CN105181670A - 一种利用细胞分泌蛋白sers光谱检测药物细胞毒性方法 - Google Patents

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本发明属于抗癌药物对细胞毒性的检测领域，具体涉及一种利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物细胞毒性方法。先利用乙醇富集经药物作用后的细胞分泌蛋白，再利用SERS光谱技术获取细胞分泌蛋白的SERS光谱，最后结合四唑盐比色法建立细胞分泌蛋白SERS光谱特征峰与细胞存活率标准曲线，从标准曲线中获得不同时间细胞存活率的定量信息，实现SERS光谱对药物细胞毒性的检测。通过测量细胞分泌蛋白的SERS光谱，可实现药物对细胞毒性的检测，对进一步研究分泌蛋白的相关生物学机制具有潜在学术和应用价值。

Description

一种利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物细胞毒性方法
技术领域
本发明属于抗癌药物对细胞毒性的检测领域，具体涉及一种利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物细胞毒性方法。
背景技术
分泌蛋白（secretedproteins）是指由细胞分泌到细胞外基质并通过体液循环作用于靶细胞和靶器官的可溶性的蛋白。细胞分泌蛋白质是一种重要的生物大分子，主要包括细胞因子、免疫调节因子、激素和其他生物活性分子，它们参与许多重要的生命过程，如：细胞信号的传导、细胞的增殖和分化、免疫防御等。尤其是肿瘤细胞的分泌蛋白，与恶性肿瘤的血管发生、分化、侵袭和转移密切相关，不同时期的肿瘤细胞可以产生各种分泌蛋白，主要作用包括增加血管通透性和纤维及纤连素外渗、调节机制金属蛋白酶、调节白细胞浸润、改变宿主免疫反应、促进血管新生等，最终促进肿瘤生长、浸润和转移。
拉曼散射效应是入射光照射到样品上时发生的频率和方向均改变的非弹性散射。拉曼光谱反映了样品分子化学键的振动信息，可用于分子结构的分析。它可以提供生物分子如蛋白质、核酸和脂质等成分和构象的化学指纹信息，具有样品预处理简单和检测无损等优点。然而常规拉曼散射信号较弱，易受样品荧光背景干扰，尤其对微量浓度的样品进行检测分析时，其灵敏度较低。表面增强拉曼光谱(Surface-enhancedRamanspectroscopy，简称SERS)技术借助增强基底的金属纳米尺度效应可显著增强吸附在金属纳米粒子表面待测分子的拉曼信号，最高达1014倍。SERS技术具有检测功率低、检测速度快、对生物样品损伤小、高灵敏度和高特异性等优点，是一种高效快速的单分子检测技术。
目前抗癌药物杀伤肿瘤细胞主要通过以下三类途径：（1）选择性阻断肿瘤细胞自分泌或旁分泌的信号传导通路，破坏其自控性生长调节机制；（2）抑制肿瘤组织血管生成；（3）诱导肿瘤细胞发生凋亡。在抗癌药物杀伤肿瘤细胞的过程中，其分泌蛋白的种类和数量均发生不同程度的变化。细胞分泌蛋白的变化情况很大程度上能反映出抗肿瘤药物的细胞毒性。
目前用于分泌蛋白检测和鉴定的传统方法主要是生物学方法，如多重聚合酶链反应（PCR）、免疫组化如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹法（westernblotting）等，然而这些传统的方法存在步骤复杂、耗时长和成本较高等缺点。而且以上方法不能实现药物对细胞毒性的检测。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物对细胞毒性的方法。该方法具有步骤简单、检测快速和成本低廉等优点，可很大程度上克服传统细胞分泌蛋白检测方法的缺点并能实现药物对细胞毒性的检测。从而对研制生物活性高、毒性低的新型抗癌药物具有重要应用价值
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物对细胞毒性的方法，先利用乙醇富集经药物作用后的细胞分泌蛋白，再利用SERS光谱技术获取细胞分泌蛋白的SERS光谱，最后结合四唑盐比色法建立细胞分泌蛋白SERS光谱特征峰与细胞存活率标准曲线，从标准曲线中获得不同时间细胞存活率的定量信息，实现SERS光谱对药物细胞毒性的检测。
所述的利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物对细胞毒性的方法，具体包括以下步骤：
1）细胞分泌蛋白的富集
待体外培养细胞处于对数分裂期时，弃掉原有细胞培养液，用PBS缓冲液冲洗三次，加入含有抗癌药物但不含双抗和胎牛血清的不完全细胞培养液，培养1-72h，分别取不同培养时间的细胞培养液200~500μL与-20℃~0℃的400-1000μL无水乙醇混合于一离心管中，8000~12000rpm离心5-10min，弃上清液；沉淀用95wt%的乙醇洗涤一次，10000rpm离心2-5min，弃上清液，得到沉淀于离心管底部的细胞分泌蛋白，室温下干燥30-60min；然后加入10~20μL超纯水溶解干燥后的细胞分泌蛋白，得到细胞分泌蛋白液；
2）SERS光谱检测
将SERS光谱增强基底溶胶进行离心浓缩处理，取SERS光谱增强基底浓缩胶体10-40μL与步骤（1）制得的细胞分泌蛋白液2-10μL混合均匀后，在光滑平整的检测基底上点样，点样直径为5-8mm，自然晾干后进行SERS光谱的测量；
3）细胞分泌蛋白SERS光谱预处理及特征峰选择
对步骤（2）测量得到的细胞分泌蛋白SERS光谱进行强度归一化或面积归一化处理，从350-3500cm-1波数范围选取1-3个变化最为显著谱峰作为细胞分泌蛋白SERS光谱特征峰；
4）建立SERS光谱特征峰-细胞存活率标准曲线
利用四唑盐比色法检测对应浓度抗癌药物作用下的细胞存活率变化，以步骤3）SERS光谱特征峰的相对强度为纵坐标，四唑盐比色法测得的细胞存活率为横坐标作图即得标准曲线；最后根据SERS光谱特征峰相对强度在标准曲线上直接查出相应浓度抗癌药物作用细胞后细胞的存活率变化。
步骤2）所述SERS光谱增强基底溶胶为银溶胶或金溶胶中的一种。
步骤2）所述的离心浓缩处理为：离心转速为8000-12000rpm，时间为8-15min。
步骤2）所述的检测基底为99.99%铝片、石英基底、不锈钢基底、金箔、MgF2、CaF2、银箔中的一种。
步骤2）所述的SERS光谱的测量其条件为：激光功率为0.15~18mW，激光激发波长为400~900nm，取谱范围为350-3500cm-1。
步骤3）所述的细胞分泌蛋白SERS光谱特征峰为药物作用细胞前后同一细胞分泌蛋白SERS光谱峰的相对强度出现明显变化的SERS光谱峰。
采用MTT比色法检测细胞存活率，将细胞配成单细胞悬液，以每孔15000-25000个细胞接种于96孔板，每孔150-300μl；将细胞置于适宜的环境下培养，待细胞贴壁后，加入不同浓度的抗癌药物，每个浓度设置8-32个复孔，每个板设置空白对照孔，孵育24h；每孔加入10-25μl浓度1-10mg/ml的MTT溶液，孵育2-6h后，弃掉孔内的溶液，改每孔加入80-250μl的DMSO（注意空白对照孔也要加入等量DMSO），振荡10-30min，使得结晶充分溶解；酶联免疫检测仪测每孔的光吸收值，记录结果。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）本发明在富集体外培养细胞的分泌蛋白时，操作简单省时，且所用的溶剂仅有乙醇，成本低；且待样品干燥后，乙醇挥发，不引入新的有机溶剂，从而不干扰分泌蛋白的SERS信号；
（2）本发明可以检测抗癌药物对细胞分泌蛋白的影响，对进一步研究分泌蛋白的相关生物学机制具有潜在学术和应用价值；
（3）本发明使用SERS技术检测细胞的分泌蛋白，检测时间仅需数十秒，检测所需激光功率低至几毫瓦，不损伤蛋白样品，因此，本发明具有快速、无损、灵敏的检测优势；
（4）本发明的方法实时监测药物对细胞的杀伤情况，为新型抗癌药物筛选及药物细胞毒性评估提供一种可参考的新方法。
附图说明
图1是本发明测得的不同浓度多柔比星作用下的HepG2细胞分泌蛋白SERS光谱图；黑线、红线和蓝线分别对应0.05μg/ml、0.01μg/ml和0μg/ml（对照）的多柔比星作用下的HepG2细胞分泌蛋白SERS光谱；
图2是本发明以HepG2细胞分泌蛋白SERS光谱特征峰的相对强度为纵坐标，不同浓度多柔比星作用下HepG2细胞存活率为横坐标作图得到的标准曲线；
图3是本发明测得的不同浓度LO2作用下的LO2细胞分泌蛋白SERS光谱图。黑线、红线和蓝线分别对应0.05μg/ml、0.01μg/ml和0μg/ml（对照）的LO2作用下的LO2细胞分泌蛋白SERS光谱；
图4是本发明以LO2细胞分泌蛋白SERS光谱特征峰的相对强度为纵坐标，不同浓度LO2作用下LO2细胞存活率为横坐标作图得到的标准曲线；
其中，图1和图3中纵坐标表示SERS谱峰的相对强度，单位为任意单位（a.u.）横坐标表示各谱线的峰位置，以波数（cm-1）表示。
具体实施方式
实施例1
不同浓度药物多柔比星对HepG2细胞毒性的检测
(1)体外培养HepG2细胞分泌蛋白的富集
待体外培养HepG2细胞处于对数分裂期时，弃掉原有细胞培养液，用PBS缓冲液冲洗三次，加入含有0.01μg/mL和0.05μg/mL多柔比星但不含双抗和胎牛血清的不完全细胞培养液，培养48h，分别取不同浓度多柔比星作用后的细胞培养液300μL与-10℃的600μL无水乙醇混合于一1.5mL离心管中，10000rpm离心8min，此时分泌蛋白呈白色沉淀在离心管底部，弃上清，用95%的乙醇洗涤一次，离心机中8000rpm离心3min，去上清，得到沉淀于离心管底部的细胞分泌蛋白，室温下干燥40min，加入12μL超纯水溶解富集后的细胞分泌蛋白。
（2）HepG2细胞分泌蛋白SERS光谱检测
将SERS增强基底溶胶进行离心浓缩处理，取SERS增强基底浓缩胶体20μL与步骤（1）富集的分泌蛋白4μL混合均匀后，在光滑平整的检测基底上点样，点样直径为5mm，自然晾干后进行SERS光谱的测量。
（3）HepG2细胞分泌蛋白SERS光谱预处理及特征峰选择
对步骤（2）测量获取的细胞分泌蛋白SERS光谱进行强度归一化处理，从450-1800cm-1波数范围选取1个变化最为显著谱峰作为HepG2细胞分泌蛋白SERS光谱特征峰。
（4）建立SERS光谱特征峰-细胞存活率标准曲线
利用MTT比色法检测不同浓度多柔比星作用下的HepG2细胞存活率变化，以步骤（3）SERS光谱特征峰的相对强度为纵坐标，MTT比色法测得的细胞存活率为横坐标作图即得标准曲线。最后根据SERS光谱特征峰相对强度在标准曲线上直接查出对应浓度多柔比星作用细胞后细胞的存活率变化。
实施例2
不同浓度药物顺铂对LO2细胞毒性的检测
待体外培养LO2细胞处于对数分裂期时，弃掉原有细胞培养液，用PBS缓冲液冲洗三次，加入含有0.01μg/mL和0.05μg/mL药物但不含双抗和胎牛血清的不完全细胞培养液，培养36h，分别取不同浓度LO2作用后的细胞培养液400μL与-20℃的800μL无水乙醇混合于一1.5mL离心管中，12000rpm离心5min，此时分泌蛋白呈白色沉淀在离心管底部，弃上清，用95%的乙醇洗涤一次，离心机中10000rpm离心1min，去上清，得到沉淀于离心管底部的细胞分泌蛋白，室温下干燥50min，加入18μL超纯水溶解富集后的细胞分泌蛋白。
（2）LO2细胞分泌蛋白SERS光谱检测
将SERS增强基底溶胶进行离心浓缩处理，取SERS增强基底浓缩胶体10μL与步骤（1）富集的分泌蛋白2μL混合均匀后，在光滑平整的检测基底上点样，点样直径为8mm，自然晾干后进行SERS光谱的测量。
（3）LO2细胞分泌蛋白SERS光谱预处理及特征峰选择
对步骤（2）测量获取的细胞分泌蛋白SERS光谱进行强度归一化处理，从400-1750cm-1波数范围选取1个变化最为显著谱峰作为LO2细胞分泌蛋白SERS光谱特征峰。
（4）建立SERS光谱特征峰-细胞存活率标准曲线
利用MTT比色法检测不同浓度LO2作用下的LO2细胞存活率变化，以步骤（3）SERS光谱特征峰的相对强度为纵坐标，MTT比色法测得的细胞存活率为横坐标作图即得标准曲线。最后根据SERS光谱特征峰相对强度在标准曲线上直接查出对应浓度LO2作用细胞后细胞的存活率变化。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物细胞毒性方法，其特征在于：先利用乙醇富集经药物作用后的细胞分泌蛋白，再利用SERS光谱技术获取细胞分泌蛋白的SERS光谱，最后结合四唑盐比色法建立细胞分泌蛋白SERS光谱特征峰与细胞存活率标准曲线，从标准曲线中获得不同时间细胞存活率的定量信息，实现SERS光谱对药物细胞毒性的检测。
2.根据权利要求1所述的利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物细胞毒性方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
1）细胞分泌蛋白的富集
待体外培养细胞处于对数分裂期时，弃掉原有细胞培养液，用PBS缓冲液冲洗三次，加入含有抗癌药物但不含双抗和胎牛血清的不完全细胞培养液，培养1-72h，分别取不同培养时间的细胞培养液200~500μL与-20℃~0℃的400-1000μL无水乙醇混合于一离心管中，8000~12000rpm离心5-10min，弃上清液；沉淀用95wt%的乙醇洗涤一次，10000rpm离心2-5min，弃上清液，得到沉淀于离心管底部的细胞分泌蛋白，室温下干燥30-60min；然后加入10~20μL超纯水溶解干燥后的细胞分泌蛋白，得到细胞分泌蛋白液；
2）SERS光谱检测
将SERS光谱增强基底溶胶进行离心浓缩处理，取SERS光谱增强基底浓缩胶体10-40μL与步骤（1）制得的细胞分泌蛋白液2-10μL混合均匀后，在光滑平整的检测基底上点样，点样直径为5-8mm，自然晾干后进行SERS光谱的测量；
3）细胞分泌蛋白SERS光谱预处理及特征峰选择
对步骤（2）测量得到的细胞分泌蛋白SERS光谱进行强度归一化或面积归一化处理，从350-3500cm-1波数范围选取1-3个变化最为显著谱峰作为细胞分泌蛋白SERS光谱特征峰；
4）建立SERS光谱特征峰-细胞存活率标准曲线
利用四唑盐比色法检测对应浓度抗癌药物作用下的细胞存活率变化，以步骤3）SERS光谱特征峰的相对强度为纵坐标，四唑盐比色法测得的细胞存活率为横坐标作图即得标准曲线；最后根据SERS光谱特征峰相对强度在标准曲线上直接查出相应浓度抗癌药物作用细胞后细胞的存活率变化。
3.根据权利要求2所述的利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物对细胞毒性的方法，其特征在于：步骤2）所述SERS光谱增强基底溶胶为银溶胶或金溶胶中的一种。
4.根据权利要求2所述的利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物对细胞毒性的方法，其特征在于：步骤2）所述的离心浓缩处理为：离心转速为8000-12000rpm，时间为8-15min。
5.根据权利要求2所述的利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物对细胞毒性的方法，其特征在于：步骤2）所述的检测基底为99.99%铝片、石英基底、不锈钢基底、金箔、MgF2、CaF2、银箔中的一种。
6.根据权利要求2所述的利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物对细胞毒性的方法，其特征在于：步骤2）所述的SERS光谱的测量其条件为：激光功率为0.15~18mW，激光激发波长为400~900nm，取谱范围为350-3500cm-1。
7.根据权利要求2所述的利用细胞分泌蛋白SERS光谱检测药物对细胞毒性的方法，其特征在于：步骤3）所述的细胞分泌蛋白SERS光谱特征峰为药物作用细胞前后同一细胞分泌蛋白SERS光谱峰的相对强度出现明显变化的SERS光谱峰。
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