CN111849780A - 一种耐药微生物的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

一种耐药微生物的筛选方法，包括：S1：将含有一种或多种微生物的处理样品放入含有重水的培养液培养以进行氘标记；S2：将S1中的经氘标记的所述处理样品转入含抑制微生物药物的无重水培养液中进行去氘孵育；S3：将S2中经去氘孵育的所述处理样品进行拉曼光谱检测，并根据所述拉曼光谱的检测结果进行所述耐药微生物的筛选。本发明的检测方法相比现有技术而言具有灵敏度更高的优点。

Description

一种耐药微生物的筛选方法
技术领域
本发明涉及生化检测分析技术领域，特别涉及一种耐药微生物的筛选方法。
背景技术
抗菌药物如抗生素是人类历史上最伟大的发明之一，它有效控制了细菌感染，挽救了数 以亿级的生命。在畜牧养殖业，抗菌药物的使用也大大提高了家畜的存活率，保障了农户的 收益。然而抗菌药物尤其是抗生素的滥用和错用却大大提高了环境中细菌的耐药性，导致细 菌感染无法有效治愈，目前已在世界范围内出现了对多种抗生素等药物的“超级细菌”，严重 威胁了人类、动物和环境的健康，更为严重的是，耐药基因可以借助可移动遗传元件，如质 粒、整合子、转座子、病毒等，通过接合、转化、转导等方式将耐药基因横向转移至其它菌 株，使其它菌株产生耐药性，甚至促进多重耐药菌的产生和蔓延，加速了耐药性的传播。另 外，环境中残留的各种抑菌和杀菌类抗菌药物，如抗生素、防腐剂、重金属，消毒副产物， 甚至抗癌和抗抑郁药物，可通过共选择的途径促进耐药基因突变，诱导细菌产生耐药性。产 生的耐药性还可进一步通过垂直转移在子代细菌中稳定遗传，导致具有耐药性的细菌不断增 加。目前，耐药菌和耐药传播已成为全球最严峻的公共卫生问题，世界卫生组织提出了“遏 制耐药-今天不采取行动，明天就无药可用”的呼吁。因此，发展检测耐药菌和耐药传播和产 生的方法，对于积极遏制耐药产生和传播，保障全球的公共卫生和人类健康具有重大意义。 然而，目前对耐药菌和耐药性传播和产生的检测，仍然缺乏快速、灵敏、精准和普适的方法。
耐药菌的检测是解析耐药性传播和产生的前提。目前对耐药菌的检测方法主要是基于纯 培养的耐药表型检测，即通过检测抗生素等药物对细菌生长的最小抑制浓度(MIC)，或者 抑菌圈的大小，来判断细菌的药物敏感性或耐药性。但是该方法非常费时，通常需要24小时 甚至一周，对于生长缓慢的细菌，需时更长。而且，可培养菌会在压力条件下进入活着但不 可培养状态，造成基于培养方法的结果出现偏差。另外，由于环境和人体如肠道中超过99％ 的大量菌不能纯培养，基于纯培养的方法无法用于这类未培养菌的耐药性检测，更无法检测 耐药性在未培养菌之间或在未培养和可培养菌之间的传播。通过检测耐药基因可克服培养限 制，如PCR技术，荧光原位杂交技术，全基因组测序等，从耐药基因角度检测耐药性。但是， 由于耐药基因需要表达后才具有耐药性，因此，携带耐药基因的菌或通过转移获得耐药基因 的菌不一定具有耐药性，造成误判。并且，具有相同耐药性的菌携带的耐药基因不尽相同甚 至未知，限制了基于耐药基因检测方法的应用。
拉曼光谱是一种可从单细胞到群体水平提供微生物组成的光学谱图。拉曼光谱与重水稳 定同位素标记结合，利用活性细胞对重水的同化作用，使得细胞拉曼谱图中出现新的碳氘 (C-D)峰，细胞活性越高，C-D峰越强。利用这一拉曼特征，现有技术中存在一种基于拉 曼光谱-重水同位素标记的耐药菌药敏快速检测方法：细菌在含有重水和抗生素的培养液中 孵育，利用抗生素作用下，耐药菌“饮用”重水活性高于敏感菌，即同化重水氘的程度高于敏 感菌，产生更强的C-D峰，从而实现耐药菌和敏感菌的区分。然而，该方法面临C-D峰强度 小，耐药菌和敏感菌C-D峰区分度小，以及条件摸索复杂等问题。C-D峰的强度不仅取决于 细胞活性，还与培养液中氘含量和孵育时间密切相关。细菌在同化氘的同时，也在同化氢， 而培养液中含氢物质的种类和含量远远高于氘，如水、碳源、氨基酸等。氢的同时大量同化 减小了氘的同化速度，造成C-D峰随孵育时间或细胞活性的增长速度大大减小。并且，为了 实现快速检测，孵育时间被缩短至0.5-2h，进一步牺牲了C-D峰强度，造成了耐药菌和敏感 菌C-D峰区分度小，降低了重水标记方法检测耐药菌的灵敏度。
发明内容
针对上述方法存在的问题至少之一，本发明提供一种耐药微生物的筛选方法
包括：
S1：将含有一种或多种微生物的处理样品放入含有重水的培养液培养以进行氘标记；
S2：将S1中的经氘标记的所述处理样品转入含抑制微生物药物的无重水培养液中进行去 氘孵育；
S3：将S2中经去氘孵育的所述处理样品进行拉曼光谱检测，并根据所述拉曼光谱的检测 结果进行所述耐药微生物的筛选。
可选的，所述根据所述拉曼光谱的检测结果进行所述耐药微生物的筛选，包括：
将C-D峰比值大于等于第一阈值的微生物确定为药敏微生物；和/或，将C-D峰比值小于 第一阈值的微生物确定为耐药微生物。本发明所称的C-D峰比值系指CD/(CD+CH)。
可选的，所述根据所述拉曼光谱的检测结果进行所述耐药微生物的筛选，包括：
将存在C-D峰的微生物确定为药敏性微生物；和/或，将不存在C-D峰的微生物确定为耐 药性微生物。
可选的，所述第一阈值为10％。
优选的，所述S1中，所述含有重水的培养液中的重水浓度为A，100％≥A≥30％，且所述 S1的进行氘标记的培养时间为T，24小时≥T≥2小时。
优选的，所述重水浓度为40％、50％、60％、70％、80％、90％中的一种；所述培养时间 为2小时、3小时、5小时、8小时、10小时、12小时、16小时、20小时中的一种。
优选的，所述含抑制微生物药物的无重水培养液中，所述抑制微生物药物的浓度为1-10 倍的MIC；所述去氘孵育时间为0.5-8小时。
优选的，所述抑制微生物药物的浓度为1倍MIC、2倍MIC、4倍MIC、5倍MIC、7倍MIC、8倍MIC、9倍MIC中的一种；所述孵育时间为0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时中的一 种。
优选的，所述拉曼光谱的检测条件为：激发光的波长为532nm或632.8nm或633nm或785nm或1064nm，物镜的放大倍数为40×-100×。
优选的，所述S1包括：将含有耐药性第一微生物的第一处理样品放入含有重水的第一培 养液中进行氘标记；将含有药敏性第二微生物的第二处理样品放入含有重水的第二培养液中 进行氘标记，将经氘标记的所述第一处理样品及经氘标记的所述第二处理样品混合以形成经 氘标记的所述处理样品，所述第一培养液及所述第二培养液的氢含量不同。
优选的，所述耐药微生物的筛选还包括确定耐药转移频率，所述确定耐药转移频率包括： 利用显微拉曼对特定种类微生物进行单细胞水平检测，获得所述特定种类微生物的总数S以 及所述特定种类微生物中耐药微生物的个数s，所述耐药性转移频率＝s/S。
优选的，所述第一培养液为含有重水的寡营养无机盐培养液，所述第二培养液为含有重 水的富营养LB培养液；
或者
所述第二培养液为含有重水的寡营养无机盐培养液，所述第一培养液为含有重水的富营 养LB培养液。
优选的，所述氘标记孵育时间为12-16小时。
优选的，所述微生物包括细菌和/或真菌。
本发明采用的重水逆向标记的技术原理是：
将含有多种微生物的处理样品放在含重水的培养液中孵育进行氘标记，获得足够强度的 C-D峰，再将氘标记后的处理样品在含抑制微生物药物不含重水的培养液中短时间孵育进行 去氘孵育；然后对去氘孵育后的处理样品进行拉曼光谱检测，并根据检测结果进行耐药微生 物的筛选，具体的，由于在抗生素作用下，仍具活性的微生物(耐药微生物)C-D峰被C-H 快速取代而减小至消失，而药敏微生物代谢受阻，C-D峰仍保持，利用拉曼检测这一特征区 分耐药和敏感菌即可完成对于耐药微生物的筛选。
由于不含重水的培养液中含有大量的水，和/或其它多种含氢的物质，对于有代谢活性 的氘标记微生物(耐药微生物)，其含有的氘会在很短的时间内被外界大量氢所取代，在拉 曼光谱下C-D峰快速消失。由于培养液中氢的含量远远高于氘，因此本发明的处理样品C-D 峰的下降速度要显著大于现有技术中C-D峰的增长速度，因此本发明具有灵敏度更高的优点。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明 显和容易理解，其中：
图1为本发明筛选方法的拉曼光谱结果示意图
图2为本发明筛选方法与现有技术对比示意图；
图3为本发明第三实施例的实验结果示意图；
图4为本发明转化率实验结果示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人 员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于 本发明的保护范围。
以下以微生物为细菌进行举例说明，此时，耐药微生物为耐药菌，药敏微生物为药敏菌，抑制微生物药物为抗菌药。
实施例1
步骤1：将含有多种细菌的处理样品，即包括耐药菌与敏感菌的处理样品在含有30-100％ 重水的培养液中培养2-24小时。
例如，具体的，可以在12孔板中加入1.5mL含50％重水的无机盐培养液，培养液中接 种药敏菌、多粘菌素耐药菌和氨苄青霉素耐药菌。摇床37℃孵育2小时，取出菌液。
步骤2：取出培养后的菌液进行两次离心清洗，清洗液为去离子水或缓冲液，条件是： 5000rpm，每次离心2分钟。
步骤3：将清洗后的菌接种到含有抗菌药(例如抗生素)但不含重水的培养液中孵育0.5-8 小时，如孵育1小时，以不含抗菌药不含重水的培养液作为对照，抗菌药的浓度为最小抑菌 浓度MIC值的1倍-10倍。
例如，具体的，可以在12孔板中加入1.5mL含1×MIC多粘菌素、1×MIC氨苄青霉素的LB 培养液和不含抗生素的LB培养基(阳性对照)，在培养液中接种上述敏感和耐药菌，LB培 养液的配方是10g·L-1蛋白胨，5g·L-1酵母提取物，和10g·L-1氯化钠。孵育1小时后，取出菌液。
步骤4：将孵育后的处理样品进行两次离心清洗，清洗液为去离子水或缓冲液，条件是： 5000rpm，每次离心2分钟。清洗后细菌样品滴在低拉曼背景基底上，空气中干燥备用，或 者将清洗后细菌溶液放在微流控芯片或毛细管中，在溶液状态下备用。例如，具体的，可以 将1μL清洗后菌液滴在铝箔纸上，空气中干燥后，进行拉曼光谱检测。
步骤5：利用拉曼光谱检测制备好的细菌样品。激发光波长选择532nm或633nm或785nm 或1064nm，光栅300-1200g/mm，物镜倍数为40×-100×。
根据是否存在C-D峰(2040-2300cm-1)或C-D峰比值(CD/(CD+CH))大小，区分耐 药菌与敏感菌，不含C-D峰或C-D峰比值小于等于10％为耐药菌，含C-D峰或C-D峰比大于10％为敏感菌。如图1所示，本实施例所获多粘菌素耐药菌和氨苄青霉素耐药菌在各自抗生素压力下均无C-D拉曼峰，而敏感菌则有明显的C-D峰，据此可区分耐药和敏感菌，并验证了该方法对多种抗生素耐药菌有适用性。
本实施例的方法，相比现有技术而言具有更高的灵敏度，具体的，采用本实施例的方法 (逆向标记)与现有技术(正向标记)对比情况如图2所示，由图2可知，在逆向标记处理组 中，两种耐药菌在0.5小时后C-D峰明显下降，在1小时后C-D峰几乎消失；敏感菌的C-D峰无 明显变化。在正向标记处理组中，耐药菌的C-D峰随时间增长缓慢，在0.5小时甚至1小时时， C-D比值与0小时无显著增加。更为重要的是，逆向标记1小时后，不同耐药菌和敏感菌的C-D 差值均显著大于正向标记，而正向标记甚至在1小时仍无法区分(图2b)，证明了逆向标记 在判别耐药菌和敏感菌时区分度更大，更灵敏，且快速。并且，由于逆向标记1小时后C-D 峰全部消失，更利于直观可视化判别耐药菌，无需计算C-D比值。
实施例2
本实施例与实施例1不同之处在于：本实施例考虑耐药基因的转移过程分析；具体的， 包括以下步骤：
步骤101：将含有耐药性第一菌的第一处理样品放入含有重水的第一培养液中进行氘标 记；例如，将含有耐药菌A的第一处理样品放入含有50％浓度重水的无机盐培养液中培养 一定时间，如12小时；
步骤102：将含有药敏性第二菌的第二处理样品放入含有重水的第二培养液中进行氘标 记；例如，将含有药敏菌B的第二处理样品放入含有50％浓度重水的LB培养液中培养一定 时间，如12小时。由于第一培养液与第二培养液的H含量不同，因此，其氘标记后的C-D 峰和/或C-D峰比值不同，如，无机盐培养液由于含有H较少，因此，C-D峰较高，而LB 培养液中H较多，因此，C-D峰较低。具体的，例如，将具有耐药质粒的供体细胞(耐药 菌)和受体细胞(药敏菌)分别在含50％重水的无机盐培养液和LB培养液中培养12小时， 标记上不同强度的C-D峰，供体细胞C-D峰高，受体细胞C-D峰低。
步骤103：将经氘标记后的第一处理样品和第二处理样品混合，并将混合后的处理样品 于含有一定浓度重水的溶液中进行孵育一定时间，例如将混合后的处理样品于含有50％浓度 重水的磷酸缓冲液中孵育3小时。该过程为接合过程，在该接合过程中，耐药菌的耐药基因 可转移至药敏菌中。具体的，例如，取出氘标的供、受体细胞混合，置于含50％重水的磷酸 缓冲液中孵育3小时，进行接合反应。
步骤104：将步骤103孵育后的处理样品执行与实施例1步骤2-5相同的操作。根据前 面描述，通过拉曼光谱检测，可以识别出A菌和B菌，以及获得耐药基因的B菌。例如， 具体的，将接合完成的细胞混合液取出，接种至含有1×MIC氨苄青霉素的LB培养液中， 孵育1小时后取出菌液，离心洗涤两遍后，将所获得的菌液在锡箔纸上，空气中干燥后利用 单细胞拉曼光谱进行检测并分析。供体菌(耐药菌)在无机盐培养基中且孵育时间长(12 小时)会摄入较多量的重水，因此具有较高的初始C-D峰；而受体菌在LB培养液中摄入相 对较少的重水，因此具有较低的初始C-D峰。在1小时的孵育后，供体菌的C-D峰会下降， 但依旧有明显的峰值；接收了氨苄抗性质粒的受体菌(接合子)，具有了抗性，C-D峰被彻 底代谢，无C-D峰存在；没有接收质粒的受体菌依旧对抗生素敏感，C-D峰无法被代谢。 无C-D峰或C-D比值＜10％的菌，即可判别为通过耐药基因横向转移获得耐药性的受体菌， 又称接合子。
步骤105：耐药转移频率确定：利用显微拉曼对特定种类微生物进行单细胞水平检测， 获得所述特定种类微生物的总数S以及所述特定种类微生物中耐药微生物的个数s，所述耐 药性转移频率＝s/S；例如，利用显微拉曼对B菌进行单细胞水平检测，根据B菌的总数以及 获得耐用基因的B菌数量从而计算出耐药性转移频率。
本实施例不但能够实现耐药菌的筛选，还能够对耐药性转移情况进行评估，这能够为临 床药物使用提供指导。
实施例3
本实施例与实施例1不同之处在于：本实施例考虑耐药基因的转化过程分析；具体的， 包括以下步骤：
步骤001：将抗生素敏感菌与携带有氨苄耐药基因的质粒载体混合，在42℃孵育90秒， 然后冰浴3分钟，完成转化过程。由于耐药基因会通过转化过程进入抗生素敏感菌体内，从 而导致抗生素敏感菌具有耐药性。
步骤002：执行实施例1的步骤2-5；具体的，对转化后的细菌(即感受态细胞)、抗生素敏感菌(阴性对照)、氨苄青霉素耐药菌(阳性对照)进行氘标记，然后将氘标细菌接种 至含有1×MIC氨苄青霉素的LB培养液中孵育1小时，取出菌液利用超纯水进行离心清洗， 条件是：5000rpm，每次离心2分钟，共2次。将1μL清洗后菌液滴在铝箔纸上，空气中 干燥后，进行拉曼检测。附图3给出载体转化实验鉴别获得耐药性的受体菌的结果，如图 3a所示，抗生素敏感菌(阴性对照)在1小时的孵育后还存在明显的C-D峰，而氨苄青霉 素耐药菌(阳性对照)则无C-D峰。对于转化后的细菌来说，部分细胞C-D峰消失，而部 分依旧有明显C-D峰，说明无C-D峰部分的抗生素敏感菌接收了耐药基因载体产生氨苄抗 性，有C-D峰的细胞依旧敏感。将转化后有、无C-D峰的细菌分别利用激光弹射分离，并 扩增氨苄耐药基因(如图3b所示)，有C-D峰的细胞中无氨苄耐药基因，无C-D峰的细胞 中含有耐药基因，证明发生了耐药基因转化并进一步验证拉曼检验的准确性。
步骤003：将单细胞拉曼检测到的无C-D峰的感受态细胞和总细胞分别计数，两者相除 得到获得耐药质粒的细胞比例，据此可计算转移频率(如图3c所示)。
本实施例的方法也可以研究多种不同未知耐药载体转化进入受体菌的过程，并通过比较 转移频率，评价不同耐药基因载体的转移风险，从而指导临床用药。
参照上述实施例3，对抗生素敏感菌利用美诺培南、万古霉素、氨苄青霉素、环丙沙星、 头孢他啶进行实验，如图4a所示，抗生素敏感菌(阴性对照)在1小时后均有明显的C-D峰。转化后的抗生素敏感菌(即感受态细胞)在美诺培南、万古霉素的处理下均存在明显 C-D峰，说明质粒载体的耐药基因中无可转化的美诺培南、万古霉素抗性基因，而在氨苄青 霉素、环丙沙星、头孢他啶作用下，部分抗生素敏感菌细胞C-D峰消失，说明氨苄青霉素、 环丙沙星、头孢他啶抗性基因可以发生转化。通过计算质粒的转移频率，发现氨苄青霉素抗 性基因的环境传播风险高于环丙沙星、头孢他啶抗性基因高于美诺培南、万古霉素抗性基因(图4b所示)。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱 离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (14)

1.一种耐药微生物的筛选方法，其特征在于，包括：
S1：将含有一种或多种微生物的处理样品放入含有重水的培养液培养以进行氘标记；
S2：将S1中的经氘标记的所述处理样品转入含抑制微生物药物的无重水培养液中进行去氘孵育；
S3：将S2中经去氘孵育的所述处理样品进行拉曼光谱检测，并根据所述拉曼光谱的检测结果进行所述耐药微生物的筛选。
2.根据权利要求1所述的耐药微生物的筛选方法，其特征在于，所述根据所述拉曼光谱的检测结果进行所述耐药微生物的筛选，包括：
将C-D峰比值大于等于第一阈值的微生物确定为药敏微生物；和/或，将C-D峰比值小于第一阈值的微生物确定为耐药微生物。
3.根据权利要求1所述的耐药微生物的筛选方法，其特征在于，所述根据所述拉曼光谱的检测结果进行所述耐药微生物的筛选，包括：
将存在C-D峰的微生物确定为药敏微生物；和/或，将不存在C-D峰的微生物确定为耐药微生物。
4.根据权利要求2所述的耐药微生物的筛选方法，其特征在于，所述第一阈值为10％。
5.根据权利要求1所述的耐药微生物的筛选方法，其特征在于，所述S1中，所述含有重水的培养液中的重水浓度为A，100％≥A≥30％，且所述S1的进行氘标记的培养时间为T，24小时≥T≥2小时。
6.根据权利要求5所述的耐药微生物的筛选方法，其特征在于，所述重水浓度为40％、50％、60％、70％、80％、90％中的一种；所述培养时间为2小时、3小时、5小时、8小时、10小时、12小时、16小时、20小时中的一种。
7.根据权利要求1所述的耐药微生物的筛选方法，其特征在于，所述含抑制微生物药物的无重水培养液中，所述抑制微生物药物的浓度为1-10倍的MIC；所述去氘孵育时间为0.5-8小时。
8.根据权利要求7所述的耐药微生物的筛选方法，其特征在于，所述抑制微生物药物的浓度为1倍MIC、2倍MIC、4倍MIC、5倍MIC、7倍MIC、8倍MIC、9倍MIC中的一种；所述孵育时间为0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时中的一种。
9.根据权利要求1所述的耐药微生物的筛选方法，其特征在于，所述拉曼光谱的检测条件为：激发光的波长为532nm或632.8nm或633nm或785nm或1064nm，物镜的放大倍数为40×-100×。
10.根据权利要求1所述的耐药微生物的筛选方法，其特征在于：所述S1包括：将含有耐药性第一微生物的第一处理样品放入含有重水的第一培养液中进行氘标记；将含有药敏性第二微生物的第二处理样品放入含有重水的第二培养液中进行氘标记，将经氘标记的所述第一处理样品及经氘标记的所述第二处理样品混合以形成经氘标记的所述处理样品，所述第一培养液及所述第二培养液的氢含量不同。
11.根据权利要求10所述的耐药微生物的筛选方法，其特征在于：所述耐药微生物的筛选还包括确定耐药转移频率，所述确定耐药转移频率包括：利用显微拉曼对特定种类微生物进行单细胞水平检测，获得所述特定种类微生物的总数S以及所述特定种类微生物中耐药微生物的个数s，所述耐药性转移频率＝s/S。
12.根据权利要求10所述的耐药微生物的筛选方法，其特征在于：所述第一培养液为含有重水的寡营养无机盐培养液，所述第二培养液为含有重水的富营养LB培养液；
或者
所述第二培养液为含有重水的寡营养无机盐培养液，所述第一培养液为含有重水的富营养LB培养液。
13.根据权利要求10所述的耐药微生物的筛选方法，其特征在于：所述氘标记孵育时间为12-16小时。
14.根据权利要求1-13任一项所述的筛选方法，其特征在于：所述微生物包括细菌和/或真菌。
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