JP2016044993A - ヒストン化学修飾判定による癌診断方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒストンコード仮説に基づき、ヒストン修飾状態をラマン分析して癌診断する方法の提供。
【解決手段】過酸化銀を含む銀酸化物のマイナス電荷に帯電するメソ結晶領域を有するバイオチップを用意し、該バイオチップのメソ結晶領域に血清又は生体試料液を滴下し、試料中の正電荷を有するメチル化ＤＮＡが巻き付いたヒストンを選択的に吸着し、吸着したヒストン試料に対しマッピング測定方式でレーザー照射してそこからのラマン散乱光を検知し、試料のＧバンドおよびＤバンドのピーク数を検出するとともに、アセチル化に基づくアミド結合のピークを検出することを特徴とする癌疾病を判断する。
【選択図】図２０

Description

本発明はがん関連遺伝子の発現異常としてヒストン化学修飾状況をラマン分光法により判定する癌診断方法に関する。

癌化の原因として、癌関連遺伝子の発現異常が重要な役割をもつ。すなわち、細胞が正常な機能をもつためには、タイミングよく、適当な組織で、適当な量の遺伝子発現を行う必要がある。これまで、これらの発現異常の分子メカニズムとして突然変異、転座や増幅または遺伝情報の欠失等がその中心的役割を演じていると考えられてきた。「癌は遺伝子の病気である」の言は、DNAの塩基配列の置換というイメージが大きいが、実際には、発現のタイミングや場、また量を狂わせているのはむしろエピジェネティックな変化の方が多いという証拠が特に癌研究分野において示されてきた。このエピジェネティックスは heritable change in gene expression that occur without a change in DNA sequence であり、ゲノム情報を多様にシステマティックかつダイナミックに活用する生体システムである。そのメカニズムの全貌は明らかではないが、DNAのメチル化、クロマチン、ヒストンのアセチル化、転写調節因子等が複雑に相互に連携している。また、直接遺伝情報と関連していなくとも、セントロメアやテロメア等の染色体やクロマチン構造と関連していると考えられる。

このようなエピジェネティックな変化が癌化の過程でどのようなかかわりを持つかを明らかにすることは興味深い。最近、多くのゲノムインプリント遺伝子が発見されてきた。ゲノムインプリントとは父母由来の対立遺伝子が識別され、その発現が異なる現象である。このインプリンティングはエピジェネティクスで、癌化過程にこのインプリント遺伝子の発現異常が多く関与していることを示す証拠がある。発癌の個人差や、癌の発生や進展にかかわっているようで、インプリント遺伝子の発現制御は染色体のドメインレベルで行われている点でユニークである（非特許文献１：佐々木裕之:「現代医学の基礎第5巻，生殖と発生」（岩波書店）第9章）。

またエピジェネティックスは、HTLV1やHIVなどのヒトレトロウイルスの発現制御、すなわちウイルスの潜伏感染の重要な分子機構の一つとして考えられている。

さらに、胃癌、大腸癌、膀胱癌等ほとんどすべての癌細胞において、このエピジェネティックな変化が関与し、癌の多段階的発生と進展にかかわっているといわれる。例えば、胃癌においてE-カドヘリン遺伝子、hMLH1遺伝子(DNA複製エラーを修復するためのミスマッチ修復系遺伝子)、p16遺伝子(現在では、CDKN2A : サイクリン依存性キナーゼ阻害因子2A と呼ばれる)等である。加齢に伴い、癌細胞におけるhMLH1のプロモーターのメチル化が亢進する事実は、加齢に伴い癌発症が増加する事実との関連において興味深い。

また、多剤耐性遺伝子MDR1の発現制御にCpGメチル化が重要であることも明らかになってきた。大腸癌ではこのMDR1のメチル化がマイクロサテライト不安定性と正相関したり、メチル化が化学療法の経過に伴って動的に変化し、予後等にも大きく影響するようである。

さらに、肝細胞癌等、癌化の多段階的変化の過程で、癌抑制遺伝子E-カドヘリンのプロモーター領域のメチル化が大きく変動することが見出された。特にDNAメチルトランスフェラーゼDNMT1の発現亢進は消化器癌におけるメチル化の異常と相関することから、メチル化の異常の補正が将来的な発癌の予防や治療につながることが期待できる。

また、MS-RDA法（methylation-sensitive-representational-defference analysis）を用いたゲノムスキャンによってヒト乳癌、肺癌、胃癌におけるCpGメチル化異常の網羅的研究がなされた。現在では、ほとんどのこのCpGアイランド近傍の遺伝子は同定され、様々な遺伝子発現に関与しているが、特にプロモーター以外のCpGアイランドの過剰メチル化と遺伝子発現低下が認められる場合もあり、発癌に関与するエピジェネティックな変化を伴う遺伝子の同定と発癌メカニズムを解明する上で重要な知見であるといされている（非特許文献２：牛島俊和「ゲノム全体の比較解析法」蛋白 核酸 酵素 Vol．42 Ｎｏ．11（１９９７））。

佐々木裕之:「現代医学の基礎第5巻，生殖と発生」（岩波書店）第9章 牛島俊和「ゲノム全体の比較解析法」蛋白 核酸 酵素 Vol．42 Ｎｏ．11（１９９７））。

このような発癌に関与するエピジェネティックな変化を伴う遺伝子の同定と発癌メカニズムを解明する上ではヒストンの化学修飾の検索が必要であり、クロマチイン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）が採用され、ＤＮＡプロモーター部のメチル化はメチル特異的ＰＣＲ法（ＭＳＰ）が採用されているが、簡易でない。そこで、本発明はヒストンコード仮説に従い、癌関連物質としてメチル化ＤＮＡとともにヒストンを選択的に吸着し、ラマン分析法により癌診断を行うことのできる方法を提供することを目的とする。

そこで、本発明者らは、発癌に関与するエピジェネティックな変化を伴う遺伝子の同定と発癌メカニズムを解明する上でヒストンの化学修飾を検出対象とすべく、鋭意研究の結果は、本発明を完成した。即ち、本発明は過酸化銀を含む銀酸化物からなり、マイナス電荷に帯電するメソ結晶領域を有するバイオチップを用意し、該バイオチップのメソ結晶領域に血清又は生体試料液を滴下し、試料中のメチル化ＤＮＡが巻き付いた正電荷を有するヒストンを選択的に吸着し、吸着したヒストン試料に対しマッピング測定方式でレーザー照射してそこからのラマン散乱光を検知し、試料の炭素ＧバンドおよびＤバンドのピークの数を検出し、試料のメチル化に基づくメチル化数としてピーク数により癌のステージを判定することを特徴とする血中のヒストン化学修飾状況に基づく癌判定方法にある。

本発明は過酸化銀を含む銀酸化物のメソ結晶が血中のヒストンを選択的に吸着することにより血中の少量の癌関連物質としてヒストン蛋白質をバイオチップ上にとラッピングすることができる。血中のヒストンは正電荷を有するのに対し、過酸化銀を含む銀酸化物のメソ結晶は試料水溶液中では負電荷を帯びるからである。バイオチップ上の試料に対しおよそ直径１０ｎｍのレーザーをマッピング法に基づき連続して照射していくと、吸着したヒストンのメチル化修飾およびそれに巻き付いているＤＮＡのメチル化に起因すると思われるピークが現れる。ヒストンのメチル化修飾情報並びにCpGの過剰メチル化は癌のステージ判定に必要であり、両者の相関関係を示すものということができる。

試料に対するレーザーマッピング中、アセチル化に起因すると思われるアミド結合由来のピークが９５０ｃｍ^−１ 付近に現れる場合があり、癌の進行ステージは低く早期がんではあるが転移が認められ、ヒストンのアセチル化が転移の開始のシグナルであることと相関した。したがって、本発明はラマン散乱光からアミド結合のピークを検出し、試料のアセチル化に基づくアミド基由来のピークとして、癌の転移の有無を判定する方法でもあり、ヒストンのメチル化とともにアセチル化を判定できるもので癌判定方法としては貴重である。

特にヒストン化学修飾の指紋領域いわれる６５０〜１３００ｃｍ^−１、特にＤバンドに種々の化学修飾に基ずくピークがラマン散乱スペクトルに現れることを見出した。ヒストンコードはヒストンタンパク質の化学修飾で決まるものであり、ラマン散乱のＤバンドのより詳細な解析により、ヒストンの化学修飾に基づく遺伝子の挙動に関する情報が提供できると思われる。

ここで、検出すべき対象にはヒストンというタンパク質にＤＮＡが巻き付いており、ひと巻きされた単位構造（1セット）はヌクレオソームと呼び、ヌクレオソームが集まりひも状になった構造をクロマチン（線維）と呼ぶ。そして、細胞ががん化して分裂を繰り返すとき、がんが増えるのに都合の悪い遺伝子（がん抑制遺伝子）が出てこないようしっかりヒストンに巻きついて蓋をし、ヒストンへの巻き方をさらにきつくして、DNAが簡単にはほどけないようにして、メチル化という修飾が起こっているが、通常ヒストンは（＋）、DNAは（−）にチャージされていて、2つは磁石のようにくっつきあい、しかもメチル化して解けないようになっており、ヒストンに巻き付いたDNAは（＋）に帯電している（図11（a）参照）。他方、ヒストンのアセチル化は（−）にチャージするため、通常は（＋）のヒストンがアセチル化されれば、（−）同士となってDNAと反発する。すると、DNAという‘糸’がヒストンからほどけて遺伝子が発現するメカニズムとなっている（図11（b）参照）。したがって、癌細胞由来のヒストンを選択的に吸着させるには、ＤＮＡが巻き付いたヒストンは（＋）に帯電しているので、吸着させる基板は（−）に帯電しているのが好ましい。

ところで、本発明者らは金属錯体水溶液を錯体を形成する金属より卑なる電極電位（イオン化傾向の大きい）金属基板上で電極電位差により化学還元して量子結晶（ナノサイズの金属錯体結晶）を凝集させている。銀錯体の場合、チオ硫酸銀水溶液を銀より卑なる電極電位（イオン化傾向の大きい）の銅または銅合金上で凝集させることにより銀錯体の量子結晶を化学還元法を採用して形成している。
詳しくは、金属錯体の水溶液中の濃度は主として形成する量子結晶のサイズを考慮して決定すべきであり、分散剤を使用するときはその濃度をも考慮するのがよく、通常、１００ｐｐｍから５０００ｐｐｍの範囲で使用できるが、配位子の機能にも依存してナノクラスタというべきナノサイズを調製するには５００から２０００ｐｐｍの濃度が好ましい。量子結晶を形成する金属錯体は担持金属の電極電位Ｅと相関する式（I）で示される錯体安定度定数（ｌｏｇβ）以上を有するように選択される。
式（I）：Ｅ゜＝ （ＲＴ／｜Ｚ｜Ｆ）ln（βi）
（ここでＥ゜は、標準電極電位、Ｒは、気体定数、Ｔは、絶対温度、Ｚは、イオン価、Ｆは、ファラデー定数を表す。）
ここで、金属錯体が、Ａｕ、Ａｇ、ＰｔまたはＰｄから選ばれるプラズモン金属の錯体である場合は、ラマン光に対して局在表面プラズモン共鳴増強効果を有する。特に、金属錯体が銀錯体であるときは、安定度定数（生成定数）（ｌｏｇ βi）が８以上の銀錯化剤とハロゲン化銀との反応により形成されるのがよく、ハロゲン化銀としては塩化銀が好ましく、錯化剤としてはチオ硫酸塩、チオシアン酸塩、亜硫酸塩、チオ尿素、ヨウ化カリ、チオサリチル酸塩、チオシアヌル酸塩から選ばれる１種であるのが好ましい。銀錯体は平均直径が５〜２０ｎｍであるナノクラスタからなる量子ドットを有し、量子結晶のサイズが１００〜２００ｎｍとなる。

かかる銀錯体をハロゲンイオンの存在下にアルカリ処理（次亜塩素酸で処理）すると、以下の反応に基板との間の電極電位差が関与することより銀ハロゲン化物を核として過酸化銀を含み、銀酸化物の複合物の針状ナノ結晶群が形成され（図９）、しかも水中で（−）荷電を帯びる一方、ヒストンが（＋）荷電を帯びるため（図１１(a)）、このヒストンに代表される正電荷を帯びた癌関連物質を選択的に吸着する。しかも過酸化銀を含む銀酸化物の針状ナノ結晶群はレーザー光の照射により還元され、金属銀を析出するため、レーザー光照射により表面プラズモン増強効果を示し、吸着された遊離ＤＮＡに代表される癌関連物質を検出する共鳴ラマン散乱が得られる。

Na2S2O3+４NaClO＋H２O →Na2SO4+H2SO４＋４NaCl
Ag+ + NaCl → AgCl ＋ Na+
Ag+ ＋ ３NaOCl → ２AgCl ＋ NaClO3 ＋ 2Na+
Ag+ + OH- → AgOH
２Ag＋＋ ２OH → Ag2O ＋H2O （米国特許第４４７８９４３号参照）

本発明は上記知見に基づいて、なされたもので、過酸化銀を含む銀酸化物の針状ナノ結晶（メソ結晶）を含み、水中で負電荷を示し、正電荷の癌関連物質を吸着して電荷移動錯体を形成可能であるとともに光照射により銀粒子を析出可能で、レーザー照射により共鳴効果が得られる領域を有する。

本発明の銀酸化物のメソ結晶群は、過酸化銀を含む銀酸化物が銀錯体量子結晶から自己組織化して規則的に配列したナノ結晶を形成するもので（図１２及び１３）、銀イオン水溶液をAg/AgCl電極を用いて定電位電析を行って形成することができるが、銀錯体量子結晶、例えばチオ硫酸銀量子結晶をハロゲンイオンの存在下でアルカリ処理（次亜塩素酸ナトリウム水溶液で処理）することによって容易に形成することができる。

また、本発明を用いることにより、ラマン分析により、血中に含む生体試料中の、癌関連物質、例えばヒストンを以下の方法で検出することができる。すなわち、過酸化銀を含む銀酸化物のメソ結晶領域（図１２及び１３）を有するバイオチップを用意し、該バイオチップの針状ナノ結晶（メソ結晶）領域に血清又は生体試料液を滴下し、試料中の正電荷を有する癌関連物質を選択的に吸着させ、吸着させた癌関連物質に対しレーザーをマッピング法で照射してそこからのラマン散乱光を検知する工程により、メチル化に由来するピーク数により癌の進行ステージを判断することができる。

血清中の癌関連物質としては、癌細胞由来のＤＮＡが巻きついてなるヒストンが代表的であり、そのひと巻きされた単位構造（1セット）のヌクレオソーム、そのヌクレオソームが集まりひも状になった構造のクロマチン（線維）を含む。また、血中には正電荷を帯びるグロブリンを含むが、その増加は他の癌関連物質に比べて最大2倍以下であるので、本発明で検知される物質ではがん進行に伴う増加が１００倍以上に達するのでグロブリン以外の増加（ヒストン）が検知されていることを物語っている。また、正常細胞から出るＤＮＡ、アセチル化してヒストンが解離したＤＮＡ、そしてアルブミンは血清中の約６０％を占めるが、負荷電を帯びるため、本発明では吸着されない。したがって、癌関連物質ヒストンの検査には好都合であり、ヒストンコードの化学修飾の簡易解析法として優れる。

また、本発明の針状ナノ結晶（過酸化銀を含む銀酸化物のメソ結晶）は、過酸化銀を含む銀酸化物が水溶液中で負電荷を帯びやすく、試料（ターゲット分子）と接触して電荷移動錯体を形成すると思われる。さらに、銀酸化物は光エネルギーを受けて還元され、金属銀を析出するので、規則的に配列する金属ナノ粒子の持つプラズモン共鳴増強効果を有することになる。したがって、本発明の針状ナノ結晶（メソ結晶）は非金属であるが金属性質とイオン化性質を兼ね備えるため、ラマン分光法に好適なバイオチップを提供できる。

なお、量子結晶を形成する金属錯体は担持金属の電極電位Ｅと相関する式（I）で示される錯体安定度定数（ｌｏｇβ）以上を有するように選択される。
式（I）：Ｅ゜ ＝ （ＲＴ／｜Ｚ｜Ｆ）ln（βi）
（ここでＥ゜は、標準電極電位、Ｒは、気体定数、Ｔは、絶対温度、Ｚは、イオン価、Ｆは、ファラデー定数を表す。）
本発明において、金属錯体が、Ａｕ、Ａｇ、ＰｔまたはＰｄから選ばれるプラズモン金属の錯体である場合は、ラマン光に対して表面プラズモン共鳴増強効果を有する。

金属錯体が銀錯体であるときは、安定度定数（生成定数）（ｌｏｇ βi）が８以上の銀錯化剤とハロゲン化銀との反応により形成されるのがよい。

ハロゲン化銀としては塩化銀が好ましく、錯化剤としてはチオ硫酸塩、チオシアン酸塩、亜硫酸塩、チオ尿素、ヨウ化カリ、チオサリチル酸塩、チオシアヌル酸塩から選ばれる１種であるのが好ましい。

銀錯体は平均直径が５〜２０ｎｍであるナノクラスタからなる量子ドットを有し、量子結晶のサイズが１００〜２００ｎｍとなる。

金属錯体の水溶液中の濃度は主として形成する量子結晶のサイズを考慮して決定すべきであり、分散剤を使用するときはその濃度をも考慮するのがよい。通常、１００ｐｐｍから５０００ｐｐｍの範囲で使用できるが、配位子の機能にも依存してナノクラスタというべきナノサイズを調製するには５００から２０００ｐｐｍの濃度が好ましい。

金属基板又は金属粒子上に形成された量子結晶は金属錯体結晶として水溶液中では正極性を持ちやすいものと思われ、生体試料中のタンパク質を吸着固定するためには、ハロゲンイオンの存在下でアルカリ処理、例えばｐＨ１１以上の次亜塩素酸ソーダ水溶液を滴下して極性を調整するのが好ましい。量子結晶は再結晶して水溶液中で負極性となるだけでなく、銀酸化物の複合針状ナノ結晶は過酸化物を形成するので、試料中正電荷を持つヒストンタンパク質の固定化を促進することができる。

生体試料中の総タンパク濃度の定量は、特定波長のレーザー光を照射してラマンスペクトルを得ることにより知ることができる。図３は大腸ガン患者の血清試料であり、それを１０倍、１００倍、５００倍、１０００倍および一万倍に純水で希釈して６３３ｎｍのレーザー（３０ｍＷ）で測定したラマンスペクトルであり、濃度とともにピーク上昇値（ＰＳＶ）およびピーク積分値が変化する。よって、血清中の総タンパク質の定量分析を行うことができることがわかる。特に炭素特有のＧバンド(１５５０〜１６００ｃｍ−１付近)Ｄバンド (１３００〜１４００ｃｍ−１付近)にピークが見られ、ヒストンタンパク質およびそれに巻き付いたＤＮＡのメチル化状態が検出されていることを物語るものであると推測される。ヒストンタンパク質のラマン分光での結晶化を検出するにはレーザー波長はより短波長５３２，４８９ｎｍのレーザーが推奨される。

したがって、得られたラマンスペクトルのピーク高さ、ピーク積分値、ピーク発現時間などの情報から癌の同定および進行状態を解析することができる。図１はラマン波形のピーク算出法を示し、ヒト血清サンプルの６３３ｎｍレーザーによるラマン散乱のスペクトルは１３５０ｃｍ−１近辺と１５５０ｃｍ−１近辺に散乱強度のピークを形成することが確認される。よって、８００ｃｍ−１（ａ）と２０００ｃｍ−１（ｂ）の散乱強度の平均値（m）を基準とした最大上昇値（ｐ−ｍ）をピーク上昇値（Shifting Peak Value：ＰＳＶ）として定義した。また、ピーク全体の面積をピーク積分値として定義した。これらのピーク上昇値およびピーク積分値はヒト血清中の癌関連物質を見る上で重要であり、ピーク発現時間とともに、ガンの同定および進行度を示す指標とすることができる。

本発明のラマン分光ではヒストンコードに考慮し、ヒストンの化学修飾を判定することを目的とした。上記ラマン分光分析で炭素由来のＧバンドおよびＤバンドの認められる場合（図１９左図）はヒストンのメチル化およびこのヒストンに巻き付いたＤＮＡのメチル化に着目した。はピークの基準値を一定強度（照射されるレーザの強度および良性疾患でのピークを参考に設定される。図１６から図１８の場合では基準値を強度３００位に置く）以上をピークの発現とした。他方、各マッピング測定で共鳴ラマン効果の結晶波形が得られると（図１９右図）、ヒストン修飾の違いでＤバンド近傍にメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＡＤＰリボース化、脱アミノ化、ビオンチン化、プロリンの異性化などの情報ピークが現れる。特に９５０ｃｍ^−１付近のピークはアミド結合のピークであり（図２０）、ヒストンのアセチル化の現象と捉えることができる。

ラマン波形のピーク算出法を示し、ヒト血清サンプルの６３３ｎｍレーザーによるラマン散乱のスペクトルは１３５０ｃｍ−１近辺と１５５０ｃｍ−１近辺に散乱強度のピークを形成することを示す。 胃癌患者１２例から得られた血清を調整した試料のラマンスペクトル図である。 大腸がん患者１２例から得られた血清を調整した試料のラマンスペクトル図である。 良性疾患患者１２例から得られた血清を調整した試料のラマンスペクトル図である。 胃癌、大腸がん、良性疾患試料のラマン散乱ピーク上昇値の比較を示すグラフである。 大腸がん患者１２例から得られた血清を調整した希釈試料とラマン散乱強度との関係を示すラマンスペクトルで、試料濃度と散乱強度ピーク上昇値が相関関係にあることを示す。 実施例１で示す新規SERS基板作成法の手順を示す説明図で、左上の有限会社マイテック製基板は右横のSEM像を示す写真である。 実施例１で製造したナノ粒子凝集体（量子結晶）の各種SEM像を示す写真である。 ナノ粒子の拡大SEM像を示す。 りん青銅坂上に滴下後の放置時間と量子結晶形状の関係を示す写真である。 量子結晶のEDSスペクトル（元素分析）の結果を示すグラフである。 量子結晶をハロゲンイオンの存在下にアルカリ処理（次亜塩素酸処理）した場合のＳＥＭ像である。 アルカリ処理した量子結晶中の針状結晶を示す図である。 ラクビーボール状の塊を示す図である。 大きい塊のEDSスペクトル（元素分析）の結果を示すグラフ図である。 メチル化した遊離ＤＮＡ(a)とアセチル化したＤＮＡ(b)の機能説明図である。 図１の量子結晶基板をハロゲンイオンの存在下にアルカリ処理（次亜塩素酸処理）した場合の再結晶基板のＳＥＭ像（上図）と、再結晶基板のEDSスペクトル（元素分析）の結果を示すグラフ（下図）である。 アルカリ処理した再結晶基板のＸＰＳ測定結果を示す。 再結晶基板の表面をエッチングした後のＸＰＳ測定結果を示す。 試料マッピング法による試料中の炭素由来の結晶化量の測定方法の説明図である。 良性疾患患者１２例から選ばれた３例の血清を純水で１０倍希釈して調整した試料の１ｍｍ四方を縦横１０×１０回マッピングして得られるラマンスペクトルに現れる得られるＧバンドおよびＤバンドのピーク数を示すグラフである。 大腸がん患者１２例から選ばれた３例の血清を純水で１０倍希釈して調整した試料の１ｍｍ四方を縦横１０×１０回マッピングして得られるラマンスペクトルに現れる得られるＧバンドおよびＤバンドのピーク数を示すグラフである。 胃癌患者１２例から選ばれた３例の血清を純水で１０倍希釈して調整した試料の１ｍｍ四方を縦横１０×１０回マッピングして得られるラマンスペクトルに現れる得られるＧバンドおよびＤバンドのピーク数を示すグラフである。 ラマン分光において、左図は非共鳴ラマンのヒストン炭素結晶波形を示し、右図は共鳴ラマンのヒストン炭素および不純物結晶波形を示す。この両者の比較により共鳴ラマン効果によりＤバンド付近の指紋領域といわれる領域の波形によりヒストンの各種化学修飾の判定が可能である。 胃癌Ｇ１６のマッピング中に９５０ｃｍ^−１付近にピークが認められる場合の共鳴ラマンスペクトルを示すグラフである。術前の腫瘍マーカーでは陰性であったが、術後の病理診断では、転移が認められ、９５０ｃｍ^−１付近で示されるアミド結合の存在はヒストンのアセチル化を示し、転移の兆候が検出されていることを示す。

以下、図面を参照して、本発明の実施形態を詳細に説明する。
(実施例１）
図４に示すように、チオ硫酸銀１０００ppm水溶液を調製し、その1滴をりん青銅板上に滴下し、約3分間放置し、溶液を吹き飛ばすと、右横のSEM像を示す量子結晶が作成されていた。
図５は実施例１で製造したナノ粒子凝集体（量子結晶）の各種SEM像を示す写真であり、図６はナノ粒子の拡大SEM像を示す。１００nm前後の薄い六角柱状結晶であって、表面に数nmオーダの凹凸が発現している。金属ナノ結晶に特有のファセットは確認できなかった。
図７はりん青銅坂上に滴下後の放置時間と量子結晶形状の関係を示す写真である。まず、六角形の量子結晶が生成し、形状を維持しつつ成長するのが認められる。
図８は量子結晶のEDSスペクトル（元素分析）の結果を示すグラフである。りん青銅板上に形成された結晶は銀及び錯体配位子由来の元素を検出したが、銅板上にチオ硫酸銀１０００ppm水溶液を調製し、その1滴を滴下し、約3分間放置し、溶液を吹き飛ばした場合は、銀のみを検出したに過ぎなかった。

（量子結晶の作成の考察）
量子結晶は１０００ppmチオ硫酸銀錯体水溶液の場合、りん青銅板上に滴下して3分間放置すると、１００nm前後の六角柱状に形成され、各六角柱状の量子結晶は数nmオーダの凹凸を持つことがSEM像から確認された（図４、図５及び図６）が、金属ナノ結晶に特有のファセットは確認できず、EDS元素分析で銀及び錯体配位子由来の元素を検出されたため、全体は銀錯体のナノ結晶であって、その表面に現れる凹凸は錯体中の銀がクラスタとして量子ドットを形成して広がっていると推測される。本発明の銀錯体量子結晶がりん青銅板上に形成される一方、銅基板上には銀のみのナノ粒子が析出する現象を見ると、チオ硫酸銀錯体の平衡電位が０．３３で銅の電極電位（０．３４）と同等であるため、銅基板上には銀（０．８０）のみが析出し、りん青銅の場合は０．２２と電極電位がわずかに卑であるため、銀錯体の結晶が析出したものと思われる。したがって、量子結晶を作成するためには１）錯体水溶液が５００〜２０００ppmという希薄な領域であること、２）金属錯体水溶液の平衡電位に対し担持金属の電極電位がわずかに卑であること、３）電極電位差で金属錯体が凝集させることが重要であると思われる。また、１０００ｐｐｍチオ尿素銀錯体水溶液を使用した場合も同様であった。

（実施例２）
実施例１で調整したりん青銅板上のチオ硫酸銀量子結晶基板にｐＨ１１の次亜塩素酸ナトリウム水溶液を滴下し、３分後水溶液を吹き飛ばし、その直後、胃癌患者１２例から得られた血清を純粋で１０倍希釈して調整した試料、大腸がん患者１２例から得られた血清を純粋で１０倍希釈して調整した試料および良性疾患患者１２例から得られた血清を純粋で１０倍調整した試料のそれぞれを６３３ｎｍのレーザー光を照射してラマンスペクトルを測定した。胃がんおよび大腸がんの進行度とピーク上昇値およびピーク積分値との間には相関関係が認められるということができる。また、胃がんの場合、ラマンスペクトルはレーザー照射後１分後に、大腸がんの場合はレーザー照射後２〜３分後にラマンスペクトルにピークが発現した。また、Ｄは胃癌、大腸がん、良性疾患試料のラマン散乱ピーク上昇値の比較を示すグラフである。良性疾患患者に対し、胃癌試料および大腸がん試料のピークは有意に高いことが認められる。胃癌試料と大腸がん試料とはピーク上昇値では差を見つけるのが困難であるということができるが、ピーク発現時間およびピーク積分値を考慮すると、両者のがん同定は可能であるということができる。

（実施例３）
上記過酸化銀を含む銀酸化物のメソ結晶基板を用い、図１５に示す通り、試料マッピング法による試料中の炭素由来の結晶化量の測定方法を上記と同じラマン分光条件で行った。
良性疾患患者１２例から選ばれた３例の血清を純水で１０倍希釈して調整した試料の１ｍｍ四方を縦横１０×１０回マッピングして得られるラマンスペクトルに現れるＧバンドおよびＤバンドのピーク出現回数を図１６に示す。
他方、大腸がん患者１２例から選ばれた３例の血清を純水で１０倍希釈して調整した試料の１ｍｍ四方を縦横１０×１０回マッピングして得られるラマンスペクトルに現れるＧバンドおよびＤバンドのピーク出現回数を図１７に示す。さらに、胃癌患者１２例から選ばれた３例の血清を純水で１０倍希釈して調整した試料の１ｍｍ四方を縦横１０×１０回マッピングして得られるラマンスペクトルに現れるＧバンドおよびＤバンドのピーク出現回数を図１８に示す。上記ピークは強度３００を超えたものとした。ピーク出現回数は病理検査の癌進行度と相関性を示した。

（実施例４）
上記過酸化銀を含む銀酸化物のメソ結晶基板を用い、図１５に示す通り、試料マッピング法による試料中の炭素由来の結晶化量の測定方法を上記と同じラマン分光条件で行うと、各マッピングのラマン分光において、非共鳴ラマンのヒストン炭素結晶波形を示す場合（図１９左図）と、共鳴ラマンのヒストン炭素および不純物結晶波形を示す場合がある。この両者の比較により共鳴ラマン効果によりＤバンド付近の指紋領域といわれる領域の波形によりヒストンの各種化学修飾の判定が可能であることがわかる。胃癌Ｇ１６のマッピング中にヒストンのＧバンドおよびＤバンド以外に指紋領域に種々のピークが検出される。特に、９５０ｃｍ^−１付近にピークが認められる場合の共鳴ラマンスペクトルは、術前の腫瘍マーカーでは陰性であったが、術後の病理診断では、転移が認められル結果と一致した。これは９５０ｃｍ^−１付近で示されるアミド結合のピークの存在はヒストンのアセチル化を示し、転移の兆候が検出されていることを示す。

（銀酸化物のメソ結晶についての考察：その１）
上記量子結晶基板に５％次亜塩素酸ソーダ水溶液を滴下して２分間処理して除去すると図１２に示す結晶構造が見られ、針状の結晶とラクビーボール状の塊と大きい塊が見られたので、それぞれの組成をEDSスペクトル（元素分析）で分析すると、以下の反応式から針状の結晶はともに塩化銀と酸化銀の複合結晶からなるものと考えられるが、図１２の結果は塩素は確認できず、銀と酸素が支配的であることがわかる。
Na2S2O3+４NaClO＋H２O →Na2SO4+H2SO４＋４NaCl （１）
Ag+ + NaCl → AgCl ＋ Na+ （２）
Ag+ ＋ ３NaOCl → ２AgCl ＋ NaClO3 ＋ 2Na+ （３）
Ag+ + OH- → AgOH （４）
２Ag＋＋ ２OH → Ag2O ＋H2O （５）
したがって、本発明に係るメソ結晶の形成には銀イオンとチオ硫酸イオンが塩素イオンの存在下にアルカリ酸化反応により生ずるものと思われるが、通常の水溶液中では酸化銀が形成されるに過ぎないが、以下のＸＰＳ測定から過酸化銀が支配的に形成されていると推測される。

（銀酸化物のメソ結晶についての考察：その２）
ＸＰＳ測定：
上記量子結晶基板に次亜塩素酸ナトリウム水溶液25μlを2分間滴下し、再結晶基板を作り、エッチングせずそのまま（使用機種： アルバック・ファイ（株）／PHI5000 Versa Probe II（走査型Ｘ線光電子分光分析装置））でAgとOとをXPS測定した。また、比較対象のため、酸化銀の粉と塩化銀の粉のAgを測定した。他方、再結晶基板をアルゴンガスクラスターイオン銃で5分間エッチングしてAgとOをXPS測定した。図１３及び図１４のＸＰＳ測定結果を図１２に基づくＥＤＳの結果から推測すると、５２９eV付近のピークは過酸化銀（AgO）に由来するＯピークで、５３０eV付近のピークは酸化銀（Ag2O）に由来するＯピークであると認められる。エッチングした場合に、酸素量は減少するが、５２９eV付近のピークの過酸化銀（AgO）に由来するＯピークが、５３０eV付近のピークは酸化銀（Ag2O）に由来するＯピークよりも大きいことは基板近傍に過酸化銀が形成されているのを物語るものといえる。これは、メソ結晶形成時の触媒作用と基板の電極電位が影響しているものと推測される。
なお、ＥＤＳ測定は上記再結晶基板を使用機種： 日本電子株式会社／JSM-7001F（電界放出形分析走査電子顕微鏡）を用いて行った。
また、チオ硫酸銀の量子結晶を次亜塩素酸水溶液、０．０１規定苛性ソーダ水溶液、０．０１規定塩酸水溶液、０．１モル炭酸ナトリウム水溶液で処理しても同様の結果は得られなかった。よって、この針状結晶の形成には銀イオンとチオ硫酸イオンの存在下に上記反応により生ずるものと思われる。酸化銀は水溶液中で負電荷を帯び、光により還元されて金属銀を析出させる。過酸化銀はその傾向が顕著なので、正電荷の癌関連物質を吸着し、しかも吸着した癌関連物質と銀粒子との間の表面プラズモン増強効果が得られるものと思われる。

したがって、本発明を利用することにより、血および生体試料中の癌関連物質ヒストンを選択的に検出することができ、ヒストンの化学修飾を判定できるので、ラマンスペクトルより癌の早期発見、癌の進行度に関する判定を行うことができる。

Claims (3)

1. 過酸化銀を含む銀酸化物からなり、マイナス電荷に帯電するメソ結晶領域を有するバイオチップを用意し、該バイオチップのメソ結晶領域に血清又は生体試料液を滴下し、試料中のメチル化ＤＮＡが巻き付いた正電荷を有するヒストンを選択的に吸着し、吸着したヒストン試料に対しマッピング測定方式でレーザー照射してそこからの各ラマン散乱光を検知し、試料の炭素ＧバンドおよびＤバンドのピークの出現回数を検出し、試料のメチル化数としてピーク数により癌のステージを判定することを特徴とする血中のヒストン化学修飾状況に基づく癌判定方法。
2. ラマン散乱光からアミド結合のピークを検出し、試料のアセチル化に基づくアミド基由来のピークとして、癌の転移の有無を判定する請求項１記載の判定方法。
3. ラマン散乱光からＤバンドの波形よりいわゆる指紋領域のヒストンテールの化学修飾状態を推定する請求項１の癌判定方法。