CN103398999B - 基于拉曼光谱技术的等鞭金藻中胡萝卜素分布的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于拉曼光谱技术的等鞭金藻中胡萝卜素分布的检测方法，采用拉曼光谱仪，获取活体等鞭金藻藻液样本的拉曼光谱原始信息；以色素中的胡萝卜素为例，结合曼光谱仪获取胡萝卜素标准品的谱线；将获得的等鞭金藻藻液样本的原始拉曼数据进行预处理，结合胡萝卜素的标准品谱线，指认等鞭金藻藻液样本的拉曼谱峰对应的谱峰位置；选取一定区域的藻液样本进行面扫描，将胡萝卜素对应的特征谱峰处的拉曼强度值进行积分，即可得到等鞭金藻藻液中胡萝卜素分布的化学图像。本发明解决了现有检测方法需要对样本进行染色或复杂的化学处理，操作相对繁琐、耗时、耗力的问题。
Description
技术领域
本发明涉及微藻色素分布的化学图像技术领域，尤其涉及一种基于拉曼光谱技术的等鞭金藻中胡萝卜素分布的检测方法。
背景技术
微藻是一类系统发生各异、个体较小、通常为单细胞或群体的、能进行光合作用（少部分为异养生长）的水生（或陆生、气生、共生）低等植物。它是能够进行光合作用的微生物，可以利用阳光、水和CO2合成自身所需要的物质。目前，对藻类的识别分类及其生化分析已经成为海洋生物学的研究热点之一。
等鞭金藻属于金藻门、等鞭金藻纲、等鞭藻属，细胞大小一般为6-7μm×5-6μm，细胞上有两条等长鞭毛。等鞭金藻具有繁殖速度快、没有细胞壁、易于吸收、生产成本低等优点。等鞭金藻营养丰富，富含蛋白质、多糖和类胡萝卜素等，且安全无毒、易于人体吸收，其营养研究已受到广泛的关注。同时等鞭金藻含有大量的ω-3多不饱和脂肪酸，其中DHA和C18:2的含量最为丰富。等鞭金藻还被用于研发抗肿瘤药物，以及用于重金属吸附。因此，等鞭金藻在生物质能源生产上具有广阔的应用前景。
拉曼光谱是一种散射光谱，是研究分子振动的一种光谱方法，它的原理和机制与红外光谱不同，红外光谱对极性基团有很强的检出能力，而非极性基团如C=C、C-C等则具有很强的拉曼活性。但它们提供的结构信息是类似的，都是关于分子内部各种分子振动频率及有关振动能级的情况，所以能从分子水平上反映样品化学组成和分子结构上的差异，实现分子中某些化学键和官能团的“指纹鉴别”。另外水的拉曼散射很微弱几乎不产生干扰信号，使得拉曼在研究水溶液中的活体生物的无损检测上具有其他分子光谱无法比拟的优势。
发明内容
本发明提供了一种基于拉曼光谱技术的等鞭金藻中胡萝卜素分布的检测方法，解决了现有检测方法需要对样本进行染色或复杂的化学处理，操作相对繁琐、耗时、耗力的问题。
一种基于拉曼光谱技术的等鞭金藻中胡萝卜素分布的检测方法，包括以下步骤：
（1）采用拉曼光谱仪，获取活体等鞭金藻藻液样本的拉曼光谱原始信息；
（2）利用步骤（1）的操作获取胡萝卜素标准品的谱线；
（3）将步骤（1）中获得的拉曼光谱原始信息进行预处理得到预处理谱图，对比预处理谱图以及步骤（2）中的谱线，在等鞭金藻藻液样本的拉曼谱峰中确定胡萝卜素对应的特征谱峰位置；
（4）利用所述的拉曼光谱仪，对待测等鞭金藻藻液样本中的选定区域进行面扫描，得到扫描信息，对扫描信息中与所述特征谱峰位置相对应的拉曼强度值进行积分，得到选定区域中胡萝卜素的分布图像。
在本发明中，拉曼光谱仪具体选用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪，在对样品进行信息采集时，都是在恒温（约25℃）条件下进行的。
在步骤（1）中，将所述的活体等鞭金藻藻液样本放置在拉曼光谱仪的载物台上，利用激光强度为1mv的激光束，并通过50X的物镜聚焦到样本的表面，曝光时间1s，得到所述的拉曼光谱原始信息。
在步骤（3）中，所述的预处理为依次进行的基线校正和平滑处理。
由于原始拉曼受荧光干扰较大，荧光的产生会覆盖拉曼的信号，因此首先采用基线校正的方法去除荧光的干扰，凸显信号，且基线校正和平滑处理均基于拉曼光谱仪附带的软件WIRE3.3。
对比预处理谱图以及胡萝卜素标准品的谱线，指认其拉曼谱峰对应的色素成分，其中，胡萝卜素标准品的特征谱峰位置为1159cm-1和1520cm-1。
在所述的步骤（4）中，以横纵步长均为1.5μm且包括576个点的圆形区域作为所述的选定区域，得到的扫描信息包括所有点1000-2000cm-1拉曼位移范围内的光谱。
结合上述的特征谱峰位置，选择拉曼位移范围为1510-1540cm-1以及1145-1175cm-1处对应的强度值进行积分，得到研究区域等鞭金藻藻液胡萝卜素分布的化学图像。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明实现了基于拉曼光谱技术的微藻色素分布的化学成像，不需要配制任何溶液以及化学测定，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间，也避免了由于操作人员操作不熟练或者主观因素带来的测量结果不准确等后果。
附图说明
图1a为等鞭金藻藻液样本的原始拉曼光谱图。
图1b为等鞭金藻藻液预处理后的拉曼光谱图。
图2为显微镜下待测等鞭金藻藻液样本图像。
图3为胡萝卜素特征谱峰1510-1540cm-1积分得到的待测等鞭金藻藻液中胡萝卜素分布的化学图像。
图4为胡萝卜素特征谱峰1145-1175cm-1积分得到的待测等鞭金藻藻液中胡萝卜素分布的化学图像。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐释本发明。
取一定浓度的等鞭金藻样本，采用雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪（inVia–Reflex 532/XYZ），获取活体等鞭金藻藻液样本的拉曼光谱原始信息。即将制好的藻液切片固定在显微拉曼光谱仪物镜下方载物台上，激光束通过50X的物镜聚焦到样本的表面。其中曝光时间设置为1s，激光强度为1mv，累计次数一次。整个实验过程都是在恒温（约25℃）条件下进行的，图1a是某等鞭金藻藻液样本的原始拉曼光谱。
由于原始拉曼光谱图受荧光干扰较大，荧光的产生会覆盖拉曼的信号，因此首先采用基线校正的方法去除荧光的干扰，凸显信号。然后采用平滑处理去除噪声。这两种预处理的过程都是在软件WIRE3.3中实现的，其中图1b是图1a中的小球藻样本经基线校正及平滑处理后的拉曼光谱。
以色素中的胡萝卜素为例，结合雷尼绍显微共焦拉曼光谱仪（inVia–Reflex 532/XYZ）获取胡萝卜素标准品的谱线，确定其主要的谱峰位置为1159cm-1和1520cm-1。结合胡萝卜素的标准品谱线，指认预处理后等鞭金藻藻液样本的拉曼谱峰对应的色素成分，主要包括胡萝卜素对应的谱峰位置。
选取某圆形区域的藻液样本进行面扫描，其中包括576个点，横纵步长均为1.5μm，采集了所有点在1000-2000cm-1拉曼位移范围内的光谱。结合提取的胡萝卜素的特征谱峰，选择拉曼位移范围为1510-1540cm-1以及1145-1175cm-1处对应的强度值进行积分，即可得到等鞭金藻藻液中胡萝卜素分布的化学图像。其中图2为显微镜下待测等鞭金藻藻液样本图像。图3为胡萝卜素特征谱峰1510-1540cm-1积分得到的待测等鞭金藻藻液中胡萝卜素分布的化学图像。图4为胡萝卜素特征谱峰1145-1175cm-1积分得到的待测等鞭金藻藻液中胡萝卜素分布的化学图像。图3与图4中所示的绿色对应了藻液中的胡萝卜素含量，并且颜色的深浅与胡萝卜素含量成正比，即随着绿色加深胡萝卜素含量增加。
Claims (4)
1.一种基于拉曼光谱技术的等鞭金藻中胡萝卜素分布的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用拉曼光谱仪，获取活体等鞭金藻藻液样本的拉曼光谱原始信息；
(2)利用步骤(1)的操作获取胡萝卜素标准品的谱线；
(3)将步骤(1)中获得的拉曼光谱原始信息进行预处理得到预处理谱图，对比预处理谱图以及步骤(2)中的谱线，在等鞭金藻藻液样本的拉曼谱峰中确定胡萝卜素对应的特征谱峰位置；
在步骤(3)中，所述的预处理为依次进行的基线校正和平滑处理；
(4)利用所述的拉曼光谱仪，对待测等鞭金藻藻液样本中的选定区域进行面扫描，得到扫描信息，对扫描信息中与所述特征谱峰位置相对应的拉曼强度值进行积分，得到选定区域中胡萝卜素的分布图像；
在所述的步骤(4)中，以横纵步长均为1.5μm且包括576个点的圆形区域作为所述的选定区域，得到的扫描信息包括所有点在1000-2000cm-1拉曼位移范围内的光谱。
2.如权利要求1所述的基于拉曼光谱技术的等鞭金藻中胡萝卜素分布的检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，将所述的活体等鞭金藻藻液样本放置在拉曼光谱仪的载物台上，利用激光强度为1mv的激光束，并通过50X的物镜聚焦到样本的表面，曝光时间1s，得到所述的拉曼光谱原始信息。
3.如权利要求1所述的基于拉曼光谱技术的等鞭金藻中胡萝卜素分布的检测方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，所述特征谱峰位置为1159cm-1和1520cm-1。
4.如权利要求1所述的基于拉曼光谱技术的等鞭金藻中胡萝卜素分布的检测方法，其特征在于，所述特征谱峰位置相对应的拉曼位移范围为1510-1540cm-1和1145-1175cm-1。
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