CN110231330A - 一种单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法 - Google Patents

一种单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，包括如下步骤：利用N组含有不同浓度的同位素D2O标记的培养基培养氨氧化古菌，并对所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心、洗涤、风干，再选取一定量的细胞区域进行拉曼光谱的测定，根据N组培养基中所述同位素D2O的浓度和计算获得的C‑D％绘制标准曲线，获取回归方程；提供氨氧化古菌样品进行代谢活性分析。上述方法可用于定量分析氨氧化古菌的代谢活性，该方法是进行原位检测，检测速度快、检测精度高、样品消耗量少、对细胞菌体没有破坏性，适用范围广。

Description

一种单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法
技术领域
本发明涉及生物活性检测，尤其涉及一种单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法。
背景技术
氨氧化古菌能够合成氨单加氧酶(AMO)，从而催化氨氧化作用，将氨氧化为NO2 -。氨氧化古菌驱动了硝化作用的开始，主导了全球氮元素循环的中心环节。所以测定氨氧化古菌在环境中的活性对判断环境中氮循环过程非常重要。
通常采用测定氨氧化古菌氨氧化速率的方法直接体现其代谢活性：(1)15N同位素收支平衡法是指通过添加15N标记的NO3 -，新合成的NO3 -对系统中的15NO3 -起到稀释的作用，通过气相色谱-同位素质谱技术检测NO3 -中15N同位素的丰度，来推算氨氧化过程的速率，(2)抑制法是一些化学试剂阻断氨氧化过程，通过检测NH4 +的积累的量反推算氨氧化速率。但这两种方法均存在检测精度较低、不能测定特定类群氨氧化速率的缺点。
此外，还有一些在基因层面间接体现氨氧化古菌代谢活性的方法：(1)通常用定量PCR测定氨氧化古菌amoA基因绝对含量的方法表征生物活性，在对潜在微生物群落种类测定上可能会存在偏差，而且仅仅测定amoA基因的绝对含量，并不能完全代表其生物活性。(2)cDNA定量数据也是可以间接判断生物活性的方法，但cDNA定量的方法消耗的样品量非常多，一个样品需要几升的菌液，才可以完成测定，对原始培养样品中的生物生长影响很大；工作量大，实验成本高，耗时长：需要添加各种反应体系，很多次的样品处理以及几个小时的上机运行；处理过的样品不能再次利用，对细胞处于完全破坏状态。
发明内容
本发明的目的在于提供一种单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，旨在解决现有技术中氨氧化古菌代谢活性检测方法耗时耗量、非原位检测对细胞破坏性强、精确度低的问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，包括如下步骤：
提供N组含有同位素D2O标记的培养基，且所述N组培养基中所述同位素D2O的浓度各不相同，其中，N大于等于5；采用所述N组含有同位素D2O标记的培养基分别对氨氧化古菌进行培养，培养至氨氧化古菌体中D原子达到饱和，收集氨氧化古菌细胞菌液；
将所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心、洗涤，得到洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液；
将所述洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液滴加到载玻片上进行风干，选取一定量的细胞区域进行拉曼光谱的测定；
以2170cm-1作为峰中心、260cm-1作为宽度，计算不同浓度D2O标记氨氧化古菌的拉曼光谱2040～2300cm-1范围的C-D特征区域的积分光谱强度；以2950cm-1作为峰中心、300cm-1作为宽度，计算不同浓度D2O标记氨氧化古菌的拉曼光谱2800～3100cm-1范围的C-H特征区域的积分光谱强度，计算不同浓度D2O标记氨氧化古菌的C-D特征区域的积分光谱强度占C-D特征区域和C-H特征区域的总积分光谱强度的百分比，标记为C-D％；根据N组培养基中所述同位素D2O的浓度和计算获得的C-D％绘制标准曲线，获取回归方程；
提供含有同位素D2O标记的培养基培养待测的氨氧化古菌样品，得到氨氧化古菌细胞菌液；将所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心、洗涤，得到高浓度的洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液，将所述高浓度的洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液滴加到载玻片上进行风干，选取一定量的细胞区域进行拉曼光谱的测定；分析拉曼光谱2800～3100cm-1范围的C-H特征区域的积分光谱强度，分析所述氨氧化古菌的代谢活性。
与现有技术相比，所述一种单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，
单细胞拉曼显微光谱是一种快速的非破坏性振动光谱方法，每个细胞的拉曼光谱都由细胞成分决定。拉曼光谱记录了系统中分子固有特性的振动、旋转和其他低频模式，它能代表分子或系统的化学指纹。根据不同细胞的拉曼光谱能够揭示单个细胞的固有化学信息，所有生化组分信息的叠加构成了激光焦点中细胞的拉曼光谱。当拉曼光谱与稳定同位素标记结合使用时，可以用于特定微生物或者未纯培养微生物代谢活性的测定。用一定浓度的稳定同位素D2O培养氨氧化古菌时，氨氧化古菌的拉曼光谱在2040～2300cm-1处会出现C-D特征区域的积分光谱；随着D2O培养浓度的增加，此峰的峰高会随之增加，从而可以测定其代谢活性。
首先，采用所述N组含有同位素D2O标记的培养基分别对氨氧化古菌进行培养，其中，所述N组培养基中所述同位素D2O的浓度各不相同，且N大于等于5，并且培养得到的氨氧化古菌体中D原子达到饱和；本发明选择使用同位素标记底物D2O进行标记，对样品的培养环境条件影响较小，不会对样品产生毒副作用，分别采用了N组同位素D2O的浓度各不相同的培养基进行培养，且N大于等于5，确保有一定数量不同浓度的样品能够绘制标准曲线进行后续的实验分析。
其次，对将所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心、洗涤处理，得到高浓度的氨氧化古菌细胞菌液，取所述高浓度的氨氧化古菌细胞菌液烘干再直接进行检测，所述高浓度的氨氧化古菌细胞菌液是直接从基质中分离得到的少量样品，不会破坏样品原有的正常生长，同时，所述氨氧化古菌细胞菌液为高浓度样品，所需用量较少；接着，选取一定量的细胞区域进行拉曼光谱的测定，并分析所述氨氧化古菌的代谢活性，选择拉曼光谱进行原位检测氨氧化古菌，其中，拉曼光谱对细胞大小的检测限为0.1μm，检测精度非常高；检测过程中，只需要选取一定量的细胞区域即可进行拉曼光谱的测定，检测速度快，同时，不会对氨氧化古菌细胞造成破坏性的影响。
最后，再以2170cm-1作为峰中心、260cm-1作为宽度，计算不同浓度D2O标记氨氧化古菌的拉曼光谱2040～2300cm-1范围的C-D特征区域的积分光谱强度；以2950cm-1作为峰中心、300cm-1作为宽度，计算不同浓度D2O标记氨氧化古菌的拉曼光谱2800～3100cm-1范围的C-H特征区域的积分光谱强度，计算不同浓度D2O标记氨氧化古菌的C-D特征区域的积分光谱强度占C-D特征区域和C-H特征区域的总积分光谱强度的百分比，标记为C-D％；根据N组培养基中所述同位素D2O的浓度和计算获得的C-D％绘制标准曲线，获取回归方程。
再提供含有同位素D2O标记的培养基培养待测的氨氧化古菌样品，得到氨氧化古菌细胞菌液；将所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心、洗涤，得到高浓度的洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液，将所述高浓度的洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液滴加到载玻片上进行风干，选取一定量的细胞区域进行拉曼光谱的测定；分析拉曼光谱2800～3100cm-1范围的C-H特征区域的积分光谱强度，分析所述氨氧化古菌的代谢活性。其中，所述高浓度的氨氧化古菌细胞菌液是直接从基质中分离得到的少量样品，不会破坏样品原有的正常生长，同时，所述氨氧化古菌细胞菌液为高浓度样品，所需用量较少；接着，选取一定量的细胞区域进行拉曼光谱的测定，并分析所述氨氧化古菌的代谢活性，选择拉曼光谱进行原位检测氨氧化古菌，其中，拉曼光谱对细胞大小的检测限为0.1μm，检测精度非常高；检测过程中，只需要选取一定量的细胞区域即可进行拉曼光谱的测定，检测速度快，同时，不会对氨氧化古菌细胞造成破坏性的影响。综上，上述方法可用于定量分析氨氧化古菌的代谢活性，该方法是进行原位检测，检测速度快、检测精度高、样品消耗量少、对细胞菌体没有破坏性，适用范围广。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的梯度浓度D2O培养后SCM1的拉曼光谱。
图2是本发明实施例1提供的SCM1古菌培养基中D2O的比例与C-D％之间的关系。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，所述“含有同位素D2O标记的培养基”包括盐溶液和生长元素溶液，在无菌的操作环境中，每升“盐溶液”中加入灭菌后的“生长元素溶液”，混合得到。
所述“盐溶液”的配制方法为：按照用量将每种盐的固体粉末溶于超纯水中，每升超纯水中加入26g氯化钠(NaCl)、5g硫酸镁(MgSO4 2-·7H2O)、5g氯化镁(MgCl2·6H2O)、1.5g氯化钙(CaCl2·2H2O)和0.1g溴化钾(KBr)，将配好的盐溶液放在高压灭菌锅中灭菌冷却后放在4℃备用。
所述“生长元素溶液”的配方如表1，
表1盐溶液中需加入的溶液及用量
所述“HEPES缓冲液(HEPES，1M；NaOH，0.6M)”配制方法：将12g氯化钠溶于超纯水中，向另外200mL超纯水中缓慢加入119.2g HEPES和氢氧化钠溶液直至HEPES被完全溶解。添加超纯水至450mL，在30℃调节pH至7.6，定容到500mL，用高压灭菌锅灭菌冷却后放在4℃备用。
所述“碳酸氢钠溶液(NaHCO3，1M)”的配制方法：用超纯水将84g碳酸氢钠溶解并定容到1L，将溶液分配到瓶中，留下约1/3的顶部空间。反复冲洗和摇动使顶部空间充满CO2并使溶液饱和，瓶子用橡胶塞紧紧封闭并高压灭菌冷却后放在4℃备用。
所述“磷酸二氢钾溶液(KH2PO4，2.93mM)”的配制方法：用超纯水将0.4g磷酸二氢钾溶解并定容到1L，用高压灭菌锅灭菌冷却后放在4℃备用。
所述“乙二胺四乙酸铁钠溶液(C10H12FeN2NaO·8.3H2O，7.5mM)”的配制方法：用超纯水将2753mg乙二胺四乙酸铁钠溶解并定容到1L，用高压灭菌锅灭菌冷却后放在4℃备用。
所述“氯化铵(NH4Cl，1M)”的配制方法：用超纯水将53.5g氯化铵溶解并定容到1L，用高压灭菌锅灭菌冷却后放在4℃下备用。
所述“微量元素混合溶液”的配制方法：按照表2配制微量元素混合溶液，这个配方不含铁，微量元素混合物在瓶子中高压灭菌，用橡胶密封的螺帽或固定塞子紧紧关闭。必须留下约1/3体积的顶部空间，冷却后放在4℃保存备用。
表2微量元素混合溶液中需加入的试剂及用量
本发明实例提供一种单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，包括如下步骤：
S01.提供N组含有同位素D2O标记的培养基，且所述N组培养基中所述同位素D2O的浓度各不相同，其中，N大于等于5；采用所述N组含有同位素D2O标记的培养基分别对氨氧化古菌进行培养，培养至氨氧化古菌体中D原子达到饱和，收集氨氧化古菌细胞菌液；
S02.将所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心、洗涤，得到高浓度的洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液；
S03.将所述高浓度的洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液滴加到载玻片上进行风干，选取一定量的细胞区域进行拉曼光谱的测定；
S04.以2170cm-1作为峰中心、260cm-1作为宽度，计算不同浓度D2O标记氨氧化古菌的拉曼光谱2040～2300cm-1范围的C-D特征区域的积分光谱强度；以2950cm-1作为峰中心、300cm-1作为宽度，计算不同浓度D2O标记氨氧化古菌的拉曼光谱2800～3100cm-1范围的C-H特征区域的积分光谱强度，
计算不同浓度D2O标记氨氧化古菌的C-D特征区域的积分光谱强度占C-D特征区域和C-H特征区域的总积分光谱强度的百分比，标记为C-D％；根据N组培养基中所述同位素D2O的浓度和计算获得的C-D％绘制标准曲线，获取回归方程；
S05.提供含有同位素D2O标记的培养基培养待测的氨氧化古菌样品，得到氨氧化古菌细胞菌液；将所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心、洗涤，得到高浓度的洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液，将所述高浓度的洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液滴加到载玻片上进行风干，选取一定量的细胞区域进行拉曼光谱的测定；分析拉曼光谱2800～3100cm-1范围的C-H特征区域的积分光谱强度，分析所述氨氧化古菌的代谢活性。
具体的，在上述步骤S01中，提供N组含有同位素D2O标记的培养基，且所述N组培养基中所述同位素D2O的浓度各不相同，其中，N大于等于5；采用所述N组含有同位素D2O标记的培养基分别对氨氧化古菌进行培养，培养至氨氧化古菌体中D原子达到饱和，收集氨氧化古菌细胞菌液；
具体的，所述氨氧化古菌为Nitrosopumilus maritimus SCM1，是目前分离得到的唯一一株来自海洋的氨氧化古菌，所述氨氧化古菌的细胞体积较小，其直径仅为0.17～0.22μm，长度为0.5～0.9μm。
具体的，提供N组含有同位素D2O标记的培养基，且所述N组培养基中所述同位素D2O的浓度各不相同，其中，N大于等于5。采用所述N组含有同位素D2O标记的培养基分别对氨氧化古菌进行培养，培养至氨氧化古菌体中D原子达到饱和，收集氨氧化古菌细胞菌液。其中，所述“含有同位素D2O标记的培养基”的配方及配制方法如上文所述，此处不再详细论述。在培养基中添加同位素D2O进行氨氧化古菌进行培养，在细胞进行传代培养的过程中，D2O参与细胞的代谢过程，增加细胞中同位素D2O的含量。在本发明优选实施例中，所述“含有同位素D2O标记的培养基”中，以所述培养基的质量为100％，所述的同位素D2O的质量百分含量为0～50％，且不为0，若同位素D2O的质量添加量过量，由于D2O本身有轻微毒性，若添加量大于50％，则会影响细胞的培养环境，使细胞培养条件受到较大的影响，进而对细胞产生毒副作用，抑制细胞生长，使细胞的生长量无法达到平台期的数量，会影响后续的测验。
具体的，本发明提供N组含有同位素D2O标记的培养基，且所述N组培养基中所述同位素D2O的浓度各不相同，其中，N大于等于5；且所述提供的N组含有同位素D2O标记的培养基中，每组采用三个平行样品进行测定，确保有一定数量不同浓度的样品能够绘制标准曲线进行后续的实验分析。
优选的，在所述利用含有同位素标记的培养基培养氨氧化古菌的步骤中，所述培养的时间为15～18天，所述培养的温度为28～30℃。控制所述培养时间为15～18天，使所述培养的样品中，所述氨氧化古菌细胞的生长量达到平台期数量，同时同位素D2O在细胞中的含量达到饱和，若培养时间太短，则会导致所述氨氧化古菌细胞的生长量达不到平台期细胞的数量，数量较少且细胞大小不均匀，后续利用拉曼光谱进行分析的过程中，无法选择细胞均匀的区域进行分析，影响分析数据；当培养时间为15～18天时，可以确保细胞的生长已经达到平台期细胞且同位素D2O在细胞中的含量已达到饱和，因此，若增加培养时间，细胞也不会继续生长，会耗费更多资源，提高成本。控制所述培养的温度为28～30℃，在所述温度下，氨氧化古菌的生长最优，若温度过低，会影响细胞的生长速率；若温度过高，会抑制细胞的生长，造成细胞容易坏死，影响后续检测分析。
利用含有上述浓度的同位素D2O标记的培养基按照上述培养条件培养氨氧化古菌，得到氨氧化古菌细胞菌液，其中，所述氨氧化古菌细胞菌液中含有饱和同位素D2O，保证所述氨氧化古菌细胞菌液中含有饱和同位素D2O，使处理得到的所述氨氧化古菌细胞菌液为高浓度样品，使检测分析所需用量较少，使用方便快捷。分别采用了N组同位素D2O的浓度各不相同的培养基进行培养，且N大于等于5，确保有一定数量不同浓度的样品能够绘制标准曲线进行后续的实验分析。
具体的，在上述步骤S02中，将所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心、洗涤，得到高浓度的洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液。优选的，将所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心处理，得到氨氧化古菌细胞菌体。优选的，在所述离心处理步骤中，所述氨氧化古菌细胞菌液的选取量为0.5～2mL；若选取氨氧化古菌细胞菌液的选取量过少，则收集得到细胞数量过少，利用拉曼光谱分析时，无法挑选到大小均一的的细胞区域进行分析，会影响分析结果；若选取的氨氧化古菌细胞菌液的选取量过多，则收集得到的细胞数量过多，后续利用拉曼光谱分析时，细胞会紧凑堆积大量聚集，影响细胞形态，利用拉曼光谱分析时，无法挑选到分散合理的的细胞区域进行分析，会影响分析结果。在本方具体实施例中，选取氨氧化古菌细胞菌液的选取量为1mL，将所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心处理，得到氨氧化古菌细胞菌体。
优选的，所述离心转速为10000g～12000g，所述离心时间为3～5min；在上述离心条件下进行离心，可以将菌体全部沉淀，使培养基与菌体进行分离，若离心转速较低或离心时间太短，则离心效果不好，菌体沉淀不完全、较松散，培养基中也会存在一部分菌体，使培养基去除不彻底，使细胞表面附着培养基的杂质，影响拉曼光谱的检测。
优选的，在所述洗涤的步骤中，采用超纯水进行洗涤，洗涤的主要目的是将培养基中的含盐杂质去除；若不用超纯水进行洗涤，则风干后得到的细胞表面会形成盐离子结晶，会影响细胞的检测。在本发明优选实施例中，所述添加超纯水进行洗涤的具体步骤如下：
G01.将所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心得到氨氧化古菌细胞菌体；
G02.在所述氨氧化古菌细胞菌体中添加1～2mL超纯水，混匀得到第一混合物；
G03.将所述第一混合物进行离心洗脱，得到第二混合物；
G04.在所述第二混合物中加入5～40μL超纯水，吸打混匀得到所述洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液。
具体的，在上述步骤G01中，将所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心得到氨氧化古菌细胞菌体，具体的离心处理步骤如上所述，此处不再进行详细阐述。
具体的，在上述步骤G02中，在所述氨氧化古菌细胞菌体中添加1～2mL超纯水，混匀得到第一混合物；所述氨氧化古菌细胞菌体为所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心处理、去除培养基得到的，在所述氨氧化古菌细胞菌体中添加1～2mL超纯水，利用移液枪吸打菌体进行混匀得到第一混合物，所述第一混合物为氨氧化古菌细胞菌体的水溶液。
在上述步骤G03中，将所述第一混合物进行离心洗脱，得到第二混合物；优选的，所述离心洗脱步骤中，离心转速为10000g～12000g，所述离心时间为3～5min，在上述离心条件下进行离心，可以将菌体全部沉淀，使菌体洗涤效果较好，若离心转速较低或离心时间太短，则离心效果不好，菌体洗涤不完全、洗涤效果较差，导致菌体表面仍然残留部分盐离子。
具体的，在上述步骤G04中，在所述第二混合物中加入5～40μL超纯水，吸打混匀得到所述洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液。在洗涤干净后得到的第二混合物中，加入5～40μL超纯水，再次吸打混匀，得到所述洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液，得到的所述洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液中细胞浓度适中，能够用于后续拉曼光谱的检测。在本发明具体实施例中，加入10～20μL超纯水，吸打混匀得到所述洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液。
优选的，所述所述洗涤步骤中，洗涤次数为3～5次，若洗涤次数较少，则得到的氨氧化古菌细胞仍会有盐离子残留，影响后续拉曼光谱的检测。
具体的，在上述步骤S03中，将所述洗涤后氨氧化古菌细胞菌液滴加到载玻片上进行风干，在本发明优选实施例中，滴加1～4μL洗涤后氨氧化古菌细胞菌液到载玻片上，进行自然风干，确保所述滴加到载玻片上的菌液包括700-1000个细胞，并保证细胞分散均匀，有利于拉曼光谱检测。在本发明具体实施例中，滴加2μL洗涤后氨氧化古菌细胞菌液到载玻片上，进行自然风干。
具体的，在自然风干的载玻片上选取一定量的细胞区域进行拉曼光谱的测定，在本发明优选实施例中，所述一定量的细胞区域的细胞数量为40～60个，选取所述细胞区域保证所选细胞大小均一，为椭圆形状，细胞分散均匀进行检测，得到的结果更有参考价值。优选的，采用拉曼光谱进行细胞测定，并进行分析，即120～180个光谱的平均值，进一步分析所述氨氧化古菌的代谢活性。
具体的，在上述步骤S04中，以2170cm-1作为峰中心、260cm-1作为宽度，计算不同浓度D2O标记氨氧化古菌的拉曼光谱2040～2300cm-1范围的C-D特征区域的积分光谱强度；以2950cm-1作为峰中心、300cm-1作为宽度，计算不同浓度D2O标记氨氧化古菌的C-D特征区域的积分光谱强度占C-D特征区域和C-H特征区域的总积分光谱强度的百分比，标记为C-D％；根据N组培养基中所述同位素D2O的浓度和计算获得的C-D％绘制标准曲线，获取回归方程；
由于选择的含有同位素D2O标记的培养基的组数大于等于5，且每组采用三个平行样品进行测定。因此，制备得到的线性方程可信度高。
具体的，上述步骤S05中，提供含有同位素D2O标记的培养基培养待测的氨氧化古菌样品，得到氨氧化古菌细胞菌液；将所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心、洗涤，得到高浓度的洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液，将所述高浓度的洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液滴加到载玻片上进行风干，选取一定量的细胞区域进行拉曼光谱的测定；分析拉曼光谱2800～3100cm-1范围的C-H特征区域的积分光谱强度，分析所述氨氧化古菌的代谢活性。
其中，所述高浓度的氨氧化古菌细胞菌液是直接从基质中分离得到的少量样品，不会破坏样品原有的正常生长，同时，所述氨氧化古菌细胞菌液为高浓度样品，所需用量较少；接着，选取一定量的细胞区域进行拉曼光谱的测定，并分析所述氨氧化古菌的代谢活性，选择拉曼光谱进行原位检测氨氧化古菌，其中，拉曼光谱对细胞大小的检测限为0.1μm，检测精度非常高；检测过程中，只需要选取一定量的细胞区域即可进行拉曼光谱的测定，检测速度快，同时，不会对氨氧化古菌细胞造成破坏性的影响。
综上，上述方法可用于定量分析氨氧化古菌的代谢活性，该方法是进行原位检测，检测速度快、检测精度高、样品消耗量少、对细胞菌体没有破坏性，适用范围广。
进一步地，以纯培养的海洋氨氧化古菌SCM1为模式菌株，利用上述方法建立快速测定氨氧化古菌代谢活性新方法。
实施例1
由于氨氧化古菌的筛选和分离很困难，目前为止人类只获得2株氨氧化古菌纯培养物，本发明具体实施例以纯培养的海洋氨氧化古菌SCM1为模式菌株，Nitrosopumilusmaritimus SCM1是唯一一株来自海洋的氨氧化古菌。
利用所述一种单细胞拉曼光谱技术测定SCM1氨氧化古菌代谢活性的方法，包括如下步骤：
利用含有0％、2.5％、10％、25％和50％D2O的培养基孵育SCM1氨氧化古菌细胞，在28℃条件下培养SCM1氨氧化古菌，培养15天后得到SCM1氨氧化古菌细胞菌液，其中，所述SCM1氨氧化古菌细胞菌液中含有饱和同位素D2O；
取1mLSCM1氨氧化古菌细胞菌液进行离心处理，离心转速为10000g，离心时间为3min，得到SCM1氨氧化古菌细胞菌体；
将所述SCM1氨氧化古菌细胞菌体进行洗涤，添加1.5mL超纯水进行洗涤，加水后吸打混匀清洗菌体，再在离心转速为10000g的条件下离心3分钟，用超纯水洗涤三次，最后用10～20μL超纯水吸打混匀菌体，得到洗涤后的SCM1氨氧化古菌细胞菌液；
将所述洗涤后SCM1氨氧化古菌细胞菌液滴加2μL到载玻片上进行自然风干，选取一定量的细胞区域进行拉曼光谱的测定，所述一定量的细胞区域的细胞数量为40～60个，选取所述细胞区域保证所选细胞大小均一，为椭圆形状，细胞分散均匀。
再以2170cm-1作为峰中心、260cm-1作为宽度，计算不同浓度D2O标记氨氧化古菌的拉曼光谱2040～2300cm-1范围的C-D特征区域的积分光谱强度；以2950cm-1作为峰中心、300cm-1作为宽度，计算不同浓度D2O标记氨氧化古菌的拉曼光谱2800～3100cm-1范围的C-H特征区域的积分光谱强度，计算不同浓度D2O标记氨氧化古菌的C-D特征区域的积分光谱强度占C-D特征区域和C-H特征区域的总积分光谱强度的百分比，标记为C-D％；根据N组培养基中所述同位素D2O的浓度和计算获得的C-D％绘制标准曲线，获取回归方程；
根据所述回归方程判定单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的可行性：若得到的回归方程的相关系数R2的数值范围为0.8～1.0，则所述回归方程可以量化所述氨氧化古菌细胞同位素掺入的量，分析氨氧化古菌代谢的代谢活性；若得到的线性回归方程的相关系数R2的数值范围＜0.8，则不能通过所述回归方程进行量化所述氨氧化古菌细胞同位素掺入的量，无法分析氨氧化古菌代谢的代谢活性。
所述SCM1氨氧化古菌的代谢活性分析结果如下：
如图一，利用含有0％、2.5％、10％、25％和50％D2O的培养基孵育SCM1氨氧化古菌细胞的拉曼光谱图，采用100×显微镜物镜、532nm激光、3mw激光功率、1s测量时间和20s累计次数下获得的SCM1古菌细胞典型拉曼光谱；其中，横坐标代表键振动波数，CCD cts代表光子计数器探测到的光子数量。
结果表明氘标记的SCM1氨氧化古菌细胞拉曼光谱中可检测到2040～2300cm-1之间区域出现的强峰。受影响的振动区域是D2O在2162cm-1处的强峰，精确度高且高度可再现。随着D2O培养浓度的增加，D特征峰的高度随之增加。
图2是本发明实施例1提供的SCM1古菌培养基中D2O的比例与C-D％之间的关系。
如图二，计算2040～2300cm-1波长范围内，不同浓度D2O标记下SCM1拉曼光谱的C-D特征区域的积分光谱强度(CCD cts)。通过计算C-D特征区域的积分光谱强度占C-D和C-H特征区域的积分光谱强度的百分比，即C-D％，发现培养基中D2O百分比和C-D％有非常好的线性关系，R2为0.97。说明通过拉曼光谱结合D2O标记可以量化氨氧化古菌的代谢活性，这对于比较不同环境中氨氧化古菌的生长活性具有广泛的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，包括如下步骤：
提供N组含有同位素D2O标记的培养基，且所述N组培养基中所述同位素D2O的浓度各不相同，其中，N大于等于5；采用所述N组含有同位素D2O标记的培养基分别对氨氧化古菌进行培养，培养至氨氧化古菌体中D原子达到饱和，收集氨氧化古菌细胞菌液；
将所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心、洗涤，得到高浓度的洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液；
将所述高浓度的洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液滴加到载玻片上进行风干，选取一定量的细胞区域进行拉曼光谱的测定；
以2170cm-1作为峰中心、260cm-1作为宽度，计算不同浓度D2O标记氨氧化古菌的拉曼光谱2040～2300cm-1范围的C-D特征区域的积分光谱强度；以2950cm-1作为峰中心、300cm-1作为宽度，计算不同浓度D2O标记氨氧化古菌的拉曼光谱2800～3100cm-1范围的C-H特征区域的积分光谱强度，计算不同浓度D2O标记氨氧化古菌的C-D特征区域的积分光谱强度占C-D特征区域和C-H特征区域的总积分光谱强度的百分比，标记为C-D％；根据N组培养基中所述同位素D2O的浓度和计算获得的C-D％绘制标准曲线，获取回归方程；
提供含有同位素D2O标记的培养基培养待测的氨氧化古菌样品，得到氨氧化古菌细胞菌液；将所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心、洗涤，得到高浓度的洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液，将所述高浓度的洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液滴加到载玻片上进行风干，选取一定量的细胞区域进行拉曼光谱的测定；分析拉曼光谱2800～3100cm-1范围的C-H特征区域的积分光谱强度，分析所述氨氧化古菌的代谢活性。
2.根据权利要求1所述的单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，其特征在于，所述含有同位素D2O标记的培养基中，以所述培养基的质量为100％，所述的同位素D2O的质量百分含量为0～50％，且不为0。
3.根据权利要求1所述的单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，其特征在于，所述采用所述N组含有同位素D2O标记的培养基分别对氨氧化古菌进行培养的步骤中，所述培养的时间为15～18天，所述培养的温度为28～30℃。
4.根据权利要求1-3任一所述的单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，其特征在于，所述提供的N组含有同位素D2O标记的培养基中，每组采用三个平行样品进行测定。
5.根据权利要求1-3任一所述的单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，其特征在于，在所述离心的步骤中，离心处理的转速为10000g～12000g，离心处理的时间为3～5min。
6.根据权利要求1-3任一所述的单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，其特征在于，在所述洗涤的步骤中，采用超纯水进行洗涤处理。
7.根据权利要求6所述的单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，其特征在于，所述采用超纯水进行洗涤处理的具体步骤如下：
将所述氨氧化古菌细胞菌液进行离心得到氨氧化古菌细胞菌体；
在所述氨氧化古菌细胞菌体中添加1～2mL超纯水，混匀得到第一混合物；
将所述第一混合物进行离心洗脱，得到第二混合物；
在所述第二混合物中加入5～40μL超纯水，吸打混匀得到所述洗涤后的氨氧化古菌细胞菌液。
8.根据权利要求1-3任一所述的单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，其特征在于，所述洗涤步骤中，洗涤次数为3～5次。
9.根据权利要求1-3任一所述的单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，其特征在于，所述将所述洗涤后氨氧化古菌细胞菌液滴加到载玻片上的步骤中，所述洗涤后氨氧化古菌细胞菌液的滴加量为1～4μL。
10.根据权利要求1-3任一所述的单细胞拉曼光谱技术测定氨氧化古菌代谢活性的方法，其特征在于，所述选取一定量的细胞区域中，所述细胞区域中的细胞数量为40～60个。
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