JP2008516249A - マルチプレックスタンパク質吸着アッセイ - Google Patents
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Abstract
− マルチウェル基材のウェルのそれぞれと、同一又は異なるタンパク質溶液とを接触させる工程であって、前記ウェルの表面が、前記基材のものと同一であるか、あるいは表面処理及び/又はコーティングされて試験表面を提供している、工程、及び
− 前記ウェルのそれぞれにおいて、タンパク質吸着レベルを測定する工程、
を含む、1つ以上のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド溶液と、1つ以上の基材表面との相互作用を測定できる、マルチプレックスアッセイ方法。
Description
1)ガラス(例えば、シリケート、ボレート、ボロシリケート、ホスフェートなど);
2)ガラスチューブを医薬包装へと変えるために利用される処理を模倣するために、酸素バーナー(oxy−fuel flame)で熱処理されているガラス;
3)ポリマー材料、例えば、アクリル系、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリアセタール、ポリスチレン、ポリアミド、ポリアクリルアミド、ポリイミド、ポリオレフィン、環状オレフィンコポリマー、特に二環式オレフィンコポリマー、又はポリマーフィルム;
4)ウェル表面に存在する、1つ以上の以下の官能基を有する有機コーティング:アミン、エポキシド、イソシアネート、イソチオシアネート、アシルアジド、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル、スルホ−NHSエステル、塩化スルホニル、イミドエステル、カルボジイミド、酸無水物、ヨードアセチル、マレミド(malemide)、アジリジン、アクリロイル、ジスルフィド、ジアゾアセテート、アリールアジド、チオール(スルフヒドリル)、メルカプト、アセテート、ヒドロキシル、カーボネート、アルデヒド、アルカン、アルケン、カルボキシレート、エステル、エーテルなど(これは、潜在的官能基の非包括的リストである);例えば前記官能基を含む、デンドリマー、ポリマー(ポリエチレングリコール−PEG)、ナノ粒子、及び高分岐ポリマーからなる有機コーティング/フィルム;
5)金属コーティング、例えば、金、銀、白金、パラジウムなど;
及び/又は
6)無機酸化物コーティング、例えば、SiO2、TiO2、ZrO2、Al2O3など;
などが含まれる。
する。タンパク質は、蛍光標識されてよく、蛍光光度計を用いて検出されてよい。例えば、V. Hlady, Applied Spectroscopy 1991, 45, 246及びD. J. Sbrich and R. E. Imhof in Topics in Fluorescence Spectroscopy, J. R. Lakowicz Ed., Plenum, New York,(1991), p.1を参照されたい。円偏光二色性は、偏光回転のマグニチュードを測定し、タンパク質の存在又は不在を検出する。例えば、C. R. McMillin and A. G. Walton−J. Colloid Interface Sci., 84,(1974), p. 345を参照されたい。ラマン散乱は、赤外線に相補的であり、分極率変化を受ける分子の振動スペクトルを測定する。これを用いて、特定の分子/官能基の存在又は不在を測定する。例えば、T. M. Cotton in Surface and Interfacial Aspects of Biomedical Polymers, 2, J. D. Andrade Ed., Plenum Press, New York,(1985), p. 161を参照されたい。一般に、本発明は、タンパク質分子を基材へ保持する力の性質により、多少なりとも限定されるものではない。
[実施例I]
(マルチプレックス製剤最適化プロトコル)
a)理想的には、一般的な形状の顕微鏡用スライド(名目上、25×75×1 mm3)又はマイクロタイタープレート(MTPフレーム内の基材が、公称寸法74×110×1 mm3を有する)である基材を選択する。
i)タンパク質を吸着させた後、標識抗体でウェルをインキュベートし、洗浄し、ついで結合タンパク質量を測定するためにスキャンしてよい;
又は
ii)タンパク質を吸着させた後、ELISAアッセイと類似のシグナル増幅が可能となるように、酵素結合抗体を用いてウェルを調べ(interrogate)てよい;
又は
iii)異なるタイプのプローブを用いて、抗体(モノクローナル及びポリクローナル)、アフィボディ(affibody)、抗体フラグメント、オリゴヌクレオチド、アミン反応性フルオロフォア及び色素(例えば、Cy−色素及び上述の他のもの)、特異リガンド(例えば、蛍光標識ストレプトアビジンを用いて、ビオチン化タンパク質を検出する)、並びに関心のあるタンパク質と特異的に結合する小分子を含む、吸着タンパク質を検出できる;
などにより実施できる。
2つのタイプのアッセイは、ガラス表面への、溶液中のタンパク質の吸着を実証する。シリコーン上部構造でウェルへと分割されたスライドガラスを使用することにより、100μL量のタンパク質溶液をインキュベートすることが可能になる。表面に結合したタンパク質を検出し、定量化するために、蛍光色素を用いて、適切な感度を確保する。2つのタイプのアッセイ、すなわち、直接及び間接アッセイについて述べる。
マルチプレックスアッセイを用いて、異なるpHで、製剤化されたタンパク質の吸着を評価する。タンパク質は、等電点(pI)を有しており、等電点は、タンパク質の正味荷電がゼロであるpHである。pI未満のいずれのpHでも、タンパク質はプラスに帯電し、他方、pIを超えるpHでは、正味荷電はマイナスとなる。その一方で、ガラスのゼータ電位は、3超のいずれのpHにおいてもマイナスであり、従って、ガラスは、そのpHを超えるpHでは、マイナスに帯電する。
一般に、タンパク質の異なる性質を考えると、異なるタンパク質は、同一表面に様々な程度で吸着することが予測される。この実験において、同一溶液中で製剤化された全ての異なるタンパク質の吸着を試験する。
表面電荷の効果はまた、タンパク質の吸着を変更するだろう。ガラス上のマイナス電荷は、プラスに帯電したタンパク質を引き寄せる傾向にあるからである。プラスに帯電した表面は、それらを撥ね退け、マイナスに帯電したタンパク質を引き寄せる傾向にあるべきである。スライド表面にアミノシランコーティングを適用することにより、この理論を試験する。コーティングは、結果として、プロトン化されている、パックされた(packed)アミノ基の表面をもたらす。ついで、塩基性(ヒストン)及び酸性(アルブミン)タンパク質の両方で表面をインキュベートする。図10に示すとおり、非コーティングコントロールと比較した場合に、プラスに帯電したタンパク質は、プラスに帯電した表面上にほとんど吸着せず、他方、マイナスに帯電したタンパク質は、より吸着する。
タンパク質治療薬(therapeutic)の製剤の最適化は、異なるpH及び濃度での多くのタイプのバッファーを考慮できる。ここに記載の方法は、これらの変化を試験するスループットを高めることを狙いとする。
Claims (25)
- 以下の工程:
− 少なくとも1つのマルチウェル基材のウェルのそれぞれと、同一又は異なるタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド溶液とを接触させる工程であって、前記ウェルの表面が、前記基材のものと同一であるか、あるいは表面処理及び/又はコーティングされて試験表面を提供している、工程、及び
− 前記ウェルのそれぞれにおいて、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド吸着レベルを測定する工程、
を含む、1つ以上のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド溶液と、1つ以上の基材表面との相互作用を測定できる、マルチプレックスアッセイ方法。 - 前記ウェル表面が、複数の異なる表面コーティング及び/又は処理を含む、請求項1記載のマルチプレックスアッセイ。
- 前記基材が、スライドガラスである、請求項1記載のマルチプレックスアッセイ。
- 前記基材が、マイクロタイタープレートである、請求項1記載のマルチプレックスアッセイ。
- 前記基材のウェルが、前記基材に適用される疎水性パターニング物質で創出される、請求項1記載のマルチプレックスアッセイ。
- 前記基材が、2〜10,000の個別のウェルを含む、請求項5記載のマルチプレックスアッセイ。
- 前記基材が、10〜1000の個別のウェルを含む、請求項6記載のマルチプレックスアッセイ。
- 前記溶液が、バッファー、塩、安定剤、保存料、酸及び/又は塩基を含む、請求項1記載のマルチプレックスアッセイ。
- 前記バッファーが、リン酸塩、クエン酸塩、及び/又は酢酸塩である、請求項8記載のマルチプレックスアッセイ。
- 前記安定剤が、ヒトアルブミン又はグリセリンである、請求項8記載のマルチプレックスアッセイ。
- 前記保存料が、フェノール、メタクレゾール、又はベンジルアルコールである、請求項8記載のマルチプレックスアッセイ。
- 前記酸又は塩基が、クエン酸、水酸化ナトリウム、塩酸、又は酢酸である、請求項8記載のマルチプレックスアッセイ。
- 前記タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドが、抗体、酵素、組み換えホルモン、組み換えインターフェロン、組み換え血液凝固カスケード因子、組み換えエリスロポエチン、ポリペプチド又はワクチン抗原である、請求項1記載のマルチプレックスアッセイ。
- 前記ウェルそれぞれにおけるタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド吸着レベルが、標識抗体で前記ウェルをインキュベートし、その結合量を測定するためにスキャンすることにより測定される、請求項1記載のマルチプレックスアッセイ。
- 前記ウェルそれぞれにおけるタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド吸着レベルが、酵素結合抗体を用いて調べ、シグナル増幅を測定することにより測定される、請求項1記載のマルチプレックスアッセイ。
- 蛍光検出が、表面に結合したタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド量の直接的な指標として用いられる、請求項1記載のマルチプレックスアッセイ。
- 以下の工程:
− マルチウェル基材のウェルのそれぞれと、同一又は異なるワクチン溶液とを接触させる工程であって、前記ウェルの表面が、前記基材のものと同一であるか、あるいは表面処理及び/又はコーティングされて試験表面を提供している、工程、及び
− 前記ウェルのそれぞれにおいて、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド吸着レベルを測定する工程、
を含む、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを含む1つ以上のワクチン溶液と、1つ以上の基材表面との相互作用を測定できる、マルチプレックスアッセイ方法。 - 前記ウェル表面が、複数の異なる表面コーティング及び/又は処理を含む、請求項17記載のマルチプレックスアッセイ。
- 前記基材が、スライドガラスである、請求項17記載のマルチプレックスアッセイ。
- 前記基材が、マイクロタイタープレートである、請求項17記載のマルチプレックスアッセイ。
- 前記基材が、2〜10,000の個別のウェルを含む、請求項20記載のマルチプレックスアッセイ。
- 前記溶液が、バッファー、塩、安定剤、保存料、酸及び/又は塩基を含む、請求項17記載のマルチプレックスアッセイ。
- 以下の工程:
− マルチウェル基材のウェルのそれぞれと、同一又は異なるポリヌクレオチド溶液とを接触させる工程であって、前記ウェルの表面が、前記基材のものと同一であるか、あるいは表面処理及び/又はコーティングされて試験表面を提供している、工程、及び
− 前記ウェルのそれぞれにおいて、ポリヌクレオチド吸着レベルを測定する工程、
を含む、1つ以上のポリヌクレオチド溶液と、1つ以上の基材表面との相互作用を測定できる、マルチプレックスアッセイ方法。 - 前記表面に結合したタンパク質が、タンパク質:色素複合体の形態である、請求項16記載のマルチプレックスアッセイ。
- 以下の工程:
− マルチウェル基材のウェルのそれぞれと、同一又は異なる生体分子溶液とを接触させる工程であって、前記ウェルの表面が、前記基材のものと同一であるか、あるいは表面処理及び/又はコーティングされて試験表面を提供している、工程、及び
− 前記ウェルのそれぞれにおいて、生体分子吸着レベルを測定する工程、
を含む、1つ以上の生体分子溶液と、1つ以上の基材表面との相互作用を測定できる、マルチプレックスアッセイ方法。
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