CN108572166A - 雨生红球藻类胡萝卜素及虾青素可视化分析方法 - Google Patents

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朱亦鸣
张慧萍
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
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Abstract

本发明涉及一种雨生红球藻类胡萝卜素及虾青素可视化分析方法，采用拉曼光谱仪，获取虾青素标准品和雨生红球藻类待测样本的谱线，利用多元曲线分辨MCR方法并结合交替最小二乘ALS经过数次迭代后解析出待测样本的几种主要成分，将解析出的主要成分光谱与虾青素标准品的拉曼光谱进行对比分析，确定出样本内虾青素的成分，解决了现有检测方法需要对样本进行染色或复杂的化学处理，操作相对繁琐、耗时、耗力的问题。实现了基于拉曼光谱技术的微藻色素分布的化学成像，不需要配制任何溶液以及化学测定，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间，也避免了由于操作人员操作不熟练或者主观因素带来的测量结果不准确等后果。

Description

雨生红球藻类胡萝卜素及虾青素可视化分析方法
技术领域
本发明涉及一种化学图像技术，特别涉及一种基于拉曼光谱技术的雨生红球藻类胡萝卜素及虾青素可视化分析方法。
背景技术
微藻是一类系统发生各异、个体较小、通常为单细胞或群体的、能进行光合作用（少部分为异养生长）的水生（或陆生、气生、共生）低等植物。它是能够进行光合作用的微生物，可以利用阳光、水和CO2合成自身所需要的物质。目前，对藻类的识别分类及其生化分析已经成为海洋生物学的研究热点之一。
作为天然虾青素含量最高的生物，雨生红球藻用来提取虾青素已经成为国内外虾青素研究的热点。雨生红球藻在受到应激胁迫条件时，DNA、蛋白质及细胞膜就会受到产生活性氧的损伤，从而就会触发次级类胡萝卜素的产生以减少活性氧的形成。也有研究推测β-胡萝卜素通过叶绿体膜运输，转化为虾青素，并在叶绿体外的脂质囊泡中形成积累。初级和次级类胡萝卜素积累途径的研究虽然取得一定的进展，然而能够直接在活体细胞中证明这个空间位置的运输过程研究仍然缺乏，用于合成和积累次级类胡萝卜素的分子和细胞机制仍然难以捉摸。认识次级类胡萝卜素的积累规律对于雨生红球藻的研究和利用具有十分重要的意义。因此，雨生红球藻细胞中成分空间分布及变化研究变得十分有意义。
拉曼成像是表征化学信息的有力手段。拉曼技术能够实现样品不同位置的逐点扫描，并且获取相应的拉曼光谱，基于拉曼信息生成伪彩图像，从而显示出材料或成分的结构信息和分布。拉曼光谱学和显微光谱学最近得到了扩展到微生物研究，这两种技术的结合使分子信息微观分辨率拉曼光谱技术对微生物的研究成为可能。
发明内容
本发明是针对雨生红球藻细胞中成分空间分布及变化重要性的问题，提出了一种雨生红球藻类胡萝卜素及虾青素可视化分析方法，解决了现有检测方法需要对样本进行染色或复杂的化学处理，操作相对繁琐、耗时、耗力的问题。
本发明的技术方案为：一种雨生红球藻类胡萝卜素及虾青素可视化分析方法，具体包括如下步骤：
1）采用拉曼光谱仪，获取虾青素标准品的谱线；
2）采用步骤1）相同的拉曼光谱仪，相同的操作获取雨生红球藻类待测样本的拉曼光谱原始信息；
3）将步骤2）中获得的拉曼光谱原始信息进行预处理得到谱图信息，在拉曼峰对应的键位C=C拉伸振动处作为类胡萝卜素化学结构的主要敏感标记；
4）利用多元曲线分辨MCR方法并结合交替最小二乘ALS经过50次迭代后解析出几种主要成分，将解析出的主要成分光谱与步骤1）得到的虾青素标准品的拉曼光谱进行对比分析，确定出待测样本内虾青素的成分；
5）结合MCR-ALS算法计算出步骤4）中确定的待测样本内虾青素成分的浓度，通过计算出的比例再结合步骤3）预处理后待测样本拉曼光谱在对应C=C伸缩键处的拉曼峰值强度，计算出待测样本中虾青素应占的强度值，利用得到的强度值进行虾青素成分在细胞内的空间可视化分析；
6）不同时间段，重复步骤1）～5）得到虾青素在细胞内不同时间的成分浓度和空间可视化分析。
所述步骤1）中拉曼光谱仪采用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪，将制好的待测样本切片固定在显微拉曼光谱仪物镜下方载物台上，激光束通过50X的物镜聚焦到样本的表面，其中曝光时间设置为1s，激光强度为1mv，累计次数一次，采样在恒温25℃条件下进行的。
所述步骤3）预处理具体步骤如下：首先采用去趋势算法De-trending对拉曼光谱进行预处理，然后采用Renishaw的Wire软件对宇宙射线进行处理，利用Unscrambler对拉曼光谱进行Baseline基线校正，然后再通过卷积平滑方法对拉曼光谱去噪平滑处理。
本发明的有益效果在于：本发明雨生红球藻类胡萝卜素及虾青素可视化分析方法，实现了基于拉曼光谱技术的微藻色素分布的化学成像，不需要配制任何溶液以及化学测定，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间，也避免了由于操作人员操作不熟练或者主观因素带来的测量结果不准确等后果。
附图说明
图1为0～48h 雨生红球藻拉曼平均光谱图与虾青素标准曲线图；
图2a为本发明基于MCR方法对雨生红球藻细胞拉曼光谱解析出的六种成分图；
图2b为本发明基于MCR方法对雨生红球藻细胞拉曼光谱解析三种主要成分与标准品对比图；
图3为本发明基于MCR方法对0h雨生红球藻细胞拉曼光谱解析成分浓度图；
图4为本发明0～48h雨生红球藻细胞类胡萝卜素及虾青素可视化图。
具体实施方式
取一定浓度的雨生红球藻液样本，采用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪（inVia–Reflex 532/XYZ），获取活体雨生红球藻液样本的拉曼光谱原始信息。即将制好的藻液切片固定在显微拉曼光谱仪物镜下方载物台上，激光束通过50X的物镜聚焦到样本的表面。其中曝光时间设置为1s，激光强度为1mv，累计次数一次。整个实验过程都是在恒温（约25℃）条件下进行的。
由于原始拉曼光谱图受荧光干扰较大，荧光的产生会覆盖拉曼的信号。因此首先采用去趋势算法De-trending对拉曼光谱进行预处理，然后采用Renishaw的Wire软件对宇宙射线进行处理。采集雨生红球藻细胞拉曼光谱时，获取生物体的拉曼光谱会存在一定的荧光背景，且存在基线漂移现象，因此在对存在宇宙射线的光谱进行处理后，需要对拉曼光谱进行背景去除。利用Unscrambler对拉曼光谱进行Baseline基线校正，然后再通过卷积平滑方法对拉曼光谱去噪平滑处理，之后的模型建立均基于以上处理步骤后得到的数据。
在图1中的雨生红球藻三个胁迫阶段的平均光谱，它们在1524～1527cm-1的拉曼峰对应的键位C=C拉伸振动是类胡萝卜素化学结构的主要敏感标记，因此可以利用位移范围的拉曼信息分析虾青素的变化。然而，可以发现在0h、24h及48h对应C=C的拉曼位移均不相同，且与虾青素标准品的拉曼位移1520cm-1存在4～7cm-1的偏差。雨生红球藻的拉曼光谱为生物光谱，在光谱中包含着很多其它成分的信息，而雨生红球藻细胞中的其它类胡萝卜素（如β-胡萝卜素）成分也存在C=C拉伸键，多种成分信息叠加也造成了键位的偏移。因此，获取的雨生红球藻细胞拉曼光谱在C=C拉伸键的强度，主要反映了类胡萝卜素成分的信息。C=C拉伸键的拉曼信息可以作为本研究中类胡萝卜素混合物拉曼成图的标记，利用该拉伸键位移处的峰强进行成图可视化，实现类胡萝卜素分布分析；而虾青素作为一种单一物质，需要进一步对获取到的拉曼光谱进行解析，才能提取出虾青素的有效信息。
雨生红球藻的拉曼光谱为生物光谱，混杂着许多藻细胞内成分信息，想要区分出虾青素信息，具有一定难度。图2a为利用多元曲线分辨MCR方法并结合交替最小二乘ALS经过50次迭代后解析出的六种成分（Component-1～Component-6）。通过将解析出的成分光谱与虾青素标准品的拉曼光谱进行对比分析，如图2b三种主要成分（Component-1～Component-3）与标准品(Astaxanthin)对比图，可以发现成分2的光谱特征与虾青素标准品十分相似，三个主要的峰的峰位十分接近，并且对应C=C拉伸键处峰位只与标准品相差约1cm-1，通过比较分析，可以将成分2推定为雨生红球藻内虾青素的成分。推定出成分2为虾青素后，可以结合MCR-ALS算法算出成分的浓度。
如图3，计算出在成分2占总浓度的比例。通过计算出的比例再结合经过预处理后的雨生红球藻拉曼光谱在对应C=C伸缩键处（1524～1527cm-1）的拉曼峰值强度，计算出雨生红球藻中虾青素应占的强度值，利用得到的强度值进行虾青素在细胞内的可视化分析。剩余24h和48h两个阶段均采用同样的数据处理方式，获取分辨获取出虾青素拉曼光谱信息。
基于共聚焦拉曼显微技术对雨生红球藻细胞面扫描后，利用C=C拉伸键处的拉曼峰位处的拉曼强度建立类胡萝卜素可视化图像，以及结合MCR-ALS模型解析出虾青素成分，推出的虾青素对应浓度，实现虾青素成分的空间可视化。
如图4所示，类胡萝卜素及虾青素空间分布得到可视化呈现。从图4可以发现，反演出的类胡萝卜素含量分布图基本形成了一个细胞状，说明在雨生红球藻细胞中，类胡萝卜素是广泛分布的，但是分布的位置也各有差异；图中（a）0h （b）24h （c）48h,且在0～48h这个胁迫过程中，细胞内的类胡萝卜素也不断发生变化，颜色越深代表着拉曼强度越高，对应着类胡萝卜素的含量也越多，因此，可以从色差或强度值分析出，随着胁迫时间的增加，类胡萝卜素含量也在逐渐增加。与此同时，从图中可以发现，虾青素含量从0h、24h及48h三个阶段是逐渐变化，分布也不断扩大，说明虾青素含量应该是不断上升的，说明虾青素可视化图在一定程度是能够反映出虾青素在整个细胞的变化情况的。说明MCR-ALS方法对于雨生红球藻虾青素成分信息提取是十分有效的，对于今后对雨生红球藻中其它成分的研究具有重要借鉴意义。

Claims (3)

1.一种雨生红球藻类胡萝卜素及虾青素可视化分析方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
1）采用拉曼光谱仪，获取虾青素标准品的谱线；
2）采用步骤1）相同的拉曼光谱仪，相同的操作获取雨生红球藻类待测样本的拉曼光谱原始信息；
3）将步骤2）中获得的拉曼光谱原始信息进行预处理得到谱图信息，在拉曼峰对应的键位C=C拉伸振动处作为类胡萝卜素化学结构的主要敏感标记；
4）利用多元曲线分辨MCR方法并结合交替最小二乘ALS经过50次迭代后解析出几种主要成分，将解析出的主要成分光谱与步骤1）得到的虾青素标准品的拉曼光谱进行对比分析，确定出待测样本内虾青素的成分；
5）结合MCR-ALS算法计算出步骤4）中确定的待测样本内虾青素成分的浓度，通过计算出的比例再结合步骤3）预处理后待测样本拉曼光谱在对应C=C伸缩键处的拉曼峰值强度，计算出待测样本中虾青素应占的强度值，利用得到的强度值进行虾青素成分在细胞内的空间可视化分析；
6）不同时间段，重复步骤1）～5）得到虾青素在细胞内不同时间的成分浓度和空间可视化分析。
2.根据权利要求1所述雨生红球藻类胡萝卜素及虾青素可视化分析方法，其特征在于，所述步骤1）中拉曼光谱仪采用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪，将制好的待测样本切片固定在显微拉曼光谱仪物镜下方载物台上，激光束通过50X的物镜聚焦到样本的表面，其中曝光时间设置为1s，激光强度为1mv，累计次数一次，采样在恒温25℃条件下进行的。
3.根据权利要求1所述雨生红球藻类胡萝卜素及虾青素可视化分析方法，其特征在于，步骤3）预处理具体步骤如下：
首先采用去趋势算法De-trending对拉曼光谱进行预处理，然后采用Renishaw的Wire软件对宇宙射线进行处理，利用Unscrambler对拉曼光谱进行Baseline基线校正，然后再通过卷积平滑方法对拉曼光谱去噪平滑处理。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109543763A (zh) * 2018-11-28 2019-03-29 重庆大学 一种基于卷积神经网络的拉曼光谱分析方法
CN109971649A (zh) * 2019-04-28 2019-07-05 哈尔滨师范大学 一种用于培养雨生红球藻的培养基及智能检测系统
CN110008836A (zh) * 2019-03-06 2019-07-12 华东师范大学 一种病理组织切片高光谱图像的特征提取方法
WO2021239121A1 (zh) * 2020-05-29 2021-12-02 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种筛选或评价药物的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101243032A (zh) * 2005-08-15 2008-08-13 法雷斯药品研究公司 虾青素的晶型
US20100204523A1 (en) * 2008-12-04 2010-08-12 Fuji Chemical Industry Co., Ltd. Method of preventing discoloration of carotenoid pigment and container used therefor
CN103398999A (zh) * 2013-08-08 2013-11-20 浙江大学 基于拉曼光谱技术的等鞭金藻中胡萝卜素分布的检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101243032A (zh) * 2005-08-15 2008-08-13 法雷斯药品研究公司 虾青素的晶型
US20100204523A1 (en) * 2008-12-04 2010-08-12 Fuji Chemical Industry Co., Ltd. Method of preventing discoloration of carotenoid pigment and container used therefor
CN103398999A (zh) * 2013-08-08 2013-11-20 浙江大学 基于拉曼光谱技术的等鞭金藻中胡萝卜素分布的检测方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AARON M. COLLINS ET AL.: "Carotenoid distribution in living cells of Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae)", 《PLOS ONE》 *
CHRISTOPHER CANNIZZARO ET AL.: "On-line monitoring of Phaffia rhodozyma fed-batch process with in situ dispersive Raman spectroscopy", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》 *
刘京华: "基于生物光谱对等离子体诱变雨生红球藻机理及突变体快速筛选方法的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *
王海滨等: "菹草红色类胡萝卜素的拉曼光谱特性研究", 《水生生物学报》 *
王雪等: "激光镊子拉曼光谱法优化红法夫酵母合成虾青素条件", 《光散射学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109543763A (zh) * 2018-11-28 2019-03-29 重庆大学 一种基于卷积神经网络的拉曼光谱分析方法
CN110008836A (zh) * 2019-03-06 2019-07-12 华东师范大学 一种病理组织切片高光谱图像的特征提取方法
CN110008836B (zh) * 2019-03-06 2023-04-25 华东师范大学 一种病理组织切片高光谱图像的特征提取方法
CN109971649A (zh) * 2019-04-28 2019-07-05 哈尔滨师范大学 一种用于培养雨生红球藻的培养基及智能检测系统
WO2021239121A1 (zh) * 2020-05-29 2021-12-02 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种筛选或评价药物的方法

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