CN108267437A - 一种基于单细胞拉曼光谱和15n2稳定同位素标记的固氮菌检测方法 - Google Patents

一种基于单细胞拉曼光谱和15n2稳定同位素标记的固氮菌检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于单细胞拉曼光谱和15N2稳定同位素标记的固氮菌检测方法。将待检物以15N2作为氮源进行孵育，再取出孵育后的待检物利用拉曼光谱进行检测并分析，15N同化后引起细胞色素c发生偏移的C‑N拉曼峰作为判别指标。该判别指标拉曼信号强，偏移显著，可明显区分固氮菌和非固氮菌，且谱峰偏移程度可指示固氮菌的固氮活性。另外，共焦显微拉曼可在单细胞水平上检测固氮菌，克服了纯培养的限制，实现环境水体和土壤中固氮菌(包括大量不可培养固氮菌)的检测。此外，拉曼检测是非破化性检测，检测出的固氮菌可用于下游拉曼分选和测序。

Description

一种基于单细胞拉曼光谱和15N2稳定同位素标记的固氮菌检 测方法
技术领域
本发明涉及拉曼光谱检测功能菌分析技术领域。尤其涉及一种基于单细胞拉曼光谱和15N2稳定同位素标记的固氮菌检测方法。
背景技术
氮是维持生命活动最重要的营养元素之一。氮气是氮元素的丰富来源，但由于性质惰性，不能为生物直接利用。氮的生物地球化学循环是将氮转化成生物可利用形式的关键过程。固氮微生物，包括固氮细菌和固氮古菌，可将惰性的氮气转化成生物可利用的氨态氮或硝态氮。据估计，生物可利用氮有一半是由生物固氮过程提供。然而，由于微生物种类和功能及其丰富多样，并且超过99％的环境菌目前无法实现纯培养，造成了对环境中固氮菌的功能和活性的认识仍非常不足。
分子生物学方法通过在基因水平上表征固氮功能基因nifH，可在不依赖纯培养的条件下研究不同生态系统的固氮潜力。多种微生物，包括不可培养的微生物，已被证明具有固氮潜力。然而，一些研究发现nifH基因的存在与固氮活性并不一致，说明在基因水平上具有固氮潜力，并不意味着一定具有固氮能力，因此，仍然需要其他更可靠的方法，指示微生物的固氮活性或能力。稳定同位素标记(Stable isotope probing,SIP)，如15N标记氮气(15N2-SIP)，是研究固氮菌并比较固氮活性的最直接和准确的方法。另外，从单细胞水平上研究环境微生物可克服纯培养或富集培养的限制，因此15N2–SIP与单细胞表征手段结合，可实现直接研究环境中的固氮功能微生物。目前，15N2–SIP与纳米二次离子质谱(NanoSIMS)联用技术，是目前很少的可在单细胞水平上判别固氮微生物的手段。然而，NanoSIMS非常昂贵、维护复杂、拥有该仪器的实验室屈指可数，并且基于质谱分析的NanoSIMS是破化性检测，无法对识别出的功能微生物进行下游的测序或培养。
拉曼光谱是另一种可从单细胞水平上提供微生物组成的指纹图谱，并且，拉曼光谱与稳定同位素结合(如13C，2D2O)，利用微生物同化稳定同位素引起的蛋白、脂类、色素等拉曼谱峰的偏移，已被证明可从单细胞水平上识别出二氧化碳固定菌和肠道菌群中糖代谢的活性菌。对于含有色素的细菌，如细胞色素和胡萝卜素，通过选用合适的激发光，利用激发光与色素电子跃迁能级的匹配，可激发出色素的共振增强拉曼信号，其强度可比普通拉曼高1000倍。并且，拉曼是非破化性检测，拉曼识别出的功能菌可开展下游的分选和测序，大大促进了对环境功能微生物的挖掘。然而，拉曼结合15N用于氮循环功能菌的研究非常少，一个重要原因缺乏明显的15N相关标志峰，即15N引起明显偏移且信号强的谱峰。近期，表面增强拉曼光谱与15N-SIP联用，利用表面增强拉曼光谱对含氮生物分子的选择性增强，获得15N引起明显偏移的标志峰。但表面增强拉曼需要引入纳米粒子进行拉曼信号增强，而纳米粒子极易被环境介质污染，目前仍无法实现在单细胞水平上，研究复杂环境中的固氮微生物。
综上所述，虽然单细胞拉曼-稳定同位素标记联用技术在研究环境功能菌方面具有巨大应用潜力，但该技术仍未能用于固氮微生物的检测。目前仍然缺乏可判别固氮微生物的合适的稳定同位素标记物，以及同位素标记引起的固氮相关的特征偏移拉曼谱峰。
发明内容
本发明的目的在于提供一种单细胞水平检测，不依赖纯培养，适于环境中不可培养固氮菌的检测方法，
为实现上述目的，本发明提供一种基于单细胞拉曼光谱和15N2稳定同位素标记的固氮菌筛选方法，其特征在于，
将待检物以15N2作为氮源进行孵育，再取出孵育后的待检物利用拉曼光谱进行检测并分析，15N同化后引起细胞色素c发生偏移的位于1110-1130cm-1C-N拉曼峰作为固氮菌判别指标，偏移程度作为比较固氮活性的参数。
进一步，
将待检物在原始环境介质或外加碳源；优选的，碳源为葡萄糖；以15N2作为氮源进行孵育，再取出孵育后的待检物利用拉曼光谱进行检测并分析，15N同化后引起细胞色素c发生偏移的C-N拉曼峰作为判别指标。
进一步，所述待检物为含固氮菌的液体或固体样品；优选的，固体样品是土壤。
进一步，所述孵育后的待检物为，将待检物放入可密封瓶中，利用橡胶塞封住瓶口，在橡胶塞上插入两个无菌针头，用作进气口和出气口，鼓入O2和15N2的混合气，取代顶空的全部或部分空气，其中15N2占顶空总氮的10％-100％；优选的，加入4倍于鼓入O2体积的15N2；获得15N2含量占顶空总氮100％的气氛；在室温孵育1天以上，优选的，在室温孵育2-14天，即为孵育后的待检物。
进一步，所述利用拉曼光谱进行检测并分析的检测条件为：激发光为532nm，物镜为50x-100x；优选的，物镜为100x。
进一步，所述利用拉曼光谱进行检测并分析的分析方法为，利用软件比如labspec.软件对1129cm-1的C-14N和1114cm-1的C-15N谱峰进行拟合，计算谱峰积分强度，并计算C-15N/(C-15N+C-14N)谱峰强度比值，以该强度比值对15N2含量百分比作图，获得谱峰变化与15N2含量的线性关系图；
或，对包含C-14N和C-15N谱峰的一段1080-1150cm-1谱图进行PCA分析，利用不同标记比例下谱图的PCA得分对15N2含量百分比作图，获得谱峰变化与15N2含量的线性关系图。
进一步，所述待检物是液体待检物，孵育后直接吸取孵育后的待检物用去离子水离心清洗1-3遍后，将菌液滴在锡箔纸上，空气中干燥后利用拉曼光谱进行检测并分析。
进一步，所述待检物是固体待检物，利用密度梯度离心法分离孵育后的待检物，将所获得的微生物滴在锡箔纸上，空气中干燥后利用拉曼光谱进行检测并分析。
本发明采用的技术方案是：
申请人发现共生和自生固氮菌普遍含有细胞色素c。细胞色素c不仅具有强的共振拉曼谱峰，而且当固氮菌同化15N2后，细胞色素c的C-N峰发生明显偏移，未标记的C-14N出现在1129cm-1，而标记后的C-15N出现在1114cm-1。利用C-15N 1114cm-1峰的出现，可判别固氮菌.利用15N引起的谱图变化程度，可定量固氮活性。基于此发现，申请人利用C-N共振拉曼信号强且偏移明显的特征，建立了单细胞拉曼和15N2稳定同位素标记联用技术，实现了在单细胞水平上研究复杂环境菌群的固氮菌，并定量固氮活性，促进环境固氮功能微生物的研究。
本发明提供的基于单细胞拉曼光谱和15N2稳定同位素标记的固氮菌检测方法，相比于其他检测方法，具有如下特点和优势：
1)该方法的特点包括：单细胞水平检测，不依赖纯培养，适于环境中不可培养固氮菌的检测；以15N2同化引起的C-N共振拉曼谱峰偏移作为固氮菌判别标准，不仅信号强，偏移明显，可明显区分固氮菌和非固氮菌，且谱峰偏移程度可指示固氮菌的固氮活性。判别简单，而且可用于定量分析固氮活性；非破化性检测，可用于下游基于拉曼的固氮菌分选、测序、培养；
2)分子生物学方法表征的是固氮基因，只能说明具有固氮潜力，拉曼-15N2稳定同位素标记给出的固氮表型，可确切说明微生物的固氮能力。
3)质谱与15N2稳定同位素标记联用，可非常灵敏地定量表征固氮菌同化15N的量，从表型上确切判断固氮能力。但普通的同位素比质谱仪需要大量细菌样品，无法做到单细胞水平，无法识别微生物群落中的固氮菌。NanoSIMS虽然可做到单细胞水平，但仪器昂贵、维护复杂、应用不普遍。另外，基于质谱的检测都是非破化性，不能进行下游研究。与此相比，拉曼检测可在单细胞水平上进行，适于复杂环境如土壤中固氮菌的识别，并且是非破化性检测，可用于下游的单细胞分选、测序和培养。
4)乙炔还原法是常用的表征固氮活性的活法，通过检测固氮酶将乙炔还原成乙烯的量，间接表征固氮酶活性。但方法只适用于大量菌的检测，无法做到单细胞水平。与此相比，利用15N2同化引起的C-N振动的拉曼偏移，可定量表征固氮活性。
附图说明
图1为15N2标记后固氮菌的谱峰偏移以及与15N2比例的关系图；
图2为利用单细胞拉曼-15N2稳定同位素标记识别固氮和非固氮菌图；
图3为利用单细胞拉曼-15N2稳定同位素标记识别复杂土壤环境中的固氮菌，并比较固氮活性结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
非固氮菌(Shewanella oneidensis MR-1希瓦氏菌，购自北京百欧博伟生物技术公司。
固氮菌(Azotobacter sp.AS1.222或Azotobacter chroococcum ACCC10096，购自广东省微生物菌种保藏中心。
本发明的方法包括：
a)对纯培养固氮菌进行不同15N2比例标记和拉曼样品制备：
在120mL血清瓶中加入60mL无氮培养基，以氮气作为唯一氮源，培养基组成是：20g·L-1甘露醇,0.2g·L-1KH2PO4,0.8g·L-1K2HPO4,0.2g·L-1MgSO4·7H2O,0.1g·L-1CaSO4·2H2O,微量Na2MoO4·2H2O和FeCl3。顶空体积是60mL，利用橡胶塞封住瓶口，在橡胶塞上插入两个无菌针头，用作进气口和出气口。利用无菌注射器将600μL固氮菌注入血清瓶中。根据下表利用注射器将不同体积的15N2和O2的混合气(体积N2:O2＝4:1)注入血清瓶，与瓶中空气进行部分或全部置换，获得不同含量的15N2。在28度和120rpm下进行48小时的培养。用注射器吸取1mL培养后的标记不同15N比例的固氮菌，用去离子水离心清洗两遍后，将1μL菌液滴在锡箔纸上，空气中干燥后进行单细胞拉曼检测。
表1 15N2占总N2不同比例的气体体积表
b)环境水体微生物15N2标记和拉曼样品制备：
环境水体以厦门杏林湾水体为例，对水体进行10um和3um滤膜过滤去除大颗粒物。在60mL血清瓶中加入30mL过滤后水体，加入10mM葡萄糖作为碳源。利用橡胶塞封住瓶口，在橡胶塞上插入两个无菌针头，用作进气口和出气口。顶空气体体积是30mL，为模拟空气组成，即N2：O2＝4:1,顶空中将加入24mL N2和6mL O2。鼓入O2置换顶空空气，然后加入24mL15N2，获得15N2含量占总氮100％的顶空气氛。在室温孵育2至12天后，用注射器取出20mL，按照步骤a)的离心清洗方法和拉曼样品制备方法，获得待测样品。
c)土壤微生物15N2标记和拉曼样品制备
土壤来自长期未施肥和管理的公园草地土。土壤过筛(0.6mm)去除植物残渣和大颗粒后，称取2g土壤加入12mL血清瓶，再加入500μL 0.5mM葡萄糖作为碳源。密封血清瓶。顶空气体体积大约是10mL，为模拟空气组成，即N2：O2＝4:1,顶空将需8mL 15N2和2mL O2。鼓入O2置换顶空空气，然后加入8mL 15N2，获得15N2含量占总氮约100％的顶空气氛。在室温孵育12天后，利用密度梯度离心法分离土壤微生物悬液和土壤颗粒。将所获得土壤微生物悬液滴在锡箔纸上，空气中干燥后进行拉曼检测。
d)单细胞共振拉曼检测
拉曼检测条件：共焦显微拉曼光谱仪，激发光532nm，光栅600g/mm，物镜100x。每个样品采集10个单细胞的共振拉曼光谱。
拉曼光谱分析方法有两种：i)利用Labspec软件对1129cm-1(C-14N)和1114cm-1(C-15N)的谱峰进行拟合，计算谱峰积分强度，并计算C-15N/(C-15N+C-14N)谱峰强度比值。以该强度比值对15N2含量百分比作图，获得谱峰变化与15N2含量的线性关系图；2)对包含C-14N和C-15N谱峰的一段谱图(1080-1150cm-1)进行PCA分析，利用不同标记比例下谱图的PCA得分对15N2含量百分比作图，获得谱峰变化与15N2含量的线性关系图。
e)固氮菌判别和固氮活性分析
固氮菌判别标准：细菌含有细胞色素c峰，且15N标记后其C-N在1114cm-1出峰，可判别为固氮菌。含细胞色素c，但15N标记后仅在1129cm-1出峰，而在1114cm-1不出峰，或者无细胞色素c峰，可判别为非固氮菌。
固氮活性判别：C-N谱峰偏移与15N2比例呈线性关系，说明了15N同化量越高，引起的偏移越明显。利用15N2相同孵育时间下，C-15N与C-14N峰的强度比例，或者PCA得分，可比较不同菌的固氮活性。
实施例1：
不同15N2比例固氮菌的培养。在120mL血清瓶中加入60mL无氮培养基，以氮气作为唯一氮源，培养基组成是：20g·L-1甘露醇,0.2g·L-1KH2PO4,0.8g·L-1K2HPO4,0.2g·L-1MgSO4·7H2O,0.1g·L-1CaSO4·2H2O,微量Na2MoO4·2H2O和FeCl3。顶空体积是60mL，利用橡胶塞封住瓶口，在橡胶塞上插入两个无菌针头，用作进气口和出气口。利用无菌注射器将600μL浓度为107cfu/mL的固氮菌注入血清瓶中。根据表1利用注射器将不同体积的15N2和O2的混合气(体积N2:O2＝4:1)注入血清瓶，与瓶中空气进行部分或全部置换，获得不同含量的15N2。在28度和120rpm下进行48小时的培养。用注射器吸取1mL培养后的标记不同15N比例的固氮菌(Azotobacter sp.AS1.222，购自广东省微生物菌种保藏中心)，用去离子水离心清洗两遍(5000rpm,5min)后，将1μL菌液滴在锡箔纸上，空气中干燥后进行单细胞拉曼检测。
单细胞拉曼检测:利用共焦显微拉曼光谱仪检测不同15N2比例的固氮菌，激发光532nm,光栅300g/mm，物镜100x。每个样品采集10个单细胞的共振拉曼光谱。结果见图1，图1为15N2标记后固氮菌的谱峰偏移以及与15N2比例的关系图，给出了标记不同比例15N2(100％,50％,25％,10％,0％)固氮菌Azotobacter sp.的单细胞拉曼光谱。图1的a中固氮菌细胞色素c的共振拉曼峰包括749，1114或1129，1312和1589cm-1，15N标记引起的偏移是位于1129cm-1的C-N振动，并且，随着标记比例增加，与C-14N相关的1129峰逐渐下降，而标记后C-15N相关的1114峰逐渐升高(图1的b)，说明14N被15N取代后，由于15N更重，引起C-N振动往低频方向移动。C-15N峰可作为固氮菌的识别标志。另外，利用拉曼软件对1129cm-1(C-14N)和1114cm-1(C-15N)的谱峰进行拟合，计算谱峰积分强度，并计算C-15N/(C-15N+C-14N)谱峰强度比值，即I1114/(I1114+I1129)。以该强度比值对15N2含量百分比作图，获得谱峰变化与15N2含量的线性关系图((图1的c)。另外，申请人也利用Matlab对包含C-14N和C-15N谱峰的一段谱图(1080-1150cm-1)进行PCA主成分分析，利用不同标记比例下谱图的PCA得分PC1对15N2含量百分比作图，获得谱峰变化与15N2含量呈线性关系(图1的d)。以上两个分析都说明15N同化量越多，拉曼谱变化越大。因此，利用15N引起的拉曼谱变化，可定量研究固氮活性。
实施例2
15N标记Azotobacter sp.的培养参见实施例1，非固氮菌Shewanella oneidensis利用Luria Bertani(LB)培养基在28度和180rpm下进行培养。LB配方是10g·L-1蛋白胨,5g·L-1酵母提取物,和10g·L-1氯化钠。培养后细菌经离心清洗两遍后(5000rpm,5min)，滴在铝箔上干燥，用于显微观测和单细胞拉曼检测，结果见图2的利用单细胞拉曼-15N2稳定同位素标记识别固氮和非固氮菌图。其中的a和b分别是Azotobacter sp.AS1.222和S.oneidensis在光学显微镜下用100x镜头下获得的显微图像，可见细菌呈单细胞水平分散，该样品用于单细胞拉曼检测。其中的c是15N2标记的固氮菌Azotobacter sp.AS1.222和非固氮菌S.oneidensis的特征拉曼谱。可以明显看出，固氮菌出现了位于1114的C-15N振动峰，而非固氮菌的C-N振动位于1129cm-1。两者间具有15cm-1的明显差异，利用该差异，可准确判别固氮菌。
实施例3：拉曼-15N2稳定同位素标记用于土壤中固氮菌的判别实验
土壤来自长期未施肥和管理的公园草地土。土壤过筛(0.6mm)去除植物残渣和大颗粒后，称取2g过筛后土壤加入12mL血清瓶，再加入500μL 0.5mM葡萄糖作为碳源。密封血清瓶。顶空气体体积大约是10mL，为模拟空气组成，即N2：O2＝4:1,顶空将需要8mL15N2和2mLO2。鼓入O2置换顶空空气，然后加入8mL 15N2，获得15N2含量占总氮约100％的顶空气氛。在室温孵育12天后，利用密度梯度离心法分离土壤微生物和土壤颗粒。将所获得土壤微生物悬液滴在锡箔纸上，空气中干燥后进行拉曼检测。附图3的a是置于锡箔纸上的提取出的土壤微生物的光学显微图像，根据此图像，无法判断图像中的颗粒来自细菌还是土壤颗粒，更无法判断是否是固氮菌。附图3的d是多个土壤微生物的单细胞拉曼谱图，附图3的b是根据d中位于1114cm-1的C-15N拉曼峰，对图3的a做出的准色彩图像，标注15N是拉曼判别出的固氮菌，附图3的c是根据d中位于1129cm-1的C-14N，对图3的a做出的准色彩图像，标注14N是拉曼判别出的非固氮菌。由于图3的a与b和c来自同一样品，申请人利用圆形标出了固氮菌，方形标出了非固氮菌。另外，将获得的土壤微生物的拉曼光谱，与标记不同15N2比例的纯菌的拉曼光谱进行PCA分析进行比较，如附图1的d最右侧菱形所示。可见，土壤固氮菌的固氮活性差异大。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.一种基于单细胞拉曼光谱和15N2稳定同位素标记的固氮菌筛选方法，其特征在于，
将待检物以15N2作为氮源进行孵育，再取出孵育后的待检物利用拉曼光谱进行检测并分析，15N同化后引起细胞色素c发生偏移的位于1110-1130cm-1C-N拉曼峰作为固氮菌判别指标，偏移程度作为比较固氮活性的参数。
2.如权利要求1所述基于单细胞拉曼光谱和15N2稳定同位素标记的固氮菌筛选方法，其特征在于，
将待检物在原始环境介质或外加碳源；优选的，碳源为葡萄糖；以15N2作为氮源进行孵育，再取出孵育后的待检物利用拉曼光谱进行检测并分析，15N同化后引起细胞色素c发生偏移的C-N拉曼峰作为判别指标。
3.如权利要求1所述基于单细胞拉曼光谱和15N2稳定同位素标记的固氮菌筛选方法，其特征在于，所述待检物为含固氮菌的液体或固体样品；优选的，固体样品是土壤。
4.如权利要求1所述基于单细胞拉曼光谱和15N2稳定同位素标记的固氮菌筛选方法，其特征在于，所述孵育后的待检物为，将待检物放入可密封瓶中，利用橡胶塞封住瓶口，在橡胶塞上插入两个无菌针头，用作进气口和出气口，鼓入O2和15N2的混合气，取代顶空的全部或部分空气，其中15N2占顶空总氮的10％-100％；优选的，加入4倍于鼓入O2体积的15N2；获得15N2含量占顶空总氮100％的气氛；在室温孵育1天以上，优选的，在室温孵育2-14天，即为孵育后的待检物。
5.如权利要求1所述基于单细胞拉曼光谱和15N2稳定同位素标记的固氮菌筛选方法，其特征在于，所述利用拉曼光谱进行检测并分析的检测条件为：激发光为532nm，物镜为50x-100x；优选的，物镜为100x。
6.如权利要求1所述基于单细胞拉曼光谱和15N2稳定同位素标记的固氮菌筛选方法，其特征在于，所述利用拉曼光谱进行检测并分析的分析方法为，利用软件对1129cm-1的C-14N和1114cm-1的C-15N谱峰进行拟合，计算谱峰积分强度，并计算C-15N/(C-15N+C-14N)谱峰强度比值，以该强度比值对15N2含量百分比作图，获得谱峰变化与15N2含量的线性关系图；
或，对包含C-14N和C-15N谱峰的一段1080-1150cm-1谱图进行PCA分析，利用不同标记比例下谱图的PCA得分对15N2含量百分比作图，获得谱峰变化与15N2含量的线性关系图。
7.如权利要求1所述基于单细胞拉曼光谱和15N2稳定同位素标记的固氮菌筛选方法，其特征在于，所述待检物是液体待检物，孵育后直接吸取孵育后的待检物用去离子水离心清洗1-3遍后，将菌液滴在锡箔纸上，空气中干燥后利用拉曼光谱进行检测并分析。
8.如权利要求1所述基于单细胞拉曼光谱和15N2稳定同位素标记的固氮菌筛选方法，其特征在于，所述待检物是固体待检物，利用密度梯度离心法分离孵育后的待检物，将所获得的微生物滴在锡箔纸上，空气中干燥后利用拉曼光谱进行检测并分析。
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