CN106841167A - 果蔬农药残留的无损检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种果蔬农药残留的无损检测方法，基于表面增强拉曼光谱SERS技术，采用多种预处理方法并建立定性模型和定量模型，实现快速、无损地检测果蔬中的农药残留含量，包括：建立菠菜表面溴氰菊酯残留量的差谱数据定量模型、建立苹果中毒死蜱、吡虫啉及马拉硫磷三种农药同时检测的光谱数据定量及定性模型。本发明采用高灵敏度的SERS技术，无需样品制备等任何复杂的前处理步骤，通过对果蔬农药残留量的直接检测或对单位面积的间接检测，能够很好地实现整个果蔬表面农药残留量的快速、无损、无污染检测，而且准确率较高，方法实用，可推广到其他果蔬中农药残留量的无损检测和现场检测应用中。

Description

果蔬农药残留的无损检测方法

技术领域

本发明属于农产品质量安全监测技术领域，涉及果蔬中农药残留量检测方法，具体涉及一种果蔬农药残留的无损检测方法，该无损检测方法利用SERS技术(SurfaceEnhanced Raman Spectroscopy，表面增强拉曼光谱)，建立残留量的多种检测模型，从而实现快速、无损地检测果蔬中农药残留的具体含量。

背景技术

目前我国对于农产品中农药残留量的要求是依据国标GB 2763-2014食品中农药残留最大残留限量的规定来实行。目前用于果蔬农残检测的技术多达几十种，检测原理遍及各个学科，其中大多数是生物、化学检测方法。虽然这些检测方法及样品前处理方法对于检测结果有突出的贡献，但是，其操作的高复杂性和高成本等特点限制了现场检测的应用，并且，基于生物化学原理的检测方法耗时长，结果的等待周期长。

光谱法可克服现在主流检测方法的诸多缺点，而其中的拉曼光谱法因其不受水的干扰、分辨率高等优点尤其适合进行果蔬中农药残留的检测。只要首次建立了准确、稳定的模型，即可对果蔬产品进行快速、无损、无污染的直接测量，无需像物理化学原理方法每次测量都进行复杂的样品制备，更适用于现场检测。表面增强拉曼散射技术，即SERS(SurfaceEnhanced Raman Spectroscopy)技术，作为拉曼光谱技术领域的一种新兴技术，由于所需样本浓度低、灵敏度高等特点，在食品与农产品安全检测方面得到越来越多的重视。

在现今的国内外研究成果中，虽然已有学者利用SERS技术进行果蔬农残检测，但样本类型还多为溶液或果蔬提取液，对果蔬本身会产生一些损坏，不仅影响果蔬的继续食用，也不适宜农残的现场检测。而要达到无损检测，就必然要对蔬果表皮进行扫描，现有检测方法还难以实现。另外，果蔬中的农药残留种类非常复杂，很多都不止含有单一一种农药，但现有技术难以实现基于SERS技术对多种农药同时进行检测。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种果蔬农药残留的无损检测方法，基于SERS技术对果蔬中农药残留量进行无损检测。本发明提供的检测方法可以对果蔬中的一种或多种农药残留进行快速、无损检测，无需复杂的样品制备，而且准确率较高。

本发明的核心是：使用SERS技术对菠菜、苹果等果蔬进行无损检测，考虑到常见果蔬的物理性状对检测精确度的影响，首先选取具有代表性的果蔬样本(菠菜、苹果)作为叶菜类、类球体等其他常见果蔬的参考；其次，针对不同种类果蔬样本之间存在的差异，可采用直接法和单位面积换算法分别处理测量样本；并且，采集的原始SERS光谱是样本的面扫描光谱，后期预处理前先拆分求平均，在一定程度上提高了光谱采集的准确率。在采用化学计量学方法进行数据处理阶段，本发明根据不同情况，结合本发明的建模算法，选取了化学计量学方法中的一种或多种方法进行组合改进并有效应用，能够达到去除采集过程中或样本本身物质干扰的预期效果。本发明采用差谱数据建模，即用含农药样本减去无农药样本光谱得到的数据，理论上该差谱数据和浓度之间存在一定联系，因此，由此建立差谱与浓度之间的定量模型，能够较好完成果蔬中具体农残含量的预测。此外，本发明在多种农药的定性分析中，采用经典的距离匹配和判别分析两种算法，较好地区分了三种农药。跟现有方法对两种农药定性相比，三种(或多种)农药的区分难度提高，因为多种农药包含的信息量及复杂程度增加，而且它们之间可能或多或少的包含某些相似成分结构或内在联系，所测得的光谱也容易有相似的特征信息，做区分容易产生干扰、难度增加。

本发明使用SERS技术对菠菜、苹果等果蔬进行无损检测，解决现有的有损检测方法在对果蔬样本进行检测时造成一定程度破坏，且达不到现场检测或快速检测的要求的问题。本发明无需复杂的样品制备，不仅可以对菠菜、苹果的农药残留量进行无损检测，而且针对果蔬可能含多种农药的实际情况，对多种类别的农药残留进行快速、无损检测，且准确率较高，因此，本发明方法可用于农残的现场检测、其他果蔬中农药残留量的无损检测。

本发明提供的技术方案是：

一种果蔬农药残留的无损检测方法，基于表面增强拉曼光谱(SERS)技术，采用多种预处理方法结合建模算法，实现快速、无损地检测果蔬中的农药残留含量；包括以下步骤：

1)同批次获取果蔬、农药原药试剂、表面增强剂；

2)配制农药溶液；制备果蔬样本；

在本发明实施实验中，由于样本之间存在差异，采用直接法和单位面积换算法分别处理测量样本；

3)使用拉曼光谱仪，在适宜的环境下采集样本的SERS光谱；

拉曼光谱仪采集到的SERS光谱(原始光谱)是样本的面扫描谱图。

4)对拉曼光谱仪采集到的SERS光谱进行数据预处理；

具体先进行拆分，求算数平均获得平均谱图，再对平均谱图进行数据预处理；针对光谱数据存在的问题，选择适当的预处理方法进行处理；优选地，可采取的预处理方法为化学计量学方法。

5)利用得到的SERS光谱数据，包括预处理后的光谱以及差谱数据，建立果蔬中农药种类的定性模型和具体残留量的定量模型；

本发明具体实施中，采用差谱数据建立了菠菜表面溴氰菊酯残留量的定量模型；建立了苹果中毒死蜱、吡虫啉以及马拉硫磷三种农药同时检测的定量及定性模型。

6)利用步骤5)建立的定性模型和定量模型，实现快速、无损地检测果蔬中的农药残留含量。

所述步骤1)中，在本发明实施具体实施时，实验样本均为市售新鲜果蔬，同批次购入，尽可能确保理化性状均匀一致；农药原药试剂购自中国计量科学研究院标准物质所以及德国拜耳作物科学(中国)有限公司；表面增强剂：Easy Peak(舒峰TM)科研型2号银溶胶，购自上海纳腾仪器有限公司，为确保其稳定性，通常密封遮光并置于冰箱冷藏。

所述步骤2)中配制农药溶液时，依据国标GB 2763-2014食品中农药残留最大残留限量的规定，以去离子水为溶剂，配制不同浓度的农药标准溶液；具体地，在制备果蔬样本时，本发明通过采用直接法和单位面积换算法，这两种方法均能实现果蔬的无损检测，能避免像前人一样在检测时大都对果蔬造成一定程度的损害；其中，直接法是将果蔬样本用去离子水洗净后，置于常温下自然干燥，再滴加表面增强剂及农药，随后进行光谱采集；单位面积换算法是通过测量和大致估计果蔬表面积，将整个果蔬的农残含量换算到单位面积上，对果蔬表面的一块单位面积滴加农药，在扫光谱时用此块面积上的光谱图代表整个果蔬的农残情况。这样在了解表面积与质量的关系后，能够更加科学地用表皮光谱衡量整个蔬果的农残含量，尤其适用于球形等立方体果蔬，如苹果、梨等。

所述步骤3)中采用的光谱仪是DXR激光共焦显微拉曼光谱仪(Thermo FisherScientific Inc.)，该仪器的有效探测范围是0～3500cm^-1；适宜环境是指要尽量保持实验仪器始终在干燥、恒定温度的环境中，同一个实验的测量环境尽可能保持不变，而且平时应避免水汽、阳光照射，并在实验完毕后进行通风换气，保持洁净的实验环境；通过对表皮滴有表面增强剂的样本进行拉曼光谱扫描得到其SERS光谱，这里得到的是面扫描谱图。

所述步骤4)中仪器采集到的原始光谱是样本的面扫描谱图，预处理之前先进行拆分，求算数平均获得平均谱图；采取的预处理方法通常是化学计量学方法，例如：基线校正、差谱、特征波段选取、Norris求导法、Savitzky-Golay卷积求导法，一阶导中的一种或多种结合。特征波段选取可以根据TQ Analyst软件自动筛选或手动筛选含特征峰较多、建模效果好的波段。

所述步骤(5)中对于得到的光谱数据，选择距离匹配和判别分析两种算法建立果蔬中农药种类的定性模型；使用PLS(偏最小二乘方法)建立果蔬中农药具体残留量的定量模型。本发明创新地采用了差谱数据建立了菠菜表面溴氰菊酯残留量的定量模型，以消除菠菜基底干扰。其中差谱是指：用含农药样本的SERS光谱减去无农药样本SERS光谱，得到的光谱即为差谱。本发明实施例中，本发明创新地建立了苹果中毒死蜱、吡虫啉以及马拉硫磷三种农药同时检测的定量及定性模型，实现了对三种农药残留样本的同时定性检测及定量检测。定性检测的同时，指该定性模型包含三种农药残留样本数据，能够一次性将三种农药区分开，而非两两区分或现有技术常见的仅对两种农药进行区分；定量检测的同时，指的是一次检测即实现了三种农药各自的残留量预测。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供一种基于SERS技术的果蔬中农药残留量的无损检测方法，可实现对果蔬中的一种或多种农药残留进行快速、无损检测。本发明采用高灵敏度的SERS技术，无需样品制备等任何复杂的前处理步骤，通过对果蔬农药残留量的直接检测或对单位面积的间接检测，能够很好地实现整个果蔬表面农药残留量的快速、无损、无污染检测。

使用本发明中的农药残留量检测方法所建立的定性和定量模型，可以准确的区别农药，正确率最高可达到100％；特别是本发明中采用单位面积换算法预设的定量模型真值，以及采用差谱数据建模以消除基底干扰的方法，使得模型拟合效果好，模型预测能力与准确性更高。

本发明中，建模的数据并非完全使用通常所采用的原始采集光谱，除使用原始采集光谱之外，还使用计算得到的差谱数据；在具体实施中，本发明建立了对三种农药同时区分的定性及各自的定量预测模型；需要说明的是，目前定性模型所用算法是常用的两种算法，现有方法通常是用在对两种农药类别进行区分，而本发明的定性模型是对三种类别做区分，复杂度提高，并非常见的两种农药定性或者对三种农药两两区分。因此，本发明能够实现对三种农药残留样本的同时定性检测及定量检测，并将定性结果在立体的三维空间展示出来，显示直观，效果较好。

采用本发明技术方案，无需复杂的样品制备，而且准确率较高，因此具有很好的实用价值，可推广到其他果蔬中农药残留量的无损检测应用中去，尤其是农残的现场检测。

附图说明

图1为本发明提供方法的流程框图。

图2为实施例一中直接法处理的待检测菠菜样本。

图3为实施例一中菠菜的农残部位面扫描谱图及指定点的SERS光谱；

其中，(a)为菠菜的农残部位面扫描谱图；(b)为农残部位显微成像图；(c)为指定点的SERS光谱。

图4为实施例一中采用判别分析和距离匹配算法建立的无(或含)溴氰菊酯的两组菠菜样本的定性分类结果；

其中，(a)为判别分析结果；(b)为距离匹配结果。

图5为实施例一中差谱数据结合PLS方法建立的菠菜表面溴氰菊酯拟合曲线和残差图；

其中，(a)为拟合曲线；(b)为残差图。

图6为实施例二中苹果样本的单位面积换算法的流程框图。

图7为实施例二中苹果的农残部位面扫描谱图及指定点的SERS光谱；

其中，(a)为苹果的农残部位面扫描谱图；(b)为农残部位显微成像图；(c)为指定点的SERS光谱。

图8为实施例二中采用判别分析法对农残种类与浓度均相同的不同苹果样本光谱的定性分类结果；

其中，(a)为毒死蜱样本；(b)为马拉硫磷样本；(c)为吡虫啉样本。

图9为实施例二中采用距离匹配、判别分析两种算法对三种农残样本的定性分类结果；

其中，(a)为距离匹配结果；(b)为判别分析结果。

图10为实施例二中采用PLS方法的苹果表皮三种农残具体含量的定量分析结果；

其中，(a)为毒死蜱；(b)为马拉硫磷；(c)为吡虫啉。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例进一步描述本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。

本发明提供一种果蔬农药残留的无损检测方法，基于SERS技术对果蔬中农药残留量进行无损检测。本发明提供的检测方法可以对果蔬中的一种或多种农药残留进行快速、无损检测，无需复杂的样品制备，而且准确率较高。

实施例一：菠菜表面农药残留的SERS无损检测

1.实验材料

溴氰菊酯农药：乳油制剂，有效成分含量为25g/L，购自德国拜耳作物科学(中国)有限公司，生产日期2016/3/2；表面增强剂：Easy Peak(舒峰TM)科研型2号银溶胶，购自上海纳腾仪器有限公司；菠菜：市售，叶片大小、颜色均匀一致。

2.样本制备

依据国标GB 2763-2014食品中农药残留最大残留限量的规定，菠菜中溴氰菊酯含量不得超过0.5mg/kg，因此实验实施方案如下：

配制不同浓度的溴氰菊酯标准溶液15个，以去离子水为溶剂，25g/L溴氰菊酯乳油为溶质，质量分数在0.05～2mg/kg之间分布。如附图2所示，选取15片形状、大小、颜色基本一致的新鲜菠菜叶片，用去离子水洗净后，置于常温下自然干燥；为去除叶片差异，做一组平行样本。共计30个样本。

3.光谱采集

本实验采集了30片完整菠菜的SERS光谱。首先，将不含农药的菠菜叶片分为两组，表面均滴加一定量的表面增强剂，将其依次放在包裹锡纸的载玻片上、对增强剂部位进行面扫描；其次，取15个溴氰菊酯标准溶液滴加于两组菠菜样本的增强剂部位，自然晾干后进行面扫描。实验最终共得到60个含或不含溴氰菊酯的菠菜样本面扫描谱图如附图3(a)所示，农残部位显微成像图如附图3(b)，指定点的SERS光谱如附图3(c)。

其中，实验仪器的参数设置为：激光波长780nm，激光能量24mW，光栅400lines/mm，光阑50，估计分辨率4.7～8.7cm^-1，采集曝光时间5s，选择荧光修正。面扫描步长50μm*50μm，点数2*2。

4.光谱预处理

本实验仪器采集得到的原始光谱是样本的面扫描谱图，每张谱图由固定区域内的4个点光谱组成。因此，首先将面扫描谱图进行基本处理，即拆分成4张点光谱图，并求算数平均获得平均谱图。随后手动剔除4个光谱差异较大的奇异样本，剩余有效样本56个。此外，由于有效样本光谱也存在漂移严重的现象，选择线性拟合方法进行基线校正。

随后，对校正后的光谱进行Norris 5点求导作为定性模型输入数据；计算校正光谱的差谱、结合Savitzky-Golay求导和一阶导作为定量模型输入数据。其中差谱是指：用含溴氰菊酯的菠菜样本SERS光谱减去无溴氰菊酯的菠菜样本SERS光谱。特征波段选取可以在后续建模时根据TQ Analyst软件自动筛选或手动筛选含特征峰较多、建模效果好的波数范围。

5.模型建立

定性分析选取判别分析和距离匹配两种算法，分别对无溴氰菊酯及含溴氰菊酯的两组菠菜样本做分类，并使用Norris 5点求导后的光谱数据建立定性模型。定性分类结果见附图4。

由于两个模型中校验集样本存在浓度相同及相近的情况，只标出了若干校验集样本，为更清楚的说明预测结果，模型的具体预测结果如表1、表2所示。其中，类别1为无农药菠菜样本，类别2为含溴氰菊酯菠菜样本。可以看到，两组预测样本都被正确分类，预测正确率为100％。

表1判别分析定性识别结果

表2距离匹配法定性识别结果

定量分析中，采用经典的PLS算法对经过Savitzky-Golay求导和一阶导后的差谱数据，建立了菠菜表面溴氰菊酯的定量模型。结果显示，其校正集相关系数可达到0.99以上，随机挑选了5个样本作为测试集后的相关系数也可达到0.95以上。定量分析结果见附图5。

实施例二：苹果表面多种农药残留的无损检测

1.实验材料

毒死蜱、马拉硫磷、吡虫啉三种农药标物，标准值均为1.0mg/ml，均购自中国计量科学研究院标准物质所；表面增强剂：Easy Peak(舒峰TM)科研型2号银溶胶，购自上海纳腾仪器有限公司；富士苹果：市售，形状大小、颜色均匀一致。

2.样本制备

毒死蜱、马拉硫磷、吡虫啉三种农药标物作为残留物配制农残样本，选取6个形状大小均一的市售富士苹果分别滴加三种农残样本，每两个苹果滴加同浓度同种农残样本，后期可探究背景对建模的影响。附图6所示为用单位面积换算法的步骤图，即在计算苹果表面积时，将苹果近似看做球体，再通过测量其质量，得到每个苹果的单位表面积对应质量，如表3所示(每个苹果测量三次取平均值)。

表3苹果样本信息

每个苹果上选取九个点分别滴加不同浓度农残样本溶液得到九个不同浓度样本，根据上表中得到的每个苹果单位表面积对应质量，以及需要得到的样本浓度可以计算得到需要配制的农残溶液样本浓度，如表4所示(单位面积滴加农残样本溶液100ul)。

表4农残样本配制表

3.光谱采集

按照上述方案配制好样本，利用DXR显微拉曼光谱仪的X-Y平台扫描得到每个样本的面扫描谱图，如附图7拉曼成像结果图所示，以待进一步分析。采集参数设置同实施例一，不同的是，面扫描点数为3*3。

4.光谱预处理

采取基线校正、差谱、特征波段选取、Norris求导法、Savitzky-Golay卷积求导法，一阶导或多种方法相结合。

5.模型建立

在定性分析时，首先考虑背景对分析结果的影响，再用判别分析算法分别对每种农残的18个样本光谱进行定性建模，结果如附图8所示，可看出滴加在不同苹果上、但农残种类与浓度均相同的样本光谱可完全被区分开，可见不同苹果背景对定性分析结果是存在一定影响的。

再将三种农残样本放到一起进行定性分析，选取距离匹配、判别分析两种定性分类算法，结果如附图9所示。本发明与大多数对两种农药做定性区分不同的是，对三种类别做区分，同时融入了三种农药的光谱特征信息，计算复杂度提高，模型准确度可能也会下降，但本发明的最终实施效果较好。附图9(a)中判别分析算法有8个样本分类错误，分类正确率85.2％；附图9(b)中距离匹配算法有2个分类错误，分类正确率96.3％，在可接受范围之内。可见农残种类对分类结果的影响要大于苹果样本背景本身对分类结果的影响。

定量分析时，用PLS算法对三种农残光谱进行建模，随机选取三个样本作为测试样本，模型校正及预测结果如附图10所示。结果表明，三个定量模型的校正结果较好，校正集相关系数均在0.99以上。

需要注意的是，公布实施例的目的在于帮助进一步理解本发明，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例所公开的内容，本发明要求保护的范围以权利要求书界定的范围为准。

Claims (9)

1.一种果蔬农药残留的无损检测方法，基于表面增强拉曼光谱SERS技术，采用多种预处理方法并建立定性模型和定量模型，实现快速、无损地检测果蔬中的农药残留含量；包括以下步骤：

1)同批次获取果蔬、农药原药试剂、表面增强剂；

2)配制农药溶液；采用直接法和单位面积换算法分别制备待测果蔬样本；

3)使用拉曼光谱仪采集待测果蔬样本的SERS光谱；

4)对拉曼光谱仪采集到的SERS光谱进行数据预处理；

5)利用预处理后得到的原始光谱或差谱，进一步建立果蔬中农药种类的定性模型和具体残留量的定量模型；所述差谱是将含农药样本SERS光谱减去无农药样本SERS光谱而获得的光谱数据；

6)利用步骤5)建立的定性模型和定量模型，实现快速、无损地检测果蔬中的农药残留含量。

2.如权利要求1所述无损检测方法，其特征是，步骤2)所述直接法是将果蔬样本用去离子水洗净后，置于常温下自然干燥，再滴加表面增强剂及农药，制备得到用于光谱采集的待测果蔬样本；所述单位面积换算法是通过测量和/或大致估计果蔬表面积，将整个果蔬的农残含量换算到单位面积上，在果蔬表面的一块单位面积滴加农药，制备得到用于光谱采集的待测果蔬样本。

3.如权利要求1所述无损检测方法，其特征是，步骤3)所述拉曼光谱仪是有效探测范围是0～3500cm^-1的DXR激光共焦显微拉曼光谱仪。

4.如权利要求1所述无损检测方法，其特征是，步骤4)所述数据预处理，具体先进行数据拆分，通过求算数平均获得平均谱图，再对平均谱图采用化学计量学方法进行数据预处理。

5.如权利要求4所述无损检测方法，其特征是，所述化学计量学方法包括基线校正、差谱、特征波段选取、Norris求导法、Savitzky-Golay卷积求导法和一阶导方法中的一种或多种。

6.如权利要求1所述无损检测方法，其特征是，步骤5)采用差谱数据建立菠菜表面溴氰菊酯残留量的定量模型。

7.如权利要求1所述无损检测方法，其特征是，步骤5)建立了苹果中毒死蜱、吡虫啉及马拉硫磷三种农药同时检测的定量及定性模型。

8.如权利要求1所述无损检测方法，其特征是，步骤5)具体通过距离匹配方法和判别分析方法建立果蔬中农药种类的定性模型。

9.如权利要求1所述无损检测方法，其特征是，步骤5)具体采用偏最小二乘方法PLS建立果蔬中农药具体残留量的定量模型。