CN108267436A - 一种基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法和判断合理用药的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于拉曼光谱‑重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法和判断合理用药的方法。针对传统药敏检测需时长的缺点，该发明利用抗生素作用下耐药菌和敏感菌活性不同，从而C‑D拉曼峰强度不同的原理，实现了0.5至1小时内的药敏性快速检测。将待检物在含有重水的培养液中孵育，其中含抗生素的作为处理组，不含抗生素的作为对照组，将孵育后的待检物离心清洗后进行拉曼检测，分别计算处理组和对照组的C‑D/(C‑D+C‑H)，并以处理组与对照组的比值作为判别标准，小于等于0.75判断为对抗生素敏感，大于0.75判别为对该抗生素耐药。所述方法快速、操作和分析简便、适于不同抗生素和不同细菌，具有临床应用前景。

Description

一种基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检 测方法和判断合理用药的方法

技术领域

本发明涉及生化检测分析技术领域，尤其涉及一种基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法和判断合理用药的方法。

背景技术

抗生素的发明是医学史上最重要的进步之一，抗生素的使用有效控制了细菌感染，挽救了无数生命。医疗卫生领域占据了抗生素使用的半壁江山(另一半是养殖业)。然而，抗生素的不合理使用问题非常突出。随着抗生素的大量使用，细菌耐药问题日趋严重，导致细菌感染无法有效治愈，并在世界范围内呈现加剧的趋势，不同国家包括发达国家(英国、美国)陆续发现了可抵抗几乎所有抗生素的超级细菌，一旦感染将无药可医，严重威胁了人类健康。2011年世界卫生组织(WHO)已将细菌耐药性作为21世纪威胁人类健康的最大挑战之一。根据一个独立研究委员会的报告，如果抗生素耐药得不到有效控制，到2050年全球每年耐药感染的死亡人数可达1000万，远远超出癌症所导致的死亡数。抗生素耐药将造成全球GDP损失累计达10万亿美元。我国是世界上最大的抗生素生产和消费大国，面临的抗生素耐药问题相比世界范围更为严重。为积极应对细菌耐药带来的挑战，提高抗菌药物科学管理水平，遏制细菌耐药发展与蔓延，维护人民群众身体健康，促进经济社会协调发展，2016年8月，国家卫生计生委、发展改革委等14个部门联合印发了《遏制细菌耐药国家行动计划(2016-2020年)》。

在医学诊断上，标准的药敏检测方法是基于纯培养，即通过检测抗生素对细菌生长的最小抑制浓度(MIC)，或者抑菌圈的大小，来判断细菌的抗生素敏感性或耐药性。但是该方法非常费时，通常需要24小时甚至一周。在临床上，没有足够时间进行药敏检测，尤其对于病情严重的病例，并且一些细菌感染引起的死亡率随着时间延长快速增加。医生通常根据经验选择针对不同耐药菌的抗生素，或者直接选择广谱抗生素，即对多种细菌具有效力的抗生素。抗生素的错误使用会导致耐药病原菌富集，良性敏感菌死亡，加速病情恶化。而利用用广谱抗生素，虽一时有效，却加剧了宿主的耐药性，导致日后的无药可医。

耐药菌药敏快速检测技术对抗生素的合理使用非常重要，不仅有助于快速对症(针对不同耐药菌)下药，避免抗生素错用和滥用问题，达到高效治疗效果。而且，可大大遏制抗生素耐药问题。目前，抗生素耐药菌药敏快检技术正不断涌现，包括光谱法(拉曼、红外、受激拉曼)、微流控芯片细菌显微观察法、电化学法和原子力显微镜法等。上述方法可以实现0.5至5小时内药敏性的快速检测，但距离临床使用要求还有很大距离。例如，光谱技术结合多元变量统计分析，涉及到大量数据的统计分析，分析复杂，远不如可视化便捷。受激拉曼虽然可在一定程度上可视化，但仪器昂贵复杂，不普遍。直接观察微流控芯片中细菌在抗生素作用下生长速率或分裂过程中的形态变化，来判断耐药菌，是一个可视化检测，但是对于含有多种菌的真实样品，在判断生长速度或形貌上具有局限和误差。电化学和原子力方法的检测通量太低。

综述所示，目前仍然缺乏快速、操作简便、具有临床应用前景的耐药菌药敏性快速检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、简便、具有临床应用前景的基于拉曼光谱-重水同位素标记的且可快速指导合理用药的耐药菌药敏性快速检测方法。

为实现上述目的,本发明提供一种基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法，其特征在于，将待检物在含有重水的培养液中孵育，其中培养液中含有抗生素的作为处理组，不含抗生素的作为对照组，将孵育后的待检物离心清洗，之后将清洗后的待检物滴在低拉曼背景基底上进行拉曼检测，分别计算处理组和对照组的C-D/(C-D+C-H)值，并以处理组除以对照组的比值，即相对C-D峰强比值作为判别标准，小于等于0.75判断为对抗生素敏感，大于0.75判别为对该抗生素耐药。其中C-D和C-H峰分别位于2040-2300cm^-1和2800-3100cm^-1。

进一步，所述抗生素具有抑菌或杀菌功能。

进一步，所述培养液中抗生素的浓度为5至60倍的抗生素最小抑菌浓度MIC值；优选的，培养液中抗生素的浓度为10倍的抗生素最小抑菌浓度MIC值。

进一步，所述培养液中重水占所有水的体积百分浓度是30％至100％。

进一步，所述孵育的时间为0.5至3小时；优选的，是1小时。

进一步，所述离心的条件为5000rpm，3分钟；

任选的，离心两次；

任选的，所述清洗的清洗液为离子水或70％乙醇。

进一步，所述检测的激发光波长为532、633、785nm，光栅300g/mm。

本发明还提供一种判断合理用药的方法，其特征在于，采用前述步骤，所述培养液为含不同抗生素和重水的培养液；根据处理组的相对C-D峰强比值作为判断合理用药的标准，小于等于0.75判断为对抗生素敏感，大于0.75判别为对该抗生素耐药。

本发明在拉曼检测时引入细菌重水标记，利用敏感和耐药菌在抗生素作用下代谢活性不同，来实现耐药菌药敏性的灵敏快速检测，以及指导合理用药。具体原理是：重水中氘(D)在细菌新陈代谢活动中被摄入，用于重要生物大分子的合成，如脂质。脂质中的C-D键可被拉曼光谱灵敏检测。氘的同化量或C-D拉曼峰强度反映了细菌的代谢活性。在抗生素作用下，敏感和耐药菌代谢活性不同，敏感菌活性低或无，C-D峰弱或无；耐药菌活性高，C-D峰强，因此细菌的C-D拉曼峰可作为一个非常简单的指标，区分耐药和敏感菌，而无需借助任何谱图统计分析软件。更重要的是，细菌摄入重水半小时后，其C-D峰即可被拉曼检测，因此方法快速。另外，只需要在细菌培养液中加入重水，操作非常简便。

本方法相比于传统药敏检测和其它新近发展的快速检测方法的优势和特点包括：

1)与传统的基于纯培养的药敏性检测方法需时24小时至一周相比，拉曼-重水同位素标记将检测时间缩短至0.5至1小时，实现了快速区分耐药和敏感菌，并快速判断对耐药菌具有效力的抗生素，指导合理用药；

2)与其它基于拉曼或红外光谱结合数据统计分析的方法比较，拉曼-重水标记方法，仅需要C-D峰这一简单指示峰，即可区分耐药和敏感菌，无需借助数据统计分析，分析更简便；

3)与昂贵、不普遍、甚至需要搭建光路系统的受激拉曼光谱仪相比，拉曼-重水标记在普通共焦显微拉曼仪，或小型的便携式拉曼仪都可实现，应用前景更大；

4)直接显微观察细菌分裂状态判断耐药菌的方法，对球状菌效率低。与此相比，拉曼-重水标记不受细菌形态的限制；

5)操作非常简便，仅需加入重水进行1小时内的孵育；

6)适用于不同作用机制的抑菌和杀菌类抗生素，适于多种抗生素；

7)可进行单细胞水平或大量菌的检测，不受样品量限制。

本发明所述拉曼-重水同位素标记方法是一个具有临床应用前景的药敏性快速检测方法，对耐药菌感染治疗、遏制细菌耐药传播、维护人民身体健康具有重要意义。

附图说明

图1为实施例1拉曼-重水同位素标记方法快速检测耐药菌药敏性的流程图，以及耐药菌和敏感菌的典型拉曼谱图。

图2为实施例1不同孵育时间下敏感和耐药菌在无和有抗生素处理下的C-D峰强度比值结果图。

图3为实施例2利用相对C-D峰强比值快速判断不同大肠杆菌的药敏性结果图。

图4为实施例3利用相对C-D峰强比值快速判断不同病原菌的药敏性结果图。

图5为实施例3利用传统抑菌圈方法判别药敏性结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例中，沙门氏菌具体为肠道沙门氏菌Salmonella enterica ATCC19585，大肠杆菌质控菌具体是大肠杆菌Escherichia coli Castellani&Chalmers AS1.2385(ATCC25922)。

一种基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法，其特征在于，将待检物在含有抗生素和重水的培养液中孵育，将孵育后的待检物离心清洗，之后将清洗后的待检物滴在低拉曼背景基底上进行检测，分别计算对照组和处理组的C-D峰强比值C-D/(C-D+C-H)，并以处理组与对照组的比值，即相对C-D峰强比值判断药敏性。其中C-D峰位于2040-2300cm^-1，C-H峰位于2800-3100cm^-1。

进一步，所述抗生素具有抑菌或杀菌功能。

进一步，所述培养液中抗生素的浓度为5至60倍的抗生素最小抑菌浓度MIC值；优选的，为10倍的抗生素最小抑菌浓度MIC值。

进一步，所述培养液中重水体积百分浓度是30％至100％。

进一步，所述离心的条件为5000rpm，3分钟；

任选的，离心两次；

任选的，所述清洗的清洗液为离子水或70％乙醇。

进一步，所述检测的激发光波长为532、633、785nm，光栅300g/mm。

一种判断合理用药的方法，其特征在于，采用前述步骤，所述培养液为含不同抗生素和重水的培养液。

实施例1：拉曼-重水同位素标记方法快速区分抗生素耐药和敏感大肠杆菌

附图1给出拉曼-重水同位素标记方法的检测流程，具体包括：

在96孔板中加入200μL含10×～60×MIC抗生素和体积百分浓度为30％-100％(vol/vol)重水D₂O(99.9atom％D；Sigma-Aldrich)的LB培养液，200μL不含抗生素但含重水D₂O的LB培养液为对照。在培养液中接种5uL过夜培养的敏感和耐药细菌。孵育0，0.5，1，1.5，2小时不同时间后，取出菌液，利用去离子水或70％乙醇进行离心清洗，条件是：5000rpm，每次离心3min，共2次。将2μL清洗后菌液滴在铝箔纸上，空气中干燥后，进行拉曼检测。拉曼检测可以采用单细胞水平检测，每个样品检测25-50个细菌，或者利用大激光光斑模式(面积从5×5μm～60×60μm)对多个细菌同时检测，获得多个菌的平均谱图。上述检测流程和所获耐药菌和敏感菌的典型拉曼谱图如附图1所示，耐药菌的拉曼谱图出现明显的C-D峰，而敏感菌则无明显C-D峰。对拉曼谱图进行基线扣除后，利用拉曼软件计算检测组和对照组C-D/(C-D+C-H)的峰强比值，其中C-D和C-H峰分别位于2040-2300cm^-1和2800-3100cm^-1。附图2的a是不同孵育时间下，敏感型大肠杆菌DH5a和耐氨苄青霉素大肠杆菌(Amp^R)，在氨苄青霉素处理和不处理条件下的C-D峰强比值，可见，敏感性大肠杆菌DH5a,在处理1小时后，其不含抗生素的对照组的峰强比值明显高于处理组，而耐药型大肠杆菌Amp^R，对照组和处理组无明显区分。附图2的b是不同时间下，敏感型大肠杆菌DH5a和耐卡那霉素大肠杆菌(Kan^R)，在卡那霉素处理和不处理条件下的C-D峰强比值，可见，敏感性大肠杆菌DH5a,在处理0.5小时后，其不含抗生素的对照组的峰强比值明显高于处理组，而耐药型大肠杆菌Kan^R，对照组和处理组无明显区分。附图2的c是不同时间下，敏感型大肠杆菌DH5a和耐氯霉素大肠杆菌(Chl^R)在氯霉素处理和不处理条件下的C-D峰强比值，可见，敏感性大肠杆菌DH5a,在处理0.5小时后，其对照组的峰强比值明显高于处理组，而耐药型大肠杆菌ChlR，对照组和处理组无明显区分。

以上事实说明拉曼-重水同位素标记在孵育0.5-1小时后即可区分敏感和耐药菌，对于部分抗生素，可在0.5小时内实现区分，说明方法的快速和简便性。

实施例2：拉曼-重水同位素标记方法快速检测大肠杆菌对不同抗生素的药敏性，指导合理用药

这里以四种不同类型的耐药型大肠杆菌为例，包括耐氨苄青霉素大肠杆菌Escherichiacoli Amp^R、耐卡那霉素大肠杆菌Escherichia coli Kan^R、耐氯霉素大肠杆菌Escherichiacoli Chl^R，以及对三种抗生素都耐药的多重耐药大肠杆菌Escherichia coliT^R。上述四种菌的药敏性已利用标准抑菌圈实验进行了检验，检验结果是敏感性大肠杆菌DH5α对三种抗生素敏感，Amp^R对氨苄青霉素呈耐药性，对卡那霉素和氯霉素呈现敏感性，Chl^R对氯霉素耐药，对氨苄青霉素和卡那霉素敏感，Kan^R对卡那霉素耐药，对氨苄青霉素和氯霉素敏感，T^R对三种抗生素都耐药。对每种耐药菌分别进行氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素三种抗生素处理。在96孔板中加入200μL含10×～60×MIC抗生素和体积百分浓度为30％-100％(vol/vol)重水D₂O(99.9atom％D；Sigma-Aldrich)的LB培养液，200μL不含抗生素但含重水D₂O的LB培养液为对照。在培养液中分别接种5uL过夜培养的不同的耐药大肠杆菌。孵育0.5小时后，取出菌液，利用去离子水或70％乙醇进行离心清洗，条件是：5000rpm，每次离心,3min，共2次。将2μL清洗后菌液滴在铝箔纸上，空气中干燥后，进行拉曼检测。拉曼检测可以采用单细胞水平检测，每个样品检测25-50个细菌，或者利用大激光光斑模式(面积从5×5μm～60×60μm)对多个细菌同时检测，获得多个菌的平均谱图。对拉曼谱图进行基线扣除后，利用拉曼软件分别计算对照组和处理组的C-D/(C-D+C-H)峰强比值，以及对照组与处理组的比值，即相对C-D峰强比值，其中C-D和C-H峰分别位于2040-2300cm^-1和2800-3100cm^-1。所设定的药敏判别标准是：相对C-D峰强比值小于等于0.75判别为敏感菌，所用抗生素对细菌具有效力；大于0.75判别为耐药菌，抗生素对此耐药菌不具效力。结果如附图3所示，附图3的a是敏感大肠杆菌DH5a分别在三种抗生素处理后的结果，处理组相对C-D峰强比值小于0.75，判别为对三种抗生素敏感。附图3的b是耐氨苄青霉素大肠杆菌Amp^R的结果，氨苄青霉素处理下的相对C-D峰强比值大于0.75，与对照组接近，判别为对氨苄青霉素耐药，卡那霉素和氯霉素处理下的相对C-D峰强比值小于0.75，判别为对卡那霉素和氯霉素敏感。附图3的c是耐氯霉素大肠杆菌Chl^R的结果，氯霉素处理下的相对C-D峰强比例大于0.75，与对照组接近，判别为对氯霉素耐药，其他两种抗生素处理后相对C-D峰强比值小于0.75，判别为对氨苄青霉素和卡那霉素敏感。附图3的d是耐卡那霉素大肠杆菌Kan^R的结果，卡那霉素处理下的相对C-D峰强比例与对照组接近，大于0.75，判别为对卡那霉素耐药，其他两种抗生素处理后相对C-D峰强比值小于0.75，判别为对氨苄青霉素和氯霉素敏感。附图3的e是多重耐药大肠杆菌TR的结果，可见，所有抗生素处理下的相对C-D峰强比例大于0.75，与对照组接近，判别为多重耐药菌。可见，拉曼-重水标记药敏性判别结果与标准抑菌圈实验完全一致，说明判别结果准确，并且，孵育时间为0.5小时，远远低于标准抑菌圈方法需要的24小时。

以上结果说明拉曼-重水同位素标记方法，可以准确快速判断对不同耐药性大肠杆菌具有效力的抗生素，快速指导合理用药。

实施例3：拉曼-重水同位素标记方法快速检测其他病原菌对不同抗生素的药敏性

这里以三种其他病原菌为例进行说明，包括肠道沙门氏菌Salmonella enterica、弗氏志贺杆菌Shigella flexneri和普通变形杆菌Proteus vulgaris。为确保抗生素有效性以及判别结果的准确性，也同时对一株质控菌大肠杆菌25922进行拉曼检测。弗氏志贺菌和普通变形杆菌从新鲜鸡粪中提取。实验流程与实施例2基本相同，不同之处的是孵育时间是1小时。结果如附图4所示，图4是上述四种菌在不含抗生素(对照)，以及含10×MIC浓度的氨苄西林、氯霉素、卡那霉素、美罗培南的100％(vol/vol)重水D₂O培养液中孵育1小时后，经拉曼检测后获得的相对C-D峰强比值。相对C-D峰强比值的计算方法是处理组的C-D/(C-D+C-H)除以对照组的C-D/(C-D+C-H)，不含抗生素的对照组的相对C-D峰强比值为1。图4的a,b，c和d分别是质控菌大肠杆菌25922(a)、普通变形杆菌(b)、肠道沙门氏菌(c)、弗氏志贺杆菌(d)的相对C-D峰强比值。所采用的判别标准是：处理组的C-D峰强比值小于等于0.75，判别为敏感菌，大于0.75判别为耐药菌。根据此标准，质控菌大肠杆菌和沙门氏菌判别为对四种抗生素氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素和美罗培南敏感。变形杆菌和志贺氏杆菌判别为对卡那霉素和美罗培南敏感，对氨苄青霉素和氯霉素耐药。

该判别结果的准确性也进一步利用表征抑菌圈的传统方法进行了验证，具体步骤是：将0.5麦氏浊度待测菌接种于MH琼脂培养基上，贴抗生素药敏纸片，将平板放于37℃，培养16-18小时后，用直尺测量抑菌圈直径。四种菌的抑菌圈实验结果如附图5所示，图5的a,b,c,d分别是大肠杆菌(a),变形杆菌(b),沙门氏菌(c),弗氏志贺杆菌(d)在不同抗生素的抑菌圈直径。根据药敏性国际标准，抑菌圈≥17-19mm,判别为敏感菌；抑菌圈≤12-15，判别为耐药菌。根据此标准，大肠杆菌和沙门氏菌判别对四种抗生素敏感，变形杆菌和志贺氏杆菌判别为对卡那霉素和美罗培南敏感，对氨苄青霉素和氯霉素耐药。抑菌圈方法与拉曼-重水标记结果完全一致，说明拉曼-重水标记方法可快速判断多种病原菌的药敏性，从而可以指导合理用药。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.一种基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法，其特征在于，将待检物在含有重水的培养液中孵育，其中培养液中含有抗生素的作为处理组，不含抗生素的作为对照组，将孵育后的待检物离心清洗，之后将清洗后的待检物滴在低拉曼背景基底上进行拉曼检测，分别计算处理组和对照组的C-D/(C-D+C-H)值，并以处理组除以对照组的比值，即相对C-D峰强比值作为判别标准，小于等于0.75判断为对抗生素敏感，大于0.75判别为对该抗生素耐药。其中C-D和C-H峰分别位于2040-2300cm^-1和2800-3100cm^-1。

2.如权利要求1所述基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法，其特征在于，所述抗生素具有抑菌或杀菌功能。

3.如权利要求1所述基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法，其特征在于，所述培养液中抗生素的浓度为5至60倍的抗生素最小抑菌浓度MIC值；优选的，培养液中抗生素的浓度为10倍的抗生素最小抑菌浓度MIC值。

4.如权利要求1所述基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法，其特征在于，所述培养液中重水占所有水的体积百分浓度是30％至100％。

5.如权利要求1所述基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法，其特征在于，所述孵育的时间为0.5至3小时；优选的，是1小时。

6.如权利要求1所述基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法，其特征在于，所述离心的条件为5000rpm，3分钟；

任选的，离心两次；

任选的，所述清洗的清洗液为离子水或70％乙醇。

7.如权利要求1所述基于拉曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏性快速检测方法，其特征在于，所述检测的激发光波长为532、633、785nm，光栅300g/mm。

8.一种判断合理用药的方法，其特征在于，采用权利要求1的步骤，所述培养液为含不同抗生素和重水的培养液；根据处理组的相对C-D峰强比值作为判断合理用药的标准，小于等于0.75判断为对抗生素敏感，大于0.75判别为对该抗生素耐药。