WO2021132576A1 - アポトーシスにより細分化されたヌクレオソームを標的とする自家蛍光によるリキッド・バイオプシィ法 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention targets subdivided nucleosomes released into the blood by cell apoptosis, excites and detects their autofluorescence by surface plasmon enhancement, and obtains epigenetic information for cancer-centered disease information. Regarding the underlying liquid biopsy method.
  • CAD caspase-activated DNase
  • the activated CAD cleaves DNA in nucleosome units, so it is said to be fragmented as DNA that is a multiple of approximately 200 bp (Non-Patent Document 5).
  • This fragmented DNA contains both genetic information and epigenetic information carried by genomic DNA. That is, although the genetic information carried by genomic DNA is in the base sequence, it may show different information even if the base sequence is the same. That is, the DNA in our cells exists in the form of being wrapped around the histone protein, and when the histone protein undergoes chemical modification such as acetylation, the state of the DNA changes.
  • the genetic information that shows such changes is called epigenetics, but it is the cells that make up one individual exert different functions even though they have the same genomic DNA received from the fertilized egg.
  • epigenetics of Epigenetics information acts as a switch, which changes the structure of DNA by adding or eliminating molecules and turns on and off the expression of genes in genomic DNA.
  • the epigenetics of each cell is important (Professor of Tohoku University: Takahiro Arima, "Epigenetics and Evolution Knowing from Humans"). Therefore, it is said that most naturally occurring cancer cells have DNA methylation and chromatin abnormalities.
  • a definitive diagnosis of cancer is generally made by a so-called biopsy method, in which a part of cancer tissue is collected by puncture or endoscopic treatment and a histopathological examination of the tissue piece is performed.
  • Many biopsies are invasive procedures with risks such as bleeding and complications of bacterial infections, and biopsies can be difficult at some major sites.
  • a liquid biopsy an attempt to diagnose a disease with an accuracy comparable to that of a pathological diagnosis using easily collectable samples such as blood and urine is called a liquid biopsy. It is attracting a great deal of attention as being suitable for clinical application due to its rapidity and simplicity.
  • the targets of this liquid biopsy include exosomes and peripheral blood circulation microRNA (microRNA:) in addition to circulating tumor cells (CTC) and peripheral blood circulating tumor DNA (circulating tumor DNA: ctDNA). miRNA) and so on.
  • microRNA peripheral blood circulation microRNA
  • CTC circulating tumor cells
  • ctDNA peripheral blood circulating tumor DNA
  • CTC blood circulating tumor cells
  • EMT epithelial mesenchymal conversion
  • CTC circulates in the blood and invades other tissues to form metastatic tumors (metastasis). Since this CTC is present in the peripheral blood of cancer patients, it is expected that detection of this CTC can be used to determine the process of metastasis and to predict the prognosis of treatment.
  • CTC is present in a very small amount, and there is a drawback that it is very difficult to detect.
  • peripheral blood circulation microRNA and exosomes containing it are expected to be particularly useful for early diagnosis.
  • microRNA complementarily binds to messenger RNA (mRNA) before it is translated into protein in cells and inhibits the translation of that mRNA, which is important in various life phenomena as a so-called fine tuner for gene expression.
  • mRNA messenger RNA
  • fine tuner for gene expression This is because it plays a role, and it is known that the expression control mechanism of microRNA is disrupted in cancer cells, and for example, microRNA that promotes cell proliferation is highly expressed.
  • exosomes almost all cells secrete extracellular vesicles (exosomes), and it is said that early cancer can be diagnosed by detecting exosomes secreted by early-stage cancer cells in body fluids. Because.
  • this type of liquid biopsy method including the diagnostic technique using the above-mentioned circulating tumor cells (CTCs, Circulating Tumor Cells), uses CD45 antibody beads after lysing red blood cells from a cancer patient sample (4 mL of peripheral blood). It is necessary to use to remove blood cells and sort cytokeratin-positive and CD45-negative cell fractions, and there is a limit to the provision of a liquid biopsy method in clinical applications that can be analyzed in a short time ( Non-Patent Documents 1, 2 and 3).
  • the present inventors have conducted diligent research, and as a result, in apoptotic cells, the inhibitory factor of CAD (caspase-activated DNase) is decomposed, and activated CAD is obtained. Since the DNA is cleaved in nucleosome units, it is fragmented as DNA that is a multiple of approximately 200 bp. This fragmented DNA (fragmented nucleosome) after apoptosis contains both genetic information and epigenetic information carried by genomic DNA, and when histone protein undergoes chemical modification such as acetylation, the appearance of DNA changes.
  • CAD caspase-activated DNase
  • fragmented DNA fragmented nucleosome
  • histone protein fragmented nucleosome
  • autofluorescence having a brightness equal to or higher than a predetermined value that can be confirmed with a fluorescence microscope is generated. It was found that it emits light and is observable (Fig. 1).
  • tumor suppressor genes including p53 are methylated by epigenetics, and although detection of methylated nucleosomes is indispensable for cancer disease information, methylated nucleosomes are selectively collected. It was difficult to do. Moreover, the fragmented DNA captured from the blood after apoptosis, that is, the fragmented nucleosomes aggregate somewhat on the biochip, and the autofluorescent colonies emitted by them are observed as multiple colonies like the constellations of the night sky. It was observed as a spread of about 25 ⁇ m in the small one and a spread of about 150 ⁇ m in the large one.
  • Non-Patent Document 6 Non-Patent Document 6
  • Circulating Tumor Cells Circulating tumor cells isolation and diagnostics: toward routine clinical use.
  • Cancer Res 2011; 71: 5955-60 GorgesTM, Pantel K :. Circulating tumor cells as therapy-related biomarkers in cancer patients.
  • Permuth-Wey Jet al. A Genome-Wide Investigation of MicroRNA Expression Identification Biologically-Meaningful MicroRNAs That Distinguish between High-Risk and Low-Risk Intraductal Papillary.Mucinous Neoplasmsof Ellen Heitzer, Peter Ulz and Jochen B.
  • fragmented DNA (subdivided nucleosomes) released by pathological cell death represented by apoptosis in blood or other body fluids due to the occurrence of a disease is the subject of examination.
  • carcinogenesis is a genetic disease caused by abnormalities in cancer genes and tumor suppressor genes, but to bases represented by methylation. It has become clear that carcinogenesis is caused by epigenetic genetic abnormalities due to modification, and not only qualitative abnormalities of tumor suppressor genes but also quantitative abnormalities due to hypermethylation are important for the carcinogenic mechanism.
  • the problem to be solved by the present invention is to target fragmented DNA (fragmented nucleosomes) released into the blood by apoptosis, and to perform histone modification analysis and chromatin structure analysis using tissue samples to perform various diseases, especially.
  • a detection method for detecting and diagnosing a tumor leading to the onset of cancer as a disease-related substance quickly and easily by a liquid biopsy method using autofluorescence of fragmented DNA (fragmented nucleosome). It is in.
  • a sample prepared by directly or diluting a culture solution containing body fluid or cells is brought into contact with a measurement substrate having a plasmon metal mesocrystal region in the sample, and fragmented DNA (fragmented nucleosome) in the sample.
  • the captured fragmented DNA (subdivided nucleosome) on the plasmon metal mesocrystal is exposed to a single wavelength excitation light by a laser light source or an LED light source.
  • the fluorescence image of the fluorescent colony of fragmented DNA is constant by irradiating the excitation light with a certain wavelength width to obtain the excitation light from the filter through a filter and enhancing its autofluorescence by the surface plasmon enhancing effect.
  • the excitation light a single wavelength excitation light from a laser light source or an excitation light having a constant wavelength width that acquires the excitation light from an LED light source or the like through a filter is used.
  • ROI is adopted in adopting a region of predetermined brightness from the observed fluorescent colonies. Then, the reason why the pixels having the brightness equal to or higher than the predetermined threshold value in the fluorescent colony are adopted is to improve the measurement accuracy.
  • the pixels of the fluorescent colonies having a brightness equal to or higher than the predetermined value adopted by binarization are adopted and the total area thereof is calculated. Alternatively, the ratio (ratio value) of the total area of two different wavelength regions is calculated.
  • the adopted RGB wavelength range is preferably the G or B region, and it is preferable to calculate the G / B or B / G ratio. This is because when the spectroscopic spectrum of the fluorescent colony is observed, a peak peculiar to a disease, particularly cancer, is observed in the B or G region.
  • the target to be captured as a detection target is fragmented DNA (subdivided nucleosome) that is a multiple of about 200 bp in which activated CAD (caspase-activated DNase) cleaves DNA in nucleosome units. Therefore, it contains both the genetic information carried by the genomic DNA and the epigenetics information, and it is preferable to perform the ratio determination in order to make it easy to extract only the epigenetics information.
  • the captured fragmented DNA fragmented nucleosome
  • the captured fragmented DNA is excited at the same or different two-wavelength excitation wavelengths in the B or G region to obtain fluorescent colonies, and the fluorescent colonies are filtered through different two-wavelength filters.
  • This is a liquid biopsy method in which the ratio of each total area value of the pixels collected from the cells is the B region / G region or the G region / B region.
  • the body fluid as a sample is plasma or serum separated from lymph or blood, and fragmented DNA (fragmented nucleosome) binds to histone protein and shows a positive charge, so that it can be selectively captured. ..
  • fragmented DNA fragment nucleosome
  • the target is to identify the canceration of the iPS cell.
  • a disease-related substance activated CAD (caspase-activated DNase), cleaves DNA in nucleosome units, and a fragmented DNA (subdivided nucleosome) in a multiple of about 200 bp is selected.
  • Autofluorescence which usually becomes noise in fluorescence diagnosis, is manifested by the surface plasmon enhancing effect, and fluorescent colonies having a brightness equal to or higher than a predetermined threshold are adopted, and the total area value of fluorescent colonies above a predetermined threshold, or
  • bioproteins have autofluorescence, but this autofluorescence provides a signal (desirably fluorescently labeled) background (such as autofluorescence, which is not desirable to be fluorescently labeled) in the fluorescence observation of the target. It forms and becomes noise.
  • the autofluorescence of this bioprotein reflects the structure of the bioprotein itself, the structural analysis by autofluorescence is particularly effective in the following points. That is, in recent years, based on the analysis results performed so far, not only genomic changes but also epigenome changes have accumulated in the process of cancer cell development and progression, and epigenome modification is used for chemical control and physical control. It is roughly divided. A representative of chemical control is the modification of various histone tails called "histone codes".
  • the gene expression state correlates well with the chromatin state of the promoter region where the transcription initiation site is located, but the chromatin state of the enhancer is also deeply involved in the gene expression regulation peculiar to the cell lineage. Recently, it has been shown that the enhancer region using H3K27ac as an index is also important in the three-dimensional structure morphology (genome topology) of genes. Therefore, observation of autofluorescence using clinical tissue specimens suggests the possibility of early diagnosis of cancer and identification of cancer sites by histone modification analysis and chromatin structural analysis. That is, the protein conjugate to which the cell-free DNA is bound stabilizes the DNA in the nucleosome when the DNA wraps around the histone to form a nucleosome and the histone protein is methylated.
  • Non-Patent Document 5 Non-Patent Document 5
  • the autofluorescence of disease-related substances including free DNA (cfDNA) and fragmented DNA (subdivided nucleosomes) is manifested by the surface plasmon enhancing effect, and the total area is based on the fluorescent colonies having a brightness of a predetermined threshold or higher. It has been found that by calculating the ratio value by the value or the two wavelength ratios that correlate with RGB and / or it, it is possible to diagnose the disease, in particular, to identify cancer patients, benign tumor patients, and healthy subjects.
  • fragment DNA fragment nucleosomes
  • cfDNA cell-free DNA
  • the DNA wrapped around histones binds to histone proteins and exists stably by methylation (various tumor suppressor genes hypermethylated from cancer cells by the cancer and epigenetics: hypermethylated RB genes).
  • P14 and p53 are included in addition to p16). Therefore, by providing a chip showing a positive charge, these can be selectively adsorbed or captured.
  • the substance captured on such a chip manifests autofluorescence by the surface plasmon effect due to specific excitation light, and when these are analyzed with a fluorescence microscope, the fluorescence wavelength indicates that the healthy subject, cancer patient, and other diseased patients. I found that I could identify. That is, cell-free DNA is also released into the blood from healthy cells via apoptosis, but tumor cell-free DNA is released from cancer cells, which are due to their own methylation and histone methylation. It binds tightly and releases disease-specific fragmented DNA (fragmented nucleosomes) from other diseased cells.
  • the DNA released from the cells of these healthy subjects, cancer patients, and other diseased patients has not only genetic genetic abnormalities but also epigenetic genetic abnormalities due to modification to bases, and is released from each cell.
  • fragmented DNA fragmented nucleosomes
  • epigenetic modification is roughly classified into its chemical control and physical control, and is affected.
  • the fluorescence wavelength spectrum or spectral peak differs depending on the site (according to the spectroscopic spectrum, a slight peak was observed around 515 nm in the fragmented DNA (subdivided nucleosome) of the cancer patient). Therefore, calculating the ratio value based on the total area value of the fluorescent colonies above the adopted predetermined threshold value or the ratio of the total area value of the fluorescent colonies above the adopted predetermined threshold value in the two wavelength region includes cancer. , Extremely effective in evaluating various diseases.
  • protein conjugates are formed. Autofluorescence can be manifested by plasma enhancement and observed with a fluorescence microscope, which can be useful for early diagnosis of diseases. This is because post-translational modification abnormalities of proteins are associated with the development of various diseases, but proteomics analysis can be easily and quickly performed on specimens of patients with various diseases such as cancer, lifestyle-related diseases, and infectious diseases.
  • these fragmented DNAs are released into blood and other body fluids by pathological cell death typified by apoptosis due to the occurrence of the disease, and thus have a relationship with the disease. deep.
  • the autofluorescence of the nucleosome itself after apoptosis is characterized by strong autofluorescence in the blue (B) region in malignant tumors and strong autofluorescence in the green (G) region in benign tumors (Fig. 9).
  • B blue
  • G green
  • Fig. 9 shows at the high-brightness area values of the region and the green (G) region by the Ratio value (B / G or G / B)
  • test level Proteo test level
  • FIG. 1 shows the obtained fluorescence image using a DM (dichroic mirror) 405-445 / 514 manufactured by Olympus, and shows a method of adopting 10 points having high brightness for each sample.
  • FIG. 2 shows images of 470-490 nm and 600-620 nm obtained using DM405-445 / 514 manufactured by Olympus.
  • FIG. 3 is a graph showing a spectroscopic spectrum acquired using BS10 / 90.
  • FIG. 4 shows a silica gel drying container, in which (a) shows a dropping state of crystals obtained by centrifuging blood, and (b) shows a state in which plasma is dried in the container with silica gel.
  • First step A of the first method of the present invention Explanatory drawing of making a measuring chip (proteo chip), Second step B: Explanatory drawing for determining the analysis range of the proteochip, Third step C: It is explanatory drawing of quantification of the area of (adopted fluorescent colony) of a proteo chip.
  • Image acquisition step (1) ⁇ analysis range determination step (2) ⁇ fluorescent colony adoption step (3) ⁇ RGB calculation step of total area value of adopted colonies in RGB fluorescent image (4) ⁇ obtained RGB
  • the conceptual diagram of the Ratio calculation method of this invention is shown.
  • the liquid biopsy method it is preferable to adopt the following steps in the first method.
  • the first method fragmented DNA (subdivided nucleosomes) captured by single-wavelength excitation light from a laser or excitation light of a certain wavelength width adopted by a filter is excited, and the total area of pixels above a predetermined threshold of the fluorescent colony is calculated.
  • Equipment used KEYENCE, fluorescence microscope BZ-X710
  • Light source Metal halide lamp 80W
  • Fluorescence filter BZ-X filter DAPI (460 ⁇ 25nm)
  • Analysis software BZ-X Analyzer a) Selective capture step of cancer-related substances: Fig.
  • Measurement substrate having a plasmon metal mesocrystal region showing a negative charge on the surface of the sample A sample prepared by directly or diluting a culture solution containing body fluid or cells is brought into contact with a proteochip (Fig. 5A (1)) (Fig. 5A). (2)), The positively charged protein conjugate in the sample is charged by the plasmon metal mesocrystal as a disease-related substance (Fig. 5A (3)) Step b) Fluorescent image acquisition step: (1) Set the proteo chip with cancer-related substances on the fluorescence microscope, determine the measurement position (X, Y axis) of the chip while looking at the bright field image, and click the autofocus button to focus the chip (1) Z-axis, focus).
  • a substance with strong fluorescence blue deposits, a binarization threshold value of 13 or more based on the brightness value under the following measurement conditions
  • the area value thereof is calculated (unit: ⁇ m 2 ). From the area value, 0 to 19999 is classified into three stages of low cancer risk A, 20000 to 29999 is classified into observation required B, and 30,000 to 3 stages with cancer risk.
  • FIG. 6 is a second method of the present invention, which is a method of adopting a fluorescence colony having a certain threshold value or more from a fluorescence image and calculating a ratio value with RGB and / or a two wavelength ratio that correlates with it.
  • FIG. 6 (1) three RGB fluorescent images are acquired for each sample.
  • the analysis range is determined and surrounded by ROI (FIG. 6 (2)).
  • “circularity and brightness of fluorescent colonies” are used as threshold values, analysis conditions are determined, and dust and the like are excluded (FIG. 6 (3)).
  • the total area value of the fluorescent colonies adopted from the RGB fluorescence image is calculated (FIG. 6 (4)). The details are as follows.
  • An LED light source was used as the light source, and a fluorescence wavelength filter was attached to the Olympus upright microscope BX-63 to limit the fluorescence wavelengths to be measured and acquire fluorescence images.
  • the excitation light of B is 375 to 400 nm and the fluorescence wavelength is in the range of 460 ⁇ 25 nm.
  • the excitation light of G is 470 to 495 nm, and the fluorescence wavelength is in the long wavelength range of 510 nm or more.
  • the excitation light of R is 530 to 550 nm, and the fluorescence wavelength is in the long wavelength range of 575 nm or more.
  • B is the excitation light and fluorescence wavelength that strongly emits autofluorescence of cancer-related substances
  • G is the excitation light and fluorescence wavelength that strongly emits autofluorescence of benign diseases.
  • B deposits with a brightness value in the range of 28000 to 50000 were selected, and deposits with a circularity of 0.3 or less were set to be removed.
  • G is a setting that selects deposits with a brightness value in the range of 27,000 to 50,000 and removes deposits with a circularity of 0.3 or less.
  • R is a setting that selects deposits with a brightness value in the range of 21000 to 50000 and removes deposits with a circularity of 0.3 or less.
  • This brightness value setting range was set according to the fluorescence intensity of the autofluorescence of the adhering substance and the light intensity of the LED light source.
  • the analysis software is set to automatically remove foreign substances with irregular shapes and improve the analysis accuracy.
  • the range of the brightness value is in the range of 10000 to 70,000, preferably about 20000 to 50,000, and the range of circularity is in the range of 0.9 to 0, preferably about 0.3. This circularity is adjusted according to the situation of the fluorescent colonies. From the RGB area value calculated by this measurement and analysis setting, the ratio value of the two wavelength ratios such as B / G and G / R is calculated, and for the large intestine, the ratio value of B / G is 1.9 to 1.0 for malignant tumors. The range was around 0.1 for benign tumors and 0.2-0.8 for healthy subjects. By measuring the fluorescence by dividing the excitation light in this way, it is possible to obtain a fluorescence image of stronger autofluorescence in each excitation light. By measuring and analyzing the same cancer-related substance at the same position on the biochip with different settings of excitation light and fluorescence wavelength, it is possible to extract more autofluorescence peculiar to the substance and improve the accuracy of the data. I was able to improve.
  • FIG. 7 shows an image of a microscope stage when four proteochips (measurement boards) are set in a holder to automate measurement.
  • the measurement positions (X-axis and Y-axis) of the chips (1) to (4) are registered in advance, and the focus (z-axis) of the chips (1) to (4) is adjusted by the initiative.
  • the X, Y, and Z axes are determined, three types of RGB measurements on the four chips are automatically performed, and four RGB fluorescent images are obtained.
  • the sample body fluid is not only plasma or serum separated from lymph or blood, but also contains urine, saliva, etc., and cell free DNA (cfDNA) in which a protein conjugate binds to histone protein and exhibits a positive charge.
  • the cell-free DNA comprises circulating tumor DNA (ctDNA) released from the cell.
  • the excitation light having a wavelength of 405 nm used for exciting the tumor-affinitive fluorescent substance, and in that case, the fluorescence wavelength is observed around 630 nm.
  • the protein conjugate captured in the present invention contains circulating tumor DNA (ctDNA), which is a nucleosome bound to histone protein or a higher-order chromatin, and when histone is modified for methylation, it is a liquid by autofluorescence.
  • ctDNA circulating tumor DNA
  • the substrate having the plasmon metal mesocrystal region used in the method of the present invention is called a proteochip.
  • the manufacturing method is as follows (see Patent Document 1). 1) Aqueous metal complex is chemically reduced by an electrode potential difference on a metal substrate having an electrode potential (high ionization tendency) lower than that of the metal forming the complex to aggregate quantum crystals (nano-sized metal complex crystals).
  • a quantum crystal of the silver complex is formed by aggregating an aqueous solution of silver thiosulfate on a copper or a copper alloy having an electrode potential (high ionization tendency) lower than that of silver by using a chemical reduction method. ..
  • the concentration of the metal complex in the aqueous solution should be determined mainly by considering the size of the quantum crystal to be formed, and when using a dispersant, the concentration should also be considered, and usually 100 ppm to 5000 ppm. However, a concentration of 500 to 2000 ppm is preferable for preparing a nanosize called a nanocluster depending on the function of the ligand.
  • E ° represents the standard electrode potential
  • R represents the gas constant
  • T represents the absolute temperature
  • Z represents the ionic value
  • F represents the Faraday constant.
  • the metal complex is a plasmon metal complex selected from Au, Ag, Pt or Pd, it has a localized surface plasmon resonance enhancing effect on excitation light.
  • the metal complex when it is a silver complex, it is preferably formed by the reaction of silver halide with a silver complexing agent having a stability constant (production constant) (log ⁇ i) of 8 or more, and as silver halide.
  • a silver complexing agent having a stability constant (production constant) (log ⁇ i) of 8 or more, and as silver halide.
  • Silver chloride is preferable, and the complexing agent is preferably one selected from thiosulfate, thiocyanate, sulfite, thiourea, potassium iodide, thiosalicylate, and thiocyanurate.
  • the silver complex has quantum dots composed of nanoclusters having an average diameter of 5 to 20 nm, and the size of the quantum crystal is 100 to 200 nm.
  • the plasmon metal mesocrystal in the proteochip used in the present invention is an oxide of the quantum crystal of the plasmon metal complex, and is a negative charge required to supplement the methylated nucleosome that is positively charged in the blood with an electric charge.
  • the acicular nanocrystals of silver oxide containing silver peroxide show a surface plasmon enhancing effect by irradiation with excitation light represented by laser light, and autofluorescence of cancer-related substances represented by adsorbed histone. Has been found to be preferable for detecting.
  • a silver ion aqueous solution can be formed by constant potential electrodeposition using an Ag / AgCl electrode, or by oxidizing a silver quantum crystal by an alkali treatment, which is a silver complex quantum. It can be easily formed by subjecting a crystal, for example, a silver thiosulfate quantum crystal, to an alkali treatment (treatment with an aqueous sodium hypochlorite solution).
  • Patent Document 2 Localized plasmon fluorescence consisting of silver nanoparticles with a uniform grain system by dispersing chips (Patent Document 2) and metal nanoparticles in an organic solvent, volatilizing the organic solvent, and self-assembling the metal nanoparticles in the two-dimensional direction.
  • An reinforcing sheet Patent Document 3 may be used.
  • sample used in the present invention Specimens are prepared from body fluids containing blood. Since erythrocytes show strong autofluorescence, it is better to centrifuge and remove only plasma. In the case of cancer disease as a disease-related substance, the dilution ratio is determined by diluting 10 to 50 times so as to facilitate the measurement of autofluorescence of fragmented DNA (fragmented nucleosome). A 20 to 30-fold dilution is desirable for a silver oxide mesocrystal formed by alkali-treating a silver thiosulfate complex quantum crystal prepared by dropping an aqueous solution of a silver thiosulfate complex of about 1000 ppm onto phosphor bronze.
  • fragmented DNA fragmented nucleosomes
  • protein conjugates Protein-bound DNA fragments: nucleosome or chromatin
  • vacuum drying or desiccant vacuum drying or desiccant because it is selectively captured by plasmon metal mesocrystals showing a negative charge and showing a surface plasmon enhancing effect by excitation light
  • fragmented DNA fragmented nucleosomes
  • iPS cells may contain cancerous gene DNA, they can be used as a sample, and the canceration of iPS cells can be identified and removed by the following autofluorescence.
  • Fluorescent image acquisition process Here, the fragmented DNA (subdivided nucleosome) captured on the plasmon metal mesocrystal substrate is irradiated with excitation light to enhance the autofluorescence of the captured fragmented DNA (subdivided nucleosome) by the surface plasmon enhancing effect. , Fluorescent colonies are acquired as fluorescent images.
  • excitation light a laser light source of excitation light having a diameter of 405 nm, which is said to be suitable for exciting a hematoporphyrin derivative (tumor-affinitive fluorescent substance) having different accumulation / excretion characteristics between normal tissue and lesion tissue, was used.
  • the ratio value is calculated by the total area value of the pixels of the fluorescent colony above the adopted predetermined threshold value, or the total area ratio of the pixels in RGB and the two wavelength regions correlating with it. As a result, healthy subjects, benign tumors, and malignant tumors can be identified by the total area value and the ratio value of the total area in different wavelength regions.
  • the brightness at each wavelength is displayed at a ratio of the brightness of 470 nm as 100%, and a graph is created with the average value of 10 points as data for each sample. Further, as shown in FIG. 3, it was confirmed that the peak of the cancer-related substance exists at a wavelength of around 610 nm.
  • Target object and its autofluorescent image of the captured target object observed with a fluorescence microscope In the present invention, fragmented DNA (fragmented nucleosomes) abnormally generated in cancer diseases and other diseases is targeted for detection. Protein conjugates associated with this type of disease are selectively captured by plasmon metal mesocrystals due to their positive charge, and are enhanced by the surface plasmon enhancing effect of plasmon metal mesocrystals by irradiation with excitation light, and are confirmed by fluorescence microscopy. It has been found that autofluorescence having a brightness equal to or higher than a predetermined value can be emitted (Fig. 1).
  • cell free DNA (cfDNA) in human plasma is released into the blood as a protein bond associated with histone or TF, preferentially survives, and in healthy individuals is mainly derived from the cell line of the myeloid lymphatic system. Contributions from one or more additional tissues are considered for certain medical conditions, including nucleosome footprints that infer cell types from cfDNA in pathological conditions such as cancer, and the origin of that tissue.
  • Non-Patent Document 5 Cell, 2016 January 14; 164: Cell-free DNA is an in vivo nucleosome footprint that informs its tissues-of-origin).
  • Non-Patent Document 4 Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer; Climinal Chemistry 2015; 61: 112-123).
  • Fragmented DNA fragment nucleosomes
  • histones nucleosomes
  • chromatin fibers
  • Globulins are also positively charged, but their increase is up to 2 times or less compared to other cancer-related substances, whereas the substance detected in the present invention increases 100 times or more with cancer progression. Therefore, the increase other than globulin is said to have detected cancer-related substances, indicating that the total area of pixels above a certain threshold of the adopted fluorescent colonies is associated with the stage of cancer.
  • Example 1 A 1000 ppm aqueous solution of silver thiosulfate was prepared, one drop thereof was dropped onto a phosphor bronze plate, the solution was left to stand for about 3 minutes, and the solution was blown off.
  • the photograph showing various SEM images of the nanoparticle aggregate (quantum crystal) produced in Example 1 (see FIG. 1 of Patent Document 1), it is a thin hexagonal columnar crystal of about 100 nm, and the surface has irregularities on the order of several nm. Is expressed. No facets peculiar to metal nanocrystals could be confirmed.
  • FIG. 1 of Patent Document 1 In the photograph showing the relationship between the standing time after dropping on the phosphorus bronze slope and the quantum crystal shape (Fig.
  • Quantum crystal construction In the case of a 1000 ppm silver thiosulfate complex aqueous solution, when the quantum crystal is dropped on a phosphorus bronze plate and left for 3 minutes, it is formed into a hexagonal columnar shape of about 100 nm, and each hexagonal columnar quantum crystal may have irregularities on the order of several nm. Although it was confirmed from the SEM image, the facet peculiar to the metal nanocrystal could not be confirmed, and the element derived from silver and the complex ligand was detected by the EDS element analysis. It is presumed that the irregularities appearing on the surface are spread by forming quantum dots as clusters of silver in the complex.
  • the equilibrium potential of the silver thiosulfate complex is 0.33 and that of copper. Since it is equivalent to the electrode potential (0.34), only silver (0.80) is deposited on the copper substrate, and in the case of phosphorus bronze, the electrode potential is 0.22, which is slightly low, and thus the silver complex.
  • Patent Document 1 9 and 10 of Patent Document 1 are estimated from the results of EDS (FIG. 8 of Patent Document 1), and the peak near 529 eV is the O peak derived from silver peroxide (AgO), which is 530 eV.
  • the nearby peak is recognized as an O peak derived from silver oxide (Ag2O).
  • the O peak derived from silver peroxide (AgO) at the peak near 529 eV is larger than the O peak derived from silver oxide (Ag2O) at the peak near 530 eV. It can be said that it shows that silver peroxide is formed in the vicinity of the substrate. It is presumed that this is due to the catalytic action during mesocrystal formation and the electrode potential of the substrate.
  • the EDS measurement was performed using the above-mentioned recrystallized substrate model: JEOL Ltd./JSM-7001F (field emission analysis scanning electron microscope). Further, the same result was not obtained even when the quantum crystal of silver thiosulfate was treated with an aqueous solution of hypochlorous acid, an aqueous solution of 0.01 specified caustic soda, an aqueous solution of 0.01 specified hydrochloric acid, and an aqueous solution of 0.1 molar sodium carbonate. Therefore, it is considered that the formation of the acicular crystals is caused by the above reaction in the presence of silver ions and thiosulfate ions. Silver oxide is negatively charged in an aqueous solution and is reduced by light to precipitate metallic silver. Since silver peroxide has a remarkable tendency, it is considered that a positively charged cancer-related substance is adsorbed and a surface plasmon enhancing effect between the adsorbed cancer-related substance and silver particles can be obtained.
  • Nucleosomes are the basic building blocks of chromatin and have a structure in which DNA is wrapped around a histone octamer consisting of four types of histones (H2A, H2B, H3, H4). Histones play a role in packaging DNA. In addition, it plays an important role in regulating the accessibility of DNA and in gene regulation. Post-translational modifications of histones regulate their interaction with DNA and other nucleoproteins, affecting reversible gene expression. As the types of histone modifications, methylation, acetylation, phosphorylation, ubiquitination, SUMOylation, citrullination, and ADP liposylation are mainly known.
  • Peripheral gene expression is activated or suppressed depending on which site in the histone sequence undergoes these modifications.
  • various histone code-related antibodies Anti-histone antibodies manufactured by Genetex
  • the combination of these post-translational modification sites of histones and their effects on gene expression can be used to obtain the modified state of the histone code captured by the plasmonic chip of the present invention.
  • the histone code hypothesis can be verified.
  • fragmented DNA fragmented nucleosome
  • fluorescence imaging based on the amount of captured crystals.
  • a peak was observed around 515 nm in a sample collected from the blood of a patient, and the peak could not be observed in a sample collected from the blood of a healthy person. It is considered that the determination can be made in consideration of the total area of the pixels equal to or larger than the predetermined threshold value or the ratio of the total area of the pixels having the predetermined threshold value or more in the two wavelength regions in the RGB region G / G, G / B and the like. And information about how cancer develops and progresses through this chromatin remodeling event tells clinicians how such cancers are likely to respond to specific chemotherapeutic agents. It allows for more accurate predictions, and in this way, chemotherapy based on knowledge of tumor chemosensitivity can be reasonably designed.
  • the Rio value of the total area ratio of pixels equal to or larger than a predetermined threshold in the two wavelength region is calculated from the fluorescence image obtained by RGB, but the fluorescence image obtained by G tends to increase the number of benign tumors. Yes, the fluorescence image obtained in B tends to increase malignant tumors. Therefore, in the examples, when the Radio value was analyzed by G / R for the prostate, the results ranged from about 2.0 for benign tumors, 1.7 for healthy subjects, and 1.76 to 1.86 for malignant tumors. On the other hand, when the Radio value of the large intestine was analyzed by B / G, it had a range of 1.9 to 2.0 for malignant tumors, 0.2 to 0.8 for healthy subjects, and around 0.1 for benign tumors. It became.
  • BP 470 to 495 nm was used as a filter for excitation light on the molecular side, and BA 510 to 550 nm was used as a fluorescence filter.
  • the total pixel area is calculated as a molecule of Ratio by adopting pixels having a threshold value equal to or higher than a predetermined value in the fluorescence image obtained by using the mirror unit.
  • BP 460 to 480 nm was used as the excitation light filter on the denominator side
  • BA 495 to 540 nm was used as the fluorescence filter.
  • the total pixel area is calculated as the denominator of Ratio by adopting pixels having a threshold value equal to or higher than a predetermined value in the fluorescence image obtained by using the mirror unit.
  • the ratio of the above G-region numerator / G-region denominator was calculated and compared with the stage separately determined by the inspection, as shown in Table 1 below. From this, it was found that the results obtained by the method of the present invention are closely related to the malignant / benign and stage determined by the actual examination.

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Abstract

【課題】細胞アポトーシスにより血液中放出される断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）を疾病関連物質とし、血液等の体液から採取されるメチル化断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）の自家蛍光によりリキッド・バイオプシィ法により迅速にかつ容易に行う疾病の検出を行う方法の提供。　【解決手段】本発明はａ）試料中プラズモン金属メソ結晶領域を有する測定基板に、体液または細胞を含む培養液をそのまま又は希釈して作成した検体を接触させ、検体中の断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）を疾病関連物質としてプラズモン金属メソ結晶に電荷捕捉させる工程と、ｂ）このプラズモン金属メソ結晶上の捕捉された断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）に励起光を照射して、その自家蛍光を表面プラズモン増強効果により増強し、断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）の蛍光コロニーの蛍光画像を一定の測定領域（ＲＯＩ）を決め、励起光フィルタより長波長域のフィルタを介して蛍光コロニー画像を取得する工程と、ｃ）該蛍光コロニー画像の所定の閾値以上の輝度を示すピクセルを採択する工程と、ｄ）採択された測定領域の所定の波長域での所定の閾値以上のピクセルの総面積値、又は採択された測定領域の異なる２波長領域の、所定の閾値以上のピクセルの総面積値のratioを演算する工程を含む、断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）の自家蛍光によるリキッド・バイオプシィ法にある。

Description

アポトーシスにより細分化されたヌクレオソームを標的とする自家蛍光によるリキッド・バイオプシィ法
　本発明は、細胞アポトーシスにより血中に放出される細分化されるヌクレオソームを標的とし、その自家蛍光を表面プラズモン増強により励起して検出し、エピジェネティックス情報を、ガンを中心とする疾病情報の基礎とするリキッド・バイオプシィ法に関する。
　アポトーシス細胞ではＣＡＤ（カスパーゼ活性化ＤＮase）の阻害因子が分解され、活性化したＣＡＤがＤＮＡをヌクレオソーム単位で切断するので、およそ２００bpの倍数のＤＮＡとして断片化されるといわれる（非特許文献５）。この断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）はゲノムDNAが担う遺伝情報とエピジェネティクスの情報の双方を含む。即ち、ゲノムDNAが担う遺伝情報は塩基配列にあるが、塩基配列が同じでも異なる情報を示すことがある。すなわち、私たちの細胞内のＤＮＡは、ヒストンタンパク質に巻きついた形で存在しており、ヒストンタンパク質がアセチル化などの化学修飾を受けるとＤＮＡのありようが変化する。またＤＮＡ自身もメチル化などの修飾を受け、それによってはたらきが変わってくる。このような変化を示す遺伝情報をエピジェネティクスというが、一つの個体を構成する様々な細胞が、受精卵から受けついだ同じゲノムＤＮＡを持つにも関わらず異なる機能を発揮するのは、細胞のエピジェネティクスが異なるためである。エピジェネティクスの情報は、分子の付加や消去によってＤＮＡの構造を変え、ゲノムDNAにある遺伝子の発現をオン、オフする、いわばスイッチの役割を果たしている。つまり個体を構成する多様な細胞が正しく働くためには、各細胞の持つエピジェネティクスが重要であるとされる（東北大学教授：有馬隆博著「ヒトから知るエピジェネティクスと進化」）。そのため、自然発生の癌細胞のほとんどに、ＤＮＡメチル化とクロマチンの異常があるといわれ、癌細胞では、ゲノム全体のＤＮＡメチル化の低下が染色体不安定性を増大するとともに、プロモーター領域の高メチル化によって癌抑制遺伝子の発現が抑制されることが知られている。ゲノム全体の低メチル化と癌抑制遺伝子の高メチル化は、一見、逆の現象のように見えるが、トランスポゾン等のリピート配列に富むゲノム領域と遺伝子のプロモーター領域では、ＤＮＡのメチル化の制御機構が異なることを示唆している。また、核構造異常（核異型）は癌細胞に共通した特徴として知られているが、ゲノム全体の低メチル化によるクロマチンの変化を反映するものと推測されている。このように、癌化におけるエピジェネティックな制御異常は、癌細胞に共通の特性のひとつとして理解することができる。高メチル化された遺伝子の不活性化に関わるＭＢＤ１とzinc fingerタンパク質)、癌細胞で高発現して遺伝子制御を変化させるＭＣＡＦ１、癌細胞の悪性形質に関わる構造的クロマチン因子ＨＭＣＡ１とＨＭＧＡ２などに着目して、癌のエピジェネティックな異常について解析を進められており（熊本大学発生医学研究所教授：中尾光善著）、各細胞の持つエピジェネティクスを解析することは重要である。
　ところで、ガンの確定診断は、がん組織の一部を穿刺や内視鏡処理などによって採取し、その組織片の病理組織検査を行う、いわゆる生検法（バイオプシィ）によってなされるのが一般的である。多くの生検法（バイオプシィ）は出血や細菌感染の合併などのリスクを伴う侵襲的な処理であり、また、主要の部位によっては生検が困難なこともある。この課題を克服するために、血液や尿など容易に採取可能な検体を用いて病理診断に匹敵する精度で疾患診断をしようとする試みは、液体生検（リキッド・バイオプシィ）と呼ばれ、その迅速性および簡易性から臨床応用に適切なものとして非常に注目されている。このリキッド・バイオプシィの標的としては、ガン疾患の場合、血中循環腫瘍細胞（circulating tumor cells：ＣＴＣ）、末梢血循環腫瘍ＤＮＡ（circulating tumor DNA:ｃｔＤＮＡ）以外に、エクソソームや末梢血循環マイクロＲＮＡ（microRNA:　miRNA）など複数挙げられる。
　ここで、血中循環腫瘍細胞(CTC) は、原発腫瘍組織または転移腫瘍組織から上皮間葉転換 (EMT)を経て血中へ遊離し、血流中を循環する細胞であり、原発腫瘍部位から遊離した後、CTCは血液内を循環し、その他の臓器を侵襲して転移性腫瘍(転移巣)を形成する。このCTCはがん患者の末梢血に存在するため、これを検出することで転移の過程を判断し、治療の予後予測に役立てることができるとされ、期待される。ところが、その他の血液細胞と比較して、CTCはごく微量しか存在せず、検出が非常に困難であるという難点がある。他方、末梢血循環マイクロＲＮＡ（miRNA）やそれを含むエクソソームは特に早期診断への有用性が期待されている。なぜなら、マイクロＲＮＡは細胞内でタンパク質へと翻訳される前のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に相補的に結合し、そのｍＲＮＡの翻訳を阻害する、いわゆる遺伝子発現のファインチューナーとして様々な生命現象において重要な役割を担っており、ガン細胞ではマイクロＲＮＡの発現制御機構の破綻が生じ、例えば細胞増殖を促進するマイクロＲＮＡなどが高発現していることが知られるためである。また、近年、ほぼ全ての細胞が細胞外小胞（エクソソーム）を分泌しており、早期がん細胞が分泌したエクソソームを体液中から検出することで、早期がんの診断も可能であるとされるためである。したがって、エクソソームを解析対象としても疾患細胞由来のエクソソームを特異的に検出することが望まれるため、超遠心分離による回収に時間を要し、ハイスループット性に難がある。また、上記血中循環腫瘍細胞（CTCs, Circulating Tumor Cells）による診断技術を含め、この種リキッド・バイオプィシィ法は、がん患者検体（末梢血4mL)から赤血球を溶血させた後、CD45抗体ビーズを用いて血液細胞を除去し、サイトケラチン陽性、かつCD45陰性の細胞分画をソートする必要があり、短時間での解析が可能な臨床応用でのリキッド・バイオプシィ法の提供には限界がある（非特許文献１、２及び３）。
　そこで、本発明者らは、各細胞の持つエピジェネティクス情報を簡易に解析するため、鋭意研究の結果、アポトーシス細胞ではＣＡＤ（カスパーゼ活性化ＤＮase）の阻害因子が分解され、活性化したＣＡＤがＤＮＡをヌクレオソーム単位で切断するので、およそ２００bpの倍数のＤＮＡとして断片化される。このアポトーシス後の断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）はゲノムＤＮＡが担う遺伝情報とエピジェネティクスの情報の双方を含み、しかも、ヒストンタンパク質がアセチル化などの化学修飾を受けるとＤＮＡのありようが変化する一方、ＤＮＡ自身もメチル化などの修飾を受け、それによってはたらきが変わってくるといわれる。本発明者は、かかる断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）は、断片化された後もヒストンタンパク質に巻きついた形（細分化されたヌクレオソーム）で存在し、メチル化され、プラス電荷を有しており、血中で、マイナス電荷を示すプラズモン金属メソ結晶の表面に選択的に吸着捕集され、しかも表面プラズモン増強効果により増強されると、蛍光顕微鏡で確認できる所定以上の輝度を有する自家蛍光を発光して観測可能であることを見出した（図１）。因みに、ｐ５３を含むガン抑制遺伝子はエピジェネティクスによりメチル化されており、メチル化されたヌクレオソームを検出することはガン疾病情報として欠かせないにも関わらず、メチル化ヌクレオソームを選択的に捕集することは難しいことであった。しかもアポトーシス後の血中から捕捉される断片化ＤＮＡ、即ち、細分化されたヌクレオソームはバイオチップ上で幾分凝集してその発する自家蛍光コロニーは夜空の星座のように複数のコロニーとして観測され、小さいものでは、２５μｍ程度の広がり、大きいものでは１５０μｍ程度の広がりとして観測された。
　従前、細胞観察では自家蛍光は背景光となり、蛍光画像の信号雑音比（Ｓ／Ｎ比）を低下させることになる。そのため、内視鏡検査では標的を蛍光標識する方法が推奨され、蛍光画像から最良のデータを取得するためには、シグナル（蛍光標識されることが望ましいもの）とバックグラウンド（蛍光標識されることが望ましくない自家蛍光など）の差をできる限り大きくすることが必要であった（非特許文献６）。そのため、自家蛍光を用いる蛍光顕微鏡の細胞観測において、自家蛍光の蛍光強度でなく、蛍光のもう一つのパラメータである蛍光寿命を画像化することにより細胞観察することが行われるのが一般的であった（非特許文献７）。
ＷＯ２０１５／１７０７１１号公報 特開２０１１－１５８３６９号公報 ＷＯ２０１３／０３９１８０号公報
末梢血循環腫瘍細胞 Circulating Tumor Cells (CTCs) の検出：Circulating tumor cell isolation and diagnostics: toward routine clinical use. Cancer Res 2011;71:5955-60 Gorges TM, Pantel K:. Circulating tumor cells as therapy-related biomarkers in cancer patients. Cancer Immunol Immunother 2013;62:931-9. Permuth-Wey J et al., A Genome-Wide Investigation of MicroRNA Expression Identifies Biologically-Meaningful MicroRNAs That Distinguish between High-Risk and Low-Risk Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms of the Pancreas., PLoS One., 2015;10:e0116869. Ellen Heitzer, Peter Ulz and Jochen B. Geigl, Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer., Clinical Chemistry 2015; 61:112-123 Ｃｅｌｌ，２０１６Ｊａｎｕａｒｙ１４；１６４:Cell-free DNA comprises an in vivo nucleosome footprint that informs its tissues-of-origin 自家蛍光内視鏡の現況Ｖｏｌ．５８（４）Ａｐｒ．２０１６ 生物物理５３（３），１６６－１６９（２０１３）
　本発明者らは、鋭意研究の結果、疾患の発生により血液その他体液中にアポトーシスに代表される病理的な細胞死によって放出される断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）を検査の対象とすると、疾患との関連性が深いことに着目した（例えば発がんはガン遺伝子及びガン抑制遺伝子の異常により発生する遺伝子疾患であることは広く受け入れられている事実であるが、メチル化に代表される塩基への修飾によるエピジェネテックスな遺伝子異常によっても発がんすることが明らかになってきており、ガン抑制遺伝子の質的異常だけでなく、高メチル化による量的異常が発ガン機構に重要となっており、ガン細胞で高メチル化を受けるガン抑制遺伝子の活性不活化として、高メチル化したＲＢ遺伝子、ｐ１６以外にｐ１４並びにｐ５３の不活化は発ガン機構として注目されている：曽和義弘、酒井敏行著癌とエピジェネティクス）ので、その高メチル化ガン抑制遺伝子を含む、断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）を選択的に捕捉し、その量的異常を検出することはガン検診としては重要である。しかもそれらは蛍光画像では図１に示す夜空の星座のように複数のコロニーが観測されるので、プラズモン金属メソ結晶の表面プラズモン増強効果により増強されると、蛍光顕微鏡で確認できる所定以上の輝度を有する自家蛍光を発光し（図１）、所定以上の輝度を示す画素、ピクセルを採択して分析すると疾病に関し、正診率の高い結果が得られることを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明が解決しようとする課題は、アポトーシスによって血中に放出される断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）を標的とし、組織検体を用いたヒストン修飾解析、クロマチン構造解析により、各種疾病、特にがんの発症につながる、腫瘍の検出や診断を、疾病関連物質として、断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）の自家蛍光によるリキッド・バイオプシィ法により迅速にかつ容易に行うための検出方法を提供することにある。
　本発明は、ａ）試料中プラズモン金属メソ結晶領域を有する測定基板に、体液または細胞を含む培養液をそのまま又は希釈して作成した検体を接触させ、検体中の断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）を疾病関連物質としてプラズモン金属メソ結晶に電荷捕捉させる工程と、ｂ）このプラズモン金属メソ結晶上の捕捉された断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）に、レーザ光源による単波長の励起光またはＬＥＤ光源などからの励起光をフィルタを介して取得する一定波長幅の励起光を照射して、その自家蛍光を表面プラズモン増強効果により増強し、断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）の蛍光コロニーの蛍光画像を一定の測定領域（ＲＯＩ）を決め、励起光フィルタより長波長域のフィルタを介して蛍光コロニー画像を取得する工程と、ｃ）該蛍光コロニー画像の所定の閾値以上の輝度を示すピクセルを採択する工程と、ｄ）採択された測定領域の所定の波長域での所定の閾値以上のピクセルの総面積値、又は採択された測定領域の異なる２波長領域の、所定の閾値以上のピクセルの総面積値のratioを演算する工程を含むことを特徴とする自家蛍光によるリキッド・バイオプシィ法にある。
　本発明において、励起光はレーザ光源による単波長の励起光またはＬＥＤ光源などからの励起光をフィルタを介して取得する一定波長幅の励起光が使用される。観測される蛍光コロニーから所定の輝度の領域を採択するにあたり、ＲＯＩを採用する。そして、蛍光コロニー中の所定の閾値以上の輝度のピクセルを採択するのは測定精度を上げるためである。また、本発明において、演算工程では、二値化して採択した所定以上の輝度の蛍光コロニーのピクセルを採択しその総面積を演算する。又は、異なる二波長域の総面積の比率（ratio値）を演算する。所定以上の輝度を有するピクセルがエピジェネティックス情報に応答するためであり、異なる二波長域の比率を求めるのはこの断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）はゲノムDNAが担う遺伝情報とエピジェネティクスの情報の双方を含むためエピジェネティクスの情報のみをできるだけ採択するためである。したがって、閾値以上の蛍光を発する蛍光コロニーのピクセルを採択し、その総面積値又は異なる二波長領域の比率（ratio値）から少なくとも２段階ガンリスクあり、ガンリスクなしに分け、又は3段階、ガンリスクあり、要観察、ガンリスク低い、に分け、リスク判定が可能となる。他方、採択されるＲＧＢの波長域は、Ｇ又はＢ領域が好ましく、Ｇ／Ｂ又はＢ／Ｇの比率を演算するのが好ましい。蛍光コロニーの分光スペクトルを観測すると、Ｂ又はＧ領域に疾病、特にがんに特有のピークが観測されるからである。
　また、本発明において、検出対象として、捕捉される標的は、活性化したＣＡＤ（カスパーゼ活性化ＤＮase）がＤＮＡをヌクレオソーム単位で切断した、およそ２００bpの倍数の断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）であって、ゲノムＤＮＡが担う遺伝情報とエピジェネティクスの情報の双方を含むものであり、エピジェネティクスの情報のみを取り出しやすくするため、比率判定を行うのが好ましい。この方法は、捕捉した断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）をＢ又はＧ領域の同一又は異なる二波長域の励起波長で励起されて蛍光コロニーを得、該蛍光コロニーを異なる二波長域のフィルタを介して採取し、そこから採取したピクセルの各総面積値のratioがＢ領域／Ｇ領域又はＧ領域／Ｂ領域であるリッキド・バイオプシィ法である。
　検体である体液としては、リンパ液あるいは血液から分離した血漿または血清であって、断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）が、ヒストン蛋白に結合してプラス電荷を示すので、選択的に捕捉が可能である。また、検体が、ｉＰＳ細胞であるときは、ｉＰＳ細胞のがん化の識別を行うことを対象とする。
　本発明によれば、第１に、疾病関連物質である、活性化したＣＡＤ（カスパーゼ活性化ＤＮase）がＤＮＡをヌクレオソーム単位で切断した、およそ２００bpの倍数の断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）を選択的に捕捉し、通常、蛍光診断においてノイズとなる自家蛍光を表面プラズモン増強効果により顕在化して所定の閾値以上の輝度の蛍光コロニーを採択し、所定の閾値以上の蛍光コロニーの総面積値、又はＲＧＢ及びそれと相関する2波長比でratio値を演算することにより、疾病の診断、特にがん患者、良性腫瘍患者、健常者の識別を可能とする。一般に、生体タンパクは自家蛍光を有するが、この自家蛍光は標的の蛍光観察においては、シグナル（蛍光標識されることが望ましいもの）のバックグラウンド（蛍光標識されることが望ましくない自家蛍光など）を形成し、ノイズとなる。しかしながら、この生体タンパクの自家蛍光は生体タンパクその物の構造を反映しているので、自家蛍光による構造解析は以下の点で特に有効である。即ち、近年、これまでに行われた解析結果から、がん細胞の発生・進展過程では、ゲノム変化だけでなくエピゲノム変化も多数蓄積しており、エピゲノム修飾は、化学的制御と物理的制御に大別される。化学的制御の代表が「ヒストンコード」と称される種々のヒストンテールの修飾である。ヒストンテールの数十に及ぶアミノ酸に対して修飾が報告されてきたが、こうした修飾単独あるいは組み合わせを認識するクロマチン結合タンパク（reader）が転写制御を担っている。一方、物理的制御としては、一次 (ヌクレオソーム) および高次よりなるクロマチン構造が重要であるとされる。クロマチン構造は正常な細胞分化・発生の過程でダイナミックに変化し (クロマチンリモデリング)、この時空間的な制御が必須であるだけでなく、制御異常が発生異常や癌化などの疾患にも関与しているので、ヒストン修飾では、遺伝子発現を正に活性化する領域（エンハンサー領域）に特徴的にみられるH3リジン27のアセチル化(H3K27ac)及びメチル化が注目される。遺伝子発現状態は転写開始点が存在するプロモーター領域のクロマチン状態とよく相関するが、細胞系譜に特有の遺伝子発現調節においては、エンハンサーのクロマチン状態も深く関与している。また、最近では、H3K27acを指標とするエンハンサー領域が、遺伝子の立体構造形態 (ゲノムトポロジー) においても重要なことが示されている。したがって、臨床組織検体を用いた自家蛍光の観測により、ヒストン修飾解析、クロマチン構造解析により、ガンの早期診断及びがん部位の特定の可能性が示唆される。即ち、細胞遊離ＤＮＡが結合したタンパク結合体はＤＮＡがヒストンに巻き付いてヌクレオソームを形成し、ヒストンタンパクがメチル化されると、ヌクレオソーム内のＤＮＡを安定化させる。さらに、ＤＮＡのメチル化異常はがん抑制遺伝子が不活性化され、がん発症の原因となるとされる。したがって、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含め、アポトーシスにより、血液中に細胞から放出される細胞遊離ＤＮＡ（cfＤＮＡ）を採取して解析することは極めて期待されるリキッド・バイオプシィの標的である。しかしながら、血液中のｃｔＤＮＡを含め、遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を捕集することは極めて困難であり、微量であるためＰＣＲが検出の基本になり、変異特異的ＰＣＲとデジタルＰＣＲに大別されて検査されている（非特許文献５）。本発明では、ＤＮＡは通常マイナス電荷を示し、プラス電荷を示すヒストン蛋白と強く結合し、マイナス電荷を示すプラズモンナノ金属結晶に捕捉される性質を有することに鑑み、これをチップで捕捉し、ラマンスペクトル分光法で検出することを試みた。しかしながら、チップ上に捕捉されるＤＮＡと結合するヒストンタンパク結合体はアポトーシスにより細かく分断されて捕捉されるため、極めて小さく、この捕捉物質を励起光で適切に励起し、増強されて反射されるラマン光を検出することは極めて難しく、簡易迅速にリキッド・バイオプシィ法にて結果を知ることが困難であった。ところが、遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む疾病関連物質、断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）の自家蛍光を表面プラズモン増強効果により顕在化し、所定以上の閾値の輝度を有する蛍光コロニーを基準とすると、総面積値、又はＲＧＢ及び／又はそれと相関する2波長比でratio値を演算することにより、疾病の診断、特にがん患者、良性腫瘍患者、健常者の識別を可能とすることがわかった。
　第２に、本発明によれば、疾病関連物質の選択的捕捉は次のように行われる。
標的とすべき断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）は、ｃｔＤＮＡを含む、細胞遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）がヒストンタンパクと結合して最小単位のヌクレオソームまたはそれが高次化したクロマチンとして血中に存在してくる。しかも、ヒストンに巻き付いたＤＮＡはヒストンタンパクと結合し、メチル化することで安定に存在する（前記癌とエピジェネチックスにより、ガン細胞から高メチル化した各種ガン抑制遺伝子：高メチル化したＲＢ遺伝子、ｐ１６以外にｐ１４並びにｐ５３が含まれる）。したがって、プラス電荷を示すチップを提供することで、これらを選択的に吸着または捕捉することができる。かかるチップ上に捕捉される物質は特定の励起光により自家蛍光を表面プラズモン効果で顕在化して現れ、これらを蛍光顕微鏡で分析すると、その蛍光波長により、健常者、がん患者、その他の疾患患者を識別できることを見出した。すなわち、健常者の細胞からも細胞遊離ＤＮＡがアポトーシスを介して血中に放出されるが、がん細胞からは腫瘍細胞遊離ＤＮＡが放出され、これらはそれ自身のメチル化及びヒストンのメチル化で強固に結合し、他の疾患細胞からは疾患特有の断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）を放出する。これら健常者、がん患者、その他の疾患患者の細胞から放出されるＤＮＡはgeneticな遺伝子異常だけでなく、塩基への修飾によるepigeneticな遺伝子異常が発生しており、各細胞からの放出される断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）には化学的又は物理的に相違が見られる。その結果、健常者、がん患者、その他の疾患患者の細胞から放出される断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）に自家蛍光の波長に相違がみられることを見出した。また、がん患者から採取したがん関連物質の蛍光波長をより詳細に分類すると、エピゲノム修飾が、その化学的制御と物理的制御に大別され、影響を受けるため、がん原発部位、転移部位により蛍光波長スペクトルまたはスペクトルピークが異なってくる（分光スペクトルによると、がん患者の断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）には５１５ｎｍ付近にわずかなピークが観測された）。したがって、採択された所定の閾値以上の蛍光コロニーの総面積値、又は2波長域での、採択された所定の閾値以上の蛍光コロニーの総面積値比でratio値を演算することはガンを含め、各種疾病の評価に極めて有効である。
　第３に、細胞のアポトーシス等の病理的分解により体液、特に血漿又は血清中に放出されるＤＮＡがヒストンタンパク等と結合してタンパク結合体を形成するが、本発明によれば、タンパク結合体の自家蛍光をプラズモン増強により顕在化して蛍光顕微鏡で観察し、疾病の早期診断に役立てることができる。なぜなら、タンパク質の翻訳後修飾異常が種々の疾患の発現と関係するが、がんや生活習慣病，感染症など様々な疾患患者検体に対し簡易迅速にプロテオーム解析を行うことができるからである。本リキッド・バイオプシィ法では、疾患に伴う翻訳後修飾異常の解明が，臨床の現場において即時実行され、治療方針を決定し、個別化医療を実現するための診断バイオマーカとなるばかりでなく，新たな治療薬を開発するための創薬方針の決定時に極めて重要な指針を与える。一般にペプチドの分析においてはサンプルの前処理技術や，修飾基特異的な濃縮技術の改良など，まだ多くの課題が残されているが、本法を活用することにより，翻訳後修飾異常と疾患との関係の解明に役立つ。
本発明によれば、具体的に、これら断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）は疾患の発生により血液その他体液中にアポトーシスに代表される病理的な細胞死によって放出されるため、疾患との関係が深い。特に、アポトーシス後のヌクレオソーム自体の自家蛍光の特徴が悪性腫瘍ではブルー（B）領域の自家蛍光が強く、良性腫瘍ではグリーン（G）領域の自家蛍光が強く現れるため（図9）、ブルー（B）領域とグリーン（G）領域の輝度の高い面積値をRatio値（B/G又はG/B）で見ると、健常者、良性腫瘍、悪性腫瘍の識別をすることに成功し、ガンの超早期診断、再発判定、転移判定、治療効果のモニタリングが可能となることが分かった（図10）。アポトーシス後の細分化されたヌクレオソームは遺伝子異常により発生するメチル化ヌクレオソームの検出を可能とするため、図11に示す多段階発がん仮説モデルに示すように、本発明の検査レベル（Proteo検査レベル）は現在の画像診断レベル（PET-CT,CT,MRI）以前のガン関連物質の検出に基づき、超早期発見が可能となることがわかった。
図１はオリンパス製ＤＭ（ダイクロイックミラー）４０５－４４５／５１４を用い、得られた蛍光画像を示し、各サンプル毎の輝度の高いポイントを１０点を採択する方法を示す。 図２はオリンパス製ＤＭ４０５－４４５/５１４を使用して取得した４７０－４９０ｎｍ及び６００－６２０ｎｍの画像を示す。 図３はＢＳ１０/９０使用して取得した分光スペクトルを示すグラフである。 図４はシリカゲル乾燥容器で、（ａ）は血液を遠心分離して得た結晶の滴下状態、（ｂ）はシリカゲルで容器内で血漿を乾燥させた状態を示す。 本発明第1法の第1工程Ａ：測定チップ（プロテオチップ）の作成の説明図、 第2工程Ｂ：プロテオチップの解析範囲の決定の説明図、 第3工程Ｃ：プロテオチップの（採択した蛍光コロニー）の面積の数値化の説明図である。 本発明第2法の画像取得工程（１）→解析範囲決定工程（２）→蛍光コロニー採択工程（３）→ＲＧＢ蛍光画像における採択コロニーの合計面積値の算出工程（４）→得られたＲＧＢ合計面積からＢ／Ｇ，Ｇ／ＲなどのＲａｔｉｏ値の作成工程（５）を示す説明図である。 本発明方法を自動的に行う場合に採用される顕微鏡ステージの説明図である。 本発明のＲａｔｉｏ演算方法の概念図を示す。 遠心分離した上澄み液（血漿部分）に存在する断片化したヌクレオソームを本発明のプロテオチップを用いてその自家蛍光を測定した場合の解析方法の説明図である。 図９の方法で識別できる健常者、良性腫瘍、悪性腫瘍のRatio値の分布を示すグラフで、ｙ軸高さはＢ領域／Ｇ領域の比率、ｘ軸は検体数を示す。 本発明の断片化ヌクレオソームを検出する場合の検査レベルと現状の画像診断（PET-CT,CT,MRI）を使用する場合の検査レベルを比較する多段階発がん仮説モデルの比較解説図である。
　本発明に係るリキッド・バイオプシィ法の実施に当たっては、第1法では次の工程を採用するのが好ましい。第１法ではレーザからの単波長励起光またはフィルタで採択した一定波長幅の励起光で捕捉した断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）を励起し、その蛍光コロニーの所定閾値以上のピクセルの総面積を計測する。
使用機器：キーエンス社、蛍光顕微鏡BZ-X710
光源：メタルハライドランプ８０W
蛍光フィルタ：BZ-XフィルタDAPI（４６０±２５nm）
解析ソフト：BZ-X　Analyzer
ａ）がん関連物質の選択的捕捉工程：図5Ａ
試料中表面マイナス電荷を示すプラズモン金属メソ結晶領域を有する測定基板：プロテオチップ（図5Ａ（１））に、体液または細胞を含む培養液をそのまま又は希釈して作成した検体を接触させ（図5Ａ（２））、検体中のプラス電荷を示すタンパク結合体を疾病関連物質としてプラズモン金属メソ結晶に電荷捕捉させる（図5Ａ（３））工程
ｂ）蛍光画像取得工程：
　　（１）　がん関連物質が付着したプロテオチップを蛍光顕微鏡にセットし、明視野画像を見ながらチップの測定位置（X,Y軸）を決めて、オートフォーカスボタンをクリックしてチップのフォーカス（Z軸、ピント）を合わせる。測定設定をBZ-XフィルタDAPIに切り替えて蛍光画像の測定を開始する。
このプラズモン金属メソ結晶（直径約８ｍｍ）上に捕捉されたタンパク結合体に励起光を照射して、捕捉タンパク結合体の自家蛍光を表面プラズモン増強効果により増強し、蛍光コロニーを蛍光画像（図5Ｂ）として取得する工程
ｃ）蛍光コロニーの採択工程：
解析範囲（直径５ｍｍ）内にある蛍光コロニーの輝度を二値化して所定の閾値以上の輝度の蛍光コロニーを採択する工程
ｄ）演算工程：
採択された所定の閾値以上の蛍光コロニーの総面積値（図5Ｃ）を算出する。ここでは、蛍光の強い物質（青色の付着物、以下の測定条件では輝度値に基づいて二値化閾値１３以上とする）を採択し、その面積値を計算する（単位μｍ２）。
面積値から０～１９９９９をガンリスクの低い場合A、２００００～２９９９９を要観察B、３００００～ガンリスクありの３段階に分類して判定する。
　図6は本発明の第2法である、蛍光画像からある閾値以上の蛍光コロニーを採択し、ＲＧＢ及び／又はそれと相関する2波長比でratio値を演算する方法である。図6（１）では1検体につき、ＲＧＢの３枚の蛍光画像を取得する。次いで、解析範囲を決め、ＲＯＩで囲う（図６（２））。ここで、閾値として「蛍光コロニーの円形度及び輝度」を用い、解析条件を決め、ごみ等を除外する（図６（３））。その後、ＲＧＢの蛍光画像から採択した蛍光コロニーの合計面積値を算出する（図６（４））。詳しくは以下の通りである。
　一般的な蛍光測定は蛍光色素をつけてその色素特有の蛍光波長で観察するのが一般的である。励起波長や蛍光波長は色素の種類により決まっている波長を設定し測定する。色素を用いた蛍光測定は色素の蛍光を見ていて、物質そのものの自家蛍光を見る測定法ではない。
　一方、自家蛍光は物質そのものの化学組成や化学構造、官能基、修飾化合物、生物学的構造などで発すると考えられる。つまり、自家蛍光はそれぞれ物質固有の蛍光波長を持っていると考えられる。本発明ではがん関連物質固有の自家蛍光を見る。一般的な色素の波長ではなくがん関連物質固有の自家蛍光の波長を複数の励起光から測定する方法である。がん関連物質固有の自家蛍光を直接測定するための最適な励起光と蛍光波長を特定した。がん関連物質の自家蛍光を分光しその蛍光波長を分析した結果から、強い自家蛍光を発するRGBの励起光とRGBの自家蛍光の測定する波長を決めた。光源にはLED光源を使用し、オリンパス正立顕微鏡BX-63に蛍光波長フィルタをつけて測定する蛍光波長を限定し蛍光画像を取得した。
具体的には
Bの励起光は375～400nmで蛍光波長は460±25nmの範囲
Gの励起光は470～495nmで蛍光波長は510nm以上の長波長の範囲
Rの励起光は530～550nmで蛍光波長は575nm以上の長波長の範囲である。
Bはがん関連物質の自家蛍光が強く発する励起光と蛍光波長で、Gは良性疾患の自家蛍光が
強く発する励起光と蛍光波長である。がん関連物質が付着したバイオチップをオリンパス正立顕微鏡BX-63にセットし、LED光源と蛍光波長フィルタを上記Bの設定にする。バイオチップのリアルタイム蛍光画像を見ながらフォーカス（Z軸）を合わす。フォーカス（Z軸）と測定位置（X,Y軸）が決まれば、Bの設定の蛍光画像を測定する。次に、LED光源と蛍光波長フィルタを上記Gの設定にし、フォーカス（Z軸）を合わせ先ほどのB設定と同じ測定位置（X,Y軸）に合わし、蛍光画像を測定する。測定位置（X,Y軸）を合わすことにより、チップの同じ位置の同じがん関連物質のそれぞれの蛍光画像を取得することが出来る。同じようにR設定のLED光源と蛍光波長フィルタにして、同じ測定位置（X,Y軸）の蛍光画像を測定する。
解析法
イメージングソフトウェア「cellSens」（日本オリンパス光学社製）を使用して解析を行った。
それぞれの励起光で測定した3種類の蛍光画像のバイオチップに付着した同じ位置の同じがん関連物質をROIで囲って解析範囲を決め、下記RGBの設定範囲の物質の面積値を算出する。Bは輝度値28000～50000の範囲の付着物を選択し、また円形度0.3以下の付着物を除去する設定とした。
Gは輝度値27000～50000の範囲の付着物を選択し、また円形度0.3以下の付着物を除去する設定。
Rは輝度値21000～50000の範囲の付着物を選択し、また円形度0.3以下の付着物を除去する設定。
この輝度値設定範囲は付着物質の自家蛍光の蛍光強度やLED光源の光の強度により範囲を設定した。また円形度0.3で解析することにより、解析ソフトが自動でいびつな形状の異物を除去し解析精度を上げる設定にした。輝度値の範囲は10000～70000の範囲で好ましくは20000～50000程度の範囲で、円形度の範囲は0.9～0の範囲で、好ましくは0.3程度である。蛍光コロニーの状況に応じてこの円形度は調整される。この測定および解析設定により算出されたRGBの面積値からB/G、G/Rなどの2波長比のRatio値を算出し、大腸に関してはB/GのRatio値で悪性腫瘍が1.9～1.0の幅を持ち、良性腫瘍で0.1前後、健常者で0.2～0.8となった。
　このように励起光を分けて蛍光測定をすることにより、各励起光におけるより強い自家蛍光の蛍光画像を得ることが出来る。この手法により、バイオチップ上の同じ位置の同じがん関連物質を違う設定の励起光、蛍光波長で測定し解析することより、物質固有の自家蛍光をより多く引き出すことが出来、データの精度を向上することができた。
　図７は４枚のプロテオチップ（測定基板）をホルダーにセットして測定を自動化する場合の顕微鏡ステージのイメージ図を示す。チップ（１）～（４）の測定位置（Ｘ軸、Ｙ軸）を事前に登録し、チップ（１）～（４）のフォーカス（ｚ軸）はそれぞれ主導で合わせる。Ｘ，Ｙ及びＺ軸が決まれば、チップ４枚のＲＧＢ３種類の測定が自動で行われ、４枚のＲＧＢ蛍光画像が得られる。
　検体である体液はリンパ液あるいは血液から分離した血漿または血清であるだけでなく、尿、唾液等を含み、タンパク結合体が、ヒストン蛋白に結合してプラス電荷を示す、細胞遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含み、該細胞遊離ＤＮＡは細胞から遊離した循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む。疾病関連物質を捕捉するプラズモン金属メソ結晶を励起する光源は腫瘍親和性蛍光物質を励起するのに使用される４０５ｎｍの波長の励起光を使うのが好ましく、その場合に６３０ｎｍ前後に蛍光波長を観測することができるので、本発明においてもガン関連物質のタンパク結合体の自家蛍光の特徴として６３０ｎｍ前後のピーク波長に着目するのが好ましい。本発明で捕捉したタンパク結合体は循環腫瘍DNA（ｃｔＤＮＡ）を含み、ヒストンタンパクと結合したヌクレオソームまたはそれが高次化したクロマチンであって、ヒストンがメチル化の修飾を受けると、自家蛍光によるリキッド・バイオプシィ法のガン診断の標的となる特徴を有している。
　「試料中表面マイナス電荷を示すプラズモン金属メソ結晶を有するチップ」
　本発明方法で用いるプラズモン金属メソ結晶領域を有する基板をプロテオチップという。その製造方法は、以下の通りである（特許文献１参照）。
　１）金属錯体水溶液を錯体を形成する金属より卑なる電極電位（イオン化傾向の大きい）金属基板上で電極電位差により化学還元して量子結晶（ナノサイズの金属錯体結晶）を凝集させている。銀錯体の場合、チオ硫酸銀水溶液を銀より卑なる電極電位（イオン化傾向の大きい）の銅または銅合金上で凝集させることにより銀錯体の量子結晶を化学還元法を採用して形成している。詳しくは、金属錯体の水溶液中の濃度は主として形成する量子結晶のサイズを考慮して決定すべきであり、分散剤を使用するときはその濃度をも考慮するのがよく、通常、１００ｐｐｍから５０００ｐｐｍの範囲で使用できるが、配位子の機能にも依存してナノクラスタというべきナノサイズを調製するには５００から２０００ｐｐｍの濃度が好ましい。
　２）量子結晶を形成する金属錯体は担持金属の電極電位Ｅと相関する式（Ｉ）で示される錯体安定度定数（ｌｏｇβ）以上を有するように選択される。
　　　　式（Ｉ）：Ｅ゜＝（ＲＴ／｜Ｚ｜Ｆ）ln（βi）
（ここでＥ゜は、標準電極電位、Ｒは、気体定数、Ｔは、絶対温度、Ｚは、イオン価、Ｆは、ファラデー定数を表す。）
　ここで、金属錯体が、Ａｕ、Ａｇ、ＰｔまたはＰｄから選ばれるプラズモン金属の錯体である場合は、励起光に対して局在表面プラズモン共鳴増強効果を有する。特に、金属錯体が銀錯体であるときは、安定度定数（生成定数）（ｌｏｇβi）が８以上の銀錯化剤とハロゲン化銀との反応により形成されるのがよく、ハロゲン化銀としては塩化銀が好ましく、錯化剤としてはチオ硫酸塩、チオシアン酸塩、亜硫酸塩、チオ尿素、ヨウ化カリ、チオサリチル酸塩、チオシアヌル酸塩から選ばれる１種であるのが好ましい。銀錯体は平均直径が５～２０ｎｍであるナノクラスタからなる量子ドットを有し、量子結晶のサイズが１００～２００ｎｍとなる。
　３）本発明で用いるプロテオチップにおける、プラズモン金属メソ結晶とは、プラズモン金属錯体の量子結晶の酸化物であり、血中でプラスに帯電するメチル化ヌクレオソームを電荷で補足するに必要なマイナス帯電で、励起光の照射により表面プラズモン増強効果を発揮し、補足したメチル化ヌクレオソームの自家蛍光を増強する効果を有するものをいう。銀錯体量子結晶の場合、アルカリ処理（次亜塩素酸ナトリウム水溶液で処理）すると、以下の反応により銀ハロゲン化物を核として過酸化銀を含み、銀酸化物の複合物の針状ナノ結晶群が形成されるものと思われ（特許文献１の図５）、しかも水中で（－）荷電を帯びる一方、ＤＮＡが巻き付いたヒストンが（＋）荷電を帯びるため（特許文献１の図７(a)）、この遊離ヌクレオソームに代表される正電荷を帯びたがん関連物質を選択的に吸着することが見出された。しかも過酸化銀を含む銀酸化物の針状ナノ結晶群は、レーザ光に代表される励起光の照射により表面プラズモン増強効果を示し、吸着されたヒストンに代表されるがん関連物質の自家蛍光を検出するのに好ましいことが見出されている。
Na2S2O3+４NaClO＋H2O→Na2SO4+H2SO4(2NaHSO4)＋４NaCl
Ag++NaCl→　AgCl　＋　Na+
Ag+＋３NaOCl→　２AgCl　＋　NaClO3　＋　2Na+
Ag++OH-　→　AgOH
２Ag+＋　２OH-　→　Ag2O＋H2O
　４）本発明の銀酸化物の複合針状ナノ結晶群は、過酸化銀を含む銀酸化物が自己組織化してニューロン状の三次元超構造体（メソ結晶）を形成するもので（特許文献１の図８及び９）、銀イオン水溶液をAg/AgCl電極を用いて定電位電析を行って、又は銀の量子結晶をアルカリ処理で酸化することにより形成することができるが、銀錯体量子結晶、例えばチオ硫酸銀量子結晶をアルカリ処理（次亜塩素酸ナトリウム水溶液で処理）することによって容易に形成することができる。
　５）疾病関連物質を吸着することができる限り、蛍光標識マーカーの高度検出と感度と迅速性を実現するピッチ３５０ｎｍの周期構造をもつ基板に銀と酸化亜鉛の薄膜を成膜してなるプラズモニックチップ（特許文献２）や金属ナノ粒子を有機溶媒中に分散させ、有機溶媒を揮発させて金属ナノ粒子を二次元方向に自己組織化して粒系の揃った銀ナノ微粒子からなる局在プラズモン蛍光増強シート（特許文献３）を用いてもよい。
「本発明で用いる検体」
　血液を含む体液から検体を作成する。赤血球は強い自家蛍光を示すので、遠心分離して血漿をのみを取り出すのがよい。疾患関連物質としてガン疾患の場合は、１０～５０倍希釈して断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）の自家蛍光を測定しやすくするように希釈率を決定する。リン青銅上におよそ１０００ｐｐｍのチオ硫酸銀錯体水溶液を滴下して作成したチオ硫酸銀錯体量子結晶をアルカリ処理して酸化形成した銀酸化物メソ結晶に対しては２０～３０倍希釈が望ましい。細胞の場合は機械的破砕がその物性を変化させないので好ましい。そして、ここで都合のいいことには、断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）は安定なタンパク結合体（Protein-bound DNA fragments: nucleosome or chromatin）を形成し、比較的強い正電荷を示す。それ故、負電荷を示し、かつ励起光により表面プラズモン増強効果を示すプラズモン金属メソ結晶に選択的に捕捉され、しかも断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）は安定であるため、真空乾燥又は乾燥剤（シリカゲル）乾燥後保存して蒸留水等に再溶解しても乾燥前のタンパク結合体の自家蛍光の特徴を再現することができる。乾燥剤（シリカゲル）乾燥ではこれは現場での採血、遠心分離での血漿の採取だけでなく、図４に示すように、容器内で乾燥させ、郵送での検査依頼を可能とするものとなる。また、全ての疾患には異常たんぱく質の蓄積を原因とする場合が多く、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病などの神経変性疾患に共通する特徴は、神経細胞内に凝集した異常タンパク質の蓄積によるものである。異常タンパク質は細胞毒性を持つため、神経細胞変性や細胞死を引き起こす。ほとんどの異常タンパク質は、ユビキチン化によって目印がつけられプロテアソームで分解されるが、プロテアソームは凝集した異常タンパク質を壊すことができず、神経変性疾患における神経細胞では、ユビキチン化された異常タンパク質の凝集体が蓄積していることから、異常タンパク質の検出ががん以外の疾病関連物質の検出として、リキッド・バイオプシィ法を用いて可能であることが示唆されるところである。さらに、ｉＰＳ細胞はガン化遺伝子ＤＮＡを含む場合があるので、検体とし、以下の自家蛍光で、ｉＰＳ細胞のがん化の識別を行い、除去することもできる。
「蛍光画像取得工程」
　ここでは、上記プラズモン金属メソ結晶基板上に捕捉された断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）に励起光を照射して、捕捉断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）の自家蛍光を表面プラズモン増強効果により増強し、蛍光コロニーを蛍光画像として取得する。
　励起光としては正常組織と病変組織でその集積・排出特性が異なるヘマトポルフィリン誘導体（腫瘍親和性蛍光物質）を励起するに適するとされる４０５ｎｍの励起光のレーザ光源を用いた。タンパク結合体は血液を採取して遠心分離にかけ、得られる血漿を蒸留水で３０倍希釈して用いた。
　ｃ）蛍光コロニーの採択工程：
　オリンパスＤＭ（ダイクロイックミラー）４０５－４４５／５１４を用い、図１の結果が得られたので、各サンプル毎の輝度の高いポイントを例えば１０点（疾病に応じ、採取ポイント数は決められる）抽出し、中心付近に円形のＲＯＩを作成し、スペクトルデータを算出した。蛍光コロニーの１０点採択は専用ソフト「cellSens」で二値化し、所定の閾値以上の輝度の蛍光コロニーを採択する。
　その他の画像取得条件は次の通りである。
レーザ：　４０５ｎｍ　５０％
対物レンズ：　１０倍（ＭＰＬＦＬＮ１０×）
ピンホール径：５００ｎｍ
取得波長：４６０－５０４ｎｍ
スリット幅：４ｎｍ
ステップ：２ｎｍ
解像度：１０２４×１０２４
平均化：４回
　ｄ）演算工程：
　採択された所定の閾値以上の蛍光コロニーのピクセルの総面積値、又はＲＧＢ及びそれと相関する2波長域でのピクセルの総面積比でratio値を演算する。
その結果、総面積値ならびに異なる波長域の総面積のＲatio値により健常者、良性腫瘍、悪性腫瘍を識別することができる。また、Ｒ、Ｇ、Ｂの2波長の比率及びそれと相関する2波長の比率（ｒａｔｉｏ）により健常者、良性腫瘍、悪性腫瘍を識別する。
　オリンパス製ＤＭ４０５－４４５/５１４を使用して４７０－４９０ｎｍ及び６００－６２０ｎｍの画像を取得し、Ｒａｔｉｏ値に変化があるかどうか確認した結果、図２の結果を得た。前立腺に関し、Ｇ/Ｒで良性腫瘍の場合２．０前後、健常者で１．７０前後、悪性腫瘍で１．７６を超え、１．８６までの幅を持ち、ステージとの関連を示すことがわかった。この結果はサンプル数の増加によりデータ精度を向上させることができる。
　また、ポイントごとの輝度が異なるため、各波長での輝度を４７０ｎｍの輝度を１００％とした割合にて表示し、１０ポイントの平均値をサンプル毎のデータとしてグラフを作成した。また、図３のように６１０nm前後の波長にがん関連物質のピークが存在することを確認できた。
「標的対象とその蛍光顕微鏡で観測される捕捉標的対象の自家蛍光画像」
　本発明ではガン疾患及びその他の疾患で異常に発生する断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）を検出対象とする。この種疾患に関連するタンパク結合体は、正電荷を有することよりプラズモン金属メソ結晶に選択的に捕捉され、励起光の照射によりプラズモン金属メソ結晶の表面プラズモン増強効果により増強され、蛍光顕微鏡で確認できる所定以上の輝度を有する自家蛍光を発光することが見出されている（図１）。これらのタンパク結合体は疾患の発生により血液その他体液中にアポトーシスに代表される病理的な細胞死によって放出され、図１に示す夜空の星座のように複数のコロニーが観測され、小さいものでは、２５μｍ程度の広がり、大きいものでは１５０μｍ程度の広がりとして観測される。アポトーシス細胞ではＣＡＤ（カスパーゼ活性化ＤＮase）の阻害因子が分解され、活性化したＣＡＤがＤＮＡをヌクレオソーム単位で切断するため、およそ２００bpの倍数の断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）として捕捉されるためである。詳しくは、ヒト血漿中の細胞遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）はヒストンまたはＴＦと関連するタンパク質結合として血中に放出され、優先的に生き延び、健常者では主に骨髄系リンパ系の細胞系に由来するが、特定の病状では１つまたは複数のさらなる組織からの寄与が考えられており、がんなどの病理学的状態におけるｃｆＤＮＡから細胞タイプを推測するヌクレオソームの足跡（footprint）を含み、その組織の起源を知らせる（非特許文献５：Ｃｅｌｌ，２０１６Ｊａｎｕａｒｙ１４；１６４:Cell-free DNA comprises an in vivo nucleosome footprint that informs its tissues-of-origin）が明らかにされている。因みに,腫瘍の悪性度がより高度な懐死に結び付き、循環血液中に腫瘍ＤＮＡ（ctDNA）が増加することが報告されており、血漿DNAがヌクレアーゼで切断されたヌクレオソームに類似した予測可能な断片化パターンを示し、健常者とガン患者でcfＤＮＡのサイズ分布を評価でき、血漿中のｃｆＤＮＡが腫瘍形成や転移の進行に関与することも報告されており、リキッド・バイオプシィの診断バイオマーカ―としてｃｆＤＮＡの重要性が明らかにされている（非特許文献４：Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer; Climinal Chemistry 2015;61:112-123）。
　ところで、がんの発生はがん遺伝子及びがん抑制遺伝子の異常により発生する遺伝子疾患であることは広く受入れられている事実であり、塩基配列の変異、欠失によるgeneticな遺伝子異常だけでなく、塩基への修飾によるepigeneticな遺伝子異常によってもがんの発生が起こることが明らかになっている。このepigeneticな遺伝子への影響は主に遺伝子の転写制御機構に作用すると考えられており、ゲノムＤＮＡのメチル化修飾と、ゲノムＤＮＡと複合体を形成するヒストンタンパク質のアセチル化修飾やメチル化修飾とがある。したがって、このｃｆＤＮＡのヒストンタンパクとの結合体の検出はgeneticな遺伝子異常だけでなく、塩基への修飾によるepigeneticな遺伝子異常を検出することで、健常者と
がん患者を区別することができるだけでなく、がん発生部位の識別性が示唆される。
　（がん関連物質の選択的捕捉）
　血清中のがん関連物質として断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）は、ＤＮＡがひと巻きされたヒストン（ヌクレオソーム）、それらが集まりひも状になった構造のクロマチン（線維）を含む。グロブリンも正電荷を帯びるが、その増加は他のがん関連物質に比べて最大2倍以下であるのに対し、本発明で検知される物質はがん進行に伴う増加が１００倍以上に達するので、グロブリン以外の増加はがん関連物質が検知されているとされ、採択された蛍光コロニーの一定閾値以上のピクセルの総面積はガンのステージと関連することを物語る。
　以下図面を参照して、本発明の実施形態を詳細に説明する。
　（実施例１）
　チオ硫酸銀１０００ppm水溶液を調製し、その１滴をりん青銅板上に滴下し、約3分間放置し、溶液を吹き飛ばすと、SEM像でみると、量子結晶が作成されていた。実施例１で製造したナノ粒子凝集体（量子結晶）の各種SEM像を示す写真（特許文献１の図１参照）では、１００nm前後の薄い六角柱状結晶であって、表面に数nmオーダの凹凸が発現している。金属ナノ結晶に特有のファセットは確認できなかった。りん青銅坂上に滴下後の放置時間と量子結晶形状の関係を示す写真（特許文献１の図６）では、まず、六角形の量子結晶が生成し、形状を維持しつつ成長するのが認められ、量子結晶のEDSスペクトル（元素分析）の結果を示すグラフ（特許文献１の図４）では、りん青銅板上に形成された結晶は銀及び錯体配位子由来の元素を検出したが、銅板上にチオ硫酸銀１０００ppm水溶液を調製し、その1滴を滴下し、約3分間放置し、溶液を吹き飛ばした場合は、銀のみを検出したに過ぎなかった。
（量子結晶の作察）
　量子結晶は１０００ppmチオ硫酸銀錯体水溶液の場合、りん青銅板上に滴下して3分間放置すると、１００nm前後の六角柱状に形成され、各六角柱状の量子結晶は数nmオーダの凹凸を持つことがSEM像から確認されたが、金属ナノ結晶に特有のファセットは確認できず、EDS元素分析で銀及び錯体配位子由来の元素を検出されたため、全体は銀錯体のナノ結晶であって、その表面に現れる凹凸は錯体中の銀がクラスタとして量子ドットを形成して広がっていると推測される。本発明の銀錯体量子結晶がりん青銅板上に形成される一方、銅基板上には銀のみのナノ粒子が析出する現象を見ると、チオ硫酸銀錯体の平衡電位が０．３３で銅の電極電位（０．３４）と同等であるため、銅基板上には銀（０．８０）のみが析出し、りん青銅の場合は０．２２と電極電位がわずかに卑であるため、銀錯体の結晶が析出したものと思われる。したがって、量子結晶を作成するためには１）錯体水溶液が５００～２０００ppmという希薄な領域であること、２）金属錯体水溶液の平衡電位に対し担持金属の電極電位がわずかに卑であること、３）電極電位差で金属錯体が凝集させることが重要であると思われる。また、１０００ｐｐｍチオ尿素銀錯体水溶液を使用した場合も同様であった。
　（銀酸化物のメソ結晶についての考察：その１）
　上記量子結晶基板に５％次亜塩素酸ソーダ水溶液を滴下して２分間処理して除去すると特許文献１の図１１に示す結晶構造が見られ、針状の結晶とラクビーボール状の塊と大きい塊が見られたので、それぞれの組成をEDSスペクトル（元素分析）で分析すると、以下の反応式から針状の結晶はともに塩化銀と酸化銀の複合結晶からなるものと考えられるが、特許文献１の図７の結果は塩素は確認できず、銀と酸素が支配的であることがわかる。Na2S2O3+４NaClO＋H2O→Na2SO4+H2SO4＋４NaCl　（１）
Ag++NaCl→　AgCl　＋　Na+（２）
Ag+＋３NaOCl→　２AgCl　＋　NaClO3　＋　2Na+　　（３）
Ag++OH-　→　AgOH　　　　　　（４）２Ag+＋　２OH-　→　Ag2O　＋H2O（５）
　したがって、本発明に係るメソ結晶の形成には銀イオンとチオ硫酸イオンが塩素イオンの存在下にアルカリ酸化反応により生ずるものと思われるが、通常の水溶液中では酸化銀が形成されるに過ぎないが、以下のＸＰＳ測定から過酸化銀が支配的に形成されていると推測される。
　（銀酸化物のメソ結晶についての考察：その２）
　ＸＰＳ測定：
　上記量子結晶基板に次亜塩素酸ナトリウム水溶液25μlを2分間滴下し、
再結晶基板を作り、エッチングせずそのまま（使用機種：アルバック・ファイ（株）／PHI5000VersaProbeII（走査型Ｘ線光電子分光分析装置））でAgとOとをXPS測定した。また、比較対象のため、酸化銀の粉と塩化銀の粉のAgを測定した。他方、再結晶基板をアルゴンガスクラスターイオン銃で5分間エッチングしてAgとOをXPS測定した。ＸＰＳ測定結果（特許文献１の図９及び図１０）をＥＤＳの結果（特許文献１の図８）から推測して、５２９eV付近のピークは過酸化銀（AgO）に由来するＯピークで、５３０eV付近のピークは酸化銀（Ag2O）に由来するＯピークであると認められる。エッチングした場合に、酸素量は減少するが、５２９eV付近のピークの過酸化銀（AgO）に由来するＯピークが、５３０eV付近のピークは酸化銀（Ag2O）に由来するＯピークよりも大きいことは基板近傍に過酸化銀が形成されているのを物語るものといえる。これは、メソ結晶形成時の触媒作用と基板の電極電位が影響しているものと推測される。　なお、ＥＤＳ測定は上記再結晶基板を使用機種：日本電子株式会社／JSM-7001F（電界放出形分析走査電子顕微鏡）を用いて行った。
　また、チオ硫酸銀の量子結晶を次亜塩素酸水溶液、０．０１規定苛性ソーダ水溶液、０．０１規定塩酸水溶液、０．１モル炭酸ナトリウム水溶液で処理しても同様の結果は得られなかった。よって、この針状結晶の形成には銀イオンとチオ硫酸イオンの存在下に上記反応により生ずるものと思われる。酸化銀は水溶液中で負電荷を帯び、光により還元されて金属銀を析出させる。過酸化銀はその傾向が顕著なので、正電荷のがん関連物質を吸着し、しかも吸着したがん関連物質と銀粒子との間の表面プラズモン増強効果が得られるものと思われる。
　　（断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）の画像診断）
　ヌクレオソームはクロマチンの基本的構成単位で、４種のヒストン（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ，Ｈ３、Ｈ４）からなるヒストン８量体にＤＮＡが巻きついた構造をしているが、ヒストンはＤＮＡをパケージングするという役割に加え、ＤＮＡのアクセシビリティを調節すること及び、遺伝子制御にも重要な役割を果たしている。ヒストンの翻訳後修飾により、ＤＮＡやその他の核蛋白質との相互作用が制御され、可逆的な遺伝子発現に影響を及ぼす。ヒストン修飾の種類として、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、シトルリン化、ＡＤＰリポシル化、が主として知られている。ヒストンの配列中、どの部位がこれらの修飾を受けるかによって、周囲の遺伝子発現は活性化または抑制される。こうしたヒストンの翻訳後修飾部位の組み合わせと遺伝子発現への影響を各種ヒストンコード関連抗体（Ｇｅｎｅｔｅｘ社抗ヒストン抗体）を使用すると、本発明のプラズモニックチップで捕捉されたヒストンコードの修飾された状態を、蛍光画像で観測すると、ヒストンコード仮説の検証を行うことができる。
　このクロマチン構造制御にDNAメチル化が深く関与すると考えられている。ＤＮＡメチル化が高密度に見られるゲノムＤＮＡ部位では、一般にクロマチン構造が強固になり、転写抑制やDNA変異率の低減が見られる。またゲノムＤＮＡのメチル化パターンとゲノムインプリンティング、X染色体不活性化や細胞の腫瘍化には明確な相関が見られるからである。したがって、断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）におけるヒストンおよびクロマチンの構造解析はがんとの関連を説く鍵を握っており、ヒストンテールを化学修飾する因子を解析することは重要な意義を持っているといえる。本発明のプラズモニックチップを用いると、がん関連物質として断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）をトラップすることにより、その捕捉される結晶の多少によりがん症状の存否が蛍光画像診断により判断することができる。そして、そのがん症状がどの臓器のがんであり、その進行状態がどの程度であるかをヒストンテールの化学修飾、リモデリング因子を解析することにより判定することができる。このため、分光の条件として、４４５ｎｍの波長のレーザ光を用い、レーザ用ミラーオリンパス製「ＢＳ１０／９０」を使用し、４５５～６５５ｎｍの範囲で５ｎｍずつ分光スペクトルを測定していくと、大腸がん患者の血液から採取したサンプルで５１５ｎｍ付近にピークが観測され、健常者の血液から採取したサンプルではそのピークが観測できず、分光によりどの臓器のがんであるかを単独で、又はＲＧＢ領域での所定閾値以上のピクセルの総面積又はＲＧＢ領域での二波長域での所定閾値以上のピクセルの総面積の比率Ｇ／Ｇ，Ｇ／Ｂなどを勘案して決定できるものと思われる。そして、このクロマチンリモデリング事象を通してどのようにがんが発生し、進展していくかに関する情報は、そのようながんがどのように特定の化学療法剤に反応しそうかということを臨床医がより正確に予測することを可能にし、この方法で、腫瘍の化学感受性の知識に基づく化学療法を合理的に設計することができる。
　なお、本発明では、ＲＧＢで得られる蛍光画像から２波長域での所定閾値以上のピクセルの総面積比のＲａｔｉｏ値を算出したが、Ｇで得られた蛍光画像では良性腫瘍が高くなる傾向にあり、Ｂで得られた蛍光画像では悪性腫瘍が高くなる傾向がある。そのため、実施例では、前立腺に関して、Ｇ／ＲでＲａｔｉｏ値を解析すると、良性腫瘍で２．０前後、健常者で１．７、悪性腫瘍で１．７６から１．８６までの幅を持つ結果となり、他方、大腸に関して、Ｂ／ＧでＲａｔｉｏ値を解析すると、悪性腫瘍で１．９から２．０の幅を持ち、健常者で０．２から０．８、良性腫瘍で０．１前後となった。
　　（Ｇ領域短波長域／Ｇ領域長波長域のピクセル比率）
光源にはLED光源（ＸＹＬＩＳ製波長３６０～７７０ｎｍ）を使用し、オリンパス正立顕微鏡BX-63に以下の蛍光波長フィルタをつけて測定する蛍光波長を限定し蛍光画像を取得した。各波長域の所定の閾値以上のピクセルを採択し、その総面積を採択するのは上記と同様である。
９名の大腸検査患者の試料（血液から遠心分離して採取した血漿）を上記バイオチップ上に滴下して検体を作成し、分子側のＧ領域および分母側Ｇ領域の所定閾値以上のピクセルの総面積を求めた。分子側の励起光のフィルタとしてＢＰ４７０～４９５ｎｍを用い、蛍光フィルタとしてＢＡ５１０～５５０ｎｍを用いた。上記ミラーユニットを用いて得られる蛍光画像の所定以上の閾値のピクセルを採択してＲａｔｉｏの分子としてピクセル総面積を算出する。
　他方、分母側の励起光のフィルタとしてＢＰ４６０～４８０ｎｍを用い、蛍光フィルタとしてＢＡ４９５～５４０ｎｍを用いた。上記ミラーユニットを用いて得られる蛍光画像の所定以上の閾値のピクセルを採択してＲａｔｉｏの分母としてピクセル総面積を算出する。以上のＧ領域分子／Ｇ領域分母のＲａｔｉｏを算出し、別途検査で決定したステージと比較すると、以下の表１の通りであった。これにより、本発明方法で得られる結果は実際の検査で決められる悪性／良性及びステージと密接な関係が見られることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 

Claims (5)

  1. 　ａ）試料中プラズモン金属メソ結晶領域を有する測定基板を用い、体液または細胞を含む培養液をそのまま又は希釈して作成した検体を接触させ、検体中の断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）を疾病関連物質としてプラズモン金属メソ結晶に電荷捕捉させる工程と、ｂ）このプラズモン金属メソ結晶上の捕捉された断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）に励起光を照射して、その自家蛍光を表面プラズモン増強効果により増強し、断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）の蛍光コロニーの蛍光画像を一定の測定領域（ＲＯＩ）を決め、ＲＧＢのいずれかの領域の蛍光コロニー画像を取得する工程と、ｃ）該蛍光コロニー画像の所定の閾値以上の輝度を示すピクセルを採択する工程と、ｄ）採択された測定領域の所定の波長域での所定の閾値以上のピクセルの総面積値、又は採択された測定領域の異なる２波長領域の、所定の閾値以上のピクセルの総面積値のratioを演算する工程を含むことを特徴とする自家蛍光によるリキッド・バイオプシィ法。
  2.  プラズモン金属メソ結晶が過酸化銀メソ結晶を含む、プラズモン金属錯体量子結晶の酸化物であって、プラス電荷を有し、かつ表面プラズモン増強効果を有する請求項１記載のリキッド・バイオプシィ法。
  3. 　捕捉した断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）がＢ又はＧ領域の同一又は異なる二波長域の励起波長で励起されて蛍光コロニーを得、該蛍光コロニーを異なる二波長域のフィルタを介して採取し、Ｂ領域の所定の閾値以上のピクセルの総面積値を悪性腫瘍とする一方、Ｇ領域の所定の閾値以上のピクセルの総面積値を良性腫瘍とし、そこから採取したピクセルの各総面積値のratio値がＢ領域／Ｇ領域又はＧ領域／Ｂ領域のＲatio値である請求項１記載のリッキド・バイオプシィ法。
  4.  所定の閾値以上のピクセルの総面積値のＢ領域／Ｇ領域のＲａｔｉｏ値で、悪性腫瘍で１．９から２．０の幅を持ち、健常者で０．２から０．８、良性腫瘍で０．１前後である請求項2記載のリッキド・バイオプシィ法。
  5.  捕捉した断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）がメチル化されたガン抑制遺伝子、高メチル化したＲＢ遺伝子、ｐ１６以外にｐ１４、ｐ５３等を含む請求項1記載のリッキド・バイオプシィ法。

     
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CN202080090408.6A CN114901839A (zh) 2019-12-25 2020-12-25 以通过细胞凋亡的经细分化的核小体作为目标的自体荧光的液体活检法
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PCT/JP2021/048606 WO2022138983A1 (ja) 2020-11-20 2021-12-27 がん疾患の標的とするヌクレオソーム自家蛍光の分光分析法
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022138983A1 (ja) * 2020-11-20 2022-06-30 有限会社マイテック がん疾患の標的とするヌクレオソーム自家蛍光の分光分析法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011158369A (ja) 2010-02-02 2011-08-18 National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology バイオチップ、抗原抗体反応検出用キット、及び抗原抗体反応の検出方法
WO2013039180A1 (ja) 2011-09-13 2013-03-21 国立大学法人九州大学 金属ナノ粒子を用いた呈色膜および呈色方法
WO2015170711A1 (ja) 2014-05-08 2015-11-12 有限会社マイテック プラズモニックチップおよびそれを用いるがん疾病の蛍光画像ならびにラマン分光による診断方法
JP2019513228A (ja) * 2016-03-07 2019-05-23 エックス−ゼル インコーポレイテッド 希少細胞を同定する組成物及び方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9952157B2 (en) * 2012-07-17 2018-04-24 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Tissue imaging and visualization of lesions using reflectance and autofluorescence measurements
JP2021156576A (ja) * 2018-06-21 2021-10-07 有限会社マイテック 疾病関連タンパク結合体を標的とする自家蛍光によるリキッド・バイオプシィ法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011158369A (ja) 2010-02-02 2011-08-18 National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology バイオチップ、抗原抗体反応検出用キット、及び抗原抗体反応の検出方法
WO2013039180A1 (ja) 2011-09-13 2013-03-21 国立大学法人九州大学 金属ナノ粒子を用いた呈色膜および呈色方法
WO2015170711A1 (ja) 2014-05-08 2015-11-12 有限会社マイテック プラズモニックチップおよびそれを用いるがん疾病の蛍光画像ならびにラマン分光による診断方法
JP2019513228A (ja) * 2016-03-07 2019-05-23 エックス−ゼル インコーポレイテッド 希少細胞を同定する組成物及び方法

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Cell-free D NA comprises an in vivo nucleosome footprint that informs its tissues-of-origin", CELL, vol. 164, 14 January 2016 (2016-01-14)
"Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer", CLIMINAL CHEMISTRY, vol. 61, 2015, pages 112 - 123
"Detecting Peripheral Blood Circulation Tumor Cells (CTCs): Circulating tumor cell isolation and diagnostics: toward routine clinical use", CANCER RES, vol. 71, 2011, pages 5955 - 60
BIOPHYSICS, vol. 53, no. 3, 2013, pages 166 - 169
CURRENT STATUS OF SELF-FLUORESCENT ENDOSCOPES, vol. 58, April 2016 (2016-04-01)
GORGES TMPANTEL K: "Circulating tumor cells as therapy-Related biomarkers in cancer patients", CANCER IMMUNOL IMMUNOTHER, vol. 62, 2013, pages 931 - 939
LLEN HEITZERPETER ULZJOCHEN B. GEIGL: "Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer", CLINICAL CHEMISTRY, vol. 61, 2015, pages 112 - 123
PERMUTH-WEY J ET AL.: "A Genome-Wide Investigation of MicroRNA Expression Identifies Biologically-Meaningful MicroRNAs That Distinguish between High-Risk and Low-Risk Intraductal Papillary Mucino us Neoplasms of the Pancreas", PLOS ONE, vol. 10, 2015, pages e0116869, XP055229757, DOI: 10.1371/journal.pone.0116869
See also references of EP4083223A4

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022138983A1 (ja) * 2020-11-20 2022-06-30 有限会社マイテック がん疾患の標的とするヌクレオソーム自家蛍光の分光分析法

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