亮氨酸
其中名称“残基Cn:m”或“残基总和Cn:m”表示酰基/烷基残基的链长，n表示酰基/烷基残基中的总碳原子数，且m表示残基中的总双键数。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述所选内源参比代谢物根据至少3种统计学稳定性量度显示出稳定性，所述统计学稳定性量度选自原始强度数据的变差系数(CV)、对数强度数据的标准偏差(SD)、geNorm算法的稳定性量度(M)或NormFinder算法的稳定性量度值(rho)，和/或这样的内源参比代谢物具体来说选自：
肉毒碱(游离)
癸酰基肉毒碱(反丁烯二酰基肉毒碱)
十二烷二酰基肉毒碱
十二酰基肉毒碱[月桂酰肉毒碱]
十六烯酰基肉毒碱[棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六烯酰基肉毒碱[3-羟基棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六碳酰基肉毒碱[3-羟基棕榈酰基肉毒碱]
丙烯酰肉毒碱
羟基丙酰肉毒碱
3-羟基丁酰肉毒碱/丙二酸单酰肉毒碱
甲基戊二酸单酰基肉毒碱
己酰基肉毒碱
庚二酰基肉毒碱
辛烯酰基肉毒碱
辛酰基肉毒碱
谷氨酰胺
PTC-谷氨酰胺
PTC-组氨酸
酰基残基为C14:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:1的溶血磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C26:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C44:6的磷脂酰胆碱
酰基残基总和为C16:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C20:2的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的羟基神经鞘磷脂
缬氨酸
PTC-缬氨酸
其中名称“残基Cn:m”或“残基总和Cn:m”表示酰基/烷基残基的链长，n表示酰基/烷基残基中的总碳原子数，且m表示残基中的总双键数。
本发明的另一个优选方法使用根据所有统计学稳定性量度显示出稳定性的内源参比代谢物，所述统计学稳定性量度选自原始强度数据的变差系数(CV)、对数强度数据的标准偏差(SD)、geNorm算法的稳定性量度(M)或NormFinder算法的稳定性量度值(rho)，和/或这样的内源参比代谢物具体来说是二酰基残基总和为C42:6的磷脂酰胆碱，其中名称“C42:6”表示酰基残基的链长，42表示酰基残基中的总碳原子数，6表示残基中的总双键数。
在本发明的范围内，所述多种内源参比代谢物包含2至80种、特别是2至60种、优选2至50种、优选2至30种、更优选2至10种、特别优选2至10种、优选3至5种内源参比代谢物。
本发明的另一个实施方案是一种或多种化合物或其衍生物在代谢物组学分析方法中作为内源参比代谢物的应用，其中所述化合物具有小于1500Da的分子质量，其中所述内源参比代谢物选自：
氨基酸，特别是精氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、犬尿氨酸；
苯硫基氨甲酰基氨基酸(PTC-氨基酸)，特别是PCT-精氨酸、PTC-谷氨酰胺、PTC-组氨酸、PTC-甲硫氨酸、PTC-鸟氨酸、PTC-苯丙氨酸、PTC-脯氨酸、PTC-丝氨酸、PTC-色氨酸、PTC-酪氨酸、PTC-缬氨酸；
二甲基精氨酸，特别是N，N-二甲基-L-精氨酸；
羧酸，即15(S)-羟基-5Z，8Z，11Z，13E-二十碳四烯酸[(5Z，8Z，11Z，13E，15S)-15-羟基二十碳-5，8，11，13-四烯酸]、琥珀酸；
肉毒碱类；在酰基残基中具有1至20个碳原子的酰基肉毒碱；在酰基残基中具有3至20个碳原子并且在酰基残基中具有1至4个双键的酰基肉毒碱；在酰基残基中具有1至20个碳原子并且在酰基残基中具有1至3个OH基的酰基肉毒碱；在酰基残基中具有3至20个碳原子并在酰基残基中具有1至4个双键和1至3个OH基的酰基肉毒碱；
磷脂类，特别是
在酰基残基中具有1至30个碳原子的溶血磷脂酰胆碱(单酰基磷脂酰胆碱)；在酰基残基中具有3至30个碳原子并在酰基残基中具有1至6个双键的溶血磷脂酰胆碱；
在酰基残基中具有总共1至50个碳原子的磷脂酰胆碱(二酰基磷脂酰胆碱)；在酰基残基中具有总共3至50个碳原子并在酰基残基中具有总共1至8个双键的磷脂酰胆碱；
鞘磷脂类，特别是
在酰基链中总碳原子数为10至30的神经鞘磷脂；在酰基链中总碳原子数为10至30并具有1至5个双键的神经鞘磷脂；在酰基残基中总碳原子数为10至30的羟基神经鞘磷脂；在酰基残基中总碳原子数为10至30并具有1至5个双键的羟基神经鞘磷脂；
前列腺素类，即6-酮基-前列腺素F1α、前列腺素D2；
腐胺。
正如前面提到的，所述代谢物组学分析方法包含通过质谱术(MS)、特别是MS技术例如基质辅助激光解吸/电离(MALDI)、电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、任选与MS偶联的1H-、13C-和/或31P-核磁共振波谱(NMR)对内源靶和参比代谢物进行定量，通过使用与分离技术，特别是液相色谱(LC-MS)、气相色谱(GC-MS)或毛细管电泳(CE-MS)偶联的MS技术和/或方法来测定代谢物浓度。
可以用作本发明的内源参比代谢物的特别优选的化合物选自：15(S)-羟基-5Z，8Z，11Z，13E-二十碳四烯酸
6-酮基-前列腺素F1α
不对称二甲基精氨酸
精氨酸
PTC-精氨酸
天冬氨酸
肉毒碱(游离)
癸酰基肉毒碱(反丁烯二酰基肉毒碱)
癸烯酰基肉毒碱
癸二烯酰基肉毒碱
十二酰基肉毒碱[月桂酰肉毒碱]
十二烯酰基肉毒碱
十二烷二酰基肉毒碱
十四酰基肉毒碱
十四烯酰基肉毒碱[肉豆蔻酰基肉毒碱]
3-羟基十四烯酰基肉毒碱[3-羟基肉豆蔻酰基肉毒碱]
3-羟基十四碳二烯酰基肉毒碱
3-羟基十四酰基肉毒碱[羟基肉豆蔻酰基肉毒碱]
十六烯酰基肉毒碱[棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六烯酰基肉毒碱[3-羟基棕榈油酰基肉毒碱]
十六碳二烯酰基肉毒碱
3-羟基十六碳二烯酰基肉毒碱
3-羟基十六碳酰基肉毒碱[3-羟基棕榈酰基肉毒碱]
十八碳酰基肉毒碱[硬脂酰基肉毒碱]
十八碳烯酰基肉毒碱[油酰肉毒碱]
3-羟基十八碳烯酰基肉毒碱[3-羟基油酰肉毒碱]
乙酰肉毒碱
丙烯酰肉毒碱
羟基丙酰肉毒碱
丁烯酰肉毒碱
3-羟基丁酰肉毒碱/丙二酸单酰肉毒碱
异戊酰基肉毒碱/2-甲基丁酰肉毒碱/戊酰基肉毒碱
甲基巴豆酰基肉毒碱/3-甲基-巴豆酰基肉毒碱
戊二酸单酰基肉毒碱/羟基己酰基肉毒碱
戊二酸单酰基肉毒碱/羟基己酰基肉毒碱
甲基戊二酸单酰基肉毒碱
3-羟基异戊酰基肉毒碱/3-羟基-2-甲基丁酰基
己酰基肉毒碱
己烯酰基肉毒碱
庚二酰基肉毒碱
辛酰基肉毒碱
辛烯酰基肉毒碱
壬酰基肉毒碱
瓜氨酸
肌酸酐
谷氨酰胺
PTC-谷氨酰胺
谷氨酸
组氨酸
PTC-组氨酸
犬尿氨酸
亮氨酸
酰基残基为C14:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C16:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C16:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C18:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C18:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C18:2的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C20:3的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C20:4的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C24:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C6:0的溶血磷脂酰胆碱
PTC-甲硫氨酸
鸟氨酸
PTC-鸟氨酸
二酰基残基总和为C24:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C26:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C28:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C30:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C30:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:6的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:6的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C40:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C40:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C40:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C40:6的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C30:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C30:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:2的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:2的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:2的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:2的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C44:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C44:6的磷脂酰胆碱
前列腺素D2
苯丙氨酸
PTC-苯丙氨酸
脯氨酸
PTC-脯氨酸
腐胺
丝氨酸
PTC-丝氨酸
酰基残基总和为C14:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C22:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C22:2的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C18:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C18:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C20:2的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C22:3的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C26:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C26:1的神经鞘磷脂
琥珀酸
总二甲基精氨酸：ADMA+SDMA的总和
色氨酸
PTC-色氨酸
酪氨酸
缬氨酸
PTC-缬氨酸
亮氨酸+异亮氨酸
其中名称“残基Cn:m”或“残基总和Cn:m”表示酰基/烷基残基的链长，n表示酰基/烷基残基中的总碳原子数，且m表示残基中的总双键数。
本发明的另一个有利实施方案是使用这样的化合物作为根据统计学稳定性量度显示出稳定性的内源参比代谢物，所述统计学稳定性量度选自原始强度数据的变差系数(CV)、对数强度数据的标准偏差(SD)、geNorm算法的稳定性量度(M)或NormFinder算法的稳定性量度值(rho)。
优选情况下，这样的化合物可以用作根据至少2种统计学稳定性量度显示出稳定性的内源参比代谢物，所述统计学稳定性量度选自原始强度数据的变差系数(CV)、对数强度数据的标准偏差(SD)、geNorm算法的稳定性量度(M)或NormFinder算法的稳定性量度值(rho)，和/或这样的内源参比代谢物具体来说选自：
PTC-精氨酸
肉毒碱(游离)
癸烯酰基肉毒碱
癸酰基肉毒碱(反丁烯二酰基肉毒碱)
十二烯酰基肉毒碱
十二烷二酰基肉毒碱
十二酰基肉毒碱[月桂酰肉毒碱]
十四酰基肉毒碱
3-羟基十四酰基肉毒碱[羟基肉豆蔻酰基肉毒碱]
十六烯酰基肉毒碱[棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六烯酰基肉毒碱[3-羟基棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六碳二烯酰基肉毒碱
3-羟基十六碳酰基肉毒碱[3-羟基棕榈酰基肉毒碱]
3-羟基十八碳烯酰基肉毒碱[3-羟基油酰肉毒碱]
丙烯酰肉毒碱
羟基丙酰肉毒碱
3-羟基丁酰肉毒碱/丙二酸单酰肉毒碱
甲基戊二酸单酰基肉毒碱
3-羟基异戊酰基肉毒碱/3-羟基-2-甲基丁酰基
己烯酰基肉毒碱
己酰基肉毒碱
庚二酰基肉毒碱
辛烯酰基肉毒碱
辛酰基肉毒碱
谷氨酰胺
PTC-谷氨酰胺
PTC-组氨酸
酰基残基为C14:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:1的溶血磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C24:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C26:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C30:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C30:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C30:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C44:6的磷脂酰胆碱
苯丙氨酸
PTC-苯丙氨酸
脯氨酸
酰基残基总和为C16:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C18:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C18:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C20:2的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C14:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C22:2的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的羟基神经鞘磷脂
琥珀酸
PTC-色氨酸
缬氨酸
PTC-缬氨酸
亮氨酸+异亮氨酸
其中名称“残基Cn:m”或“残基总和Cn:m”表示酰基/烷基残基的链长，n表示酰基/烷基残基中的总碳原子数，且m表示残基中的总双键数。
本发明的另一种有利应用是使用这种根据至少3种统计学稳定性量度显示出稳定性的内源参比代谢物，所述统计学稳定性量度选自原始强度数据的变差系数(CV)、对数强度数据的标准偏差(SD)、geNorm算法的稳定性量度(M)或NormFinder算法的稳定性量度值(rho)，和/或这样的内源参比代谢物具体来说选自：
肉毒碱(游离)
癸酰基肉毒碱(反丁烯二酰基肉毒碱)
十二烷二酰基肉毒碱
十二酰基肉毒碱[月桂酰肉毒碱]
十六烯酰基肉毒碱[棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六烯酰基肉毒碱[3-羟基棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六碳酰基肉毒碱[3-羟基棕榈酰基肉毒碱]
丙烯酰肉毒碱
羟基丙酰肉毒碱
3-羟基丁酰肉毒碱/丙二酸单酰肉毒碱
甲基戊二酸单酰基肉毒碱
己酰基肉毒碱
庚二酰基肉毒碱
辛烯酰基肉毒碱
辛酰基肉毒碱
谷氨酰胺
PTC-谷氨酰胺
PTC-组氨酸
酰基残基为C14:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:1的溶血磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C26:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C44:6的磷脂酰胆碱
酰基残基总和为C16:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C20:2的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的羟基神经鞘磷脂
缬氨酸
PTC-缬氨酸
其中名称“残基Cn:m”或“残基总和Cn:m”表示酰基/烷基残基的链长，n表示酰基/烷基残基中的总碳原子数，且m表示残基中的总双键数。
本发明的另一个优选实施方案使用这样的化合物作为根据所有统计学稳定性量度显示出稳定性的内源参比代谢物，所述统计学稳定性量度选自原始强度数据的变差系数(CV)、对数强度数据的标准偏差(SD)、geNorm算法的稳定性量度(M)或NormFinder算法的稳定性量度值(rho)，和/或这样的内源参比代谢物具体来说是二酰基残基总和为C42:6的磷脂酰胆碱，其中名称“C42:6”表示酰基残基的链长，42表示酰基残基中的总碳原子数，6表示残基中的总双键数。
此外，优选使用2至80种、特别是2至60种、优选2至50种、优选2至30种、更优选2至10种、特别优选2至10种、优选3至5种化合物作为内源参比代谢物。
对用于代谢物组学数据归一化的好方法的需求再怎么强调也不为过，并且这种方法是需要定量数据或与参比值进行比较的应用、例如诊断学中所需的先决条件。存在大量技术性变差的来源，例如试剂的装载影响、批次影响、稀释影响、内标在向组织添加后的不可重现的分布以及实验条件中被忽视的变化。理想情况下，归一化也应该允许对从不同样品类型、不同物种获得的以及在不同测定平台上和由不同实验室测定的数据进行直接比较。此外，更具体来说，与质谱相关的未解决问题包括对数据的跨矩阵、跨组织和跨物种比较来说有害的矩阵特异性信号抑制或离子抑制。
必须执行上述步骤来转变原始信号信息，以适合于随后的数据分析和解释的格式提呈数据。然而，即使使用对照点或外部对照样品，不希望得到的实验变差仍能污染数据。在实验中也可能遗漏一些或所有物理归一化技术，在这种情况下发现其他归一化手段甚至更加重要。
理论上说，用于代谢物组学的理想内源标准品是一种化合物或一组化合物，其浓度水平在细胞周期中、细胞类型之间、各种疾病状态之间、各种健康状态之间或对人们希望检验的实验性治疗做出响应而不发生变化。此外，对于在代谢物组学中有效的内源标准品(其是内源代谢物)来说，关键是它应该与代谢物测定法中的测试和参比(或靶)代谢物具有相似的相对丰度。到目前为止还没有描述过这样的分子，也没有描述过在定量多参数代谢物组学和使用质谱或产生定量或相对浓度数据的任何其他方法进行代谢物水平测定的情形中利用这些分子的方法。
使用外源添加的标准品，具有使用户对照超过所添加的化合物量的优点，导致样品间变差低。然而，使用外源标准品不能控制用于开始工作并随后进行分析的起始材料或组织的质量的差异。如果在其他方面都一致的样品之间存在代谢物完整性水平的差异，提取得率将反映出这种变差，尽管外部标准品仍将表现一致。
在理论上，内源标准品——其不能与也是从外部添加的内标混淆——可以避开许多上面列出的代谢物组学实验中的问题。然而，尽管在基因表达和转录组学的背景下内源持家基因的概念是已知的，但持家代谢物或组合的产生、鉴定和应用以及它们的组合使用，在代谢物组学中是未知的，并且尽管存在大量描述代谢数据在各种情形中的应用的研究，但在代谢物组学中使用对照、持家或内源参比代谢物尚未被描述。
然而，由于营养状况或食物摄取量的变差，物种间代谢物浓度对生理和环境条件做出响应而发生显著变化，因此鉴定和使用内源化合物或代谢物作为归一化工具已被评估为高度不可能。鉴定在不同组织、不同物种之间、更不用说各种健康状态之间或在患有不同疾病的对象中变差有限的内源化合物，甚至更加不可能，并且在任何情况下都不明显。具体来说，对于本技术领域的普通专业人员来说，令人吃惊的是在本申请中鉴定到的化合物可以用作内源参比代谢物。在下面的实施例中描述的实验结果进一步显示，在代谢物组学中获得了明显提高的预测力，正如在使用内源参比代谢物与不使用内源参比代谢物归一化的实施例的比较中所显示的。
尽管存在现有技术中的障碍，本发明人仍调查了是否有可能鉴定具有最小浓度变化或“恒定”水平的多种代谢物，其可用于归一化，因此是用于鉴定、测定、定量和应用其他可变代谢物的疾病相关的浓度变化，以及将这些参比或对照代谢物与可变代谢物的测定相结合应用于诊断工具中的先决条件。
在本发明的方法中，本发明显示出内源参比代谢物或持家代谢物的子集确实存在，并且对于这些代谢物来说，水平的分布在确定限度内保持恒定，或具有令人吃惊地不依赖于任何具体样品、对象的生理状况、样品建立和组织的某些平均值和标准偏差。
因此，本发明为归一化代谢物数据的难题提供了通用方法和新的解决方案，提供了产生内源参比代谢物的通用方法，提供了使用内源参比代谢物的方法以及内源参比化合物和代谢物的名单。
本发明的另一个目的，是通过产生并提供用于对代谢物和代谢物组学测定中的相对信号强度进行归一化的新的内源标准品的名单，提供用于将这些标准品应用于归一化并因此应用于代谢物定量测定和诊断的方法，以致力于并解决上面概述的代谢物组学数据归一化和数据应用中的问题。
本发明提供了对代谢物组学数据进行比较、定量和归一化以及因此应用它们的解决方案，所述代谢物组学数据的产生是通过使用包括但不限于质谱术(MS)、特别是MS技术例如MALDI、ESI、大气压化学电离(APCI)和其他方法来定量内源代谢物，使用MS技术或与分离(LC-MS、LC-NMR、GC-MS、CE-MS)偶联的可选方法来确定代谢物浓度，随后进行特征选择和/或特征到分类物的组合，包括至少两种分子或相同或不同分子的至少两种被分析物的分子数据，以及对从不同对象、不同物种、不同取样时间点、由不同人处理和在不同实验条件下获得的这些数据进行比较。
我们证实了内源参比代谢物组在来自不同物种、不同组织和建立条件的样品间令人吃惊地显示出浓度的最小变差。我们还演示了在疾病状态表征或诊断中的应用。
因此，本发明提供了强有力的对照代谢物，其在各种物种、动物模型、健康状况、样品类型、样品建立和实验设置、组织类型或体液、样品处理和测定条件以及内含物分析测定中令人吃惊地显示出几乎不变的水平，允许对代谢物特征进行归一化、鉴定并应用于不同的生物学状态，或与不同疾病、这些疾病相应的等级及其在人类或哺乳动物模型系统中疗法的响应相关联，而不论使用何种实验设置和测定平台。
本发明还涉及将代谢物测量值用于例如诊断、分类或鉴定疾病，对将来的发展预后，辨别各种疾病状态，控制治疗方式或治疗的时间长度，控制药物摄取的结果或不同内源药物浓度的结果或由实验条件引起的对内源代谢物水平的任何结果。它提供了参比点和适合的基础值，用于鉴定和识别与疾病相关的代谢变化，并因此可应用于诊断和治疗检测。
代谢物测量值的使用依赖于在体液、细胞和组织中检测或测量代谢物的差异浓度的能力。被分析的代谢物包括以与目标生物表型相关的方式被差异检测的代谢物。在样品或对象的细胞、组织或体液中测定一种或多种浓度有差异的代谢物的代谢物水平，然后直接使用一种或多种被分析物的代谢物浓度水平，或者在测定多种被分析物的情况下，对它们进行相互比较来使用。后一种情况的一个非限制性实例是测定两个样品的代谢物浓度水平，然后使用一种与另一种的比率。
当将水平针对参比值进行归一化时，细胞、组织、体液中以及不同样品和/或来源的样本之间和跨实验或实验测量日期的代谢物水平的比较得到改进。这可以被视为归一化至单一标度。例如但不限于当使用代谢物组学或具有多个探针的代谢物组学试剂盒测定代谢物水平时，归一化的使用允许直接进行测定之间的比较，或者在多孔板上测定的情况下进行板之间的比较。
“质谱术”(MS)是用于测量和分析分子的技术，其涉及将靶分子片段化，然后根据片段的质量/电荷比分析片段，以产生用作“分子指纹”的质谱图。通过测定物体吸收电磁能的波长的手段来进行物体的质量/电荷比的确定。有几种常用于测定离子的质量电荷比的方法，其中一些测量离子轨道与电磁波的相互作用，其他的测量离子通过给定距离所花费的时间，或二者的组合。来自这些片段质量测量的数据可以针对数据库进行搜索，以获得靶分子的决定性鉴定。质谱术也广泛用于其他化学领域，例如石油化学或药物质量控制等等。
“离子”是通过向原子添加电子或从原子移除电子而形成的带电物体。
“质谱图”是由质谱仪产生的数据图，典型包含x-轴上的m/z值和y-轴上的强度值。术语“m/z”是指用离子的质量数除以其绝对电荷数而形成的无量纲的数量值。长期以来，它被称为“质荷”比。
当在本文中使用时，术语“代谢物”是指细胞、生物体、组织的，或存在于体液中和从上面提到的来源获得的提取物中的内源有机化合物，其具有典型低于1500道尔顿的分子量。代谢物的典型实例是糖类、脂类、磷脂、鞘脂类和鞘磷脂、氨基酸、胆甾醇、甾类激素和氧化甾醇，以及其他化合物例如收集在人类代谢物数据库[Wishart DS等，HMDB：人类代谢组数据库(HMDB：the Human Metabolome Database)，Nucleic Acids Res.2007 Jan；35(数据库版)：D521-6(参见http://www.hmdb.ca/)]和其他数据库和文献中的化合物。这包括通过代谢或通过代谢过程产生的任何物质和参与代谢的任何物质。
术语“代谢”是指在生物体的组织内发生的化学变化，包括“合成代谢”和“分解代射”。合成代谢是指分子的生物合成或形成，分解代射是指分子的分解。
在本发明的范围内所理解的“代谢物组学”是指通过多种方法对几种(两千种)代谢物进行的全面定量测量，所述方法例如但不限于质谱术，液相色谱、气相色谱和其他分离方法与质谱术或核磁共振(NMR)的偶联。
基质是指用于分析或样品建立的样品类型，例如体液(血浆、血液)、不同组织(例如脑和肝脏)、来自生物体的不同部分例如从植物等获得的叶与根的比较。不同的基质也可以包括同样的组织或体液类型，但是来自于不同物种，例如大鼠血浆与人类血浆的比较。
在本发明的情形中，生物标志物是特征，包含至少一种被测量和评估的代谢物的数据，其可用作生物过程、病理过程或对与疾病状态相关的治疗干预或相关治疗的响应的指示物。当在本文中使用时，组合生物标志物可以选自至少两种小的内源分子和代谢物。
被分析物是指被分析的化学实体或化合物的混合物。受限于技术(质谱术)对双键位置、构型不同的结构异构体(例如磷脂或甘油三酯中脂肪酸残基的位置)的结构解析力，因此一种被分析物可能在形式上包括一种以上代谢物。
术语持家代谢物或被分析物、参比或对照代谢物在本发明中可以互换，并且是指当对具有各种生理状况、各种健康状态或疗法或先期治疗的不同对象的不同样品进行比较时，在几种样品间量和浓度水平变差小的代谢物和被分析物。因此，对照、参比或持家代谢物是在几种样品中浓度变化最小并因此可用作内源参比代谢物的代谢物。因此，这些内源参比代谢物能够补偿与代谢物组学中的技术设置、样品操作、实验建立和随机波动相关的可变性。
内源参比代谢物优选不以统计学显著的水平(例如p-值小于0.05和/或q-值小于0.05)差异存在。示例性的窒息特异性内源参比代谢物描述在下面的详细说明和实验部分中。
当在本文中使用时，术语“疾病特异性内源参比代谢物”是指与未患病生物体相比，不差异存在或差异浓缩在患病生物体中的代谢物。例如术语“窒息特异性内源参比代谢物”是指在窒息生物体与未窒息生物体中相比具有低变化性的相同浓度水平的代谢物。
当在本文中使用时，术语“靶代谢物”是指在不同条件或不同治疗下，例如患病生物体与未患病生物体相比、在治疗的生物体与未治疗生物体中相比等，差异存在或差异浓缩的代谢物。例如，术语“窒息特异性代谢物”是指在窒息生物体与未窒息生物体中相比差异存在或差异浓缩的代谢物。
在本说明书和权利要求书中的术语“样品”以其最广泛的意义使用。一方面，它意味着包括样本或培养物。有两方面，它意味着包括生物和环境样品两者。样品可以包括合成来源的样本。
生物样品可以是动物包括人类的流体、固体(例如粪便)或组织，以及液体和固体食品和饲料制品和成分，例如乳制品、蔬菜、肉类和肉类副产品和垃圾。生物样品可以从所有各种不同类型的驯养动物以及未驯养或野生动物获得，包括但不限于例如有蹄类、熊类、鱼类、啮齿类动物等。
生物样品可以包含适合于检测所需生物标志物的任何生物材料，并可以包含来自对象的细胞和/或非细胞材料。样品可以从任何适合的生物组织或流体例如组织、血液、血浆、尿液或脑脊液(CSF)、植物提取物或加工过的生物材料(例如食品)来分离。
当在本文中使用时，术语“细胞”是指任何真核或原核细胞(例如细菌细胞例如大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼类细胞和昆虫细胞)，无论位于体外还是体内。
当在本文中使用时，术语“检测可以描述发现或察觉或特异性观察可检测标记或未标记成分的一般性行动。
归一化：在本发明的背景中理解的归一化是指通过减少或消除技术变异性使不同测定的代谢物组学数据可比的此方法。在这种比较性分析中，归一化对于补偿分离技术的变差、初始定量误差、先前化学或酶修饰中的试管间变差和其他实验变差来说，是必需的。
本发明的方法的示意图显示如下：
Figure BDA0000128596270000391
首先，获得从对象或生物体获得的生物样品。
其次，测量来自生物样品的生物分子的量，并作为原始数据储存在数据库或任何电子装置中。
第三，对来自数据库的原始数据进行预处理。该步骤是任选的，但是人们通常使用对数变换的被分析物浓度用于进一步分析，其中对数变换用于使方差稳定并获得至少近似正态分布的数据。当然，人们也可以使用其他变换例如Box-Cox幂变换[Box G.E.P.和Cox D.R.(1964)变换的分析(与讨论)(An analysis of transformations(with discussion))，Journal of the Royal Statistical Society B，26，211-252.]、通过vsn的广义对数变换[Huber W.，von Heydebreck A.，Sueltmann H.，Poustka A.，Vingron M.(2002).应用于微阵列数据校准和差异表达定量的方差稳定化(Variance stabilization applied to microarray data calibration and to thequantification of differential expression)，Bioinformatics 18 Suppl.1S96-S104.]或通过vst的广义对数变换[Lin S.M.，Du P.，Huber W.，Kibbe，W.A.(2008).用于Illumina微阵列数据的基于模型的方差稳定化变换(Model-based variance-stabilizing transformation for Illumina microarraydata)，Nucleic Acids Research，Vol.36，No.2e11.]，或从该步骤中的微阵列归一化公知的一些其他归一化方法。在Affymetrix微阵列数据情况下的归一化方法的比较性调查，提供在Cope等，(2004)[L.M.Cope等(2004).Affymetrix GeneChip表达测量的基准点(A Benchmark forAffymetrix GeneChip Expression Measures)，Bioinformatics20(3)：323-331]或Irizarry等，(2006)[R.A.Irizarry等(2006).AffymetrixGeneChip表达测量的比较(Comparison of Affymetrix GeneChipExpression Measures)，Bioinformatics 22(7)：789-794]中。
第四，选择一种最稳定的代谢物作为持家代谢物，其中稳定性可以根据变差系数、标准偏差、两两变化性、组间和组内变化性等来确定。由于对于不同被分析物类别来说技术变化性可能不同，因此人们也能在该选择过程期间辨别被分析物类别。
第五，通过所选的持家代谢物对靶代谢物进行归一化。这可以通过考虑原始或预处理过的浓度比率或差异来进行。如果存在一种以上持家代谢物，使用几何平均值、算术平均值、中位数或一些其他归并方法将这些代谢物的原始或预处理过的浓度归并，然后将靶代谢物的浓度与钙归并的参比值相关联。通过对不同代谢物类别使用不同持家代谢物，归一化也可以将被分析物类别考虑在内。
第六，将靶代谢物的持家归一化浓度用于统计分析，所述统计分析可以是单或多变量检验、回归或分类分析等。
本发明提供了对代谢物组学数据进行比较、定量和归一化以及因此应用它们的解决方案，所述代谢物组学数据的产生是通过使用包括但不限于质谱术(MS)、特别是MS技术例如MALDI、ESI、大气压化学电离(APCI)和其他方法来定量内源代谢物，使用MS技术或与分离(LC-MS、LC-NMR、GC-MS、CE-MS)偶联的可选方法来确定代谢物浓度，随后进行特征选择和/或特征到分类物的组合，包括至少两种分子的分子数据，以及对从不同对象、不同物种、不同取样时间点、由不同人处理和在不同实验条件下获得的这些数据进行应用和比较。
参比被分析物浓度可用于确定随着实验条件、疾病、疾病状态、先期治疗、疗法、疗法控制和预后的变化而变的其他被分析物和代谢物的可变浓度。
“内源参比代谢物”或“内源参比被分析物”意味着代谢物的水平在不同实验条件之间恒定，并且靶代谢物相对于作为标准的内源参比代谢物的相对值可以指示特定疾病状态、表型或其缺失，以及疾病状态、表型或其缺失的组合。
出于本发明的目的，内源参比代谢物的稳定性意味着
CV为＜0.50、＜0.25、＜0.10、＜0.05和/或
SD为＜1.0、＜0.5、＜0.25、＜0.10(在对数标度上)和/或
M为＜0.5、＜0.25、＜0.10、＜0.05和/或
rho为＜0.5、＜0.25、＜0.10、＜0.05。
内源参比代谢物的参比水平可以是代谢物的绝对或相对量或浓度、代谢物的量或浓度的范围、内源参比代谢物的平均量或浓度和/或内源参比代谢物的量或浓度的中位数；此外，内源参比代谢物组合的“参比水平”也可以是两种或多种代谢物的绝对或相对量或浓度相对于彼此的比率，或通过分类获得的合成值/分值。
适合于特定疾病状态、表型或其缺失的内源参比代谢物的参比水平，可以通过测量一个或多个适合对象中所需代谢物的水平并与内源参比代谢物的水平进行比较来确定。代谢物水平以及内源参比代谢物的参比水平可以被定制成适合于特定对象群体(例如水平可以是年龄匹配的，以便可以在来自某个年龄对象的样品中的代谢物水平与某个年龄组中用于特定疾病状态、表型或其缺失的内源参比代谢物水平之间进行比较)。这样的代谢物水平以及内源参比代谢物的参比水平也可以被定制成适合于用于测量生物样品中代谢物水平的特定技术(例如LC-MS、GC-MS、ELISA、酶测试等)，其中取决于所使用的具体技术，代谢物水平或内源参比代谢物的水平可以不同。
根据实施例的描述并结合附图，本发明的其他特点和优点将变得明显。
图1显示了根据实施例1的小猪数据的对数变换的被分析物浓度的平均值-SD图；
图2显示了对于通过对数变换和持家归一化的对数变换的小猪数据对窒息开始与窒息结束进行比较来说显著的被分析物的Venn图；
图3显示了对于通过对数变换和持家归一化的对数变换的小猪数据对窒息结束与复苏结束进行比较来说显著的被分析物的Venn图；
图4显示了对于通过对数变换和持家归一化的对数变换的小猪数据对窒息开始与复苏结束进行比较来说显著的被分析物的Venn图；
图5显示了根据实施例2的绵羊血浆数据的对数变换的被分析物浓度的平均值-SD图；
图6显示了使用对于对数变换和持家归一化的对数变换的绵羊数据来说，具有显著治疗效果的被分析物数量的Venn图；
图7显示了使用对于对数变换和持家归一化的对数变换的绵羊数据来说，具有显著时间点效果的被分析物数量的Venn图；
图8显示了使用对于对数变换和持家归一化的对数变换的绵羊数据来说，具有治疗和时间点之间的显著相互作用的被分析物数量的Venn图；
图9显示了根据实施例3的大鼠脑数据的对数变换的被分析物浓度的平均值-SD图；
图10显示了使用在三个组(OP、假物、对照)中的至少一个与持家归一化的原始大鼠数据之间具有显著差异的被分析物数量的Venn图；
图11显示了根据实施例4的人类血浆数据的对数变换的被分析物浓度的平均值-SD图；以及
图12显示了使用在三个组(肺炎、混合脓毒症、对照)中的至少一个与持家归一化的人类数据之间具有显著差异的被分析物数量的Venn图。
实施例
提供了下面的实施例以便演示和进一步说明本发明的优选实施方案和特点，并且不应被解释为对本发明范围的限制。
通用分析法：
样品制备和代谢物组学分析在奥地利Innsbruck的BIOCRATESLife Sciences AG进行。我们使用了多参数、高鲁棒性、灵敏和高通量的定向代谢物组学平台，其由流动注射分析(FIA)-MS/MS和LC-MS/MS方法组成，用于对血浆和脑样品中的广范围内源中间体，即酰基肉毒碱、神经鞘磷脂、己糖、甘油磷脂、氨基酸、生物胺、胆汁酸、类二十烷酸、和小的有机酸(能量代谢)、氧甾酮进行同时定量。所有程序(样品操作、分析)由未告知研究组的合作人员执行。
样品制备
血浆和血清样品通过标准程序制备。
将脑样品在冰上融化1小时，通过向组织样品按3∶1(w/v)比率加入磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲盐水，0.1μmol/L；Sigma Aldrich，Vienna，奥地利)，然后使用Potter S匀浆器(Sartorius，Goettingen，德国)在冰上以9g匀浆1分钟，来制备匀浆液。为了确保在一批内同时分析所有样品，将样品再次冷冻(-70℃)，在分析当天在冰上融化(1h)，并在2℃下以18000g离心5分钟。所有试管用0.001％BHT(叔丁基对羟基甲苯；Sigma-Aldrich，Vienna，奥地利)制备，以防止由自氧化引起的前列腺素的人为形成。
酰基肉毒碱、神经鞘磷脂、己糖、甘油磷脂(FIA-MS/MS)
为了测定脑匀浆液和血浆中酰基肉毒碱、神经鞘磷脂和甘油磷脂的浓度，按照制造商的流程中所述准备AbsoluteIDQ试剂盒p150(Biocrates Life Sciences AG)。简单来说，将10μL脑匀浆液加到试剂盒的上层96孔板上滤膜的中央，并使用氮吹仪(VLM Laboratories)干燥样品。随后加入20μL 5％的苯基异硫氰酸酯溶液进行衍生。在温育后，将滤膜斑再次使用氮吹仪干燥。使用300μL 5mM乙酸铵的甲醇溶液提取代谢物。通过离心到下层96深孔板中获得提取液，然后使用600μL试剂盒的MS运行溶剂执行稀释步骤。质谱分析在装备有电喷雾电离(ESI)源的API4000QTrap
Figure BDA0000128596270000451
串联质谱仪(Applied Biosystems/MDSAnalytical Technologies)上，使用在AbsoluteIDQ试剂盒中提供的分析捕获方法来进行。将标准的FIA-MS/MS方法应用于所有测定，进行两次相继的20μL注射(一个用于正离子模式分析，一次用于负离子模式分析)。应用整合在MetIQ软件(Biocrates Life Sciences AG)中的谱图剖析算法，使用多反应监测(MRM)检测进行定量。将通过内部校准获得的148种代谢物的浓度值(所有被分析物使用代谢物组学试剂盒测定，只有氨基酸例外，其通过不同方法测定)输出，用于全面统计分析。
氨基酸、生物胺(LC-MS/MS)
通过反相LC-MS/MS为通过外部校准和利用内标执行的单个定量获得同量异位(相同MRM离子对)代谢物的层析分离，对氨基酸和生物胺进行定量分析。对于使用下述样品制备的分析来说，需要10μL样品体积(血浆、脑匀浆液)。将样品加到置于固定在96深孔板(捕集板)上的溶剂惰性96孔板中的滤膜斑上(事先已放置内标并在在氮气下干燥)。加入20μL 5％的苯基异硫氰酸酯衍生试剂。温育后，将衍生过的样品用甲醇水溶液提取到捕集板中。使用API4000 QTrap
Figure BDA0000128596270000461
串联质谱仪(Applied Biosystems/MDS Analytical Technologies)以正MRM检测模式通过LC-ESI-MS/MS分析样品提取物。将分析过的单个代谢物浓度(Analyst 1.4.2软件，Applied Biosystems)输出，用于全面统计分析。
胆汁酸(LC-MS/MS)
在负MRM检测模式下使用高选择性反相LC-MS/MS分析方法来测定血浆样品中的胆汁酸浓度。将样品通过干燥滤膜斑技术以非常适合于高通量分析的96孔板格式进行提取。为了进行高精确性定量，使用了内标和外部校准。简单来说，将置于滤膜斑上的内标和20μL样品体积进行提取，同时用甲醇水溶液进行蛋白质沉淀。这些样品提取物通过LC-ESI-MS/MS，使用API4000 QTrap
Figure BDA0000128596270000462
串联质谱仪(AppliedBiosystems/MDS Analytical Technologies)来测量。使用Analyst 1.4.2软件(Applied Biosystems)来定量胆汁酸的数据，并最后将其输出用于全面统计分析。
前列腺素类化合物、氧化型脂肪酸(LC-MS/MS)
通过在线固相提取(SPE)-LC-MS/MS[Unterwurzacher等RapidCommun Mass Spec submitted]，使用API4000 QTrap
Figure BDA0000128596270000463
串联质谱仪(Applied Biosystems/MDS Analytical Technologies)，采用负MRM检测方式，通过LC-ESI-MS/MS来分析血浆提取物[Unterwurzacher等Clin Chem Lab Med 2008；46(11)：1589-1597]和脑匀浆液提取物中的前列腺素类化合物——概括了前列腺素(PG)，凝血烷(TX)和前列环素的术语——和氧化型脂肪酸代谢物。样品制备对于血浆和脑匀浆液两者来说是相同的。简单来说，在96孔板中的滤膜斑中掺入内标；加入20μL血浆或组织匀浆液，并用甲醇水溶液提取，然后对各个提取物进行分析。使用Analyst 1.4.2软件(Applied Biosystems)来定量前列腺素类化合物和氧化型脂肪酸的数据，并最后将其输出用于统计分析。
能量代谢(有机酸)(LC-MS/MS)
对于能量代谢中间体(糖酵解、柠檬酸循环、戊糖磷酸途径、尿素循环)的定量分析来说，使用亲水相互作用液相色谱(HILIC)-ESI-MS/MS方法，采用高选择性负MRM检测模式。MRM检测使用API4000 QTrap
Figure BDA0000128596270000471
串联质谱仪(Applied Biosystems/MDS AnalyticalTechnologies)进行。以96孔板格式将20μL样品体积(血浆、脑匀浆液)进行蛋白质沉淀，同时用甲醇水溶液提取。使用内标(外标与内标的比率)和外部校准进行高精确性定量。数据使用Analyst 1.4.2软件(Applied Biosystems)进行定量，并最后输出用于统计分析。
详细实施例
由于分析代谢物组学数据的许多可能性，我们选择了几种策略来挑选最稳定的被分析物。一方面，我们使用基于变差系数(CV)和标准偏差(SD)的用于选择的直接方法。另一方面，我们改造了来自实时定量RT-PCR的算法，并证实了这些方法在代谢物组学的情形中也能良好发挥作用。在实时定量RT-PCR的架构中，使用持家基因进行归一化沿用已久，并存在相当多的可用于持家基因(参比基因)选择的方法；参考Vandesompele等，(2009)[Vandesompele J.，Kubista M.和PfaffiM.W.(2009).用于改进归一化的参比基因验证软件(Reference GeneValidation Software for Improved Normalization)，在《实时PCR：当前技术和应用》(Real-Time PCR：Current Technology and Applications)中，Caister Academic Press.主编：Logan J.，Edwards K.和Saunders N.]。
在选择持家被分析物后，我们在第二步中证实了通过持家被分析物进行的代谢物组学数据归一化工作良好，并提高了统计分析的能力。
表1a：靶代谢物的常用和系统名称
Figure BDA0000128596270000491
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表1b：CAS编号和具有相同结构的靶代谢物种类
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Figure BDA0000128596270000781
表1a和1b概述了所分析的靶代谢物和相应的缩写，所述缩写对于下面的表格也有效；甘油磷脂根据甘油组成部分中的酯(a)和醚(e)键的存在进一步区分，其中两个字母(aa、ea或ee)表示甘油支架的第一和第二位置与脂肪酸残基结合，而单字母(a或e)表示只与一个脂肪酸残基成键；例如PC_ea_33:1表示缩醛磷脂磷脂酰胆碱，其在两个脂肪酸侧链中具有33个碳，并在其中之一中具有单个双键。在化合物名称末端处的指示“.K1或.K2”是由申请人使用的内部名称，其不具有化学意义。
1.窒息
对小猪进行窒息。为了“模拟”产时窒息，我们通过向小猪通入8％氧气并添加CO2以将整个身体暴露于低氧，来获得高碳酸血症。作为高碳酸血性缺氧的结果而发生低血压，并将其用于引起缺血性损伤。
实验程序：
实验方案得到国家动物研究管理局(National Animal ResearchAuthority)(NARA)批准。动物按照欧洲实验动物使用准则(EuropeanGuidelines for Use of Experimental Animals)进行护理和操作。挪威动物研究委员会(Norwegian Council for Animal Research)批准了实验方案。动物按照由FELASA(欧洲实验室动物科学联合会联盟(Federationof European Laboratory Animals Science Association))认证的欧洲实验动物使用准则(European Guidelines for Use of Experimental Animals)进行护理和操作。研究中包含了32只新生Noroc(LYxLD)猪(12-36时龄)。此外，我们使由6只新生猪构成的参比组经历所有程序。
a.手术准备和麻醉
通过给药5％的七氟烷(Sevorane，Abbott)来诱导麻醉；将耳静脉插管，通过静脉内快速浓注向小猪给药15mg/kg戊巴比妥钠和50μg/kg芬太尼。将小猪经口插管然后仰面放置，并进行无菌清洗程序。通过使用IVAC P2000输注泵连续输注芬太尼(50μg/kg/h)和咪达唑仑(0.25mg/kg/h)混合物以提供每种药物1ml/kg/h来维持麻醉。在需要时添加芬太尼(10μg/kg)、咪达唑仑(1mg/kg)或戊巴比妥(2.5mg/kg)的大丸剂(对药物的需要被定义为颤抖、触发呼吸器、通过四肢的被动运动评估的紧张度增加、血压和/或脉搏增加)。在缺氧之前以及从复苏开始后15分钟并在整个实验过程中，提供连续IV输注(Salidex：0.3％盐水和3.5％葡萄糖，10mL/kg/h)。
将小猪用压力控制的换气机(Babylog 8000+；
Figure BDA0000128596270000791
Lübeck，德国)进行换气。通过调整吸气压峰值或换气率来获得正常换气(动脉二氧化碳张力(PaCO2)4.5-5.5kPa)和6-8mL/kg的潮气量。换气率为15-40次呼吸/min。在整个实验过程中保持恒定的0.4s的吸气时间和4.5cm H2O的呼气末正压。连续监测O2吸入分数和潮气末CO2(Datex Normocap Oxy；Datex，Helsinki，芬兰)。
用聚乙烯导管(Porex PE-50，内径为0.58mm；Porex Ltd Hythe，Kent，UK)对左股动脉进行插管。使用BioPac系统MP150-CE连续测量左股动脉中的平均动脉血压(MABP)。使用加热毯和辐射热灯将直肠温度维持在38.5至39.5℃之间。在手术后允许稳定1小时。在实验结束时，向小猪静脉内给药过量的150mg/kg戊巴比妥。(在15(30Gr 3)和60分钟时进行眼摘除)。
实验流程：
通过用8％O2在N2中的气体混合物进行换气直至平均动脉血压降低至20mm Hg或碱剩余(BE)达到-20mM，来获得血氧不足。在血氧不足期间加入CO2使PaCO2为8.0-9.5kPa，以模拟出生前窒息。在复苏开始之前，将低氧小猪随机分组，使用21％或100％氧气复苏15分钟，然后用室内空气换气45分钟(第1和2组)或接收100％氧气60分钟(第3组)。在复氧开始后，将小猪保持血碳酸正常(PaCO2 4.5-5.5kPa)。在整个实验过程中，对血压、饱和度、脉搏、体温和血气测量值进行连续监视。在基线和结束时在HemoCue Hb 201+(HemoCue AB，Angelholm，瑞典)上测量血红蛋白。在整个实验过程中，在血气分析仪860(Ciba Corning Diagnostics，Midfield，Mass.，USA)上定期测量温度校正的动脉酸/碱状态和葡萄糖。在低氧开始之前、低氧结束时和复氧开始后60分钟抽取用于代谢物组学的血样，并按照Biocrates的流程进行操作。血浆或血清按照标准流程进行制备，然后储存在-70℃下直至进行后续分析。将从股动脉导管获得的所有血样用1.5倍抽取体积的盐水替换。在低氧结束后1小时，向动物提供过量戊巴比妥(150mg/kgiv)。研究人员和实验室工作溶液对于复苏所使用的氧气百分率不知情。
通过LC-MS/MS测定和定量生物样品中的氧甾酮
氧甾酮通过HPLC-串联质谱(HPLC-API-MS/MS)，在正检测方式下使用多反应方式(MRM)来测定。
将20μL样品、校准物或内标混合物置于捕获板中，并通过加入200μL乙腈和离心来进行蛋白质沉淀。将180μL适合的上清液转移到带有7mm滤膜斑并在氮气流下干燥的新的过滤板上。通过加入100μL0.35M KOH在95％EtOH中的溶液，然后在暗处温育2小时，来水解被分析物。将反应混合物干燥，并用200μL水清洗三次。用100μL 90％MeOH水溶液提取氧甾酮。将20μL提取的样品注射到HPLC-MS/MS系统上。通过以0.3mL/min的流速使用Zorbax Eclipse XDB C18，150x 2.0mm，3.5μm HPLC柱，然后在API4000串联质谱仪上进行电喷雾电离，来进行层析分离和检测。对于定量来说，使用来自Applied Bioystems的被分析物定量软件(Analyst Quantitation software)。
持家被分析物的选择
我们使用32只小猪在每个时间点SA(窒息开始)、EA(窒息结束)和ER(复苏结束)的数据。
在第一步周，我们使用原始数据并通过变差系数(CV)对被分析物进行分类，所述变差系数被定义为标准偏差(SD)与平均值的比率，即CV＝SD/平均值。表2显示了具有最小CV的前20种被分析物。此外，我们提供了原始浓度的SD和平均值。
表2：具有最小CV的前20种被分析物(基于原始数据)
因为人们通常将对数变换的被分析物浓度用于进一步分析，其中对数变换被用于使变差稳定并获得至少近似正态分布的数据，因此我们在第二步中计算了对数变换数据的平均值和SD。当然，人们也能使用其他变换，例如Box-Cox幂变换[Box G.E.P.和Cox D.R.(1964)变换的分析(与讨论)(An analysis of transformations(with discussion))，Journalof the Royal Statistical Society B，26，211-252.]、通过vsn的广义对数变换[Huber W.，von Heydebreck A.，Sueltmann H.，Poustka A.，Vingron M.(2002).应用于微阵列数据校准和差异表达定量的方差稳定化(Variancestabilization applied to microarray data calibration and to the quantificationof differential expression)，Bioinformatics 18 Suppl.1 S96-S104.]或通过vst的广义对数变换[Lin S.M.，Du P.，Huber W.，Kibbe，W.A.(2008).用于Illumina微阵列数据的基于模型的方差稳定化变换(Model-basedvariance-stabilizing transformation for Illumina microarray data)，NucleicAcids Research，Vol.36，No.2 e11.]，或从该步骤中的微阵列归一化公知的一些其他归一化方法。在Affymetrix微阵列数据情况下的归一化方法的比较性调查，提供在Cope等，(2004)[L.M.Cope等(2004).Affymetrix GeneChip表达测量的基准点(A Benchmark for AffymetrixGeneChip Expression Measures)，Bioinformatics 20(3)：323-331]或Irizarry等，(2006)[R.A.Irizarry等(2006).Affymetrix GeneChip表达测量的比较(Comparison of Affymetrix GeneChip Expression Measures)，Bioinformatics 22(7)：789-794]中。图1显示，通过对数变换的变差稳定化工作良好，但是不完美。因此，较低的对数浓度平均值倾向于具有较小的SD。因为我们正在寻找在SD方面具有最小变化性的被分析物，因此我们将对数浓度分成三个部分(低、中、高)，以避免仅获得具有低浓度的被分析物。如果被分析物的平均浓度小于0.5(即log2-浓度的平均值＜-1)，将其分类为低浓度；如果它们的平均浓度在0.5至4之间(即log2-浓度的平均值在-1至2之间)，分类为中浓度；如果它们的平均浓度大于4(即log2-浓度的平均值＞2)，分类为高浓度。这产生了如图1中所示的三个近似相等的大组。当然，组的选择是相当随意的，人们可以相应地使用其他截止值和更多的组。对于低、中和高浓度被分析物分别选择10种排序最高、即具有最低SD值的被分析物，我们获得了在表3中描述的被分析物。
Figure BDA0000128596270000831
Figure BDA0000128596270000841
表3：每种情况下，即分别对于低、中和高浓度被分析物来说，10种排序最高、即具有最小SD的被分析物(基于对数变换的数据)。
除了上述的直接方法之外，我们还使用了在实时定量RT-PCR数据的情况下对于鉴定持家基因(参比基因)来说已知工作良好的两种算法。首先，我们使用Vandesompele等的方法[Vandesompele等(2002).通过多种内部对照基因的几何平均对实时定量RT-PCR数据进行精确归一化(Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data bygeometric averaging of multiple internal control genes)，Genome Biology，3(7)：research0034.1-0034.11.]，其被称为geNorm。也就是说，我们通过由Vandesompele等引入的稳定性量度M对被分析物进行排序，并在每个步骤中移除具有最大M值、即最低稳定性的被分析物。因为geNorm方法是基于被分析物比率，因此不能对两种最稳定的被分析物进行排序。geNorm按照浓度情况的相似性对被分析物进行排序。因此，结果与其他选择方法的结果相当不同(参见表6)，并表明存在两组被分析物，它们具有非常类似的浓度情况并因此主导了选择方法；参见表4，其中描述了20种排序最高的被分析物。
Figure BDA0000128596270000842
Figure BDA0000128596270000851
表4：使用geNorm排序最高的20种被分析物。
最后，我们使用由Andersen等(2004)引入的方法[Andersen等，(2004).实时定量反转录-PCR数据的归一化：鉴定适合于归一化的基因、应用于膀胱和结肠癌数据集的基于模型的变差估算方法(Normalization of Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCRData：A Model-Based Variance Estimation Approach to Identify GenesSuited for Normalization，Applied to Bladder and Colon Cancer DataSets)，Cancer Research 64：5245-5250.]，其被称为NormFinder。也就是说，我们通过由Andersen等引入的稳定性量度rho对被分析物进行排序，其中在每个步骤中，在以前选择的被分析物中添加具有最低rho值、即最高稳定性的被分析物。NormFinder方法将被分析物浓度的组间和组内变化性考虑在内，其中我们考虑了组(时间点)SA(窒息开始)、EA(窒息结束)和ER(复苏结束)。
表5显示了排序最高的50种被分析物。
Figure BDA0000128596270000861
Figure BDA0000128596270000871
表5：使用NormFinder排序最高的50种被分析物。
表6显示了通过四种不同方法中的至少一种选择的所有被分析物的总结，其中选择用“真实”标出。有几种被分析物被两种或甚至三种方法同时选中。
Figure BDA0000128596270000881
Figure BDA0000128596270000891
Figure BDA0000128596270000901
表6：所选被分析物的总结。“真实”表示被分析物通过相应的算法被选中。
统计分析
我们使用成对t-检验来比较三个组(时间点)SA(窒息开始)、EA(窒息结束)和ER(复苏结束)，并通过Bonferroni-Holm的方法来调整这三个成对比较的p值[Holm，S.(1979).简单的顺序拒绝检验方法(A simple sequentially rejective multiple test procedure)，ScandinavianJournal of Statistics 6：65-70]。将获得的调整过的p值通过Benjamini和Hochberg(1995)的方法进一步调整，用于检验多种被分析物[BenjaminiY.和Hochberg Y.(1995).控制假发现率：多重检验的实用有力方法(Controlling the false discovery rate：a practical and powerful approachto multiple testing)，Journal of the Royal Statistical Society Series B57：289-300]。作为持家被分析物，我们使用了通过NormFinder算法排序靠前的C8.K1、C6(C4:1-DC).K1、PC aa C26:0.K1。我们比较了对数变换数据和持家(HK)归一化的对数变换数据的结果。利用持家被分析物的归一化，通过从其他被分析物的对数变换的浓度中减去三种所选持家被分析物的对数变换浓度的平均值来进行；即根据原始浓度来说，这意味着我们使用所有被分析物(除了持家被分析物之外)的原始浓度与持家被分析物的几何平均值之间的比率的对数进行统计分析。图2-4中的维恩图是基于调整过的p值小于0.01的所有代谢物，并且显示出在三个成对比较的结果之间存在很大一致性。然而，在所有情形中，在HK归一化的对数变换数据的情况下检测到更显著的差异，表明使用HK归一化的对数变换数据导致统计分析的能力增加。
能力增加的假设通过曲线下面积(AUC)的计算得到证实；即对于每个成对比较和每种被分析物来说，我们计算了AUC，其是单个被分析物的预测能力的度量。在本分析中包含的216种被分析物中，142种(SA对EA)、158种(EA对ER)和131种(SA对ER)在HK归一化的对数变换数据的情况下具有较大AUC。相应的比例分别为65.7％(p＜0.001)、73.1％(p＜0.001)和60.6％(p＝0.002)，与50％显著不同(即更大)。同时，最大AUC保持近似相同，对于SA对EA、EA对ER和SA对ER来说分别为0.915(对数数据)对0.912(HK)、0.881(对数数据)对0.867(HK)和0.889(对数数据)对0.887(HK)。因此，这再一次说明通过使用HK归一化的对数变换数据代替对数变换数据，统计分析的能力得以提高。
2.脂多糖(LPS)
在绵羊血浆中，在各个时间点0h，2h，...，240h，使用LPS与对照的比较这种用于哺乳动物免疫应答的公知动物模型，调查了宿主对病原体的应答。
在全身麻醉(1.5％异氟烷在O2中)下，使用无菌技术(Mallard等，2003)对12只处于妊娠97-99天(妊娠期＝147天)的胎绵羊安装器械。使用Stesolid(0.1-0.2mg/kg，iv)作为先期药物，通过硫喷妥钠(13mg/kg，iv)诱导麻醉，然后插管。在手术时和术后前两天期间给药丁基原啡因(0.01mg/kg，iv)。通过子宫壁，平行于任何血管，在胎羊头部上方进行进行小的子宫切开术。将聚乙烯导管置于两个腋动脉、一个腋静脉和羊膜腔内。暴露出覆盖着矢状窦旁皮层的胎羊头皮，通过颅骨钻出两个两侧孔，但是避开前囟前端5和15mm处和中线侧面0.5mm处的硬膜。通过钻孔锥的孔插入两对EEG电极(P/N Ag7/40T，Leico Ind，Medwire
Figure BDA0000128596270000921
MT.Vernon，NY)，并使用小橡胶圆盘用氰基丙烯酸酯胶粘固定到颅骨上，并将皮瓣粘回在电极上方。将参比电极皮下放置在EEG电极前方，并将一个接地电极皮下置于颈中。在手术结束时，用50E/ml肝素的盐水溶液填充导管。将子宫封闭在两层中，将导管和电极拉出体外。将一根导管置于母羊的跗静脉中。在手术后，将母羊饲养在单独笼子中，使其自由取用食物和水。在实验之前，允许动物从手术恢复至少4天，在此期间每天一次向母羊静脉内(i.v.)给药抗生素(庆大霉素，5mg/kg)。这些研究得到
Figure BDA0000128596270000922
大学动物伦理委员会(Animal Ethical Committee of the University of)的批准(伦理号：307-2006)。
实验步骤
在101-106天(妊娠期＝145天)时，将长期装有器械的胎绵羊随机分派以接受iv介质(盐水，n＝5)或脂多糖(LPS，Sigma O55:B5，200ng，n＝7)快速浓注。在注射前至少12小时和注射后10天中，在BIOPAC系统(MPAl50)上连续记录胎羊动脉血压平均值(MAP)和羊膜腔压力。在LPS注射之前和之后，使用临床BRM2 BrainZ监测器(新西兰)记录EEG数据。将血样(1ml)收集在冰上，用于血气分析(pH、pCO2 kPa、SO2％、葡萄糖mmol/l和乳酸mmol/l，RadiometerABL 725，Copenhagen，丹麦)。将剩余的血液离心，并将血清立即冷冻并储存在-80℃，用于下述的进一步分析。
持家被分析物的选择
我们使用了12只绵羊的数据，其中数据在注射后0h、2h、6h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h和240h时获得。
在第一步中，我们使用原始数据并通过变差系数(CV)对被分析物进行分类，所述变差系数被定义为标准偏差(SD)与平均值的比率，即CV＝SD/平均值。表7显示了具有最小CV的前20种被分析物。此外，我们给出了原始浓度的SD和平均值。
Figure BDA0000128596270000931
Figure BDA0000128596270000941
表7：具有最小CV的前20种被分析物(基于原始数据)
因为人们通常将对数变换的被分析物浓度用于进一步分析，其中对数变换被用于使变差稳定并获得至少近似正态分布的数据，因此我们在第二步中计算了对数变换数据的平均值和SD。当然，人们也能使用其他变换，例如Box-Cox幂变换[Box G.E.P.和Cox D.R.(1964)变换的分析(与讨论)(An analysis of transformations(with discussion))，Journal ofthe Royal Statistical Society B，26，211-252.]、通过vsn的广义对数变换[Huber W.，von Heydebreck A.，Sueltmann H.，Poustka A.，Vingron M.(2002).应用于微阵列数据校准和差异表达定量的方差稳定化(Variance stabilization applied to microarray data calibration and to thequantification of differential expression)，Bioinformatics 18 Suppl.1S96-S104.]或通过vst的广义对数变换[Lin S.M.，Du P.，Huber W.，Kibbe，W.A.(2008).用于Illumina微阵列数据的基于模型的方差稳定化变换(Model-based variance-stabilizing transformation for Illuminamicroarray data)，Nucleic Acids Research，Vol.36，No.2e11.]，或从该步骤中的微阵列归一化公知的一些其他归一化方法。在Affymetrix微阵列数据情况下的归一化方法的比较性调查，提供在Cope等，(2004)[L.M.Cope等(2004).Affymetrix GeneChip表达测量的基准点(ABenchmark for Affymetrix GeneChip Expression Measures)，Bioinformatics 20(3)：323-331]或Irizarry等，(2006)[R.A.Irizarry等(2006).Affymetrix GeneChip表达测量的比较(Comparison of AffymetrixGeneChip Expression Measures)，Bioinformatics 22(7)：789-794]中。图5显示变差稳定化工作良好，但是不完美。因此，较低的对数浓度平均值倾向于具有较小的SD。因为我们对具有最小SD的被分析物感兴趣，因此我们将对数浓度分成三个部分(低、中、高)，以避免仅获得具有低浓度的被分析物。如果被分析物的平均浓度小于0.5(即log2-浓度的平均值＜-1)，将其分类为低浓度；如果它们的平均浓度在0.5至4之间(即log2-浓度的平均值在-1至2之间)，分类为中浓度；如果它们的平均浓度大于4(即log2-浓度的平均值＞2)，分类为高浓度。当然，组的选择是相当随意的，人们可以相应地使用其他截止值和更多的组。对于低、中和高浓度被分析物分别选择10种排序最高、即具有最低SD值的被分析物，我们获得了在表8中描述的被分析物。
Figure BDA0000128596270000951
Figure BDA0000128596270000961
表8：每种情况下，即分别对于低、中和高浓度被分析物来说，10种排序最高、即具有最小SD的被分析物(基于对数变换的数据)。
除了上述的直接方法之外，我们还使用了在实时定量RT-PCR数据的情况下对于鉴定持家基因(参比基因)来说已知工作良好的两种算法。首先，我们使用Vandesompele等的方法[Vandesompele等(2002).通过多种内部对照基因的几何平均对实时定量RT-PCR数据进行精确归一化(Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data bygeometric averaging of multiple internal control genes)，Genome Biology，3(7)：research0034.1-0034.11.]，其被称为geNorm。也就是说，我们通过由Vandesompele等引入的稳定性量度M对被分析物进行排序，并在每个步骤中移除具有最大M值、即最低稳定性的被分析物。因为geNorm方法是基于被分析物比率，因此不能对两种最稳定的被分析物进行排序。geNorm按照浓度情况的相似性对被分析物进行排序。因此，结果与其他选择方法的结果相当不同(参见表11)，并表明存在三组被分析物，它们具有非常类似的浓度情况并因此主导了选择方法；参见表9，其中描述了20种排序最高的被分析物。
Figure BDA0000128596270000971
表9：使用geNorm排序最高的20种被分析物。
最后，我们使用由Andersen等(2004)引入的方法[Andersen等，(2004).实时定量反转录-PCR数据的归一化：鉴定适合于归一化的基因、应用于膀胱和结肠癌数据集的基于模型的变差估算方法(Normalization of Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCRData：A Model-Based Variance Estimation Approach to Identify GenesSuited for Normalization，Applied to Bladder and Colon Cancer DataSets)，Cancer Research 64：5245-5250.]，其被称为NormFinder。也就是说，我们通过由Andersen等引入的稳定性量度rho对被分析物进行排序，其中在每个步骤中，在以前选择的被分析物中添加具有最低rho值、即最高稳定性的被分析物。NormFinder方法将被分析物浓度的组间和组内变化性考虑在内，其中我们考虑了在时间点0h、2h、6h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h、240h处的组LPS(LPS处理的动物)和对照，并获得了26个不同组。表10显示了排序最高的50种被分析物。
Figure BDA0000128596270000981
Figure BDA0000128596270000991
Figure BDA0000128596270001001
表10：使用NormFinder排序最高的50种被分析物。
表11显示了通过四种不同方法中的至少一种选择的所有被分析物的总结，其中选择用“真实”标出。有几种被分析物被两种或甚至三种方法同时选中。
Figure BDA0000128596270001002
Figure BDA0000128596270001011
Figure BDA0000128596270001021
Figure BDA0000128596270001031
表11：所选被分析物的总结。“真实”表示被分析物通过相应的算法被选中。
统计分析
我们使用具有自回归和异质性方差结构的线性模型来分析数据。将获得的p值通过Benjamini和Hochberg(1995)的方法进行校正[Benjamini Y.和Hochberg Y.(1995).控制假发现率：多重检验的实用有力方法(Controlling the false discovery rate：a practical and powerfulapproach to multiple testing)，Journal of the Royal Statistical SocietySeries B 57：289-300]。作为持家被分析物，我们使用了通过geNorm算法排序靠前的SM C 16:0.K1、PC aa C38:1.K1和SM(OH)C22:2.K1。我们比较了对数变换数据和持家(HK)归一化的对数变换数据的结果。利用持家被分析物的归一化，通过从其他被分析物的对数变换的浓度中减去三种所选持家被分析物的对数变换浓度的平均值来进行；即根据原始浓度来说，这意味着我们使用所有被分析物(除了持家被分析物之外)的原始浓度与持家被分析物的几何平均值之间的比率的对数进行统计分析。图6-8中的维恩图是基于调整过的p值小于0.01的所有代谢物。在所有情形中，在HK归一化的对数变换数据的情况下检测到更显著的差异，表明使用HK归一化的对数变换数据导致统计分析的能力增加。
能力增加的假设通过曲线下面积(AUC)的计算得到证实。对于LPS与对照的比较来说，我们计算了AUC，其是每种被分析物的预测能力的度量。在本分析中包含的193种被分析物中，127种在HK归一化的对数变换数据的情况下具有较大AUC。相应的比例65.8％(p＜0.001)与50％显著不同(即更大)。此外，最大AUC从0.798(对数数据)增加至0.892(HK)。因此，这再一次说明通过使用HK归一化的对数变换数据代替对数变换数据，统计分析的能力得以提高。
3.大鼠——脑数据
动物模型HI脑损伤：在出生后的第7天(P7)根据Rice-Vanucci的方法进行HI脑损伤模型的建立。通过吸入异氟烷(3％用于诱导麻醉，1.5％用于维持)将任意性别的Sprague-Dawley大鼠幼仔(来自CharlesRiver，Wilmington，MA，U.S.A.)进行麻醉。通过中线切开评估右侧颈动脉，并使用双重缝线和永久切口进行手术结扎。过程在室温(23-25℃)下进行。在颈部伤口封闭后，将幼仔放回其雌亲处2小时。整个手术过程持续不超过10分钟。然后将幼仔暴露于8％氧气的低氧下100分钟。模拟手术的动物经历相同的麻醉过程和颈部切开和血管操作，但是没有结扎或低氧。对照动物保持不受任何伤害。i)在低氧后立即(P7)、ii)24小时后(P8)、iii)5天后(P12)将动物安乐死，收集大脑右半球并储存在-80℃直至进一步制备。所有动物的干预和时间点是随机的。
持家被分析物的选择
我们使用了150只大鼠的数据，其中数据在处理后的时间点P7、P8和P12时从Op、假物和对照组获得，并且它在雄性与雌性之间以及左右半球之间进行区分。
在第一步中，我们使用了原始数据，并通过变差系数(CV)对被分析物进行分类，所述变差系数被定义为标准偏差(SD)与平均值的比率，即CV＝SD/平均值。表12显示了具有最小CV的前20种被分析物。此外我们给出了原始浓度的SD和平均值。
Figure BDA0000128596270001051
表12：具有最小CV的前20种被分析物(基于原始数据)。
因为人们通常将对数变换的被分析物浓度用于进一步分析，其中对数变换被用于使变差稳定并获得至少近似正态分布的数据，因此我们在第二步中计算了对数变换数据的平均值和SD。当然，人们也能使用其他变换，例如Box-Cox幂变换[Box G.E.P.和Cox D.R.(1964)变换的分析(与讨论)(An analysis of transformations(with discussion))，Journal of the Royal Statistical Society B，26，211-252.]、通过vsn的广义对数变换[Huber W.，von Heydebreck A.，Sueltmann H.，Poustka A.，Vingron M.(2002).应用于微阵列数据校准和差异表达定量的方差稳定化(Variance stabilization applied to microarray data calibration and to thequantification of differential expression)，Bioinformatics 18 Suppl.1S96-S104.]或通过vst的广义对数变换[Lin S.M.，Du P.，Huber W.，Kibbe，W.A.(2008).用于Illumina微阵列数据的基于模型的方差稳定化变换(Model-based variance-stabilizing transformation for Illuminamicroarray data)，Nucleic Acids Research，Vol.36，No.2e11.]，或从该步骤中的微阵列归一化公知的一些其他归一化方法。在Affymetrix微阵列数据情况下的归一化方法的比较性调查，提供在Cope等，(2004)[L.M.Cope等(2004).Affymetrix GeneChip表达测量的基准点(ABenchmark for Affymetrix GeneChip Expression Measures)，Bioinformatics 20(3)：323-331]或Irizarry等，(2006)[R.A.Irizarry等(2006).Affymetrix GeneChip表达测量的比较(Comparison of AffymetrixGeneChip Expression Measures)，Bioinformatics 22(7)：789-794]中。图9显示变差稳定化工作良好，但是不完美。因此，较低的对数浓度平均值倾向于具有较小的SD。因为我们对具有最小SD的被分析物感兴趣，因此我们将对数浓度分成三个部分(低、中、高)，以避免仅获得具有低浓度的被分析物。如果被分析物的平均浓度小于0.5(即log2-浓度的平均值＜-1)，将其分类为低浓度；如果它们的平均浓度在0.5至4之间(即log2-浓度的平均值在-1至2之间)，分类为中浓度；如果它们的平均浓度大于4(即log2-浓度的平均值＞2)，分类为高浓度。当然，组的选择是相当随意的，人们可以相应地使用其他截止值和更多的组。对于低、中和高浓度被分析物分别选择10种排序最高、即具有最低SD值的被分析物，我们获得了在表13中描述的被分析物。
Figure BDA0000128596270001061
Figure BDA0000128596270001071
表13：每种情况下，即分别对于低、中和高浓度被分析物来说，10种排序最高、即具有最小SD的被分析物(基于对数变换的数据)。
除了上述的直接方法之外，我们还使用了在实时定量RT-PCR数据的情况下对于鉴定持家基因(参比基因)来说已知工作良好的两种算法。首先，我们使用Vandesompele等的方法[Vandesompele等(2002).通过多种内部对照基因的几何平均对实时定量RT-PCR数据进行精确归一化(Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data bygeometric averaging of multiple internal control genes)，Genome Biology，3(7)：research0034.1-0034.11.]，其被称为geNorm。也就是说，我们通过由Vandesompele等引入的稳定性量度M对被分析物进行排序，并在每个步骤中移除具有最大M值、即最低稳定性的被分析物。因为geNorm方法是基于被分析物比率，因此不能对两种最稳定的被分析物进行排序。geNorm按照浓度情况的相似性对被分析物进行排序。因此，结果与其他选择方法的结果相当不同(参见表16)，并表明存在一组被分析物，其中被分析物具有非常类似的浓度情况并因此主导了选择方法；参见表14，其中描述了20种排序最高的被分析物。
Figure BDA0000128596270001081
Figure BDA0000128596270001091
表14：使用geNorm排序最高的20种被分析物。
最后，我们使用由Andersen等(2004)引入的方法[Andersen等，(2004).实时定量反转录-PCR数据的归一化：鉴定适合于归一化的基因、应用于膀胱和结肠癌数据集的基于模型的变差估算方法(Normalization of Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCRData：A Model-Based Variance Estimation Approach to Identify GenesSuited for Normalization，Applied to Bladder and Colon Cancer DataSets)，Cancer Research 64：5245-5250.]，其被称为NormFinder。也就是说，我们通过由Andersen等引入的稳定性量度rho对被分析物进行排序，其中在每个步骤中，在以前选择的被分析物中添加具有最低rho值、即最高稳定性的被分析物。NormFinder方法将被分析物浓度的组间和组内变化性考虑在内，其中我们考虑了在治疗后的时间点P7、P8和P12时的Op、假物和对照组，并在雄性与雌性之间以及左右半球之间进行区分。总的来说，这产生了31个不同的组。表15显示了排序最高的50种被分析物。
Figure BDA0000128596270001092
Figure BDA0000128596270001111
表15：使用NormFinder排序最高的50种被分析物。
表16显示了通过四种不同方法中的至少一种选择的所有被分析物的总结，其中选择用“真实”标出。有几种被分析物被两种或甚至三种方法同时选中。
Figure BDA0000128596270001112
Figure BDA0000128596270001121
Figure BDA0000128596270001131
Figure BDA0000128596270001141
表16：所选被分析物的总结。“真实”表示被分析物通过相应的算法被选中。
统计分析
我们只分析了数据的一个子集。我们选择了时间点P7和右半球，并调查了处理和性别的影响。以前的分析显示没有显著的性别影响。因此，我们忽略了性别，并使用原始浓度和HK归一化的原始浓度执行Kruskal-Wallis检验(非参数单因子ANOVA)。将获得的p值通过Benjamini和Hochberg(1995)的方法进行校正[Benjamini Y.和HochbergY.(1995).控制假发现率：多重检验的实用有力方法(Controlling thefalse discovery rate：a practical and powerful approach to multipletesting)，Journal of the Royal Statistical Society Series B 57：289-300]。作为持家被分析物，我们使用了对于原始浓度的CV来说前5位的被分析物PC aa C26:0.K1、lysoPC a C26:1.K1、lysoPC a C14:0.K1、C10.K1和C8:1.K1。我们比较了原始和持家(HK)归一化的原始数据的结果。利用持家被分析物的归一化，通过用被分析物(除了5种持家被分析物之外)的原始浓度除以5种所选持家被分析物的几何平均值来进行。图10中的维恩图是基于调整过的p值小于0.01的所有代谢物。两种方法的结果一致性非常好，就更显著的差异来说，在HK归一化的原始数据情况下略有优势。这表明使用HK归一化的原始数据导致统计分析的能力增加。
能力增加的假设通过曲线下面积(AUC)的计算得到证实。对于Op与假物的比较来说，我们计算了AUC，其是每种被分析物的预测能力的度量。在本分析中包含的266种被分析物中，153种在HK归一化的对数变换数据的情况下具有较大AUC。相应的比例为74.3％(p＜0.001)，与50％显著不同(即更大)。在两种情况下最大AUC最大，即等于1.000，其中在对数变换数据的情况下15种被分析物达到最大值，在HK归一化的对数变换数据的情况下16种被分析物达到最大值。因此，这些结果再一次说明通过使用HK归一化的对数变换数据代替对数变换数据，统计分析的能力得以提高。
4.人类——血浆数据
持家被分析物的选择
我们使用了80个对象的数据，其中数据通过14位肺炎患者、45位混合脓毒症患者和21位对照获得。
按照实施例1至3中所述，分析100μl血清样品中的靶代谢物。
在第一步中，我们使用了原始数据，并通过变差系数(CV)对被分析物进行分类，所述变差系数被定义为标准偏差(SD)与平均值的比率，即CV＝SD/平均值。表17显示了具有最小CV的前20种被分析物。此外我们给出了原始浓度的SD和平均值。
Figure BDA0000128596270001161
Figure BDA0000128596270001171
表17：具有最小CV的前20种被分析物(基于原始数据)。
因为人们通常将对数变换的被分析物浓度用于进一步分析，其中对数变换被用于使变差稳定并获得至少近似正态分布的数据，因此我们在第二步中计算了对数变换数据的平均值和SD。当然，人们也能使用其他变换，例如Box-Cox幂变换[Box G.E.P.和Cox D.R.(1964)变换的分析(与讨论)(An analysis of transformations(with discussion))，Journal ofthe Royal Statistical Society B，26，211-252.]、通过vsn的广义对数变换[Huber W.，von Heydebreck A.，Sueltmann H.，Poustka A.，Vingron M.(2002).应用于微阵列数据校准和差异表达定量的方差稳定化(Variance stabilization applied to microarray data calibration and to thequantification of differential expression)，Bioinformatics 18 Suppl.1S96-S104.]或通过vst的广义对数变换[Lin S.M.，Du P.，Huber W.，Kibbe，W.A.(2008).用于Illumina微阵列数据的基于模型的方差稳定化变换(Model-based variance-stabilizing transformation for Illuminamicroarray data)，Nucleic Acids Research，Vol.36，No.2e11.]，或从该步骤中的微阵列归一化公知的一些其他归一化方法。在Affymetrix微阵列数据情况下的归一化方法的比较性调查，提供在Cope等，(2004)[L.M.Cope等(2004).Affymetrix GeneChip表达测量的基准点(ABenchmark for Affymetrix GeneChip Expression Measures)，Bioinformatics 20(3)：323-331]或Irizarry等，(2006)[R.A.Irizarry等(2006).Affymetrix GeneChip表达测量的比较(Comparison of AffymetrixGeneChip Expression Measures)，Bioinformatics 22(7)：789-794]中。图11显示变差稳定化工作良好，但是不完美。因此我们与以前的实施例中相同将对数浓度分成三个部分(低、中、高)。如果被分析物的平均浓度小于0.5(即log2-浓度的平均值＜-1)，将其分类为低浓度；如果它们的平均浓度在0.5至4之间(即log2-浓度的平均值在-1至2之间)，分类为中浓度；如果它们的平均浓度大于4(即log2-浓度的平均值＞2)，分类为高浓度。当然，组的选择是相当随意的，人们可以相应地使用其他截止值和更多的组。对于低、中和高浓度被分析物分别选择10种排序最高、即具有最低SD值的被分析物，我们获得了在表18中描述的被分析物。
Figure BDA0000128596270001181
Figure BDA0000128596270001191
表18：每种情况下，即分别对于低、中和高浓度被分析物来说，10种排序最高、即具有最小SD的被分析物(基于对数变换的数据)。
除了上述的直接方法之外，我们还使用了在实时定量RT-PCR数据的情况下对于鉴定持家基因(参比基因)来说已知工作良好的两种算法。首先，我们使用Vandesompele等的方法[Vandesompele等(2002).通过多种内部对照基因的几何平均对实时定量RT-PCR数据进行精确归一化(Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data bygeometric averaging of multiple internal control genes)，Genome Biology，3(7)：research0034.1-0034.11.]，其被称为geNorm。也就是说，我们通过由Vandesompele等引入的稳定性量度M对被分析物进行排序，并在每个步骤中移除具有最大M值、即最低稳定性的被分析物。因为geNorm方法是基于被分析物比率，因此不能对两种最稳定的被分析物进行排序。geNorm按照浓度情况的相似性对被分析物进行排序。因此，结果与其他选择方法的结果相当不同(参见表21)，并表明存在一组被分析物，其中被分析物具有非常类似的浓度情况并因此主导了选择方法；参见表19，其中描述了20种排序最高的被分析物。
Figure BDA0000128596270001192
Figure BDA0000128596270001201
表19：使用geNorm排序最高的20种被分析物。
最后，我们使用由Andersen等(2004)引入的方法[Andersen等，(2004).实时定量反转录-PCR数据的归一化：鉴定适合于归一化的基因、应用于膀胱和结肠癌数据集的基于模型的变差估算方法(Normalization of Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCRData：A Model-Based Variance Estimation Approach to Identify GenesSuited for Normalization，Applied to Bladder and Colon Cancer DataSets)，Cancer Research 64：5245-5250.]，其被称为NormFinder。也就是说，我们通过由Andersen等引入的稳定性量度rho对被分析物进行排序，其中在每个步骤中，在以前选择的被分析物中添加具有最低rho值、即最高稳定性的被分析物。NormFinder方法将被分析物浓度的组间和组内变化性考虑在内，其中我们考虑了肺炎、混合脓毒症和对照组。表20显示了排序最高的50种被分析物。
Figure BDA0000128596270001211
Figure BDA0000128596270001221
表20：使用NormFinder排序最高的50种被分析物。
表21显示了通过四种不同方法中的至少一种选择的所有被分析物的总结，其中选择用“真实”标出。有几种被分析物被两种或甚至三种方法同时选中。
Figure BDA0000128596270001241
Figure BDA0000128596270001251
表21：所选被分析物的总结。“真实”表示被分析物通过相应的算法被选中。
统计分析
我们使用对数变换浓度和HK归一化的对数变换浓度执行Welch改良的单变量ANOVA来分析数据。将获得的p值通过Benjamini和Hochberg(1995)的方法进行校正[Benjamini Y.和Hochberg Y.(1995).控制假发现率：多重检验的实用有力方法(Controlling the falsediscovery rate：a practical and powerful approach to multiple testing)，Journal of the Royal Statistical Society Series B 57：289-300]。作为持家被分析物，我们使用了在中浓度下具有最低SD的前四种被分析物lysoPCa C26:1.K1、PC ae C40:0.K1、PC aa C42:6.K1、PC aa C26:0.K1。我们比较了对数变换数据和持家(HK)归一化的对数变换数据的结果。利用持家被分析物的归一化，通过从其余被分析物的对数变换的浓度中减去四种所选持家被分析物的平均值来进行。图12中的维恩图是基于调整过的p值小于0.01的所有代谢物。两种方法的结果一致性非常好，就更显著的差异来说，在HK归一化的对数变换数据情况下略有优势。这表明使用HK归一化的对数变换数据导致统计分析的能力增加。
能力增加的假设通过曲线下面积(AUC)的计算得到证实。对于对照与肺炎和对照与混合脓毒症的比较来说，我们计算了AUC，其是单个被分析物的预测能力的度量。在本分析中包含的195种被分析物中，106种(对照对肺炎)和128种(对照对混合脓毒症)在HK归一化的对数变换数据的情况下具有较大AUC。对照对混合脓毒症的比例为65.6％(p＜0.001)与50％显著不同(即更大)，对照对肺炎的比例也大于50％(54.3％)，但是与50％没有显著差别。同时，最大AUC对于对照对肺炎来说保持近似相同，分别为0.997(对数数据)对1.000(HK)，对于对照对混合脓毒症来说略微增加，为0.945(对数数据)对0.971(HK)。这些结果再一次说明通过使用HK归一化的对数变换数据代替对数变换数据，统计分析的能力得以提高。
诊断代谢物的鉴定和使用，是基于对照代谢物及其水平不随疾病类型或给定疾病的状态而变，并且不能与健康个体中的对照代谢物水平区分开这一发现和基本特征。这允许定量测定其他代谢物及其随疾病状态的变化，从而确定诊断、预后和疗法控制。
利用对照、参比或持家代谢物进行定量数据归一化提供了几个优点。它能够鉴定在各种健康状态之间或由差异调节代谢物的浓度/水平的疾病或疾病的不同等级/分值所引起的代谢物，并基于这些代谢物开发诊断工具。
本发明提供了能够在样品中用作归一化内源参比或“持家”被分析物或代谢物的被分析物和代谢物的身份。这些被分析物或代谢物的浓度水平，可以有利地用于根据代谢信息的确定来诊断和分类疾病的方法中，并最终应用于来自不同物种、疾病状态和组织的对象样品中。
在一些实施方案中，本发明的内源参比代谢物的子集可以有利地用于不同可变代谢物的归一化，以表征对象的生理或诊断对象中的某种疾病。
因此，内源参比代谢物的应用还包括鉴定响应者和非响应者、疗法控制和最终使用特定响应性代谢物。
本发明方法的特征在于相对于一种或多种内源参比代谢物的量、水平或浓度确定对象样品中一种或多种代谢物或代谢生物标志物的存在与否、量、水平或浓度，以及将该信息用于诊断、预后和疗法控制的能力。
内源参比代谢物可以用作单一内源参比代谢物和值，或组合使用。
在一个实施方案中，所述对照或靶代谢物可用于确定化合物或化合物和药物的混合物的毒性、安全性和效能以及为信号传导途径建立模型的试验中。
本发明还提供了对使用不同测定平台获得的数据进行比较的方法，其中反复进行上述归一化步骤，并使用归一化因子来校正通过用一种给定方法例如质谱术测量测试样品所提供的信号，所述校正使得所述信号可以与通过使用一种或几种可选的代谢物和内源参比代谢物测定方法测定同样的参比代谢物所提供的代谢物信号直接相比，所述可选测定方法例如IR光谱术、NMR光谱术、拉曼光谱术、免疫测定法ELISA、Western印迹，以及使用适体、核苷酸或化学修饰的适体或核苷酸、通过任何可定量信号例如荧光来检测代谢物结合并指示水平的结合测定法。
因此，可以通过本技术领域的专业人员已知的任何测定法来测定数据和代谢物水平，所述测定法例如但不限于红外光谱术、拉曼光谱术、质谱术、ELISA或使用抗体和/或酶和/或核苷酸和/或适体的其他免疫测定法，或通过用于特异性结合代谢物或其识别配对物或将它们固定化到固体支持物，并应用各种检测和可视化方法例如但不限于荧光成像或MRI成像的其他方法。
本发明的方法适合用于高通量筛选实验。
内源参比代谢物可以进行化学修饰或通过本技术领域的专业人员已知的任何适合手段进行标记，所述手段例如用含有反应性化学基团的染料进行标记，例如但不限于与异硫氰酸酯、氰酸酯、酸酐、硫醇、胺、偶氮(N3)基团或氟、活化的酯例如N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，或用花青染料、生物素、地高辛、荧光素、双脱氧核苷酸或任何其他标记物形式进行标记。
另一个实施方案的特征在于使用放射活性标志物或标记物、特别是32P、14C、125I、33P或3H检测对照或靶代谢物。
另一个实施方案的特征在于使用非放射活性可检测标志物，特别是染料或荧光标志物或量子点、酶标志物、免疫标志物或能够通过电信号、特别是内源参比或靶代谢物上的电流、电阻或电容变化检测的标志物。
因此，被分析物的表达也可以使用免疫组织化学技术或使用酶或其他抗体或适体或相关技术介导的检测的测定法来检测，所述测定法仅仅是非限制性的实例。可以使用其他用于被分析物测定分析的手段，包括代谢物的酶或催化性化学转化，或通过拉曼光谱术、IR光谱术、NMR波谱术、UV光谱术和本技术领域的专业人员熟悉的其他光谱技术来检测。这些方法还可以包括例如使用同位素或含有相应同位素例如碳13、氘原子的官能团进行预先或中间化学修饰或标记，或使用荧光或顺磁性标记物进行衍生以便能够使检测和定量方法专门化。
在一些实施方案中，这可以包括特异性标记所有已知或一部分参比代谢物或差异处理或标记内源参比代谢物和可变代谢物。
在阅读了下面本发明优选实施方案的非限制性描述并参考仅作为示例的附图后，本发明的其他目的、优点和特点将变得更加明显。
在另一个实施方案中，可以将内源参比代谢物的水平与代谢物的水平进行比较，其中内源参比代谢物或靶代谢物的值在独立实验中确定，或以校准曲线或校准表的形式使用。
在一些实施方案中，本发明提供了测定来自对象的细胞、组织或体液中的一种或多种代谢物的代谢物水平的方法。方法包含测定一种或多种代谢物的代谢物水平。方法包含测定所述一种或多种代谢物或被分析物的代谢物浓度，并如上所述将所述浓度水平与参比被分析物或代谢物的浓度水平进行比较。
本发明的一种或多种参比被分析物的浓度水平，提供了将来自目标被分析物和代谢物的代谢物组学数据进行归一化，用于与来自样品的数据进行比较的手段。
换句话说，目标代谢物的浓度或相对丰度，以“相对于”本发明的一种或多种参比被分析物的水平的方式计算。归一化也可用于在样品之间进行比较，特别是当它们在独立实验中进行时。有利情况下，本发明的方法可以以试剂盒格式、多孔阵列、基于阵列的格式使用，因此可以同时评估大量代谢物的浓度。本发明的一种或多种参比被分析物也可以作为相同实验的一部分进行评估。
在一些非限制性实施方案中，本发明的内源参比代谢物可用于将对象分类为患病、诊断疾病、将细胞或组织分类为患病、将含有细胞的样品识别为包含(或来自于)某种组织类型或组织来源的肿瘤细胞。分类或诊断是基于样品中多种被分析物的水平或浓度或相对丰度与它们在已证实的患病样品和/或已知的未患病样品中的水平的比较。
当在本文中使用时，“多种”是指两种或以上的状态。这种在分类中的应用将在下面作为非限制性实例的本发明的其他描述中使用。本发明的参比被分析物也可以用于将获取的体液或样品分类为含有来自于组织或器官的细胞，不限于肿瘤细胞。
在其他非限制性实施方案中，本发明针对人类对象进行描述。然而，也可以使用来自其他对象的样品。所必需的只是在多种已知样品中评估代谢物水平或浓度的能力，以便可以比较未知或测试样品中的表达水平。因此，本发明可以应用于可以从其获得多种代谢物和多种已知样品的任何生物体。
在一个优选实施方案中，使用对照代谢物和与靶代谢物的比较来诊断窒息、窒息的严重性和控制窒息的疗法和治疗。
在一个优选实施方案中，使用对照代谢物和与靶代谢物的比较来诊断低氧、缺血、缺血性脑病和中风、产期窒息、气哽、溺水、触电、受伤或吸入有毒气体，和/或确定所述障碍的严重性和/或控制这些病症和疗法和治疗。
此外，利用本发明的方法，首次提供了通过内源代谢物对含氧量正常、低氧和高氧状况和/或含氧量正常和高氧疗法的体外监测进行归一化的方法。这种方法的特征在于使用至少一种内源参比代谢物和哺乳动物对象的至少一种组织的至少一个生物样品。
例如，在某些实施方案中，本发明提供了诊断窒息、低氧或缺氧和/或持续时间/严重性的方法，所述方法包含使用一种或多种(例如2种或以上、3种或以上、5种或以上、10种或以上等)本发明的内源参比代谢物，以多路或组的格式与1种或2种或以上、3种或以上、5种或以上、10种或以上等靶代谢物一起进行测量：检测来自对象的样品(例如组织(例如活检)样品、血液样品、血清样品或尿液样品)中一种或多种(例如2种或以上、3种或以上、5种或以上、10种或以上等)窒息特异性靶代谢物的存在或不存在或对其进行定量(以多路或组的格式测量)；以及根据窒息特异性靶代谢物的归一化值来诊断窒息。
本发明还提供了通过响应性代谢物的优越定量来筛选化合物的方法，所述方法包含：将含有窒息特异性代谢物的动物、组织、细胞与测试化合物相接触；以及使用内源参比代谢物来定量测定窒息特异性代谢物的水平。在某些实施方案中，方法还包含使用所述内源参比代谢物，将存在测试化合物或治疗性干预情况下的窒息特异性代谢物水平与不存在窒息特异性代谢物情况下的窒息特异性代谢物水平进行比较的步骤。在一些实施方案中，细胞在体外、在非人类哺乳动物中或是离体的。在一些实施方案中，测试化合物是小分子或核酸(例如反义核酸、siRNA或miRNA)或氧气/氙气，或抑制参与窒息特异性代谢物的合成或分解的酶的表达的任何神经保护性药物。在一些实施方案中，方法是高通量方法。
在本发明的情形中，“窒息”是指与氧气、氧饱和度缺乏、低氧相关的任何患病状态。窒息可以在产前/产期中由于缺少脐带的氧气供应而诱导，或者可以由与不能呼吸和/或肺通气不足相关的任何病症例如气哽、溺水、触电、受伤或吸入有毒气体所引起。
在一个优选实施方案中，使用对照代谢物和与靶代谢物的比较来诊断对象对细菌片段或细菌细胞壁片段的应答或对细菌片段或细菌细胞壁片段的免疫应答、所述病症的严重性，并用于控制由系统炎症引起的病症的疗法和治疗。
在本发明的优选实施方案中，内源参比代谢物和通过使用这些内源参比代谢物归一化和定量的靶代谢物水平，被用于表征、确定或验证对应于标签“患病”的病理生理状态，对应于标签“健康”的生理状态，或对应于“疾病等级”、“疾病亚型”的不同标签和“限定疾病的分值”的不同值的病理生理状态；所述预后状态对应于标签“良好”、“中等”、“不良”或“治疗响应性”或“非治疗响应性”或“治疗响应性不良”。
本发明方法的特别有用的应用是所述障碍是低氧缺血性脑病、新生儿窒息或系统性炎症或脓毒症或免疫应答，所述哺乳动物对象是人类，所述生物样品是血液，其中丢失数据被推算；
其中代谢物浓度的原始数据使用对数变换进行预处理；
其中使用线性混合效应模型来鉴定差异存在的代谢物；
其中选择随机forest算法作为适合的分类算法，分类算法包括预处理的代谢物浓度的训练，使用分层抽样复制来进行
将所述训练过的随机forests分类器应用于怀疑患有低氧缺血性脑病的对象的所述预处理过的代谢物浓度数据集，并使用训练过的分类器诊断低氧缺血性脑病。
优选情况下，可以从其获得生物样品的组织选自血液和其他体液、脑脊液、尿液、脑组织、神经组织，和/或所述样品是活检样品和/或所述哺乳动物对象包括人类。
在一些实施方案中，基于内源参比代谢物的归一化可用于物种比较、不同组织类型比较、不同哺乳动物物种间的相同组织类型的比较、不同哺乳动物物种间的不同组织类型的比较。因此，本发明的方法和所提供的内源参比代谢物可用于动物模型比较和数据转移，包括数据比较和从动物模型向人类的转移和与其相反的转移，并可用于包括但不限于哺乳动物和人类中的药物开发、诊断和动物诊断学等应用中。
因此，设想了将本发明用于其他样品，作为非限制性实例包括哺乳动物、灵长动物和临床试验中使用的动物(例如大鼠、小鼠、兔、狗、猫和黑猩猩)的样品。本发明使用本文中公开的一种或多种参比被分析物提供了测定法代谢物水平的归一化。因此，分类可以可选地基于测定法被分析物水平与同一样品中参比被分析物的水平的比较相对于或基于已知患病样品和/或已知未患病样品中的相同比较。作为非限制性实例，可以在一组已知患病样品中确定测定法的归一化被分析物水平来提供数据库，并将在来自对象的样品、组织、体液或含细胞样品中检测或测定的归一化被分析物水平与其进行比较。
也可以将样品中的被分析物水平与正常或未患病样品、组织、体液或优选来自同一样品或对象的细胞中的所述被分析物水平进行比较。在本发明的其他实施方案中，可以将被分析物水平与同一样品中的参比被分析物水平进行比较，或者可以使用浓度水平的比率。
除了靶代谢物值之外，方法还可以包含在临床化学和临床监护病房中常用的标准实验室参数，特别是血气优选为动脉血氧气、血液pH、碱状态和乳酸，常规使用的低分子量生物化学化合物、酶、酶活性、细胞表面受体的血清和/或血浆水平，和/或细胞计数、特别是红细胞和/或白细胞计数、血小板计数。
在测定代谢物浓度的多孔板或基于阵列的平台情况下，看到了这种情况的一个非限制性实例，其中也测量了其他代谢物的水平。
来自对照代谢物或源自于对照代谢物水平数据的数据可用于并进一步加工用于软件，或用于专家系统、患者管理系统或远距离诊断系统中，并用于诊断疾病、区分健康与患病对象、鉴定或表征疾病状态、确定疾病的严重性和确定分值，以确定疾病的起源或原因。
对于本技术领域的专业人员来说，显然在所述实施方案中描述的本发明的特点可以以任何可能的组合使用。

Claims (20)

1.一种用于将对应于哺乳动物对象的生物样品中所选靶代谢物的量和/或浓度的强度数据进行归一化的方法，其中所述强度数据使用多种内源参比代谢物通过代谢物组学分析方法获得，所述方法包含
对所述生物样品中的所述所选靶代谢物执行至少一种体外代谢物组学分析方法；
同时在同一样品中执行多种内源参比代谢物或其衍生物的定量分析，其中所述内源参比代谢物是生物样品中以基本上恒定的水平存在于对象中的化合物；其中所述内源参比代谢物或其衍生物具有小于1500Da的分子质量，并且选自：
氨基酸，特别是精氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、犬尿氨酸；
苯硫基氨甲酰基氨基酸(PTC-氨基酸)，特别是PCT-精氨酸、PTC-谷氨酰胺、PTC-组氨酸、PTC-甲硫氨酸、PTC-鸟氨酸、PTC-苯丙氨酸、PTC-脯氨酸、PTC-丝氨酸、PTC-色氨酸、PTC-酪氨酸、PTC-缬氨酸；
二甲基精氨酸，特别是N，N-二甲基-L-精氨酸；
羧酸，即15(S)-羟基-5Z，8Z，11Z，13E-二十碳四烯酸[(5Z，8Z，11Z，13E，15S)-15-羟基二十碳-5，8，11，13-四烯酸]、琥珀酸；
肉毒碱类；在酰基残基中具有1至20个碳原子的酰基肉毒碱；在酰基残基中具有3至20个碳原子并且在酰基残基中具有1至4个双键的酰基肉毒碱；在酰基残基中具有1至20个碳原子并且在酰基残基中具有1至3个OH基的酰基肉毒碱；在酰基残基中具有3至20个碳原子并在酰基残基中具有1至4个双键和1至3个OH基的酰基肉毒碱；
磷脂类，特别是
在酰基残基中具有1至30个碳原子的溶血磷脂酰胆碱(单酰基磷脂酰胆碱)；在酰基残基中具有3至30个碳原子并在酰基残基中具有1至6个双键的溶血磷脂酰胆碱；
在酰基残基中具有总共1至50个碳原子的磷脂酰胆碱(二酰基磷脂酰胆碱)；在酰基残基中具有总共3至50个碳原子并在酰基残基中具有总共1至8个双键的磷脂酰胆碱；
鞘磷脂类，特别是
在酰基链中总碳原子数为10至30的神经鞘磷脂；在酰基链中总碳原子数为10至30并具有1至5个双键的神经鞘磷脂；在酰基残基中总碳原子数为10至30的羟基神经鞘磷脂；在酰基残基中总碳原子数为10至30并具有1至5个双键的羟基神经鞘磷脂；
前列腺素类，即6-酮基-前列腺素F1α、前列腺素D2；
腐胺；
并且其中
每种所述所选靶代谢物的所述检测到的强度与所述内源参比代谢物的所述强度相关。
2.权利要求1的方法，其中对靶和内源参比代谢物的多个强度进行数学预处理，特别是变换例如使用算法、广义化算法、幂变换。
3.权利要求1或2的方法，其中将内源参比代谢物的多个强度归并成一个参比值。
4.权利要求3的方法，其中通过计算几何平均值、算术平均值、中位数值、权重算数平均值将内源参比代谢物的多个强度归并成一个参比值。
5.权利要求1至4任一项的方法，其中在线性强度的情况下形成靶代谢物的每个强度与测定到的参比值的比率，或者在对数强度的情况下从每个靶代谢物强度中减去测定到的参比值。
6.权利要求1至5任一项的方法，其中所述代谢物组学分析方法包含通过质谱术(MS)、特别是MS技术例如基质辅助激光解吸/电离(MALDI)、电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、任选与MS偶联的1H-、13C-和/或31P-核磁共振波谱(NMR)产生用于为内源代谢物定量的强度数据，通过使用与分离技术，特别是液相色谱(LC-MS)、气相色谱(GC-MS)或毛细管电泳(CE-MS)偶联的MS技术和/或方法来测定代谢物浓度。
7.权利要求1至6任一项的方法，其中所述内源参比代谢物选自：
15(S)-羟基-5Z，8Z，11Z，13E-二十碳四烯酸
6-酮基-前列腺素F1α
不对称二甲基精氨酸
精氨酸
PTC-精氨酸
天冬氨酸
肉毒碱(游离)
癸酰基肉毒碱(反丁烯二酰基肉毒碱)
癸烯酰基肉毒碱
癸二烯酰基肉毒碱
十二酰基肉毒碱[月桂酰肉毒碱]
十二烯酰基肉毒碱
十二烷二酰基肉毒碱
十四酰基肉毒碱
十四烯酰基肉毒碱[肉豆蔻酰基肉毒碱]
3-羟基十四烯酰基肉毒碱[3-羟基肉豆蔻酰基肉毒碱]
3-羟基十四碳二烯酰基肉毒碱
3-羟基十四酰基肉毒碱[羟基肉豆蔻酰基肉毒碱]
十六烯酰基肉毒碱[棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六烯酰基肉毒碱[3-羟基棕榈油酰基肉毒碱]
十六碳二烯酰基肉毒碱
3-羟基十六碳二烯酰基肉毒碱
3-羟基十六碳酰基肉毒碱[3-羟基棕榈酰基肉毒碱]
十八碳酰基肉毒碱[硬脂酰基肉毒碱]
十八碳烯酰基肉毒碱[油酰肉毒碱]
3-羟基十八碳烯酰基肉毒碱[3-羟基油酰肉毒碱]
乙酰肉毒碱
丙烯酰肉毒碱
羟基丙酰肉毒碱
丁烯酰肉毒碱
3-羟基丁酰肉毒碱/丙二酸单酰肉毒碱
异戊酰基肉毒碱/2-甲基丁酰肉毒碱/戊酰基肉毒碱
甲基巴豆酰基肉毒碱/3-甲基-巴豆酰基肉毒碱
戊二酸单酰基肉毒碱/羟基己酰基肉毒碱
戊二酸单酰基肉毒碱/羟基己酰基肉毒碱
甲基戊二酸单酰基肉毒碱
3-羟基异戊酰基肉毒碱/3-羟基-2-甲基丁酰基肉毒碱
己酰基肉毒碱
己烯酰基肉毒碱
庚二酰基肉毒碱
辛酰基肉毒碱
辛烯酰基肉毒碱
壬酰基肉毒碱
瓜氨酸
肌酸酐
谷氨酰胺
PTC-谷氨酰胺
谷氨酸
组氨酸
PTC-组氨酸
犬尿氨酸
亮氨酸
酰基残基为C14:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C16:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C16:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C18:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C18:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C18:2的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C20:3的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C20:4的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C24:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C6:0的溶血磷脂酰胆碱
PTC-甲硫氨酸
鸟氨酸
PTC-鸟氨酸
二酰基残基总和为C24:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C26:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C28:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C30:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C30:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:6的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:6的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C40:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C40:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C40:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C40:6的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C30:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C30:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:2的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:2的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:2的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:2的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C44:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C44:6的磷脂酰胆碱
前列腺素D2
苯丙氨酸
PTC-苯丙氨酸
脯氨酸
PTC-脯氨酸
腐胺
丝氨酸
PTC-丝氨酸
酰基残基总和为C14:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C22:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C22:2的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C18:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C18:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C20:2的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C22:3的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C26:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C26:1的神经鞘磷脂
琥珀酸
总二甲基精氨酸：ADMA+SDMA的总和
色氨酸
PTC-色氨酸
酪氨酸
缬氨酸
PTC-缬氨酸
亮氨酸+异亮氨酸
其中名称“残基Cn:m”或“残基总和Cn:m”表示酰基/烷基残基的链长，n表示酰基/烷基残基中的总碳原子数，且m表示残基中的总双键数。
8.权利要求1至7任一项的方法，其中这样的代谢物被用作根据统计学稳定性量度显示出稳定性的内源参比代谢物，所述统计学稳定性量度选自原始强度数据的变差系数(CV)、对数强度数据的标准偏差(SD)、geNorm算法的稳定性量度(M)或NormFinder算法的稳定性量度值(rho)。
9.权利要求1至8任一项的方法，其中所述内源参比代谢物根据至少2种统计学稳定性量度显示出稳定性，所述统计学稳定性量度选自原始强度数据的变差系数(CV)、对数强度数据的标准偏差(SD)、geNorm算法的稳定性量度(M)或NormFinder算法的稳定性量度值(rho)，和/或这样的内源参比代谢物具体来说选自：
PTC-精氨酸
肉毒碱(游离)
癸烯酰基肉毒碱
癸酰基肉毒碱(反丁烯二酰基肉毒碱)
十二烯酰基肉毒碱
十二烷二酰基肉毒碱
十二酰基肉毒碱[月桂酰肉毒碱]
十四酰基肉毒碱
3-羟基十四酰基肉毒碱[羟基肉豆蔻酰基肉毒碱]
十六烯酰基肉毒碱[棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六烯酰基肉毒碱[3-羟基棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六碳二烯酰基肉毒碱
3-羟基十六碳酰基肉毒碱[3-羟基棕榈酰基肉毒碱]
3-羟基十八碳烯酰基肉毒碱[3-羟基油酰肉毒碱]
丙烯酰肉毒碱
羟基丙酰肉毒碱
3-羟基丁酰肉毒碱/丙二酸单酰肉毒碱
甲基戊二酸单酰基肉毒碱
3-羟基异戊酰基肉毒碱/3-羟基-2-甲基丁酰基
己烯酰基肉毒碱
己酰基肉毒碱
庚二酰基肉毒碱
辛烯酰基肉毒碱
辛酰基肉毒碱
谷氨酰胺
PTC-谷氨酰胺
PTC-组氨酸
酰基残基为C14:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:1的溶血磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C24:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C26:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C30:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C30:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C30:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C44:6的磷脂酰胆碱
苯丙氨酸
PTC-苯丙氨酸
脯氨酸
酰基残基总和为C16:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C18:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C18:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C20:2的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C14:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C22:2的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的羟基神经鞘磷脂
琥珀酸
PTC-色氨酸
缬氨酸
PTC-缬氨酸
亮氨酸+异亮氨酸
其中名称“残基Cn:m”或“残基总和Cn:m”表示酰基/烷基残基的链长，n表示酰基/烷基残基中的总碳原子数，且m表示残基中的总双键数。
10.权利要求1至8任一项的方法，其中所述内源参比代谢物根据至少3种统计学稳定性量度显示出稳定性，所述统计学稳定性量度选自原始强度数据的变差系数(CV)、对数强度数据的标准偏差(SD)、geNorm算法的稳定性量度(M)或NormFinder算法的稳定性量度值(rho)，和/或这样的内源参比代谢物具体来说选自：
肉毒碱(游离)
癸酰基肉毒碱(反丁烯二酰基肉毒碱)
十二烷二酰基肉毒碱
十二酰基肉毒碱[月桂酰肉毒碱]
十六烯酰基肉毒碱[棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六烯酰基肉毒碱[3-羟基棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六碳酰基肉毒碱[3-羟基棕榈酰基肉毒碱]
丙烯酰肉毒碱
羟基丙酰肉毒碱
3-羟基丁酰肉毒碱/丙二酸单酰肉毒碱
甲基戊二酸单酰基肉毒碱
己酰基肉毒碱
庚二酰基肉毒碱
辛烯酰基肉毒碱
辛酰基肉毒碱
谷氨酰胺
PTC-谷氨酰胺
PTC-组氨酸
酰基残基为C14:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:1的溶血磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C26:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C44:6的磷脂酰胆碱
酰基残基总和为C16:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C20:2的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的羟基神经鞘磷脂
缬氨酸
PTC-缬氨酸
其中名称“残基Cn:m”或“残基总和Cn:m”表示酰基/烷基残基的链长，n表示酰基/烷基残基中的总碳原子数，且m表示残基中的总双键数。
11.权利要求1至8任一项的方法，其中所述内源参比代谢物根据所有统计学稳定性量度显示出稳定性，所述统计学稳定性量度选自原始强度数据的变差系数(CV)、对数强度数据的标准偏差(SD)、geNorm算法的稳定性量度(M)或NormFinder算法的稳定性量度值(rho)，和/或这样的内源参比代谢物具体来说是二酰基残基总和为C42:6的磷脂酰胆碱，其中名称“C42:6”表示酰基残基的链长，42表示酰基残基中的总碳原子数，且6表示残基中的总双键数。
12.权利要求1至11任一项的方法，其中所述多种内源代谢物包含2至80种、特别是2至60种、优选2至50种、优选2至30种、更优选2至10种、特别优选2至10种、优选3至5种内源代谢物。
13.多种化合物或其衍生物在代谢物组学分析方法中作为内源参比代谢物的应用，其中所述化合物具有小于1500Da的分子质量，其中所述内源参比代谢物选自：
氨基酸，特别是精氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、犬尿氨酸；
苯硫基氨甲酰基氨基酸(PTC-氨基酸)，特别是PCT-精氨酸、PTC-谷氨酰胺、PTC-组氨酸、PTC-甲硫氨酸、PTC-鸟氨酸、PTC-苯丙氨酸、PTC-脯氨酸、PTC-丝氨酸、PTC-色氨酸、PTC-酪氨酸、PTC-缬氨酸；
二甲基精氨酸，特别是N，N-二甲基-L-精氨酸；
羧酸，即15(S)-羟基-5Z，8Z，11Z，13E-二十碳四烯酸[(5Z，8Z，11Z，13E，15S)-15-羟基二十碳-5，8，11，13-四烯酸]、琥珀酸；
肉毒碱类；在酰基残基中具有1至20个碳原子的酰基肉毒碱；在酰基残基中具有3至20个碳原子并且在酰基残基中具有1至4个双键的酰基肉毒碱；在酰基残基中具有1至20个碳原子并且在酰基残基中具有1至3个OH基的酰基肉毒碱；在酰基残基中具有3至20个碳原子并在酰基残基中具有1至4个双键和1至3个OH基的酰基肉毒碱；
磷脂类，特别是
在酰基残基中具有1至30个碳原子的溶血磷脂酰胆碱(单酰基磷脂酰胆碱)；在酰基残基中具有3至30个碳原子并在酰基残基中具有1至6个双键的溶血磷脂酰胆碱；
在酰基残基中具有总共1至50个碳原子的磷脂酰胆碱(二酰基磷脂酰胆碱)；在酰基残基中具有总共3至50个碳原子并在酰基残基中具有总共1至8个双键的磷脂酰胆碱；
鞘磷脂类，特别是
在酰基链中总碳原子数为10至30的神经鞘磷脂；在酰基链中总碳原子数为10至30并具有1至5个双键的神经鞘磷脂；在酰基残基中总碳原子数为10至30的羟基神经鞘磷脂；在酰基残基中总碳原子数为10至30并具有1至5个双键的羟基神经鞘磷脂；
前列腺素类，即6-酮基-前列腺素F1α、前列腺素D2；
腐胺。
14.权利要求13的应用，其中所述代谢物组学分析方法包含通过质谱术(MS)、特别是MS技术例如基质辅助激光解吸/电离(MALDI)、电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、任选与MS偶联的1H-、13C-和/或31P-核磁共振波谱(NMR)对内源靶和内源参比代谢物进行定量，通过使用与分离技术，特别是液相色谱(LC-MS)、气相色谱(GC-MS)或毛细管电泳(CE-MS)偶联的MS技术和/或方法来测定代谢物浓度。
15.权利要求13或14的应用，其中所述内源参比代谢物选自：
15(S)-羟基-5Z，8Z，11Z，13E-二十碳四烯酸
6-酮基-前列腺素F1α
不对称二甲基精氨酸
精氨酸
PTC-精氨酸
天冬氨酸
肉毒碱(游离)
癸酰基肉毒碱(反丁烯二酰基肉毒碱)
癸烯酰基肉毒碱
癸二烯酰基肉毒碱
十二酰基肉毒碱[月桂酰肉毒碱]
十二烯酰基肉毒碱
十二烷二酰基肉毒碱
十四酰基肉毒碱
十四烯酰基肉毒碱[肉豆蔻酰基肉毒碱]
3-羟基十四烯酰基肉毒碱[3-羟基肉豆蔻酰基肉毒碱]
3-羟基十四碳二烯酰基肉毒碱
3-羟基十四酰基肉毒碱[羟基肉豆蔻酰基肉毒碱]
十六烯酰基肉毒碱[棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六烯酰基肉毒碱[3-羟基棕榈油酰基肉毒碱]
十六碳二烯酰基肉毒碱
3-羟基十六碳二烯酰基肉毒碱
3-羟基十六碳酰基肉毒碱[3-羟基棕榈酰基肉毒碱]
十八碳酰基肉毒碱[硬脂酰基肉毒碱]
十八碳烯酰基肉毒碱[油酰肉毒碱]
3-羟基十八碳烯酰基肉毒碱[3-羟基油酰肉毒碱]
乙酰肉毒碱
丙烯酰肉毒碱
羟基丙酰肉毒碱
丁烯酰肉毒碱
3-羟基丁酰肉毒碱/丙二酸单酰肉毒碱
异戊酰基肉毒碱/2-甲基丁酰肉毒碱/戊酰基肉毒碱
甲基巴豆酰基肉毒碱/3-甲基-巴豆酰基肉毒碱
戊二酸单酰基肉毒碱/羟基己酰基肉毒碱
戊二酸单酰基肉毒碱/羟基己酰基肉毒碱
甲基戊二酸单酰基肉毒碱
3-羟基异戊酰基肉毒碱/3-羟基-2-甲基丁酰基
己酰基肉毒碱
己烯酰基肉毒碱
庚二酰基肉毒碱
辛酰基肉毒碱
辛烯酰基肉毒碱
壬酰基肉毒碱
瓜氨酸
肌酸酐
谷氨酰胺
PTC-谷氨酰胺
谷氨酸
组氨酸
PTC-组氨酸
犬尿氨酸
亮氨酸
酰基残基为C14:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C16:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C16:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C18:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C18:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C18:2的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C20:3的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C20:4的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C24:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C6:0的溶血磷脂酰胆碱
PTC-甲硫氨酸
鸟氨酸
PTC-鸟氨酸
二酰基残基总和为C24:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C26:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C28:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C30:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C30:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:6的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:6的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C40:3的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C40:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C40:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C40:6的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C30:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C30:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:2的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:2的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:2的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:2的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:3的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C44:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C44:6的磷脂酰胆碱
前列腺素D2
苯丙氨酸
PTC-苯丙氨酸
脯氨酸
PTC-脯氨酸
腐胺
丝氨酸
PTC-丝氨酸
酰基残基总和为C14:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C22:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C22:2的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C18:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C18:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C20:2的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C22:3的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C26:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C26:1的神经鞘磷脂
琥珀酸
总二甲基精氨酸：ADMA+SDMA的总和
色氨酸
PTC-色氨酸
酪氨酸
缬氨酸
PTC-缬氨酸
亮氨酸+异亮氨酸
其中名称“残基Cn:m”或“残基总和Cn:m”表示酰基/烷基残基的链长，n表示酰基/烷基残基中的总碳原子数，且m表示残基中的总双键数。
16.权利要求13至15任一项的应用，其中所述内源参比代谢物根据统计学稳定性量度显示出稳定性，所述统计学稳定性量度选自原始强度数据的变差系数(CV)、对数强度数据的标准偏差(SD)、geNorm算法的稳定性量度(M)或NormFinder算法的稳定性量度值(rho)。
17.权利要求13至16任一项的应用，其中所述内源参比代谢物根据至少2种统计学稳定性量度显示出稳定性，所述统计学稳定性量度选自原始强度数据的变差系数(CV)、对数强度数据的标准偏差(SD)、geNorm算法的稳定性量度(M)或NormFinder算法的稳定性量度值(rho)，和/或这样的内源参比代谢物具体来说选自
PTC-精氨酸
肉毒碱(游离)
癸烯酰基肉毒碱
癸酰基肉毒碱(反丁烯二酰基肉毒碱)
十二烯酰基肉毒碱
十二烷二酰基肉毒碱
十二酰基肉毒碱[月桂酰肉毒碱]
十四酰基肉毒碱
3-羟基十四酰基肉毒碱[羟基肉豆蔻酰基肉毒碱]
十六烯酰基肉毒碱[棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六烯酰基肉毒碱[3-羟基棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六碳二烯酰基肉毒碱
3-羟基十六碳酰基肉毒碱[3-羟基棕榈酰基肉毒碱]
3-羟基十八碳烯酰基肉毒碱[3-羟基油酰肉毒碱]
丙烯酰肉毒碱
羟基丙酰肉毒碱
3-羟基丁酰肉毒碱/丙二酸单酰肉毒碱
甲基戊二酸单酰基肉毒碱
3-羟基异戊酰基肉毒碱/3-羟基-2-甲基丁酰基
己烯酰基肉毒碱
己酰基肉毒碱
庚二酰基肉毒碱
辛烯酰基肉毒碱
辛酰基肉毒碱
谷氨酰胺
PTC-谷氨酰胺
PTC-组氨酸
酰基残基为C14:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:1的溶血磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C24:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C26:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C30:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C30:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C34:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:4的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C30:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C34:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:1的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C44:6的磷脂酰胆碱
苯丙氨酸
PTC-苯丙氨酸
脯氨酸
酰基残基总和为C16:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C18:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C18:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C20:2的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C14:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C22:2的羟基神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的羟基神经鞘磷脂
琥珀酸
PTC-色氨酸
缬氨酸
PTC-缬氨酸
亮氨酸+异亮氨酸
其中名称“残基Cn:m”或“残基总和Cn:m”表示酰基/烷基残基的链长，n表示酰基/烷基残基中的总碳原子数，且m表示残基中的总双键数。
18.权利要求13至17任一项的应用，其中所述内源参比代谢物根据至少3种统计学稳定性量度显示出稳定性，所述统计学稳定性量度选自原始强度数据的变差系数(CV)、对数强度数据的标准偏差(SD)、geNorm算法的稳定性量度(M)或NormFinder算法的稳定性量度值(rho)，和/或这样的内源参比代谢物具体来说选自：
肉毒碱(游离)
癸酰基肉毒碱(反丁烯二酰基肉毒碱)
十二烷二酰基肉毒碱
十二酰基肉毒碱[月桂酰肉毒碱]
十六烯酰基肉毒碱[棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六烯酰基肉毒碱[3-羟基棕榈油酰基肉毒碱]
3-羟基十六碳酰基肉毒碱[3-羟基棕榈酰基肉毒碱]
丙烯酰肉毒碱
羟基丙酰肉毒碱
3-羟基丁酰肉毒碱/丙二酸单酰肉毒碱
甲基戊二酸单酰基肉毒碱
己酰基肉毒碱
庚二酰基肉毒碱
辛烯酰基肉毒碱
辛酰基肉毒碱
谷氨酰胺
PTC-谷氨酰胺
PTC-组氨酸
酰基残基为C14:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:0的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C26:1的溶血磷脂酰胆碱
酰基残基为C28:1的溶血磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C26:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C32:2的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C36:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C38:0的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:1的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
二酰基残基总和为C42:6的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C38:4的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C40:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:0的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C42:5的磷脂酰胆碱
酰基-烷基残基总和为C44:6的磷脂酰胆碱
酰基残基总和为C16:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C16:1的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C20:2的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:0的神经鞘磷脂
酰基残基总和为C24:1的羟基神经鞘磷脂
缬氨酸
PTC-缬氨酸
其中名称“残基Cn:m”或“残基总和Cn:m”表示酰基/烷基残基的链长，n表示酰基/烷基残基中的总碳原子数，且m表示残基中的总双键数。
19.权利要求13至18任一项的应用，其中所述内源参比代谢物根据所有统计学稳定性量度显示出稳定性，所述统计学稳定性量度选自原始强度数据的变差系数(CV)、对数强度数据的标准偏差(SD)、geNorm算法的稳定性量度(M)或NormFinder算法的稳定性量度值(rho)，和/或这样的内源参比代谢物具体来说是二酰基残基总和为C42:6的磷脂酰胆碱，其中名称“C42:6”表示酰基残基的链长，42表示酰基残基中的总碳原子数，且6表示残基中的总双键数。
20.权利要求13至19任一项的应用，其中所述多种内源代谢物包含2至80种、特别是2至60种、优选2至50种、优选2至30种、更优选2至10种、特别优选2至10种、优选3至5种内源代谢物。
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C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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