CN103592283B

CN103592283B - 一种快速检测微藻产能过程的方法

Info

Publication number: CN103592283B
Application number: CN201310595881.1A
Authority: CN
Inventors: 籍月彤; 王婷婷; 王允; 何曰辉; 黄巍; 徐健
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2013-11-21
Filing date: 2013-11-21
Publication date: 2016-03-09
Anticipated expiration: 2033-11-21
Also published as: CN103592283A

Abstract

本发明涉及能源微藻的评价领域，具体是一种快速检测微藻产能过程的方法。将产能状态下的待测微藻通过拉曼光谱技术测定获得微藻单细胞的拉曼光谱采集，进而定量的对待测微藻产能过程进行确定。本发明利用单细胞拉曼光谱技术，对能源微藻生产过程进行检测，克服了传统方法中存在的样本处理时间过长、测量步骤复杂、样本需求量大等缺点，进而能够快速（实时）、简便、痕量且准确的测定能源微藻代谢物的产量。

Description

一种快速检测微藻产能过程的方法

技术领域

本发明涉及能源微藻的评价领域，具体是一种快速检测微藻产能过程的方法。

背景技术

碳排放和化石能源原料短缺已成为制约全球经济可持续发展的重大瓶颈。通过光合作用，利用太阳能将CO₂转化为化石能源替代品，是缓解全球能源危机和对温室气体CO₂有效利用的理想途径。

微藻具有光合效率高、不与粮食作物竞争土地和淡水、固定二氧化碳并转化成高含量能量物质等优点。同时，微藻还能用于污水处理以及碳捕获，因此藻类生物燃料生产更利于保护环境和公共健康，被认为是最有潜力投入规模化生产的新一代生物燃料和功能性产品的原料供应者。

在能源微藻生产过程中如何快速准确的检测代谢物，来优化生产条件、指导采收时间、评价生产工艺稳定性等，是降低生产成本、提高生产效率的有效途径。目前微藻代谢物的检测手段主要基于质谱、色谱、核磁共振、比色法等方法，这些方法操作复杂，耗时耗力，且需要的样品量大（上百毫升）。如对用来生产生物柴油的微藻细胞胞内累积的油脂进行检测时，常用薄层层析、气质联用、液质联用等方法，前期样本的处理步骤复杂，涉及冷冻干燥、液氮研磨、萃取等多个步骤，且需要上百毫升的藻体，最终得到数据至少需要1-2天，严重影响了数据的有效性；又如对用来生产生物乙醇的微藻细胞胞内累积的淀粉进行检测时，在对样本进行冷冻干燥、液氮研磨、萃取处理后，采用酸法或酶法将淀粉水解成葡萄糖，进行比色法定量，该过程需要的藻体量大（上百毫升），且用时长（1-2天）。由此可见，样本处理时间过长、测量步骤复杂、样本需求量大等问题，严重制约了生产过程中代谢物的检测效率。

拉曼光谱在微藻油脂检测上的应用少许报道，Samek等通过测定固定在琼脂糖上的藻细胞拉曼图谱，建立了通过特定峰位比值分析估测脂类不饱和度的方法，但其细胞处理步骤繁琐，且因为对细胞进行了固定操作而无法进行后续研究。Singh小组通过拉曼图谱分析不同微藻的油脂产量，并通过特定峰位比值的分析对脂类的不饱和度及凝固温度进行定量，但对每个细胞进行采集前，至少需要2分钟去荧光化，严重影响了分析速度。拉曼光谱在微藻淀粉检测上的应用未见报道。

发明内容

本发明的发明目的在于提供一种快速检测微藻产能过程的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种快速检测微藻产能过程的方法：

将产能状态下的待测微藻通过拉曼光谱技术测定获得微藻单细胞的拉曼光谱采集，进而定量的对待测微藻产能过程进行确定。

具体为，利用激光光钳捕获产能状态下的待测微藻单细胞，同时瞬间对胞内的色素进行淬灭，然后进行对待测微藻单细胞的拉曼光谱采集，对获得的拉曼光谱数据进行处理后，选取微藻所产能的特征拉曼峰位，进而定量的对待测微藻产能过程进行确定。

主要步骤如下：

1）将产能状态下的微藻细胞用低拉曼背景的溶液(如ddH₂O)，洗净后重悬；

2）用激光光钳捕获重悬后单个微藻细胞，读取细胞拉曼光谱；

3）测定细胞附近背景拉曼光谱；

4）扣除背景值后，进行数据处理；

5）读取特征拉曼峰位读数。

所述产能微藻为小球藻（Chlorella）、衣藻（Chlamydomonas）、栅藻（Scenedesmus）、微拟球藻（Nannochloropsis）、绿球藻（Chlorococcum）、拟绿球藻（Pseudochlorococcum）、褐指藻（Phaeodactylum）、杜氏藻（Dunaliella）、聚球藻（Synechococcus）、鱼腥藻（Anabaena）或螺旋藻（Spirulina）。

所述步骤2）中激发光源波长为532nm，功率范围为10mW-1000mW，拉曼光谱采集时间0.01-100秒。

所述产能过程包括藻株产油、产淀粉等固定CO₂、转化太阳能为胞内能量物质的过程。

所述数据处理包括基线校准、归一化处理、Savitzky-Golay平滑处理等。

所述特征拉曼峰位特征包括油脂、淀粉等特征拉曼峰位，

具体，1056cm^-1，1075cm^-1，1116cm^-1，1260cm^-1，1302cm^-1，1441cm^-1，1656cm^-1，1735cm^-1，2850-2930cm^-1，3023cm^-1等与脂类相关的拉曼峰位；

478cm^-1，868cm^-1，941cm^-1，1053cm^-1，1083cm^-1，1109cm^-1，1127cm^-1，1340cm^-1，1380cm^-1，1396cm^-1，1461cm^-1，2911cm^-1等与淀粉相关的拉曼峰位。

本发明所具有的优点：

本发明利用单细胞拉曼光谱技术对微藻生产过程进行检测，拉曼光谱是一种高效的信息识别技术，直接检测化合物分子振动或转动能级，通过对特定入射光线对化合物的非弹性散射谱线分析，获得化合物分子构成和结构的信息。因此用于测定整个细胞化学物质指纹图谱时不需要任何标记，直接可提供胞内包括核酸、蛋白质、糖类和脂类等大量化合物的信息，从而识别活体细胞的细胞类型、生理特性和表征变化。本发明所阐述的方法具有样本前处理简单——仅需要离心；测量步骤简单——仅需测量拉曼光谱；样本需求量小——仅需微升级样品等诸多优点，整个过程可在1小时内完成，真正做到实时反映微藻产能过程，且与传统方法相比准确性很高，如油脂检测与传统方法（液质联用）测定结果相关性R²=0.9790，淀粉检测与传统方法（酶法）测定结果相关性R²=0.9681。

本发明利用单细胞拉曼光谱技术，对能源微藻生产过程进行检测，克服了传统方法中存在的样本处理时间过长、测量步骤复杂、样本需求量大等缺点，进而能够快速（实时）、简便、痕量且准确的测定能源微藻代谢物的产量。

本发明提供的方法无需细胞的固定化处理及2分钟以上的去荧光化处理，即可快速、准确的获知微藻细胞的产能状态，为工业化生产提供一种快速简便的检测手段，为藻株筛选提供一种高效的判别方法。

附图说明

图1为本发明实施例提供的NannochloropsisoceanicaIMET-1产油过程拉曼光谱随着时间变化曲线图。

图2为本发明实施例提供的拉曼光谱预测总脂含量与液质联用测定值相关性曲线图。

图3为本发明实施例提供的Chlorellapyrenoidosa产淀粉过程拉曼光谱随着时间变化曲线图。

图4为本发明实施例提供的拉曼光谱预测淀粉含量与酶法测定值相关性曲线图。

具体实施方式

以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1（以产油过程的检测为例）

1）微拟球藻（NannochloropsisoceanicaIMET-1）接种到f/2培养基中（3个生物学重复），50μmolphotonsm^-2s^-1光强持续光照，1.5%CO₂通气量，25度培养至OD₇₅₀=3.0；

2）将上述培养液于4℃、3000rpm离心5分钟收集藻细胞，将藻细胞转接到缺氮f/2培养基中，并对0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h和96h下培养液各取样200uL（同时取200mL藻液用于传统的液质联用总脂含量测定）；

3）将上述不同培养时间的培养液在室温下3000rpm离心1分钟分别收集藻细胞，ddH₂O洗3遍，并分别重悬在1mLddH₂O中，分别用于单细胞拉曼光谱采集；

4）将上述分别重悬后的藻细胞虹吸到扁平毛细管（50mm×1mm×0.1mm，Camlab，UK）中；

5）用拉曼激活细胞分选系统（RACS，WellsensInc，China）捕获单细胞，激光参数选择300mW532nm，拉曼光谱采集时间1s，每个样品采集20个细胞；

6）并按照上述设定的相同条件测定细胞周围背景拉曼光谱，用LabSpec5（HORIBAScientific）进行背景扣除、基线校准和归一化处理，如图1所示，随着培养时间的延长，脂类拉曼峰位逐渐变强。

7）读取脂类相关拉曼峰位读数（1056cm^-1，1075cm^-1，1116cm^-1，1260cm^-1，1302cm^-1，1441cm^-1，1656cm^-1，1735cm^-1，2850-2930cm^-1，3023cm^-1），不同时间点总脂含量，与液质联用测定结果相关性R²=0.9790，如图2所示，表明本发明所陈述方法可以准确定量微藻胞内累积的脂类。

实施例2（以产淀粉过程的检测为例）

1）蛋白核小球藻（Chlorellapyrenoidosa）接种到Endo培养基中（3个生物学重复），100μmolphotonsm^-2s^-1光强持续光照，150rpm25度培养；

2）将上述培养液0h、8h、24h、48h和72h各取样200uL（同时取200mL藻液用于传统的酶法测定淀粉含量）；

3）将上述不同培养时间的培养液在室温下3000rpm离心1分钟收集藻细胞，ddH₂O洗3遍，并分别重悬在1mLddH₂O中，分别用于单细胞拉曼光谱采集；

4)将上述分别重悬后的藻细胞虹吸到扁平毛细管（50mm×1mm×0.1mm，Camlab，UK）中；

5)用拉曼激活细胞分选系统（RACS，WellsensInc，China）捕获单细胞，激光参数选择100mW532nm，拉曼光谱采集时间5s，每个样品采集20个细胞；

6)并按照上述设定的相同条件测定细胞周围背景拉曼光谱，用LabSpec5（HORIBAScientific）进行背景扣除、基线校准和归一化处理，如图3所示，随着培养时间的延长，淀粉拉曼峰位逐渐增强又减弱；

7)读取淀粉相关拉曼峰位（478cm^-1，868cm^-1，941cm^-1，1053cm^-1，1083cm^-1，1109cm^-1，1127cm^-1，1340cm^-1，1380cm^-1，1396cm^-1，1461cm^-1，2911cm^-1）读数，不同时间点淀粉含量，与酶法MegazymeKit（MegazymeInternational,CountyWicklow,Ireland）测定结果相关性R²=0.9681，如图4所示，表明本发明所陈述方法可以准确定量微藻胞内累积的淀粉类物质。

Claims

1.一种快速检测微藻产能过程的方法，其特征在于：

将产能状态下的待测微藻通过拉曼光谱技术测定获得微藻单细胞的拉曼光谱采集，进而定量的对待测微藻产能过程进行确定；

具体为，

利用激光光钳捕获产能状态下的待测微藻单细胞，同时瞬间对胞内的色素进行淬灭，然后进行对待测微藻单细胞的拉曼光谱采集，对获得的拉曼光谱数据进行处理后，选取微藻所产能的特征拉曼峰位，进而定量的对待测微藻产能过程进行确定；

所述产能为产脂类或产淀粉；

所述激发光源波长为532nm，功率范围为10mW-1000mW，拉曼光谱采集时间0.01秒-100秒。

2.按权利要求1所述的快速检测微藻产能过程的方法，其特征在于：主要步骤如下：

1)将产能状态下的微藻细胞用低拉曼背景的溶液，洗净后重悬；

2)用激光光钳捕获重悬后单个微藻细胞，读取细胞拉曼光谱；

3)测定细胞附近背景拉曼光谱；

4)扣除背景值后，进行数据处理；

5)读取特征拉曼峰位读数。

3.按权利要求2所述的快速检测微藻产能过程的方法，其特征在于：所述产能微藻为小球藻(Chlorella)、衣藻(Chlamydomonas)、栅藻(Scenedesmus)、微拟球藻(Nannochloropsis)、绿球藻(Chlorococcum)、拟绿球藻(Pseudochlorococcum)、褐指藻(Phaeodactylum)、杜氏藻(Dunaliella)、聚球藻(Synechococcus)、鱼腥藻(Anabaena)或螺旋藻(Spirulina)。