CN116926218B - 一种检测拟柱孢藻菌型的探针组合、基因芯片、试剂盒及方法 - Google Patents

一种检测拟柱孢藻菌型的探针组合、基因芯片、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测拟柱孢藻菌型的探针组合、基因芯片、试剂盒及方法，其中，所述探针组合包括SEQ ID No.1‑SEQ ID No.141所示的探针，用来检测14种拟柱孢藻菌型，还公开了利用上述探针组合制备的基因芯片、试剂盒以及检测方法。本发明利用全基因组范围内的探针，对拟柱孢藻进行检测，相对传统检测方法具有分辨率高的优势，并且，检测方法操作简单，数据处理简单便捷。该检测方法对水体危害蓝藻污染的长期动态监测具有重要应用价值，可指导藻华控制和水生态修复。

Description

一种检测拟柱孢藻菌型的探针组合、基因芯片、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测易引起蓝藻藻华的拟柱孢藻菌型的探针组合、基因芯片、试剂盒及方法。
背景技术
在错综复杂的淡水生态系统中，存在着一群令人着迷的微生物，被称为拟柱孢藻属(Cylindrospermopsis)，包括了分布在全球湖泊、河流、水库和池塘等水域中的多种物种。拟柱孢藻属物种通常具有微小的体型，通常由单个细胞或形成短链菌丝体。在显微镜下观察，它们的独特特征变得明显，细胞内存在大量尖长的细胞外囊泡。这些被称为刺体的囊泡为这个属命名，源自于希腊语中的“raphis”，意为针或尖。细胞本身呈现出长椭圆形或圆柱形，内部包含有色素体和其他参与光合作用的细胞器。
拟柱孢藻属物种在淡水生态系统中发挥着关键作用。作为光合生物，它们利用光能进行光合作用，将二氧化碳和水转化为有机物和氧气。这些微生物具有适应性强的特点，在从贫营养到富营养的水域中均能存活和繁殖。它们适应不同营养条件的能力使得它们能够占据其他生物无法适应的生态位。通过参与初级生产，拟柱孢藻属物种为水生食物链中的能量流动做出重要贡献，成为无机营养物和高级营养级之间的关键纽带。
尽管拟柱孢藻属物种在生态系统中扮演重要的角色，但其中一些物种被认为是有害藻类。某些物种具有产生毒素的能力，其中最常见的是微囊藻毒素(Microcystin)和拟柱孢藻(Cylindrospermopsin)。这些毒素会释放到周围环境中，对水生生物和人类健康构成风险。拟柱孢藻属物种过度繁殖会导致有害藻华或蓝藻华的形成。在这些事件中，拟柱孢藻属物种的密度显著增加，占据藻类群落的主导地位，改变了水体的外观，通常呈现出绿色或蓝色。这些藻华对水生生态系统产生不良影响。拟柱孢藻属物种产生和释放的毒素可以破坏水体的生态平衡，对其他植物、动物和微生物造成伤害，甚至导致一些生物的死亡。有效的管理和减轻措施对于应对拟柱孢藻属藻华的潜在危害效应至关重要。早期检测和监测藻华的出现至关重要，以确定拟柱孢藻的存在并评估其对生态系统和人类健康的风险。水质监测计划可以提供有关养分水平、藻类种群和毒素浓度的宝贵数据，有助于制定适当的管理计划。
准确检测和监测拟柱孢藻属是理解其生态动态和管理潜在有害效应的关键。目前检测和鉴定拟柱孢藻属物种的方法有很多。这些方法采用不同的方法和工具，使研究人员和环境管理者能够评估这些微生物的存在、丰度和潜在风险。显微镜仍然是拟柱孢藻属的目视鉴定的重要工具。通过在显微镜下观察水样品，研究人员可以观察到拟柱孢藻属的独特形态特征，如细胞的延长和尖形刺体。显微镜检查可快速检测和初步确定拟柱孢藻属的物种水平。然而，需要注意的是，仅依靠显微镜检查可能无法准确确定物种，因为它依赖于视觉解释并缺乏分子特异性。聚合酶链反应(PCR)和定量PCR(qPCR)技术常用于检测和定量拟柱孢藻属物种特定的DNA序列。这些方法利用特定引物靶向蓝藻基因组中保守区域，准确鉴定和定量环境样品中的拟柱孢藻属DNA。此外，DNA测序技术，如Sanger测序和下一代测序(NGS)，使研究人员能够分析不同拟柱孢藻属物种的遗传多样性和系统发育关系。荧光原位杂交(FISH)是一种利用荧光探针在完整细胞内标记特定DNA或RNA序列的技术。对于拟柱孢藻属，FISH可以用于可视化和鉴定环境样品中这些微生物的存在。FISH提供了关于复杂水生环境中拟柱孢藻属的空间分布和丰度的宝贵信息。免疫学检测方法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)，为拟柱孢藻属毒素的检测提供了另一种方法。这些检测方法利用特异性抗体识别和结合拟柱孢藻属产生的目标毒素。通过测量抗体和毒素之间的相互作用，可以定量拟柱孢藻属毒素的存在和浓度。利用卫星传感器的遥感技术提供了一种非侵入性和大规模监测藻华的方法，包括由拟柱孢藻属引起的藻华。这些传感器可以检测水体的特定光学特性，如叶绿素浓度和水色，这些特性可以指示藻类的存在和丰度。然而这些方法都存在一个显著的缺点那就是无法鉴定到拟柱孢藻的菌株水平，这导致了拟柱孢藻内的菌株变异在监测和研究中被直接忽略。
目前还没有一种可以达到很好的菌株水品分辨率的拟柱孢藻的检测方法，因此开发一种高物种分辨率的检测方法对有害藻华进行监测是非常有必要的。
发明内容
为了克服现有拟柱孢藻检测方法上的不足和在藻华爆发监测策略的缺陷，本发明采用如下技术手段：
本发明的第一方面提供用于拟柱孢藻菌型检测的探针组合，所述探针组合包括检测拟柱孢藻菌型：Cylindrospermopsis raciborskii C07、Cylindrospermopsisraciborskii CENA302、Cylindrospermopsis raciborskii CENA303、Cylindrospermopsisraciborskii CYLP、Cylindrospermopsis raciborskii CYRF、Cylindrospermopsisraciborskii GIHE 2018、Cylindrospermopsis raciborskii MVCC14、Cylindrospermopsis raciborskii S01、Cylindrospermopsis raciborskii S06、Cylindrospermopsis sp.CR12、Cylindrospermum sp.FACHB-282、Cylindrospermumsp.NIES-4074、Cylindrospermum stagnale PCC 7417、Raphidiopsis curvata NIES-932型中的一种或者两种以上的探针。
本发明中，拟柱孢藻菌型是指同一种拟柱孢藻菌的不同拟柱孢藻菌类型，它们之间在产毒或者基因变异方面存在差异。在本发明中，定义上述14种菌型，若检测其中一种菌型的探针检测结果为阳性，则待测样本中存在该菌型的拟柱孢藻菌。
每种拟柱孢藻菌型对应的探针选自下列各自对应的多条检测探针中：
检测Cylindrospermopsis raciborskii C07菌型的探针包括11条，探针序列如SEQ IDNo.1至SEQ ID No.11所示；检测Cylindrospermopsis raciborskii CENA302菌型的探针包括13条，探针序列如SEQ ID No.12至SEQ ID No.24所示；检测Cylindrospermopsisraciborskii CENA303菌型的探针包括12条，探针序列如SEQ ID No.25至SEQ ID No.36所示；检测Cylindrospermopsis raciborskii CYLP菌型的探针包括13条，探针序列如SEQ IDNo.37至SEQ ID No.49所示；检测Cylindrospermopsis raciborskii CYRF菌型的探针包括13条，探针序列如SEQ ID No.50至SEQ ID No.62所示；检测Cylindrospermopsisraciborskii GIHE 2018菌型的探针包括12条，探针序列如SEQ ID No.63至SEQ ID No.74所示；检测Cylindrospermopsis raciborskii MVCC14菌型的探针包括13条，探针序列如SEQ ID No.75至SEQ ID No.87所示；检测Cylindrospermopsis raciborskii S01菌型的探针包括10条，探针序列如SEQ ID No.88至SEQ ID No.97所示；检测Cylindrospermopsisraciborskii S06菌型的探针包括10条，探针序列如SEQ ID No.98至SEQ ID No.107所示；检测Cylindrospermopsis sp.CR12菌型的探针包括11条，探针序列如SEQ ID No.108至SEQID No.118所示；检测Cylindrospermum sp.FACHB-282菌型的探针包括8条，探针序列如SEQID No.119至SEQ ID No.126所示；检测Cylindrospermum sp.NIES-4074菌型的探针包括8条，探针序列如SEQ ID No.127至SEQ ID No.134所示；检测Cylindrospermum stagnalePCC 7417菌型的探针包括7条，探针序列如SEQ ID No.135至SEQ ID No.141所示；检测Raphidiopsis curvata NIES-932菌型的探针包括7条，探针序列如SEQ ID No.142至SEQID No.148所示。
在本发明的一些具体实施方案中，探针组合是由多种探针组成的混合物；在一些具体实施方案中，探针组合包括检测1种、2种、3种......14种拟柱孢藻菌型检测对应的探针，检测一种拟柱孢藻菌型时，所述拟柱孢藻菌型对应的探针至少包含2条，检测多种拟柱孢藻菌型时，所述拟柱孢藻菌型对应的探针可选择1条；优选的具体实施方案中，探针组合包括检测全部14种拟柱孢藻菌型的探针，并且包含对应拟柱孢藻菌型探针中的全部148条探针。
本发明的第二方面提供了本发明第一方面任一所述的探针组合在制备用于检测拟柱孢藻菌型的基因芯片或者试剂盒中的应用。
本发明的第三方面提供了一种检测拟柱孢藻菌型的基因芯片，所述基因芯片包括前文所述的探针组合；在一些具体实施方案中，基因芯片中包含前文所述的全部探针时，一张基因芯片可以对一份样本中全部14种拟柱孢藻菌型同时进行检测。
本发明的第四方面提供了一种检测拟柱孢藻菌型的试剂盒，包括本发明第一方面所述的探针组合或者第三方面所述的基因芯片。
在一些具体实施方案中，试剂盒还包括待测样本DNA提取试剂。
在一些具体实施方案中，试剂盒还包括核酸扩增试剂、荧光标记试剂。
进一步地，在一些具体实施方案中，试剂盒还包括纯化试剂。
本发明的第五方面提供了一种检测拟柱孢藻菌型的方法，包括如下步骤：
(1)待测水样过滤，采集过滤得到的颗粒物并完成gDNA提取和纯化；
(2)将(1)中的得到的核酸稀释到固定浓度，使用随机引物和带荧光基团的ATCG碱基进行PCR，得到带荧光基团的gDNA序列；
(3)在杂交炉中将(2)中得到的荧光标记gDNA与本发明第三方面所述的基因芯片进行杂交实验；
(4)对(3)杂交实验结果进行扫描和成像，根据菌株特异探针组的荧光信号强度以及显性荧光探针所占全部探针的比例对拟柱孢藻菌型检测结果进行判定，
在一些具体实施方案中，(1)中的提取DNA可使用本领域常规方法进行，以获取待测样本中的gDNA，提取后的核酸样本经过纯化，以去除杂质和污染物后，使用分光光度法或荧光法评估DNA的数量和质量，在一些具体实施方案中，对DNA样品进行标记，以便在杂交过程中进行检测，常用的标记方法包括使用荧光染料或放射性同位素。
在一些具体实施方案中，(3)中的基因芯片包括检测Cylindrospermopsisraciborskii C07、Cylindrospermopsis raciborskii CENA302、Cylindrospermopsisraciborskii CENA303、Cylindrospermopsis raciborskii CYLP、Cylindrospermopsisraciborskii CYRF、Cylindrospermopsis raciborskii GIHE 2018、Cylindrospermopsisraciborskii MVCC14、Cylindrospermopsis raciborskii S01、Cylindrospermopsisraciborskii S06、Cylindrospermopsis sp.CR12、Cylindrospermum sp.FACHB-282、Cylindrospermum sp.NIES-4074、Cylindrospermum stagnale PCC 7417、Raphidiopsiscurvata NIES-932中的一种或者两种以上拟柱孢藻菌型的探针。
在一些具体实施例方案中，检测Cylindrospermopsis raciborskii C07菌型的探针选自SEQ ID No.1至SEQ ID No.11所示探针中的至少一种；检测Cylindrospermopsisraciborskii CENA302菌型的探针选自SEQ ID No.12至SEQ ID No.24所示探针中的至少一种；检测Cylindrospermopsis raciborskii CENA303菌型的探针选自SEQ ID No.25至SEQID No.36所示探针中的至少一种；检测Cylindrospermopsis raciborskii CYLP菌型的探针选自SEQ ID No.37至SEQ ID No.49所示探针中的至少一种；检测Cylindrospermopsisraciborskii CYRF菌型的探针选自SEQ ID No.50至SEQ ID No.62所示探针中的至少一种；检测Cylindrospermopsis raciborskii GIHE 2018菌型的探针选自SEQ ID No.63至SEQID No.74所示探针中的至少一种；检测Cylindrospermopsis raciborskii MVCC14菌型的探针选自SEQ ID No.75至SEQ ID No.87所示探针中的至少一种；检测Cylindrospermopsisraciborskii S01菌型的探针选自SEQ ID No.88至SEQ IDNo.97所示探针中的至少一种；检测Cylindrospermopsis raciborskii S06菌型的探针选自SEQ ID No.98至SEQ ID No.107所示；检测Cylindrospermopsis sp.CR12菌型的探针选自SEQ ID No.108至SEQ ID No.118所示探针中的至少一种；检测Cylindrospermum sp.FACHB-282菌型的探针选自SEQ IDNo.119至SEQ ID No.126所示探针中的至少一种；检测Cylindrospermum sp.NIES-4074菌型的探针选自SEQ ID No.127至SEQ ID No.134所示探针中的至少一种；检测Cylindrospermum stagnale PCC 7417菌型的探针选自SEQ ID No.135至SEQ ID No.141所示探针中的至少一种；检测Raphidiopsis curvata NIES-932菌型的探针选自SEQ IDNo.142至SEQ ID No.148所示探针中的至少一种。
在一些具体实施方案中，(3)杂交实验完成后，还包括对基因芯片进行洗涤步骤，以去除任何未结合或非特异性结合的DNA，洗涤通过在不同浓度逐渐变化的洗涤溶液中依次浸泡基因芯片来实现；洗涤步骤有助于减少背景噪音并增强杂交信号的特异性。
在一些具体实施方案中，(4)中在结果判定之前，为避免杂交实验中一些非特异探针信号的干扰，还需要进行包括质量控制、背景校正、归一化、数据过滤和插补、差异表达分析等一系列预处理步骤；适当的预处理确保结果的可靠性和有效性，从而实现有意义的生物学解释和发现。
在本发明中，所述待测样本可以来源为任意水源，包括但不限于江、河、溪、海、湖、泊、水库、池塘等任意流动的或不流动的水源。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
1、现有的产毒拟柱孢藻分子检测技术大都将检测目标区域限定在16S rRNA核糖体基因，或者拟柱孢藻毒素基因区域，因为目标检测区域较小因此分辨率较低，无法鉴定到种以及以下水平。本发明通过基因芯片技术，利用全基因组范围内菌株特异探针，可以对菌株水平的拟柱孢藻进行检测，达到高的物种分辨率，弥补了现有检测技术分辨率不够的缺陷。
2、本发明利用基因芯片技术，可以同时对14种常见拟柱孢藻菌型在水体中的存在进行检测，且该检测方法操作方法简单，相比较于基于测序的检测方法省去了目标区域PCR和测序的步骤，同时数据处理更为简单便捷，达到较高的检测效率和准确性。这种高通量，高分辨率的便捷产毒拟柱孢藻菌型检测方法对于水体危害蓝藻污染的长期动态监测具有重要应用价值，可指导藻华控制和水生态修复。
附图说明
图1示出了本发明拟柱孢藻检测基因芯片中检测探针排布设计图；
图2示出了本发明拟柱孢藻检测基因芯片特异性实验结果图；
图3示出了本发明实施例3应用拟柱孢藻检测基因芯片对广东省六个水源地水库中的拟柱孢藻进行检测的结果展示图，其中，六个水源地水库分别：深圳水库(SZ)，新丰江水库(XFJ)，大沙河水库(DSH)，高州水库(GZ)、流溪河水库(LXH)以及飞来峡水库(FLX)。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。
关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然(例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。
术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
实施例1拟柱孢藻菌型探针筛选和基因芯片制备
1、数据集收集
为筛选拟柱孢藻菌型特异探针，需要准备的数据包括两个部分：目标菌株基因组序列和背景基因组序列。我们以14株拟柱孢藻菌型的基因组为目标序列，基因组信息如下表1，以NCBI数据库中全部的约4000个其它的蓝藻基因组序列设定为背景序列。
表1用于设计拟柱孢藻菌型的基因组信息
2、菌株特异探针初步挑选
将目标拟柱孢藻基因组序列全部打断成50mer长度的Kmer片段，并建立背景序列Kmer片段hash库，记录Kmer的出现频率和所归属菌株信息。再建立菌株基因组序列的Kmer片段hash库。将目标序列Kmer库与背景序列的Kmer库进行比较分析，将只存在于目标序列Kmer库中而没有出现在背景序列Kmer库中的Kmer挑选出来，作为该菌株的备选特异探针库。
3、备选特异探针中潜在非特异结合探针的剔除
有研究指出，如果探针与非目标序列有超过20个碱基的连续匹配，可能发生潜在的非特异结合。利用NCBI的Blast程序，将备选特异探针与背景Kmer库进行序列比对，根据比对结果，将备选特异探针中与背景Kmer有超过20个碱基连续匹配的探针剔除。
4、探针理化性质筛选：
上步结束后得到的菌株特异探针，这些探针序列唯一的存在于该菌株基因组中，且与其它的菌株基因组没有超过20个连续碱基的匹配。随后对剩余特异探针进行理化性质筛选，主要条件包括：
(1)探针序列与目标序列的核酸自由能(Free energy，单位kcal/mol)，如核酸自由能小于-30，则去除该探针序列；
(2)若探针的连续相同碱基出现5次，那么该探针的复杂度太低，去除该探针序列；
(3)根据熔接温度Tm值(65<Tm<95)和GC含量(0.2<GC含量<0.8)进行菌株特异探针的最后筛选。
最终，筛选得到148个分布于全基因组范围内的拟柱孢藻菌型特异探针，探针序列如SEQ ID No.1-SEQ ID No.148所示。其中不同拟柱孢藻菌型对应的探针组及探针数目和具体序列信息见表2：
表2拟柱孢藻菌型及探针信息
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6、制备基因芯片
前文所述的检测探针通过商业公司(博奥生物有限公司)合成并集成于一张基因芯片中，该基因芯片中的其他类型的探针是一般DNA芯片通用的内置探针，不影响本专利的检测内容，基因芯片中检测探针排布设计的示意图如图1所示。
实施例2利用基因芯片快速检测水体中拟柱孢藻菌种的方法
1、水体蓝藻微生物收集
A、采样前准备：
(1)选择孔径为0.2-0.45微米的合适超滤膜滤器。
(2)确保过滤设备，包括滤器座和管道，清洁并消毒。
(3)准备无菌容器、管子和收集瓶用于采样。
B、采样收集：
(1)根据研究目的和相关水源确定采样地点。
(2)根据分析要求和微生物负荷确定要采集的水样体积。
(3)启动水流并将过滤设备调整为控制的流速，通常为100-500ml/min。
(4)将水样通过超滤膜滤器，确保所有水样都被过滤。
(5)将包含较小颗粒和分子的滤液收集到无菌容器中，以备后续分析或处理。
(6)断开滤器座，将滤膜上保留的微生物细胞小心地转移到无菌收集瓶或管子中。
C、样品处理：
(1)用无菌水或缓冲液冲洗滤器座和管道，以回收系统中任何剩余的微生物细胞。
(2)将滤膜上的保留微生物细胞转移到含有保存液(如无菌PBS)的无菌容器或管子中，以防止细胞降解。
(3)确保滤膜完全浸没在保存液中，以在运输和储存过程中保持微生物细胞的存活性。
(4)为每个容器或管子贴上独特的标识符，包括采样地点、日期和其他相关信息。
D、运输和储存：
(1)将收集的微生物样品放置在运输用保温冷却器或冰袋中，以保持适当的温度。
(2)尽量减少暴露于极端温度、阳光和其他可能影响微生物存活性或组成的环境因素。
(3)尽快将样品运送到实验室，最好在24-48h内，以避免微生物群落发生变化。
(4)到达实验室后，根据分析要求的温度，如冷藏或冷冻，储存样品以保持微生物的存活性。
E、样品准备：
(1)使用无菌采样管或容器收集环境样品。
(2)如有需要，使用无菌研钵和研钉或其他适当的方法均质化固体样品。
(3)可选地，将样品在液氮中快速冷冻，并在-80℃冷藏保存，直至进一步处理。
2、DNA提取：
(1)戴上无菌手套，并确保操作区域清洁。
(2)根据样品大小和厂商的指示，在样品管中加入适量的裂解缓冲液，确保样品完全悬浮。
(3)按推荐的浓度将蛋白酶K和SDS加入样品管中。通过多次翻转样品管轻轻混合。
(4)将样品管在55-65℃的温度下孵育1-2h，以使细胞发生酶解和蛋白消化。
(5)通过向样品管中加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇混合液，进行苯酚：氯仿：异戊醇萃取。通过多次翻转样品管彻底混合。
(6)12000rpm，10min离心样品管，将含有DNA的水相与有机相分离。
(7)小心地将水相转移到新的管中，避免扰乱界面或有机相。
(8)通过向新管中加入等体积的氯仿：异戊醇混合液进行氯仿：异戊醇萃取。通过多次翻转样品管彻底混合。
(9)以适当的转速和时间离心管，分离水相。
(10)将水相转移到新的管中，留下任何界面上的污染物。
(11)通过加入等体积的异丙醇使DNA沉淀。通过翻转管轻轻混合。
(12)在-20℃或-80℃孵育至少1h，以使DNA沉淀。
(13)12000rpm，10min离心样品管，使DNA沉淀。
(14)丢弃上清液，使用70％乙醇洗涤DNA沉淀，以去除残留污染物。
(15)风干DNA沉淀，或使用氮气轻柔吹干残留的乙醇。
(16)用无菌水或缓冲液溶解DNA沉淀。轻轻混合，确保完全溶解。
(17)可选地，使用DNA定量试剂盒测量DNA的浓度和纯度。
3、DNA纯化
(1)取500ng上步提取DNA样品于打断管中，用H2O补足至50μL。设置打断时间为90秒；
(2)预先室温平衡OnePure MagBeads 30min，并充分振荡混匀，确保无明显磁珠沉淀；
(3)向低吸附管/八联管中加入60μL OnePure MagBeads(1.2X)，再加入(1)中的打断产物，涡旋混匀，瞬离收集管壁液体，室温静置5min；
(4)将低吸附管或八联管放在磁力架上，待管中溶液澄清，弃去上清液；
(5)向1.5mL低吸附管或八联管中加入200μL 80％新鲜配制的乙醇，静置30秒后弃去上清液，重复操作步骤，直至上清去除较为干净；
(6)将低吸附管或八联管置于磁力架上，室温静置1-2min至磁珠干裂或将管子开盖放于45℃金属浴上，待磁珠表面无水光干裂，管底无乙醇残留；
(7)将离心管从磁力架上移开，并加入15μL温育好的Nuclease-free water重悬磁珠，涡旋或吹打混匀后，瞬离收集管壁液体，室温放置3min；
(8)将低吸附管或八联管放在磁力架上，待管中溶液澄清，转移13μL上清液到新的PCR管中，用于下一步标记。
4、DNA荧光标记
本实施例使用Agilent SureTag Complete DNA Labeling Kit试剂盒，包括以下步骤：
(1)向打断后纯化好的gDNA中加入2.5μL Random primer，混匀后，进行如下变性反应：98℃3min、4℃hold；
(2)向上述变形反应体系中直接加入以下试剂：15.5μL gDNA和primer mix、5μL5XReaction buffer、2.5μL 10X dNTP、1.5μL Cyanine 3-dUTP、0.5μL Exo(-)Klenow，共25μL；
(3)使用移液枪吹打或涡旋振荡混匀后，快速离心收集管壁上的液体，去除气泡；
(4)将反应体系置于PCR仪上，设置热盖温度为75℃，并运行以下程序：37℃2h、65℃10min、4℃hold。
5、目标样本荧光DNA与本发明基因芯片杂交
本实施例使用Agilent Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit试剂盒，包括以下步骤：
(1)将纯化后的样品提及浓缩至14.3μL，并按表1配置杂交体系好后，用枪吹打混匀，瞬离后将反应体系置于PCR仪上，设置热盖温度为105℃，并运行以下程序：98℃3min、37℃30min、37℃hold；
(2)杂交：a、首先将一个干净的垫片放入安捷伦chamber里面，垫片标签朝上，与chamber底部的矩形部分对准，确保垫圈与腔室底座齐平；b、然后吸取上一步37℃的样品55μL到垫片上的橡胶圈中间，避免产生气泡，将基因芯片倒扣在垫片上；c、接着将chamber盖子盖上去，拧紧旋钮；d、将每个组装好的装置装入恒温箱旋转架，取一个配平的chamber，垂直旋转杂交室，使载玻片湿润，并评估气泡的流动性。e、设置杂交旋转器旋转速度为20rpm，67℃杂交4h。
(3)基因芯片清洗：杂交后在室温下取出基因芯片，放在洗液1(Agilent试剂盒的试剂)中，设置250rpm，在室温下震荡清洗5min；接着再用洗液2(Agilent试剂盒的试剂)，设置200rpm，在39℃下震荡清洗1min，最后去除基因芯片表面的液体，并在4h内扫描。
6、荧光结果扫描与信号分析
(1)将微阵列数据文件导入微阵列数据预处理软件。
(2)验证数据文件的完整性，并确保文件格式与预处理软件兼容。
(3)进行质控检查，评估数据的整体质量，识别异常值、伪影等潜在问题，如设置异常值检测阈值±3个标准差；
(4)从数据中移除或标记低质量或不可靠的探针或斑点，如设置探针移除的信号强度<100的探针；
(5)应用背景校正方法去除非特异杂交信号，如设置背景校正算法RMA、mas5、基于模型的背景校正参数；
(6)进行数据归一化以调整阵列之间的系统性变异，如分位数归一化、loess归一化；
(7)将预处理后的微阵列数据以适当的格式导出，供后续分析使用，如导出CSV、Excel文件。
实施例3基因芯片对拟柱孢藻的检测特异性测试
特异性检测指的是，对于目标菌可以针对性的检测在水体样本中的有无，为了测试我们设计的探针与基因芯片的特异检出效果，我们对检测范围内的产毒拟柱孢藻利用实施例2中的方法对混合菌液进行检测，比较检测结果与实验选定组合设计之间的一致性，并分析检测结果的假阳性和假阴性比率。
共包括两种实验设计：
实验一中只包含Cylindrospermopsis raciborskii C07一种菌型。
实验二中包含Cylindrospermopsis raciborskii C07和Raphidiopsis curvataNIES-932两种菌型。检测结果如图2所示。
图2结果显示：实验一中，只有Cylindrospermopsis raciborskii C07探针组内的探针有较高的荧光信号，而其他没有添加的菌型的探针信号均比较低，整体低于我们的探针阳性阈值。实验二中，我们添加的Cylindrospermopsis raciborskii C07和Raphidiopsis curvata NIES-932两种菌型也被成功检出，它们的探针组内探针均有较高的荧光信号，而其他十二种未添加的菌型探针信号非常微弱，均通不过阳性检出阈值。本发明方法具有可靠的拟柱孢藻菌型水平检测效果。
实施例4对来自广东多个水库的水体样本中拟柱孢藻进行检测分析
选取了六个广东省饮用水源水库，应用本发明的拟柱孢藻检测基因芯片，按照实施例2中的方法对水库中的拟柱孢藻进行调查分析。六个水库分别为深圳水库(SZ)，新丰江水库(XFJ)，大沙河水库(DSH)，高州水库(GZ)、流溪河水库(LXH)以及飞来峡水库(FLX)。检测结果如图3所示。
图3结果表明：本发明在实际应用中可成功检出水体所包含的拟柱孢藻蓝藻菌株类型，其中，在新丰江水库(XFJ)中发现的拟柱孢藻类型最为丰富；其次是大沙河水库(DSH)和流溪河水库(LXH)中也发现了较多的拟柱孢藻菌型，这意味着在这些水源地水库中分布有较多可能引起藻华爆发的蓝藻，需加强库区水体污染监测和治理。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种检测拟柱孢藻菌型的探针组合，其特征在于：所述探针组合包括检测拟柱孢藻菌型：Cylindrospermopsis raciborskii C07、Cylindrospermopsis raciborskiiCENA302、Cylindrospermopsis raciborskii CENA303、Cylindrospermopsis raciborskiiCYLP、Cylindrospermopsis raciborskii CYRF、Cylindrospermopsis raciborskii GIHE2018、Cylindrospermopsis raciborskii MVCC14、Cylindrospermopsis raciborskiiS01、Cylindrospermopsis raciborskii S06、Cylindrospermopsis sp. CR12、Cylindrospermum sp. FACHB-282、Cylindrospermum sp. NIES-4074、Cylindrospermum stagnale PCC 7417、Raphidiopsis curvata NIES-932型中各个菌型对应的探针：
检测Cylindrospermopsis raciborskii C07菌型的探针序列如SEQ ID No.1至SEQ IDNo.11所示；检测Cylindrospermopsis raciborskii CENA302菌型的探针序列如SEQ IDNo.12至SEQ ID No.24所示；检测Cylindrospermopsis raciborskii CENA303菌型的探针序列如SEQ ID No.25至SEQ ID No.36所示；检测Cylindrospermopsis raciborskii CYLP菌型的探针序列如SEQ ID No.37至SEQ ID No.49所示；检测Cylindrospermopsis raciborskii CYRF菌型的探针序列如SEQ ID No.50至SEQ ID No.62所示；检测Cylindrospermopsis raciborskii GIHE 2018菌型的探针序列如SEQ ID No.63至SEQ IDNo.74所示；检测Cylindrospermopsis raciborskii MVCC14菌型的探针序列如SEQ IDNo.75至SEQ ID No.87所示；检测Cylindrospermopsis raciborskii S01菌型的探针序列如SEQ ID No.88至SEQ ID No.97所示；检测Cylindrospermopsis raciborskii S06菌型的探针序列如SEQ ID No.98至SEQ ID No.107所示；检测Cylindrospermopsis sp. CR12菌型的探针序列如SEQ ID No.108至SEQ ID No.118所示；检测Cylindrospermum sp. FACHB-282菌型的探针序列如SEQ ID No.119至SEQ ID No.126所示；检测Cylindrospermum sp.NIES-4074菌型的探针序列如SEQ ID No.127至SEQ ID No.134所示；检测Cylindrospermum stagnale PCC 7417菌型的探针序列如SEQ ID No.135至SEQ ID No.141所示；检测Raphidiopsis curvata NIES-932菌型的探针序列如SEQ ID No.142至SEQ ID No.148所示。
2.权利要求1所述的探针组合在制备用于检测拟柱孢藻菌型的基因芯片或者试剂盒中的应用，其特征在于：所述检测拟柱孢藻菌型包括Cylindrospermopsis raciborskii C07、Cylindrospermopsis raciborskii CENA302、Cylindrospermopsis raciborskiiCENA303、Cylindrospermopsis raciborskii CYLP、Cylindrospermopsis raciborskiiCYRF、Cylindrospermopsis raciborskii GIHE 2018、Cylindrospermopsis raciborskiiMVCC14、Cylindrospermopsis raciborskii S01、Cylindrospermopsis raciborskii S06、Cylindrospermopsis sp. CR12、Cylindrospermum sp. FACHB-282、Cylindrospermum sp.NIES-4074、Cylindrospermum stagnale PCC 7417、Raphidiopsis curvata NIES-932中的各个菌型。
3.一种检测拟柱孢藻菌型的基因芯片，其特征在于：包括权利要求1所述的探针组合。
4.一种检测拟柱孢藻菌型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的探针组合或者权利要求3所述的基因芯片。
5.根据权利要求4所述的一种检测拟柱孢藻菌型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括待测样本DNA提取试剂、核酸扩增试剂、荧光标记试剂和/或纯化试剂。
6.一种检测拟柱孢藻菌型的方法，特其征在于，包括如下步骤：
（1）待测水样过滤，采集过滤得到的颗粒物并完成gDNA提取和纯化；
（2）将（1）中的得到的核酸稀释到固定浓度，使用随机引物和带荧光基团的ATCG碱基进行PCR，得到带荧光基团的gDNA序列；
（3）在杂交炉中将（2）中得到的荧光标记gDNA与权利要求3所述的基因芯片进行杂交实验；
（4）对（3）杂交实验结果进行读取，根据读取的探针信号对拟柱孢藻菌型检测结果进行判定；其中，所述拟柱孢藻菌型包括Cylindrospermopsis raciborskii C07、Cylindrospermopsis raciborskii CENA302、Cylindrospermopsis raciborskiiCENA303、Cylindrospermopsis raciborskii CYLP、Cylindrospermopsis raciborskiiCYRF、Cylindrospermopsis raciborskii GIHE 2018、Cylindrospermopsis raciborskiiMVCC14、Cylindrospermopsis raciborskii S01、Cylindrospermopsis raciborskii S06、Cylindrospermopsis sp. CR12、Cylindrospermum sp. FACHB-282、Cylindrospermum sp.NIES-4074、Cylindrospermum stagnale PCC 7417、Raphidiopsis curvata NIES-932中的各个菌型。
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