TWI818278B - 透過自體螢光的液態生檢法 - Google Patents

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Abstract

本發明之目的係提供一種藉由液態生檢法迅速且容易地進行疾病檢測之方法，該方法係將藉由細胞凋亡而釋放到血液中之片段化DNA(細分化核小體)作為疾病關連物質，並利用從血液等體液採集之甲基化片段化DNA(細分化核小體)之自體螢光。
本發明係一種利用片段化DNA(細分化核小體)之自體螢光進行的液態生檢法，該方法係包括下列步驟：a)使具有試料中電漿子金屬介晶區域之測定基板與檢體接觸，將檢體中之片段化DNA(細分化核小體)作為疾病關連物質並於電漿子金屬介晶捕捉電荷之步驟，其中，前述檢體係將含有體液或細胞之培養液原狀或稀釋作成者；b)對該電漿子金屬介晶上捕捉到之片段化DNA(細分化核小體)照射激發光，藉由表面電漿子增強效果而增強其自體螢光，決定片段化DNA(細分化核小體)之螢光菌落的螢光影像的固定測定區域(ROI)，通過比激發光濾器長波長域之濾器取得螢光菌落影像之步驟；c)採用該螢光菌落影像中顯示規定閾值以上亮度之像素之步驟；d)演算於採用之測定區域之預定波長域中預定閾值以上之像素之總面積值、或採用之測定區域不同之2波長區域預定閾值以上之像素之總面積值之比(ratio)之步驟之。

Description

透過自體螢光的液態生檢法
本發明係有關一種液態生檢法，其係將藉由細胞凋亡而釋放於血中之經細分化之核小體作為標的，並將表觀遺傳(epigenetics)訊息作為以癌症為中心之疾病訊息基礎。
表觀遺傳之訊息為藉由分子之附加或消去改變DNA之結構，擔任基因體DNA中基因表現開、關之可說是切換之角色。亦即，為了將構成個體之各種細胞正確地作用，各細胞具有之表觀遺傳為重要(東北大學教授：有馬隆博著「從人類了解之表觀遺傳及進化」)。另一方面，可理解於癌化之表觀遺傳控制異常為癌細胞共同特性之一。著眼於經高甲基化之基因之不活性化等，對於癌症之表觀遺傳異常進行分析(熊本大學發生醫學研究所教授：中尾光善著)，重要的是分析各細胞具有之表觀遺傳。
幾乎所有細胞分泌細胞外囊泡(外泌體)，近年來藉由從體液中檢測出早期癌細胞所分泌之外泌體亦可診斷出早期癌，也可期待特異性地檢測出源自疾病細胞之外泌體，惟，包含藉由血中循環腫瘤細胞(CTCs,Circulating Tumor Cells)進行之診斷技術，為臨床應用提供可於短時間內進行分析之液態生檢法是有限的(非專利文獻1、2及3)。
因此，本發明人等為了簡單地解析各細胞具有之表觀遺傳訊息進行深入研究之結果，發現於凋亡細胞，由於CAD(凋亡蛋白酶活化DNase)之阻礙因子被分解，經活化之CAD將DNA以核小體單位切斷，因此片段化成約200bp倍數之DNA。此細胞凋亡後之片段化DNA(細分化核小體)包含基因體DNA所負責之遺傳訊息及表觀遺傳訊息雙方，而且組織蛋白受到乙醯化等化學修飾時，DNA之存在方式產生變化，另一方面，DNA本身亦受到甲基化等修飾，經由此作用方式亦產生變化。所述之片段化DNA(細分化核小體)經甲基化時，具有正電荷，於血中，被選擇性吸附捕集於顯示負電荷之電漿子金屬介晶的表面，並且，藉由表面電漿子增強效果而增強時，發現可將具有可藉由螢光顯微鏡確認之預定以上亮度之自體螢光發光並可觀測之(圖1)。
亦即，含有p53之癌抑制基因藉由表觀遺傳甲基化，儘管檢測經甲基化之核小體作為癌疾病訊息為不可或缺，惟，難以選擇性地捕集甲基化核小體。而且從細胞凋亡後之血中捕捉到之片段化DNA，亦即經細分化之核小體係於生物晶片上有些凝集，其發出之自體螢光菌落係以如夜空星座般作為複數菌落被觀測，小者被觀測到約25μm之擴展，大者被觀測到約150μm之擴展。
以前，細胞觀察中自體螢光成為背景光，導致螢光影像之信號雜音比(S/N比)降低。因此，於內視鏡檢査推薦將標的進行螢光標識之方法，為了從螢光影像取得最佳值，必要的是儘可能加大信號(期待為被螢光標識)與背景(不期待被螢光標識之自體螢光等)之差(非專利文獻6)。因此，於使用自體螢 光之螢光顯微鏡之細胞觀測中，通常不是藉由自體螢光之螢光強度，而是藉由將屬於螢光另一參數之螢光壽命影像化而進行細胞觀察(非專利文獻7)。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]WO2015/170711號公報
[專利文獻2]日本特開2011-158369號公報
[專利文獻3]WO2013/039180號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1]末梢血液循環腫瘤細胞Circulating Tumor Cells (CTCs)之檢測：Circulating tumor cell isolation and diagnostics: toward routine clinical use. Cancer Res 2011;71:5955-60
[非專利文獻2]Gorges TM, Pantel K:. Circulating tumor cells as therapy-related biomarkers in cancer patients. Cancer Immunol Immunother 2013;62:931-9.
[非專利文獻3]Permuth-Wey J et al., A Genome-Wide Investigation of MicroRNA Expression Identifies Biologically-Meaningful MicroRNAs That Distinguish between High-Risk and Low-Risk Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms of the Pancreas., PLoS One., 2015;10:e0116869.
[非專利文獻4]Ellen Heitzer, Peter Ulz and Jochen B. Geigl, Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer., Clinical Chemistry 2015; 61:112-123
[非專利文獻5]Cell，2016 January14；164：Cell-free DNA comprises an in vivo nucleosome footprint that informs its tissues-of-origin
[非專利文獻6]自體螢光內視鏡之現況Vol.58(4)Apr, 016
[非專利文獻7]生物物理53(3)，166-169(2013)
本發明人等經過深入研究之結果，著眼於將藉由疾病之發生，於血液其他體液中藉由以細胞凋亡為代表之病理性細胞壞死而釋放出之片段化DNA(細分化核小體)作為檢査之對象時，與疾病有密切的關連性(例如癌症發生係藉由癌基因及癌抑制基因的異常而發生的基因疾病為被廣泛接受的事實，然而亦逐漸明瞭癌症亦利用以甲基化為代表之對鹼基修飾所進行之表觀遺傳基因異常而發生癌症，不僅癌抑制基因之質的異常，藉由高甲基化所致之量的異常於致癌機構亦為重要，作為於癌細胞接受高甲基化之癌抑制基因之活性不活化，經高甲基化之RB基因、於p16以外，p14及p53之不活化作為致癌機構受到注目：曾和義弘、酒井敏行著癌症及表觀遺傳)，因此重要的是選擇性地捕捉含有其高甲基化癌抑制基因之片段化DNA(細分化核小體)，檢測其量的異常作為癌症檢診。而且，此等於螢光影像中以圖1表示之如夜空星座般被觀測道複數菌落，因此藉由電漿子金屬介晶之表面電漿子增強效果而增強時，將具有可於螢光顯微鏡確認之預定以上亮度之自體螢光進行發光(圖1)，採用顯示預定以上亮度之畫素、像素進行分析時，發現可獲得對疾病具有正確診斷率高之結果，進而完成本發明。亦即，本發明欲解決之課題為提供一種檢測方法，其係將藉由細胞凋亡而釋放於血中之片段化DNA(細分化核小體)作為標的，藉由使用組 織檢體之組織蛋白修飾分析、染色質結構分析，將各種疾病，尤其是與癌之發症關連之腫瘤檢測或診斷作為疾病關連物質，並藉由利用片段化DNA(細分化核小體)之自體螢光所進行的液態生檢法而迅速且容易地進行。
本發明係利用自體螢光進行的液態生檢法，係包含下列步驟：a)使具有試料中電漿子金屬介晶區域之測定基板與檢體接觸，將檢體中之片段化DNA(細分化核小體)作為疾病關連物質，捕捉電荷於電漿子金屬介晶之步驟，其中，該檢體係含有體液或細胞之培養液以原狀或經稀釋作成者；b)對此電漿子金屬介晶上捕捉到之片段化DNA(細分化核小體)照射激發光，藉由表面電漿子增強效果而增強其自體螢光，決定片段化DNA(細分化核小體)之螢光菌落之螢光影像之固定測定區域(ROI)，通過比激發光濾器長波長域之濾器取得螢光菌落影像之步驟，其中，該激發光係由雷射光源所致之單波長之激發光或將源自LED光源等之激發光通過濾器取得之固定波長寛之激發光；c)採用該螢光菌落影像顯示預定閾值以上亮度之像素之步驟；及d)演算所採用之測定區域之預定波長域中預定閾值以上之像素的總面積值、或所採用之測定區域不同之2波長區域中預定閾值以上之像素的總面積值之比(ratio)之步驟。
於本發明，激發光係使用藉由雷射光源所致之單波長之激發光或將源自LED光源等之激發光通過濾器所取得之固定波長寛之激發光。從觀測之螢光菌落採用預定亮度之區域時採用ROI。然後，為了提昇測定精確度，採用螢光菌落中預定閾值以上亮度之像素。又，於本發明，演算步驟中，採用經二值化所採用之預定以上亮度之螢光菌落之像素，並演算其總面積。或者是，演算不同二波長域之總面積之比率(比(ratio)值)。由於具有預定以上亮度之像素 響應表觀遺傳訊息，尋求不同二波長域之比率係由於此片段化DNA(細分化核小體)包含基因體DNA負責之遺傳訊息及表觀遺傳訊息雙方，因而儘可能只採用表觀遺傳訊息。因此，採用發光閾值以上之螢光之螢光菌落之像素，從其總面積值或不同二波長區域之比率(比值)至少分為有癌症風險、無癌症風險2階段，或分為有癌症風險、需觀察、癌症風險低3階段，使風險判定成為可能。另一方面，採用之RGB之波長域較佳為G或B區域，較佳為演算G/B或B/G之比率。觀測螢光菌落之分光光譜時，於B或G區域觀測到疾病，尤其是癌症特有之峰。
又，於本發明，作為檢測對象被捕捉之標的，係DNA被經活化之CAD(凋亡蛋白酶活化DNase)以核小體單位切斷之約200bp倍數之片段化DNA(細分化核小體)，並且包含基因體DNA所負責之遺傳訊息及表觀遺傳訊息雙方者，因此為了容易進行只取出表觀遺傳之訊息，較佳為進行比率判定。此方法為將捕捉到之片段化DNA(細分化核小體)以B或G區域相同或不同之二波長域之激發波長激發而獲得螢光菌落，將該螢光菌落藉由不同之二波長域之濾器採集，由此採集到之像素之各總面積值比為B區域/G區域或G區域/B區域之液態生檢法。
屬於檢體之體液係從淋巴液或血液分離出之血漿或血清，由於片段化DNA(細分化核小體)與組織蛋白蛋白結合顯示正電荷，因此可選擇性捕捉。又，檢體為iPS細胞時，將進行iPS細胞癌化之識別作為對象。
根據本發明，第1可診斷疾病，尤其是識別癌症患者、良性腫瘤患者、健康人，其係藉由選擇性地捕捉屬於疾病關連物質之DNA經活化之 CAD(凋亡蛋白酶活性化DNase)以核小體單位切斷之約200bp倍數之片段化DNA(細分化核小體)，將通常於螢光診斷中成為雜訊之自體螢光藉由表面電漿子增強效果而顯現成預定閾值以上之亮度之螢光菌落並採用之，並演算預定閾值以上之螢光菌落之總面積值或RGB及與此相關之2波長比之比值。
第2，根據本發明，如下述般進行疾病關連物質之選擇性捕捉。
應標的之片段化DNA(細分化核小體)係包含ctDNA之細胞遊離DNA(cfDNA)與組織蛋白(histone protein)結合，作為最小單位之核小體或比此高水平之染色質存在於血中。而且，纏繞於組織蛋白之DNA係與組織蛋白結合，藉由甲基化而穩定地存在(藉由前述癌及表觀遺傳，從癌細胞高甲基化成各種癌症抑制基因：包含高甲基化之RB基因、p16以外之p14及p53)。因此，藉由提供顯示正電荷之晶片，可將此等選擇性地吸附或捕捉。捕捉於所述晶片上之物質係藉由特定之激發光將自體螢光以表面電漿子效果顯現，並發現將此等以螢光顯微鏡分析時，藉由其螢光波長可識別健康人、癌症患者、其他疾病患者。亦即，從此等健康人、癌症患者、其他疾病患者之細胞釋放出之DNA不僅發生遺傳性(genetic)基因異常，亦發生藉由於鹼基之修飾所致之表觀遺傳性(epigenetic)基因異常，從各細胞釋放出之片段化DNA(細分化核小體)觀察到化學性或物理性的不同。從此結果發現從健康人、癌症患者、其他疾病患者之細胞釋放出之片段化DNA(細分化核小體)，觀察到自體螢光之波長存在不同。又，將從癌症患者採集之癌症關連物質之螢光波長更詳細地分類時，表觀基因組修飾大致分為其化學性控制及物理性控制，由於受到影響，根據癌原發部位、轉移部位，螢光波長光譜或光譜峰變不同(若根據分光光譜，於癌症患者之片段化DNA(細分化核小體)在515nm附近觀測到些微峰)。因此，演算所採用 之預定閾值以上之螢光菌落之總面積值或於2波長域所採用之預定閾值以上之螢光菌落之總面積值比之比值，係對包含癌症之各種疾病之評估非常有效。
第3，根據本發明，具體而言，此等片段化DNA(細分化核小體)係藉由疾病的發生，經由以細胞凋亡為代表之病理性細胞壞死而被釋放到血液其他體液中，因而與疾病之關係深切。尤其是，細胞凋亡後之核小體自體之自體螢光之特徵，係於惡性腫瘤中，藍色(B)區域之自體螢光強，於良性腫瘤中，綠色(G)區域之自體螢光強(圖9)，因此將藍色(B)區域與綠色(G)區域亮度高之面積值以比(ratio)值(B/G或G/B)觀察時，可成功地識別健康人、良性腫瘤、惡性腫瘤，使癌症之極早期診斷、復發判定、轉移判定、治療效果之監控成為可能(圖10)。細胞凋亡後經細分化之核小體由於可檢測藉由基因異常發生之甲基化核小體，如圖11所示之多階段發癌假設模型所示，本發明之檢査水平(蛋白(Proteo)檢査水平)係依據現在之影像診斷水平(PET-CT,CT,MRI)以前之癌症關連物質之檢測為基礎，可極早期發現癌症。
圖1為表示使用奧林巴斯(Olympus)公司製造之DM發色鏡(dichroic mirror))405-445/514獲得之螢光影像，並顯示各試樣每個亮度之高點採用10點之方法。
圖2為表示使用奧林巴斯公司製造之DM405-445/514取得之470-490nm及600-620nm之影像。
圖3為表示使用BS10/90取得之分光光譜。
圖4為於矽膠乾燥容器顯示(a)為將血液離心分離獲得之結晶之滴下狀態、(b)為利用矽膠使血漿乾燥於容器內之狀態。
圖5A係本發明第1法之第1步驟A：作成測定晶片(蛋白晶片(Proteo chip))之說明圖，
圖5B係第2步驟B：決定蛋白晶片分析範圍之說明圖，
圖5C係第3步驟C：蛋白晶片之(採用之螢光菌落)面積數值化之說明圖。
圖6為顯示本發明第2法之影像取得步驟(1)→解析範圍決定步驟(2)→螢光菌落採用步驟(3)→RGB螢光影像中採用菌落之合計面積值之算出步驟(4)→從獲得之RGB合計面積作成B/G、G/R等比(Ratio)值之步驟(5)之說明圖。
圖7為於自動化進行本發明方法時所採用之顯微鏡載物台之說明圖。
圖8為顯示本發明Ratio演算方法之概念圖。
圖9為將存在於經離心分離之上清液(血漿部分)之片段化核小體使用本發明之蛋白晶片，測定其自體螢光時之分析方法之說明圖。
圖10為顯示可以圖9之方法識別之健康人、良性腫瘤、惡性腫瘤之比(Ratio)值分布之圖，y軸高表示B區域/G區域之比率、x軸表示檢體數。
圖11為比較檢測本發明之片段化核小體時之檢査水平及使用現狀之影像診斷(PET-CT,CT,MRI)時之檢査水平之多階段發癌假設模型之比較解說圖。
於實施本發明所述之液態生檢法，於第1法較佳採用下列步驟。於第1法，將片段化DNA(細分化核小體)激發，計測其螢光菌落預定閾值以上之 像素之總面積，該片段化DNA(細分化核小體)係藉由來自雷射之單波長激發光或利用濾器採用之固定波長寛之激發光所捕捉者。
使用機器：奇恩斯(Keyence)公司，螢光顯微鏡BZ-X710
光源：金屬鹵素燈80W
螢光濾器：BZ-X濾器DAPI(460±25nm)
分析軟體：BZ-X Analyzer
a)癌症關連物質之選擇性捕捉步驟：圖5A
使具有顯示試料中表面負電荷之電漿子金屬介晶區域之測定基板：蛋白晶片(圖5A(1))，與含有體液或細胞之培養液以原狀或經稀釋作成之檢體接觸(圖5A(2))，將檢體中顯示正電荷之蛋白質結合體作為疾病關連物質，使其電荷捕捉於電漿子金屬介晶(圖5A(3))之步驟。
b)螢光影像取得步驟：
(1)將癌症關連物質所附著之蛋白晶片安裝於螢光顯微鏡，一邊觀察明視野影像一邊決定晶片之測定位置(X、Y軸)，按下自動對焦鈕將晶片對焦(Z軸、焦點)。將測定設定切換為BZ-X濾器DAPI，開始螢光影像之測定。
對捕捉於此電漿子金屬介晶(直徑約8mm)上之蛋白質結合體照射激發光，藉由表面電漿子增強效果而增強捕捉蛋白質結合體之自體螢光，取得螢光菌落作為螢光影像(圖5B)之步驟。
c)螢光菌落之採用步驟：將解析範圍(直徑5mm)內之螢光菌落之亮度二值化，採用預定閾值以上之亮度之螢光菌落之步驟。
d)演算步驟：
算出所採用之預定閾值以上之螢光菌落之總面積值(圖5C)。此處，採用螢光強之物質(藍色附著物，於以下之測定條件，以亮度值為基礎作成二值化閾值13以上)，計算其面積值(單位μm2)。
從面積值分類成3階段進行判定：0至19999分類為癌症風險低之情況A、20000至29999分類為需觀察B、30000以上分類為有癌症風險C。
圖6為本發明之第2法，採用來自螢光影像之閾值以上之螢光菌落，演算RGB及/或與此相關之2波長比之比(ratio)值之方法。於圖6(1)中每1檢體取得RGB之3張螢光影像。接著決定解析範圍，以ROI包圍(圖6(2))。此處，使用「螢光菌落之圓形度及亮度」作為閾值，決定解析條件，並排除垃圾等(圖6(3))。之後，算出從RGB之螢光影像採用之螢光菌落得合計面積值(圖6(4))。詳細如下所述。
一般的螢光測定通常為塗抹螢光色素，並以該色素特有之螢光波長進行觀察。激發波長或螢光波長係根據色素之種類設定所決定之波長進行測定。使用色素之螢光測定為觀看色素之螢光，不是觀看物質本體之自體螢光之測定法。
另一方面，自體螢光認為是以物質本身之化學組成或化學結構、官能基、修飾化合物、生物學結構等發出。亦即，認為自體螢光具有各個物質固有之螢光波長。於本發明，觀看癌症關連物質固有之自體螢光。不是以一般色素之波長而是從複數之激發光測定癌症關連物質固有之自體螢光波長之方法。特定出用以直接測定癌症關連物質固有之自體螢光之最適合之激發光及螢光波長。將癌症關連物質之自體螢光分光，從分析其螢光波長分析之結果決定發出強自體螢光之RGB之激發光及測定RGB自體螢光之波長。光源使用LED光源，於奧 林巴斯(Olympus)正立顯微鏡BX-63安裝螢光波長濾器並限定進行測定之螢光波長，取得螢光影像。
具體而言，
B之激發光為於375至400nm螢光波長為460±25nm之範圍
G之激發光為於470至495nm螢光波長為510nm以上之長波長之範圍
R之激發光為於530至550nm螢光波長為575nm以上之長波長之範圍。
B為癌症關連物質之自體螢光所強力發出之激發光及螢光波長，G為良性疾病之自體螢光所強力發出之激發光及螢光波長。將附著癌症關連物質之生物晶片安裝於奧林巴斯正立顯微鏡BX-63，將LED光源及螢光波長濾器進行上述B之設定。一邊觀看生物晶片之即時螢光影像一邊將焦距(Z軸)對焦。一旦決定焦距(Z軸)及測定位置(X、Y軸)，即可測定B之設定之螢光影像。接著，將LED光源及螢光波長濾器進行上述G之設定，將焦距(Z軸)聚焦，並與先前B設定相同之測定位置(X,Y軸)合併，測定螢光影像。藉由將測定位置(X、Y軸)合併，可取得晶片相同位置之相同癌症關連物質之各個螢光影像。同樣地操作R設定之LED光源及螢光波長濾器，測定相同測定位置(X、Y軸)之螢光影像。
解析法
使用成像軟體「cellSens」(日本奧林巴斯光學社製)進行分析。
將相同癌症關連物質以ROI包圍，決定解析範圍，該相同癌症關連物質係附著於以各個激發光測定之3種螢光影像之生物晶片之相同位置，算出下述RGB設定範圍之物質之面積值。B係設定成選擇亮度值28000至50000範圍之附著物並除去圓形度0.3以下之附著物設定。
G係設定成選擇亮度值27000至50000範圍之附著物並除去圓形度0.3以下之附著物。
R係設定成選擇亮度值21000至50000範圍之附著物並除去圓形度0.3以下之附著物。
此亮度值設定範圍係藉由附著物質自體螢光之螢光強度或LED光源之光強度設定範圍。再者，藉由以圓形度0.3進行解析，解析軟體設定成自動除去扭曲形狀之異物，提昇解析精度。亮度值之範圍為10000至70000之範圍，較佳為約20000至50000之範圍，圓形度之範圍為0.9至0之範圍，較佳為約0.3。因應螢光菌落之狀況調整此圓形度。從藉由此測定及解析設定所算出之RGB之面積值，計算出B/G、G/R等2波長比之比(ratio)值，關於大腸，於B/G之比值，於惡性腫瘤具有1.9至1.0之寛，於良性腫瘤為0.1左右，健康人為0.2至0.8。
如此般將激發光分開，並進行螢光測定，藉此可獲得於各激發光中更強之自體螢光之螢光影像。藉由此手法將生物晶片上相同位置之相同癌症關連物質以不同設定之激發光、螢光波長進行測定及解析，可引出更多物質固有之自體螢光，可提昇數值之精確度。
圖7為表示將4張蛋白晶片(測定基板)安裝於支架上，進行自動化測定時之顯微鏡載物台之成像圖。事前登錄晶片(1)至(4)之測定位置(X軸、Y軸)，晶片(1)至(4)之焦距(z軸)分別以主導合併。若決定X、Y及Z軸，則自動進行4張晶片之3種RGB之測定，可獲得4張RGB螢光影像。
屬於檢體之體液不僅是從淋巴液或血液分離出之血漿或血清，亦包含尿、唾液等，蛋白質結合體包含與組織蛋白蛋白結合並顯示正電荷之細 胞遊離DNA(cfDNA)，該細胞遊離DNA包含從細胞遊離之循環腫瘤DNA(ctDNA)。激發捕捉疾病關連物質之電漿子金屬介晶之光源較佳為使用為了激發腫瘤親和性螢光物質所使用之405nm波長之激發光。於此情況，可在630nm前後觀測到螢光波長，因此本發明中較佳是著眼於630nm前後之峰波長作為癌症關連物質之蛋白質結合體自體螢光之特徵。於本發明捕捉到之蛋白質結合體包含循環腫瘤DNA(ctDNA)，其為與組織蛋白結合之核小體或此等高水平化之染色質，組織蛋白接受甲基化修飾時，具有成為利用自體螢光進行的液態生檢法之癌症診斷標的之特徵。
「具有顯示試料中表面負電荷之電漿子金屬介晶之晶片」
將本發明方法使用之具有電漿子金屬介晶區域之基板稱為蛋白晶片。其製造方法如下所述(參照專利文獻1)。
1)將金屬錯合物水溶液於電極電位低於形成錯合物之金屬(離子化傾向大)之金屬基板上藉由電極電位差進行化學還原，使量子結晶(奈米尺寸之金屬錯合物結晶)凝集。銀錯合物的情形，藉由將硫代硫酸銀水溶液在電極電位低於比銀(離子化傾向大)之銅或銅合金上進行凝集，採用化學還原法形成銀錯合物之量子結晶。詳言之，金屬錯合物之水溶液中之濃度應考量主要形成之量子結晶之尺寸而決定，使用分散劑時較佳是亦考量其濃度，通常，可使用100ppm至5000ppm之範圍，惟亦依賴配位基之功能，調製所謂奈米團簇(Nanocluster)之奈米尺寸中，較佳為500至2000ppm之濃度。
2)形成量子結晶之金屬錯合物係以具有錯合物穩定常數(log β)以上之方式進行選擇，該錯合物穩定常數(log β)係以與負載金屬之電極電位E相關之式(I)表示。
式(I)：E°=(RT/｜Z｜F)ln(β i)(此處，E°表示標準電極電位，R表示氣體常數，T表示絕對溫度，Z表示離子價，F表示法拉第常數(Faraday constant))
此處，金屬錯合物為選自Au、Ag、Pt或Pd之電漿子金屬之錯合物時，對於激發光具有局部表面電漿子共鳴增強效果。尤其是金屬錯合物為銀錯合物時，較佳是藉由穩定常數(生成常數)(log β i)為8以上之銀錯化劑與鹵化銀之反應形成，鹵化銀較佳為氯化銀，錯合劑較佳為選自硫代硫酸鹽、硫氰酸鹽、亞硫酸鹽、硫脲、碘化鉀、硫代水楊酸鹽、硫氰尿酸鹽中之1種。銀錯合物具有由平均直徑為5至20nm之奈米團簇構成之量子點(Quantum dot)，量子結晶之尺寸成為100至200nm。
3)所謂於本發明使用之蛋白晶片中之電漿子金屬介晶，係電漿子金屬錯合物之量子結晶之氧化物，係利用將於血中帶正電之甲基化核小體以電荷補足必需之負帶電，藉由激發光之照射發揮表面電漿子增強效果，具有增強經補足之甲基化核小體之自體螢光之效果。銀錯合物量子結晶的情形，進行鹼處理(以次氯酸鈉水溶液處理)時，認為藉由下述反應而包含以銀鹵化物作為核之過氧化銀，並形成銀氧化物複合物之針狀奈米結晶群者(專利文獻1之圖5)，而且為於水中帶有(-)荷電之一方，由於DNA纏繞之組織蛋白帶有(+)荷電(專利文獻1之圖7(a))，因而發現其選擇性吸附以此遊離核小體為代表之帶有正電荷之癌症關連物質。而且發現含有過氧化銀之銀氧化物之針狀奈米結晶群係藉由以雷射 光為代表之激發光的照射而顯示表面電漿子增強效果，檢測出以所吸附之組織蛋白為代表之癌症關連物質之自體螢光而較佳。
Na2S2O3+4NaClO+H2O→Na2SO4+H2SO4(2NaHSO4)+4NaCl
Ag++NaCl→AgCl+Na+
Ag++3NaOCl→2AgCl+NaClO3+2Na+
Ag++OH-→AgOH
2Ag++2OH-→Ag2O+H2O
4)本發明之銀氧化物之複合針狀奈米結晶群係含有過氧化銀之銀氧化物自己組織化而形成神經元狀之三維超結構體(介晶)者(專利文獻1之圖8及9)，因此可藉由將銀離子水溶液使用Ag/AgCl電極進行定電位電析，或是將銀之量子結晶以鹼處理進行氧化而形成，惟，可藉由將銀錯合物量子結晶，例如硫代硫酸銀量子結晶進行鹼處理(以次氯酸鈉水溶液處理)而容易地形成。
5)為了盡可能地吸附疾病關連物質，可使用於實現螢光標識標記之高度檢測、敏感度及迅速性且具有節距(pitch)350nm之周期結構之基板上，將銀與氧化鋅之薄膜成膜形成之等離子晶片(專利文獻2)；或是使金屬奈米粒子分散於有機溶劑中，將有機溶劑揮發而使金屬奈米粒子於二維方向自己組織化，從粒系均勻之銀奈米微粒子形成之局部電漿子螢光增強片(專利文獻3)。
「於本發明使用之檢體」
從含有血液之體液作成檢體。由於紅血球顯示強的自體螢光，較佳為進行離心分離僅取出血漿。癌症疾病作為疾病關連物質時，稀釋10至50倍，以可容易地測定片段化DNA(細分化核小體)之自體螢光的方式決定稀釋率。於磷青 銅上滴下約1000ppm之硫代硫酸銀錯合物水溶液，將作成之硫代硫酸銀錯合物量子結晶進行鹼處理而氧化形成銀氧化物介晶，較佳為將該銀氧化物介晶稀釋20至30倍。細胞之情形時，由於機械性破碎不會改變其物性而較佳。然後，方便的是片段化DNA(細分化核小體)形成穩定之蛋白質結合體(Protein-bound DNA fragments：nucleosome or chromatin)，顯示較強的正電荷。因此，片段化DNA(細分化核小體)被選擇性捕捉於顯示負電荷且藉由激發光顯示表面電漿子增強效果之電漿子金屬介晶，且由於片段化DNA(細分化核小體)穩定，即使真空乾燥或以乾燥劑(矽膠)乾燥後保存，再溶解於蒸餾水等中，亦可再現乾燥前之蛋白質結合體自體螢光之特徵。以乾燥劑(矽膠)乾燥不僅於現場採血、採集離心分離之血漿，如圖4所示，亦成為可於容器內乾燥，以郵寄申請檢査。又，所有疾病中以異常蛋白質蓄積為原因之情況多，例如，阿茲海默病、巴金森氏症、肌肉萎縮性脊隨側索硬化症、亨丁頓氏舞蹈症等神經變性疾病之共通特徵為由於神經細胞內凝集之異常蛋白質蓄積所致者。異常蛋白質由於具有細胞毒性，引起神經細胞變性或細胞壞死。大多數的異常蛋白質藉由泛素化被標記，以蛋白酶體分解，惟，蛋白酶體無法將凝集之異常蛋白質破壞，於神經變性疾病之神經細胞，由於經泛素化之異常蛋白質之凝集體蓄積，暗示異常蛋白質之檢測係作為癌症以外之疾病關連物質之檢測而可使用液態生檢法。再者，由於iPS細胞有含有癌化基因DNA之情況，可將iPS細胞作為檢體並以下列之自體螢光進行iPS細胞癌化之識別而除去。
「螢光影像取得步驟」
此處，對被捕捉於上述電漿子金屬介晶基板上之片段化DNA(細分化核小體)照射激發光，藉由表面電漿子增強效果而增強捕捉片段化DNA(細分化核小體)之自體螢光，取得螢光菌落作為螢光影像。
激發光使用適用於將於正常組織及病變組織其集積/排出特性不同之血紫質誘導體(腫瘤親和性螢光物質)激發之405nm之激發光之雷射光源。蛋白質結合體為採集血液進行離心分離，將獲得之血漿以蒸餾水稀釋30倍使用。
c)螢光菌落之採用步驟：
使用奧林巴斯DM(分色鏡(dichroic mirror))405-445/514，由於獲得圖1之結果，將各試樣每亮度之高點抽出例如10點(因應疾病而決定採集點數)，於中心附近作成圓形之ROI，算出光譜值。螢光菌落之10點採用為以専用軟體「cellSens」二值化，採用預定閾值以上之亮度之螢光菌落。
其他之影像取得條件如下所述。
雷射：405nm 50%
物鏡：10倍(MPLFLN10×)
針孔徑：500nm
取得波長：460-504nm
狹縫寬度：4nm
階(step)：2nm
解像度：1024×1024
平均化：4次
d)演算步驟：
以採用之預定閾值以上之螢光菌落像素之總面積值或RGB及於與此相關之2波長域之像素之總面積比演算比(ratio)值。
其結果，根據總面積值及不同波長域之總面積之比(ratio)值可識別健康人、良性腫瘤、惡性腫瘤。又，根據R、G、B之2波長比率及與此相關之2波長之比率(ratio)識別健康人、良性腫瘤、惡性腫瘤。
使用奧林巴斯公司製之DM405-445/514，取得470-490nm及600-620nm之影像，確認比(ratio)值是否有變化之結果獲得圖2之結果。關於前列腺，G/R於良性腫瘤時為2.0左右，於健康人為1.70左右，於惡性腫瘤具有超過1.76至1.86為止之寛，明顯顯示與階段(stage)之關連。此結果係藉由試樣數之增加可提昇數值之精確度。
又，由於每個點之亮度不同，以470nm之亮度作為100%，將各波長之亮度以比例表示，將10點之平均值作為每試樣之數值並作成圖表。又，如圖3所示，可確認於610nm前後之波長存在癌症關連物質之峰。
「標的對象及其以螢光顯微鏡觀測到之捕捉標的對象之自體螢光影像」
於本發明將於癌症疾病及其他疾病中異常地產生之片段化DNA(細分化核小體)作為檢測對象。發現與如此疾病關連之蛋白質結合體係具有正電荷而被選擇性捕捉於電漿子金屬介晶，經由激發光照射，藉由電漿子金屬介晶之表面電漿子增強效果而增強，發光具有可以螢光顯微鏡確認之預定以上亮度之自體螢光(圖1)。此等蛋白質結合體係藉由疾病之發生而以細胞凋亡為代表之病理性細胞壞死而釋放於血液及其他體液中，觀測到圖1所示之如夜空星座之複數菌落，於小者觀測到約25μm之擴展，於大者觀測到約150μm之擴展。凋亡細 胞係由於CAD(凋亡蛋白酶活性化DNase)之阻礙因子被分解，經活化之CAD將DNA以核小體單位切斷，因而捕捉到約200bp倍數之片段化DNA(細分化核小體)。詳言之，已知人類血漿中之細胞遊離DNA(cfDNA)作為組織蛋白或與TF關連之蛋白質結合而釋放於血中優先生存，於健康人主要為源自骨髄系淋巴系之細胞系，於確定病狀認為是來自1種或複數之進一步組織的貢獻，包含從癌症等病理學狀態中之cfDNA推測細胞類型之核小體之足跡(footprint)，告知其組織之起源(非專利文獻5：Cell，2016January14；164：Cell-free DNA comprises an in vivo nucleosome footprint that informs its tissues-of-origin)。因此，已報導腫瘤之惡性度與更高度壞死有關，於循環血液中增加腫瘤DNA(ctDNA)，亦報導血漿DNA顯示與以核酸酶切斷之核小體類似之可予測之片段化模型，於健康人及癌症患者可評估cfDNA之大小分布，血漿中之cfDNA參予腫瘤形成或轉移之進行，且明白cfDNA作為液態生檢之診斷生物標記之重要性(非專利文獻4：Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer；Climinal Chemistry 2015；61：112-123)。
此處，癌症之發生係由於癌症基因及癌症抑制基因異常而產生之基因疾病為廣被接受之事實，已知不僅是由於鹼基序列之突變、缺失所致之基因性基因異常，於鹼基之修飾導致之表觀遺傳之基因異常亦導致癌症發生。於此表觀遺傳之基因之影響認為主要是於基因之轉錄控制機構作用，包括基因體DNA之甲基化修飾、與基因體DNA形成複合體之組織蛋白之乙醯化修飾或甲基化修飾。因此，檢測與此cfDNA之組織蛋白之結合體不僅檢測基因性之基因異常，亦檢測藉由於鹼基之修飾所致之表觀遺傳之基因異常，藉此不僅可區別健康人及癌症患者，亦暗示癌症發生部位之識別性。
(癌症關連物質之選擇性捕捉)
作為血清中之癌症關連物質的片段化DNA(細分化核小體)係包含DNA所纏繞之組織蛋白(核小體)、此等聚集成為繩狀結構之染色質(纖維)。球蛋白亦帶正電荷，相較於其他癌症關連物質，球蛋白之增加最大為2倍以下，相對於此，於本發明探測之物質伴隨癌之進行而增加至100倍以上，因此球蛋白以外之增加表示探測到癌症關連物質，所採用之螢光菌落的一定閾值以上之像素之總面積係與癌症之階段有關。
參照下列圖表詳細地說明本發明之實施形態。
(實施例1)
調製硫代硫酸銀1000ppm水溶液，將該水溶液在磷青銅板上滴下1滴，放置約3分鐘，將溶液吹散後，查看SEM像，已作成量子結晶。於顯示實施例1製造之奈米粒子凝集體(量子結晶)之各種SEM像之照片(參照專利文獻1之圖1)中，為100nm左右之薄六角柱狀結晶，於表面發現數奈米級之凹凸。無法確認金屬奈米結晶所特有之刻面。於表示於磷青銅板上滴下後之放置時間及量子結晶形狀關係之照片(專利文獻1之圖6)中，首先，確認生成六角形之量子結晶，一邊維持形狀一邊成長，於表示量子結晶之EDS光譜(元素分析)結果之圖表(專利文獻1之圖4)中，雖然形成於磷青銅板上之結晶係檢測到銀及源自錯合物配位基之元素，惟，調製硫代硫酸銀1000ppm水溶液，將該水溶液於銅板上滴下1滴，放置約3分鐘，並將溶液吹散時僅檢測到銀。
(量子結晶之建造)
量子結晶為1000ppm硫代硫酸銀錯合物水溶液時，滴下至磷青銅板上並放置3分鐘時，形成100nm左右之六角柱狀，可從SEM像確認各六角柱狀之量子結晶具有數奈米級之凹凸，惟，無法確認金屬奈米結晶所特有之刻面，由於以EDS元素分析檢測到銀及源自錯合物配位基之元素，因此全體為銀錯合物之奈米結晶，推測於其表面出現之凹凸為錯合物中之銀作為團簇形成量子點而擴展。本發明之銀錯合物量子結晶形成於磷青銅板上，另一方面，觀察到於銅基板上只析出銀之奈米粒子之現象時，推測硫代硫酸銀錯合物之平衡電位為0.33，因與銅之電極電位(0.34)同等，於銅基板上只有銀(0.80)析出，為磷青銅時為0.22，因電極電位稍低而析出銀錯合物之結晶。因此，為了作成量子結晶，認為重要的是：1)錯合物水溶液為500至2000ppm之稀薄區域、2)相對於金屬錯合物水溶液之平衡電位，負載金屬之電極電位稍低、3)以電極電位差使金屬錯合物凝集。又，使用1000ppm硫脲銀錯合物水溶液時亦相同。
(對於銀氧化物之介晶之考察之1)
於上述量子結晶基板滴下5%次氯酸鈉水溶液，進行2分鐘後除去時，觀察到於專利文獻1之圖11表示之結晶結構，由於觀察到針狀之結晶及橄欖球狀塊之大塊，若以EDS光譜(元素分析)分析各個組成，從以下之反應式認為針狀之結晶皆為由氯化銀及氧化銀之複合結晶構成，惟，專利文獻1之圖7之結果無法確認氯，明瞭以銀及氧為主導。
Na2S2O3+4NaClO+H2O→Na2SO4+H2SO4+4NaCl (1)
Ag++NaCl→AgCl+Na+ (2)
Ag++3NaOCl→2AgCl+NaClO3+2Na+ (3)
Ag++OH-→AgOH (4)
2Ag++2OH-→Ag2O+H2O (5)
因此，本發明之介晶形成認為是銀離子及硫代硫酸離子在氯離子存在下藉由鹼氧化反應生成者，惟，於通常之水溶液中只形成氧化銀，從下述XPS測定推測為由過氧化銀主導形成。
(對於銀氧化物之介晶之考察之2)
XPS測定：
於上述量子結晶基板花費2分鐘滴下次氯酸鈉水溶液25μl，製作再結晶基板，不經過浸蝕直接將Ag及O進行XPS測定(使用機種：ULVAC-PHI(股)公司製造)/PHI5000VersaProbeII(掃描型X線光電子分光分析裝置))。又，為了比較對象，測定氧化銀粉及氯化銀粉之Ag。另一方面，將再結晶基板以氬氣團簇離子槍浸蝕5分鐘，將Ag及O進行XPS測定。從EDS之結果(專利文獻1之圖8)推測XPS測定結果(專利文獻1之圖9及圖10)，認為529eV附近之峰為源自過氧化銀(AgO)之O峰，530eV附近之峰為源自氧化銀(Ag2O)之峰。進行浸蝕時氧量減少，529eV附近之峰係源自過氧化銀(AgO)之O峰，惟530eV附近之峰大於源自氧銀(Ag2O)之O峰，說明於基板附近形成過氧化銀。此是被推測會影響介晶形成時之催化作用及基板之電極電位。此外，EDS測定為將上述再結晶基板利用JSM-7001F(使用機種：日本電子(股)公司製造，場發射分析掃描式電子顯微鏡)進行。
又，即使以次氯酸水溶液、0.01當量濃度氫氧化鈉水溶液、0.01當量濃度鹽酸水溶液、0.1莫耳碳酸鈉水溶液處理硫代硫酸銀之量子結晶，仍不能獲得 相同之結果。據此，針狀結晶之形成認為係在銀離子及硫代硫酸離子存在下藉由上述反應產生者。氧化銀於水溶液中帶負電荷，藉由光還原使金屬銀析出。過氧化銀由於其傾向顯著，吸附正電荷之癌症關連物質且獲得吸附之癌症關連物質與銀粒子之間之表面電漿子增強效果。
(片段化DNA(細分化核小體)之影像診斷)
核小體係以染色質之基本構成單位，在由4種組織蛋白(H2A、H2B，H3、H4)構成之組織蛋白8聚體以DNA包裹之結構，惟，組織蛋白除了擔任將DNA包裹的角色之外，於調節DNA之可及性(Accessibility)及基因控制亦擔任重要之角色。藉由組織蛋白之轉譯後修飾控制與DNA或其他核蛋白質之相互作用，於可逆性之基因表現造成影響。組織蛋白修飾之種類己知主要有甲基化、乙醯化、磷酸化、泛素化、SUMO化、瓜胺酸化、ADP核糖基化。組織蛋白之序列中藉由哪個部位受到此等修飾，周圍之基因表現活化或被抑制。若將此等組織蛋白之轉譯後修飾部位之組合及於基因表現之影響使用各種組織蛋白編碼關連抗體(Genetex公司抗組織蛋白抗體)，將於本發明之電漿子晶片捕捉到之組織蛋白編碼之經修飾之狀態以螢光影像觀測時，可進行組織蛋白編碼假設之驗證。
DNA甲基化被認為深度參予此染色質結構控制。於DNA甲基化高密度所看到之基因體DNA部位，係通常染色質結構堅定，觀察到轉錄抑制或DNA變異率降低。又，於基因體DNA之甲基化模型及基因體印記，X染色體不活化或細胞腫瘤化觀察到明確之相關。因此，於片段化DNA(細分化核小體)中之組織蛋白及染色質之結構解析係掌握說明與癌症關連之關鍵，將組織蛋白尾 解析化學修飾之因子可說是具有重要之意義。使用本發明之電漿子晶片時，藉由捕捉作為癌症關連物質之片段化DNA(細分化核小體)，根據其所捕捉到之結晶之多少，藉由螢光影像診斷可判斷癌症狀是否存在。因此，其癌症狀為何種臓器之癌症、其進行狀態為何種程度可藉由解析組織蛋白尾之化學修飾、重塑因子(Remodeling factor)而判定。因此，作為分光條件使用445nm波長之雷射光，使用雷射用反射鏡使用奧林巴斯公司製造之「BS10/90」，於455至655nm之範圍每5nm測定分光光譜時，於從大腸癌症患者之血液採集之試樣中，於515nm附近觀測到峰，於從健康人之血液採集之試樣未觀測到該峰，認為藉由分光可將何種臓器之癌單獨或考慮於RGB區域之預定閾值以上之像素之總面積或於RGB區域之二波長域之預定閾值以上之像素之總面積比率G/G，G/B等而確定。因此，通過此染色質重塑事象，關於如何發生癌症、是否正進展著的訊息，係可使臨床醫生更正確地預測此類癌對何種特定之化學療法劑會如何反應，於此方法，以腫瘤之化學感受性之知識為基礎，可合理地設計化學療法。
此外，於本發明，從以RGB獲得之螢光影像計算出於2波長域之預定閾值以上之像素之總面積比之比(ratio)值，於G獲得之螢光影像中，良性腫瘤有變高之傾向，於B獲得之螢光影像中，惡性腫瘤有變高之傾向。因此，於實施例，關於前列腺，以G/R解析比(ratio)值時，於良性腫瘤具有2.0左右，於健康人具有1.7，於惡性腫瘤具有1.76至1.86寛度之結果，另一方面，關於大腸，以B/G解析比(ratio)值時，惡性腫瘤具有1.9至2.0寛度，於健康人為0.2至0.8，於良性腫瘤為0.1左右。
(G區域短波長域/G區域長波長域之像素比率)
光源使用LED光源(XY L IS製波長360至770nm)，於奧林巴斯正立顯微鏡BX-63安裝下列螢光波長濾器並限定進行測定之螢光波長，取得螢光影像。與上述同樣地採用各波長域預定之閾值以上之像素，採用其總面積。
將9名大腸檢査患者之試料(從血液離心分離所採集之血漿)滴在上述生物晶片上作成檢體，尋求分子側G區域及分母側G區域之預定閾值以上之像素總面積。作為分子側之激發光之濾器使用BP470至495nm，作為螢光濾器使用BA510至550nm。採用使用上述鏡單元獲得之螢光影像預定以上之閾值之像素作為比(Ratio)之分子並算出像素總面積。
另一方面，作為分母側激發光之濾器使用BP460至480nm，作為螢光濾器使用BA495至540nm。採用使用上述鏡單元獲得之螢光影像預定以上之閾值之像素作為比(Ratio)之分母並算出像素總面積。算出以上之G區域分子/G區域分母之比(Ratio)，與以其他方法檢査決定之階段比較時，如下述表1所示。藉由此明瞭於本發明方法獲得之結果可觀察到與實際檢査決定之惡性/良性及階段有密切關係。
Figure 110124623-A0202-12-0027-1

Claims (6)

  1. 一種利用自體螢光的液態生檢法，係包含下列步驟：a)藉由使用具有試料中電漿子金屬介晶區域之測定基板，對檢體中作為疾病關連物質之片段化DNA(細分化核小體)進行電荷捕捉之步驟，其中，該檢體為包含體液或含有細胞之培養液者；b)對該電漿子金屬介晶上捕捉到之片段化DNA(細分化核小體)照射激發光，藉由表面電漿子增強效果而增強其自體螢光，藉由確定某個固定測定區域(ROI)來決定片段化DNA(細分化核小體)之螢光菌落之螢光影像，取得B的任意區域之螢光菌落影像作為惡性腫瘤訊號之步驟；c)採用亮度等於或高於該螢光菌落影像的預定閾值之像素之步驟；d)演算於所採用的測定區域之B區域中高於預定閾值之像素之總面積值之步驟。
  2. 一種利用自體螢光的液態生檢法，係包含下列步驟：a)藉由使用具有試料中電漿子金屬介晶區域之測定基板，對檢體中作為疾病關連物質之片段化DNA(細分化核小體)進行電荷捕捉電荷之步驟，其中，該檢體為包含體液或含有細胞之培養液者；b)對該電漿子金屬介晶上捕捉到之片段化DNA(細分化核小體)照射激發光，藉由表面電漿子增強效果而增強其自體螢光，藉由確定某個固定測定區域(ROI)來決定片段化DNA(細分化核小體)之螢光菌落之螢光影像，取得B的任意區域之螢光菌落影像作為惡性腫瘤訊號以及G的任意區域之螢光菌落影像作為良性腫瘤訊號之步驟；c)採用亮度等於或高於該螢光菌落影像的預定閾值之像素之步驟； d)演算所收集的像素之總面積值的B區域/G區域或G區域/B區域之比值之步驟。
  3. 如請求項2所述之液態生檢法，其中，惡性腫瘤採用1.9至2.0範圍的B/G比值，健康人採用0.2至0.8範圍的B/G比值，良性腫瘤採用0.1左右範圍的B/G比值。
  4. 如請求項1所述之液態生檢法，其中，捕捉到之片段化DNA(細分化核小體)含有經甲基化之癌抑制基因、經高甲基化之RB基因、p16以外，再包含p14、p53。
  5. 如請求項1所述之液態生檢法，更包含e)測量分光光譜作為總面積值以外的附加數據之步驟。
  6. 如請求項2所述之液態生檢法，更包含e)測量分光光譜作為比值以外的附加數據之步驟。
TW110124623A 2020-11-20 2021-07-05 透過自體螢光的液態生檢法 TWI818278B (zh)

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PCT/JP2020/048764 WO2021132576A1 (ja) 2019-12-25 2020-12-25 アポトーシスにより細分化されたヌクレオソームを標的とする自家蛍光によるリキッド・バイオプシィ法
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