WO2022138983A1 - がん疾患の標的とするヌクレオソーム自家蛍光の分光分析法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞アポトーシスにより血液中放出される断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）を疾病関連物質とし、その自家蛍光の分光分析により迅速にかつ容易に行う疾病の検出を行う方法の提供。 【解決手段】本発明は、検体中の断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）を疾病関連物質としてプラズモン金属メソ結晶に電荷捕捉させ、単波長のレーザー光を照射して、その自家蛍光を表面プラズモン増強効果により増強し、断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）の蛍光コロニーの蛍光画像を一定の測定領域（ＲＯＩ）を決め、採択された測定領域の自家蛍光を観測するリッキド・バイオプシィ法において、採択された測定領域の所定の閾値以上の蛍光点を０．５ｎｍ以上３０ｎｍの波長幅で分光し、分光スペクトルを取得する工程と複数の蛍光点の分光スペクトルを平均化する工程を含み、平均化スぺクトルのピークトップの波長を検出することを特徴とする自家蛍光による分光分析法。

Description

がん疾患の標的とするヌクレオソーム自家蛍光の分光分析法

本発明はアポトーシスにより血液等に放出されるヌクレオソームをがん疾患の標的とするヌクレオソームの自家蛍光を分光分析する方法に関する。

人の体内では体内を正常な状態に保つために、遺伝子が変異した細胞や劣化した細胞、がん化した細胞などを取り除くアポトーシス（プログラムされた細胞死）が起こっている。不要になった細胞や異常がある細胞は、免疫細胞によってアポトーシスが誘導され、細分化、バラバラの状態まで分解される。細胞核内にあるDNAやヌクレオソーム(ヒストンとDNAの複合体)も、アポトーシスによってバラバラに分解されて血液中に遊離する。ここで、DNAやヒストンには後天的にその一部に化学修飾「エピジェネティクス」が起こっている。このエピジェネティクスよって、人の体内にある様々な細胞（筋肉細胞、神経細胞、腺細胞など）はそれぞれ違う働きをすることが出来る。これは、エピジェネティクスによって、細胞毎に活性のある遺伝子と不活性の遺伝子が分けられていて、細胞毎に違う遺伝子が働くことで、違う働きをすることが出来るためである。DNAやヒストンに起こるエピジェネティクスにはメチル化、アセチル化、リン酸化などがある。特にメチル化されたDNAやヒストンは正電荷に帯電する。そのため、ヒストンとDNAの複合体であるヌクレオソームもメチル化によって正電荷に帯電する。

　がん化した細胞は、免疫細胞の働きによってアポトーシスを誘導され、バラバラに分解される。バラバラになったがん細胞のヌクレオソームは血中に遊離し、エピジェネティクスによりメチル化したヌクレオソームも血中に遊離する。メチル化されたヌクレオソームは正電荷に帯電していて、負電荷に帯電する過酸化銀メソ結晶を形成したバイオチップで特異的に吸着させることができることを見出している（特許文献１）。

本件出願人マイテックは開発した新規物質の量子結晶（ナノサイズのプラズモン金属錯体結晶、例えば、チオ硫酸銀結晶）をアルカリ処理（例えば、次亜塩素酸ナトリウム水溶液処理）すると新たな新規物質である過酸化銀メソ結晶が形成され、この過酸化銀メソ結晶は水溶液中で負電荷に帯電するという特徴を有しており、この量子結晶を形成する銀錯体溶液は、50ppm~4000ppmの広い濃度範囲で、やや卑なる電極電位の、例えばリン青銅板上で、濃度に反比例して凝集時間を調整して凝集させ、次いで次亜塩素酸ナトリウム水溶液（濃度）で処理すると、針状結晶とラグビーボール状の結晶が混在するバイオチップが形成されることが見出されている（特許文献１）が、近年、図５に示すように、低濃度のチオ硫酸銀（a）50ppm,（b）200ppm,（c）1000ppmで血漿中に遊離したヌクレオソームを捕捉できるバイオチップを調整できることを見出している。この過酸化銀メソ結晶を基板上に形成すると、その負電荷に帯電する特徴から正電荷の物質のみを特異的・選択的に基板上に吸着させることが出来ることが見出されている。つまり、様々な蛋白質などが混在する血清や血漿から正電荷の物質のみを特異的にバイオチップへ吸着させることが出来る。

過酸化銀メソ結晶は銀ナノ結晶を有する構造を持ち、蛍光を増幅するプラズモン効果を持っている。そのため、通常は微弱な自家蛍光の光を過酸化銀メソ結晶のプラズモン効果により増幅して計測することによって、はっきりとした蛍光画像として蛍光顕微鏡で観察することが出来ることを見出している（特許文献２）が、本発明のバイオチップで捕捉されたヌクレオソームの自家蛍光を見ると、白色ＬＥＤ光で励起し、フィルタを介してB（ブルー）領域とG（グリーン）領域との蛍光を取得し、その比率では健常者とがん患者とを識別できるものの、分光スペクトルでの識別は不完全であった（特許文献３）が、今回、４０５ｎｍの単波長のレーザー光で励起すると、健常者とがん患者のヌクレオソームの自家蛍光のスペクトルを観測すると、両者の間に識別可能なピークトップが観測できることを見出した。

がん細胞と正常細胞のエピジェネティクス(メチル化)の違い
がん細胞と正常細胞において、DNAやヒストンのエピジェネティクス(特にメチル化)に違いがあることはすでに知られている。がん細胞では特異的な遺伝子部位（がん抑制遺伝子など）に高頻度でメチル化が起こり、他方ゲノム全体では低メチル化状態となっていることが知られている。このような特定の遺伝子領域（がん抑制遺伝子など）が高メチル化される事で、その遺伝子の発現が抑制されて発癌の原因となる。また、DNAメチル化の異常の程度とがんの再発率が相関する事や、前がん状態でDNAのメチル化異常が検出されるなど、がん細胞ではエピジェネティクス制御の状態が破綻している事も知られている（非特許文献１及び２）。
このようにがん細胞と正常細胞でヌクレオソームのエピジェネティクスの状態に違いがあり、過酸化銀メソ結晶を形成したバイオチップ上に吸着するメチル化ヌクレオソームも違うものであると考えられる。同様に、良性腫瘍細胞においてもエピジェネティクスの状態が違い、ヌクレオソームのメチル化が違うことも考えられる。

分化によるエピジェネティクスの違い
次に、DNAやヒストンのエピジェネティクス(特にメチル化)のパターンは、体を構成する臓器（心臓、肺、大腸など）の各細胞に共通したパターンでないことも知られている。未分化細胞がそれぞれの組織に分化していく際に、それぞれの組織特有のエピジェネティクスが起こり、遺伝子を制御している。つまり、分化の過程において、DNAやヒストンをメチル化することで違う遺伝子を発現させて、細胞の多様性や細胞の性質を制御していると言える。このことは、体を構成する臓器毎に、DNAやヒストンのエピジェネティクス(メチル化)のパターンが異なることを示唆している。つまり、がん細胞、良性腫瘍細胞、正常細胞、分化をうけた各臓器の細胞は、それぞれ違うエピジェネティクス（メチル化）を受けたヌクレオソームを持つことが示唆される。

化学構造による光学スペクトルの違い
ここで、メチル基などの置換基の違い（化学構造の変化）が光学スペクトルにどう影響を与えるかについて、すでにさまざまな知見がある。例えば、ベンゼン環にメチル基が1つ付いた化合物であるトルエンは、ベンゼン特有の山形ピークのUVスペクトルがブロードなスペクトルに変わり、全体的に長波長側へシフトする。ベンゼン環の1つの水素がメチル基に置換される、つまりメチル化される事でUVスペクトルに大きな影響を与えることが分かっている。また、ベンゼン環に2つのメチル基が付いたキシレンは、メチル基の付く位置によって、o-キシレン、p-キシレン、m-キシレンの3種類に別れる。このメチル基の位置によって、スペクトルが大きく異なり、オルト、パラ、メタの順で長波長側へシフトする。このようにメチル化の化学的な位置が少し異なるだけで、スペクトルに大きな影響があることが分かる。この事から、DNAやヒストンに起こるエピジェネティクス、特にメチル化について、どの部位がメチル化されるかで光学スペクトルに変化が出ることも示唆される。つまり、がん細胞、良性腫瘍細胞、正常細胞、分化をうけた各臓器の細胞は、それぞれ違うメチル化を受けたヌクレオソームを持ち、それぞれの細胞でメチル化の部位が違うことから光学スペクトルに違いが出ることも示唆される。

WO2014/181816

WO2015/170711

PCT/JP2020/048764

京府医大誌「癌とエピジェネティクス」　2009年）

日経バイオビジネス「エピジェネティクス」　2006年）

がん細胞、良性腫瘍細胞、正常細胞、分化をうけた各臓器の細胞は、それぞれ違うエピジェネティクス（特にメチル化）を受けたヌクレオソームを持つことが示唆される。つまり、バイオチップ上に吸着する正電荷に帯電したメチル化ヌクレオソームも、それぞれ違うエピジェネティクスを受けた違うヌクレオソーム（DNAとヒストンの複合体）であると考えられる。しかしながら、自然光で励起するヌクレオソームの自家蛍光の観測で、グリーン領域Gとブルー領域Bの蛍光比率を取る方法では、ブルー領域に対しグリーン領域の比率G/Bが２．０以上の場合にがんの可能性があると判断される、すなわち、グリーン領域は健常者特有の自家蛍光を示し、ブルー領域ががん患者特有の自家蛍光を示すと考えられるのに対し、それぞれのヌクレオソームの自家蛍光をオリンパス社製共焦点レーザー走査型顕微鏡「FV3000」を用いて、詳しく分光測定し、複数の自家蛍光のスペクトルを平均化すると、健常者のヌクレオソームでは平均化分光スペクトルのピークトップが４６０ｎｍ付近のブルー領域に現れるのに対し、がん患者の場合、平均化分光スペクトルのピークトップが５１０ｎｍ付近のグリーン領域に現れることを見出した。
　そこで、本発明者らは、プラズモン金属メソ結晶が凝集した領域を有するバイオチップで検体中のヌクレオソームを捕捉し、レーザー光を励起光として照射すると、取得する蛍光画像中には複数のメソ結晶が捕捉したヌクレオソームの自家蛍光が観測され、その内、所定以上の輝度を示す蛍光点を採択して分光分析すると、がん患者と健常者の分光スペクトルに明らかに識別できるピークが存在することを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明が解決しようとする課題は、アポトーシスによって血中に放出される断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）を標的とし、その自家蛍光の分光スペクトルによりがん患者を迅速にかつ容易に検出する方法を提供することをある。

 本発明は、試料中プラズモン金属メソ結晶領域を有する測定基板に、体液または細胞を含む培養液をそのまま又は希釈して作成した検体を接触させ、検体中の断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）をがん関連物質としてプラズモン金属メソ結晶に電荷捕捉させる工程と、このプラズモン金属メソ結晶上の捕捉された断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）に、レーザー光源による単波長の励起光を照射して、その自家蛍光を表面プラズモン増強効果により増強し、断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）の蛍光コロニーの蛍光画像を一定の測定領域（ＲＯＩ）を決め、該蛍光コロニー画像の所定の閾値以上の輝度を示す蛍光点の分光スペクトルを検出し、この分光スペクトルを平均化する工程を含むことを特徴とする自家蛍光によるリキッド・バイオプシィ法にある。

本発明方法によれば、患者から採取した検体の自家蛍光の分光分析法により、がん患者と健常者を識別することができる。そして、その蛍光分光スペクトルを平均化していずれの位置にピークトップが存在するかにより、がん患者と健常者との識別をより正確に行なうことができる。本発明に、励起光はレーザー光源による単波長の励起光とし、観測される蛍光コロニーから所定の輝度の領域を採択するにあたり、ＲＯＩを採用する。そして、蛍光コロニー中の所定の閾値以上の輝度の蛍光点を採択するのは測定精度を上げるためである。また、本発明において、演算工程では、二値化して採択した所定以上の輝度の蛍光コロニーを採択し、０．５～３０ｎｍの波長範囲で分光し、分光スペクトルを得る。得られる複数の分光スペクトルを平均化することによりスペクトル中のピーク位置を検出する。所定以上の輝度を有する蛍光点がエピジェネティクス情報に応答するためであり、複数の分光スペクトルを平均化するのは断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）はゲノムDNAが担う遺伝情報とエピジェネティクスの情報の双方を含むためエピジェネティクスの情報のみをできるだけ採択するためである。

また、本発明において、検出対象として、捕捉される標的は、活性化したＣＡＤ（カスパーゼ活性化ＤＮase）がＤＮＡをヌクレオソーム単位で切断した、およそ２００bpの倍数の断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）であって、ゲノムＤＮＡが担う遺伝情報とエピジェネティクスの情報の双方を含むものであり、エピジェネティクスの情報のみを取り出しやすくする平均化分光スペクトルを用いる。

検体としては、広くヌクレオソームを含むものを対象とし、唾液、リンパ液等を含む体液を含むが、通常リンパ液あるいは血液から分離した血漿または血清が用いられる。断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）は、ヒストン蛋白に結合してプラス電荷を示すので、選択的に捕捉が可能である。また、検体が、ｉＰＳ細胞であるときは、ｉＰＳ細胞のがん化の識別を行うことを対象とする。

一般に、生体タンパクは自家蛍光を有するが、この自家蛍光は標的の蛍光観察においては、シグナル（蛍光標識されることが望ましいもの）のバックグラウンド（蛍光標識されることが望ましくない自家蛍光など）を形成し、ノイズとなる。しかしながら、この生体タンパクの自家蛍光は生体タンパクその物の構造を反映しているので、自家蛍光による構造解析は以下の点で特に有効である。即ち、近年、これまでに行われた解析結果から、がん細胞の発生・進展過程では、ゲノム変化だけでなくエピゲノム変化も多数蓄積しており、エピゲノム修飾は、化学的制御と物理的制御に大別される。化学的制御の代表が「ヒストンコード」と称される種々のヒストンテールの修飾である。ヒストンテールの数十に及ぶアミノ酸に対して修飾が報告されてきたが、こうした修飾単独あるいは組み合わせを認識するクロマチン結合タンパク（reader）が転写制御を担っている。一方、物理的制御としては、一次(ヌクレオソーム) および高次よりなるクロマチン構造が重要であるとされる。クロマチン構造は正常な細胞分化・発生の過程でダイナミックに変化し(クロマチンリモデリング)、この時空間的な制御が必須であるだけでなく、制御異常が発生異常や癌化などの疾患にも関与しているので、ヒストン修飾では、遺伝子発現を正に活性化する領域（エンハンサー領域）に特徴的にみられるH3リジン27のアセチル化(H3K27ac)及びメチル化が注目される。遺伝子発現状態は転写開始点が存在するプロモーター領域のクロマチン状態とよく相関するが、細胞系譜に特有の遺伝子発現調節においては、エンハンサーのクロマチン状態も深く関与している。また、最近では、H3K27acを指標とするエンハンサー領域が、遺伝子の立体構造形態(ゲノムトポロジー) においても重要なことが示されている。したがって、臨床組織検体を用いた自家蛍光の観測により、ヒストン修飾解析、クロマチン構造解析により、ガンの早期診断及びがん部位の特定の可能性が示唆される。即ち、細胞遊離ＤＮＡが結合したタンパク結合体はＤＮＡがヒストンに巻き付いてヌクレオソームを形成し、ヒストンタンパクがメチル化されると、ヌクレオソーム内のＤＮＡを安定化させる。さらに、ＤＮＡのメチル化異常はがん抑制遺伝子が不活性化され、がん発症の原因となるとされる。したがって、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含め、アポトーシスにより、血液中に細胞から放出される細胞遊離ＤＮＡ（cfＤＮＡ）を採取して解析することは極めて期待されるリキッド・バイオプシィの標的である。しかしながら、血液中のｃｔＤＮＡを含め、遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を捕集することは極めて困難であり、微量であるためＰＣＲが検出の基本になり、変異特異的ＰＣＲとデジタルＰＣＲに大別されて検査されている。本発明では、ＤＮＡは通常マイナス電荷を示し、プラス電荷を示すヒストン蛋白と強く結合し、マイナス電荷を示すプラズモンナノ金属結晶に捕捉される性質を有することに鑑み、これをチップで捕捉し、ラマンスペクトル分光法で検出することを試みた（特許文献１）。しかしながら、チップ上に捕捉されるＤＮＡと結合するヒストンタンパク結合体はアポトーシスにより細かく分断されて捕捉されるため、極めて小さく、この捕捉物質を励起光で適切に励起し、増強されて反射されるラマン光を検出することは極めて難しく、簡易迅速にリキッド・バイオプシィ法にて結果を知ることが困難であった。ところが、遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む疾病関連物質、断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）の自家蛍光を表面プラズモン増強効果により顕在化し、所定以上の閾値の輝度を有する蛍光コロニーを基準とすると、分光スペクトルの平均化することにより分光スペクトルのピークトップが特にがん患者、良性腫瘍患者、健常者の識別を可能とすることがわかった。

第２に、本発明によれば、疾病関連物質の選択的捕捉は次のように行われる。標的とすべき断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）は、ｃｔＤＮＡを含む、細胞遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）がヒストンタンパクと結合して最小単位のヌクレオソームまたはそれが高次化したクロマチンとして血中に存在してくる。しかも、ヒストンに巻き付いたＤＮＡはヒストンタンパクと結合し、メチル化することで安定に存在する（前記癌とエピジェネティクスにより、ガン細胞から高メチル化した各種ガン抑制遺伝子：高メチル化したＲＢ遺伝子、ｐ１６以外にｐ１４並びにｐ５３が含まれる）。したがって、プラス電荷を示すチップを提供することで、これらを選択的に吸着または捕捉することができる。かかるチップ上に捕捉される物質は特定の励起光により自家蛍光を表面プラズモン効果で顕在化して現れ、これらを蛍光顕微鏡で分光分析すると、その蛍光スペクトルにピークが現れ、ピークトップ波長により、健常者、がん患者、その他の疾患患者を識別できることを見出した。すなわち、健常者の細胞からも細胞遊離ＤＮＡがアポトーシスを介して血中に放出されるが、がん細胞からは腫瘍細胞遊離ＤＮＡが放出され、これらはそれ自身のメチル化及びヒストンのメチル化で強固に結合し、他の疾患細胞からは疾患特有の断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）を放出する。これら健常者、がん患者、その他の疾患患者の細胞から放出されるＤＮＡはgeneticな遺伝子異常だけでなく、塩基への修飾によるepigeneticな遺伝子異常が発生しており、各細胞からの放出される断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）には化学的又は物理的に相違が見られる。その結果、健常者、がん患者、その他の疾患患者の細胞から放出される断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）に自家蛍光の波長に相違がみられることを見出した。また、がん患者から採取したがん関連物質の蛍光波長をより詳細に分光分析して分類すると、エピゲノム修飾が、その化学的制御と物理的制御に大別され、影響を受けるため、がん原発部位、転移部位により蛍光波長スペクトルまたはスペクトルピークが異なってくる（分光スペクトルによると、がん患者の断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）には５１０ｎｍ付近にわずかなピークトップが観測される（図７(ｂ)及び図８（ｂ））一方、健常者のヌクレオソームの分光スペクトルには４６０ｎm付近にピークトップが観測される（図６（ｂ）））。したがって、採択された所定の閾値以上の蛍光コロニーの分光分析によりガン疾病の評価に極めて有効である。

第３に、細胞のアポトーシス等の病理的分解により体液、特に血漿又は血清中に放出されるＤＮＡがヒストンタンパク等と結合してタンパク結合体を形成するが、本発明によれば、タンパク結合体の自家蛍光をプラズモン増強により顕在化して蛍光顕微鏡で観察し、疾病の早期診断に役立てることができる。なぜなら、タンパク質の翻訳後修飾異常が種々の疾患の発現と関係するが、がんや生活習慣病，感染症など様々な疾患患者検体に対し簡易迅速にプロテオーム解析を行うことができるからである。本リキッド・バイオプシィ法では、疾患に伴う翻訳後修飾異常の解明が，臨床の現場において即時実行され、治療方針を決定し、個別化医療を実現するための診断バイオマーカとなるばかりでなく，新たな治療薬を開発するための創薬方針の決定時に極めて重要な指針を与える。一般にペプチドの分析においてはサンプルの前処理技術や，修飾基特異的な濃縮技術の改良など，まだ多くの課題が残されているが、本法を活用することにより，翻訳後修飾異常と疾患との関係の解明に役立つ。本発明によれば、具体的に、これら断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）は疾患の発生により血液その他体液中にアポトーシスに代表される病理的な細胞死によって放出されるため、疾患との関係が深い。特に、アポトーシス後のヌクレオソーム自体の自家蛍光の特徴が悪性腫瘍ではグリーン（G）領域に分光スペクトルのピークトップが現れ、健常者ではブルー（B）領域に分光スペクトルのピークトップが現れるため、分光スペクトルのピークトップがどの領域に現れるかを見ると、健常者、良性腫瘍、悪性腫瘍の識別をすることに成功し、ガンの超早期診断、再発判定、転移判定、治療効果のモニタリングが可能となることが分かった。アポトーシス後の細分化されたヌクレオソームは遺伝子異常により発生するメチル化ヌクレオソームの検出を可能とするため、本発明の検査レベルは現在の画像診断レベル（PET-CT,CT,MRI）以前のガン関連物質の検出に基づき、超早期発見が可能となることがわかった。

図１はオリンパス製ＤＭ（ダイクロイックミラー）４０５－４４５／５１４を用い、得られた蛍光画像を示し、各サンプル毎の輝度の高いポイントを１０点を採択する方法を示す。 図２はシリカゲル乾燥容器で、（ａ）は血液を遠心分離して得た結晶の滴下状態、（ｂ）はシリカゲルで容器内で血漿を乾燥させた状態を示す。 本発明第1法の第1工程Ａ：測定チップ（プロテオチップ）の作成の説明図、 第2工程Ｂ：プロテオチップの解析範囲の決定の説明図である。 本発明方法を自動的に行う場合に採用される顕微鏡ステージの説明図である。 チオ硫酸銀５０ｐｐｍで形成したメソ結晶のＳＥＭ画像である。 チオ硫酸銀２００ｐｐｍで形成したメソ結晶のＳＥＭ画像である。 チオ硫酸銀１０００ｐｐｍで形成したメソ結晶のＳＥＭ画像である。 健常者の血漿から採取したヌクレオソームの各蛍光点の分光スペクトルである。 図６Ａの分光スペクトルの平均化スペクトルを示すグラフである。 膀胱がん患者の血漿から採取したヌクレオソームの各蛍光点の分光スペクトルである。 図７Ａの分光スペクトルの平均化スペクトルを示すグラフである。 肺がん患者の血漿から採取したヌクレオソームの各蛍光点の分光スペクトルである。 図８Ａの分光スペクトルの平均化スペクトルを示すグラフである。

 本発明に係るリキッド・バイオプシィ法の実施に当たっては、では次の工程を採用するのが好ましい。
ａ）がん関連物質の選択的捕捉工程：図３Ａ
試料中表面マイナス電荷を示すプラズモン金属メソ結晶領域を有する測定基板：プロテオチップ（図３Ａ（１））に、体液または細胞を含む培養液をそのまま又は希釈して作成した検体を接触させ（図３A（２））、検体中のプラス電荷を示すタンパク結合体を疾病関連物質としてプラズモン金属メソ結晶に電荷捕捉させる（図３Ａ（３））工程を示す。
ｂ）蛍光画像取得工程：図４
（１） がん関連物質が付着したプロテオチップを蛍光顕微鏡にセットし、チップの測定位置（X,Y軸）を決めて、チップのフォーカス（Z軸、ピント）を合わせる。測定設定を切り替えて蛍光画像の測定を開始する。このプラズモン金属メソ結晶（直径約８ｍｍ）上に捕捉されたタンパク結合体に励起光を照射して、捕捉タンパク結合体の自家蛍光を表面プラズモン増強効果により増強し、蛍光コロニーを蛍光画像（図１）として取得する工程
ｃ）蛍光コロニーの採択工程：
解析範囲（直径５ｍｍ）内にある蛍光コロニーの輝度を二値化して所定の閾値以上の輝度の蛍光コロニーを採択する工程
1検体につき、蛍光画像中の複数の蛍光点につき０．５ｎｍから３０ｎｍ間隔で取得する。
次いで、解析範囲を決め、ＲＯＩで囲う。ここで、閾値として「蛍光コロニーの円形度及び輝度」を用い、解析条件を決め、ごみ等を除外する。

図４は４枚のプロテオチップ（測定基板）をホルダーにセットして測定を自動化する場合の顕微鏡ステージのイメージ図を示す。チップ（１）～（４）の測定位置（Ｘ軸、Ｙ軸）を事前に登録し、チップ（１）～（４）のフォーカス（ｚ軸）はそれぞれ手動で合わせる。Ｘ，Ｙ及びＺ軸が決まれば、チップ４枚の分光分析が自動で行われ、分光スペクトルが得られる。

検体である体液はリンパ液あるいは血液から分離した血漿または血清であるだけでなく、尿、唾液等を含み、タンパク結合体が、ヒストン蛋白に結合してプラス電荷を示す、細胞遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含み、該細胞遊離ＤＮＡは細胞から遊離した循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む。疾病関連物質を捕捉するプラズモン金属メソ結晶を励起する光源は腫瘍親和性蛍光物質を励起するのに使用される４０５ｎｍの波長の励起光を使うのが好ましい。本発明で捕捉したタンパク結合体は循環腫瘍DNA（ｃｔＤＮＡ）を含み、ヒストンタンパクと結合したヌクレオソームまたはそれが高次化したクロマチンであって、ヒストンがメチル化の修飾を受けると、自家蛍光によるリキッド・バイオプシィ法のガン診断の標的となる特徴を有している。

「試料中表面マイナス電荷を示すプラズモン金属メソ結晶を有するチップ」
本発明方法で用いるプラズモン金属メソ結晶領域を有する基板をプロテオチップという。その製造方法は、以下の通りである（WO２０１５/１７０７７１号参照）。
１）金属錯体水溶液を錯体を形成する金属より卑なる電極電位（イオン化傾向の大きい）金属基板上で電極電位差により化学還元して量子結晶（ナノサイズの金属錯体結晶）を凝集させている。銀錯体の場合、チオ硫酸銀水溶液を銀より卑なる電極電位（イオン化傾向の大きい）の銅または銅合金上で凝集させることにより銀錯体の量子結晶を化学還元法を採用して形成している。詳しくは、金属錯体の水溶液中の濃度は主として形成する量子結晶のサイズを考慮して決定すべきであり、分散剤を使用するときはその濃度をも考慮するのがよく、通常、５０ｐｐｍから４０００ｐｐｍの範囲で使用できるが、配位子の機能にも依存してナノクラスタというべきナノサイズを調製するには１００から２０００ｐｐｍの濃度が好ましい。図５（a）,(b)及び（ｃ）はチオ硫酸銀５０ｐｐｍ、2００ｐｐｍ及び1000ｐｐｍの結晶を３％濃度の次亜塩素酸ナトリウム溶液でアルカリ処理した場合の過酸化銀メソ結晶のＳＥＭ画像を示す。２００ｐｐｍで良好な結晶状態が得られることが分かった。
２）量子結晶を形成する金属錯体は担持金属の電極電位Ｅと相関する式（Ｉ）で示される錯体安定度定数（ｌｏｇβ）以上を有するように選択される。
式（Ｉ）：Ｅ゜＝（ＲＴ／｜Ｚ｜Ｆ）ln（βi）
（ここでＥ゜は、標準電極電位、Ｒは、気体定数、Ｔは、絶対温度、Ｚは、イオン価、Ｆ、ファラデー定数を表す。）
ここで、金属錯体が、Ａｕ、Ａｇ、ＰｔまたはＰｄから選ばれるプラズモン金属の錯体である場合は、励起光に対して局在表面プラズモン共鳴増強効果を有する。特に、金属錯体が銀錯体であるときは、安定度定数（生成定数）（ｌｏｇβi）が８以上の銀錯化剤とハロゲン化銀との反応により形成されるのがよく、ハロゲン化銀としては塩化銀が好ましく、錯化剤としてはチオ硫酸塩、チオシアン酸塩、亜硫酸塩、チオ尿素、ヨウ化カリ、チオサリチル酸塩、チオシアヌル酸塩から選ばれる１種であるのが好ましい。銀錯体は平均直径が５～２０ｎｍであるナノクラスタからなる量子ドットを有し、量子結晶のサイズが１００～２００ｎｍとなる。
３）本発明で用いるプロテオチップにおける、プラズモン金属メソ結晶とは、プラズモン金属錯体の量子結晶の酸化物であり、血中でプラスに帯電するメチル化ヌクレオソームを電荷で補足するに必要なマイナス帯電で、励起光の照射により表面プラズモン増強効果を発揮し、補足したメチル化ヌクレオソームの自家蛍光を増強する効果を有するものをいう。銀錯体量子結晶の場合、アルカリ処理（次亜塩素酸ナトリウム水溶液で処理）すると、以下の反応により銀ハロゲン化物を核として過酸化銀を含み、銀酸化物の複合物の針状ナノ結晶群が形成されるものと思われ（特許文献１の図５）、しかも水中で（－）荷電を帯びる一方、ＤＮＡが巻き付いたヒストンが（＋）荷電を帯びるため（WO２０１５/１７０７1１号の図７(a)）、この遊離ヌクレオソームに代表される正電荷を帯びたがん関連物質を選択的に吸着することが見出された。しかも過酸化銀を含む銀酸化物の針状ナノ結晶群は、単波長レーザー光に代表される励起光の照射により表面プラズモン増強効果を示し、吸着されたヒストンに代表されるがん関連物質の自家蛍光を検出するのに好ましいことが見出されている。
Na2S2O3+４NaClO＋H2O→Na2SO4+H2SO4(2NaHSO4)＋４NaCl
Ag++NaCl→ AgCl ＋ Na+
Ag+＋３NaOCl→ ２AgCl ＋ NaClO3 ＋ 2Na+
Ag++OH- → AgOH
２Ag+＋ ２OH- → Ag2O＋H2O
４）本発明の銀酸化物の複合針状ナノ結晶群は、過酸化銀を含む銀酸化物が自己組織化してニューロン状の三次元超構造体（メソ結晶）を形成するもので（WO２０１５/１７０７1１号特許文献１の図８及び９）、銀イオン水溶液をAg/AgCl電極を用いて定電位電析を行って、又は銀の量子結晶をアルカリ処理で酸化することにより形成することができるが、銀錯体量子結晶、例えばチオ硫酸銀量子結晶をアルカリ処理（次亜塩素酸ナトリウム水溶液で処理）することによって容易に形成することができる。
５）疾病関連物質を吸着することができる限り、蛍光標識マーカーの高度検出と感度と迅速性を実現するピッチ３５０ｎｍの周期構造をもつ基板に銀と酸化亜鉛の薄膜を成膜してなるプラズモニックチップ（特開２０１１－１５８３６９号参照）や金属ナノ粒子を有機溶媒中に分散させ、有機溶媒を揮発させて金属ナノ粒子を二次元方向に自己組織化して粒系の揃った銀ナノ微粒子からなる局在プラズモン蛍光増強シート（WO２０１３－０３９１８０号参照）を用いてもよい。

「本発明で用いる検体」
血液を含む体液から検体を作成する。赤血球は強い自家蛍光を示すので、遠心分離して血漿をのみを取り出すのがよい。疾患関連物質としてガン疾患の場合は、１０～５０倍希釈して断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）の自家蛍光を測定しやすくするように希釈率を決定する。リン青銅上におよそ２００ｐｐｍのチオ硫酸銀錯体水溶液を滴下して作成したチオ硫酸銀錯体量子結晶をアルカリ処理して酸化形成した銀酸化物メソ結晶に対しては２０～３０倍希釈が望ましい。細胞の場合は機械的破砕がその物性を変化させないので好ましい。そして、ここで都合のいいことには、断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）は安定なタンパク結合体（Protein-bound DNA fragments: nucleosome or chromatin）を形成し、比較的強い正電荷を示す。それ故、負電荷を示し、かつ励起光により表面プラズモン増強効果を示すプラズモン金属メソ結晶に選択的に捕捉され、しかも断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）は安定であるため、真空乾燥又は乾燥剤（シリカゲル）乾燥後保存して蒸留水等に再溶解しても乾燥前のタンパク結合体の自家蛍光の特徴を再現することができる。乾燥剤（シリカゲル）乾燥ではこれは現場での採血、遠心分離での血漿の採取だけでなく、図４に示すように、容器内で乾燥させ、郵送での検査依頼を可能とするものとなる。

「蛍光画像取得工程」
ここでは、上記プラズモン金属メソ結晶基板上に捕捉された断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）に励起光を照射して、捕捉断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）の自家蛍光を表面プラズモン増強効果により増強し、蛍光コロニーを蛍光画像として取得する。励起光としては正常組織と病変組織でその集積・排出特性が異なるヘマトポルフィリン誘導体（腫瘍親和性蛍光物質）を励起するに適するとされる４０５ｎｍの励起光のレーザー光源を用いた。タンパク結合体は血液を採取して遠心分離にかけ、得られる血漿を蒸留水で３０倍希釈して用いた。
ｃ）蛍光コロニーの採択工程：
オリンパスＤＭ（ダイクロイックミラー）４０５－４４５／５１４を用い、図１の結果が得られたので、各サンプル毎の輝度の高いポイントを例えば１０点（疾病に応じ、採取ポイント数は決められる）抽出し、中心付近に円形のＲＯＩを作成し、スペクトルデータを算出した。蛍光コロニーの１０点採択は専用ソフト「cellSens」で二値化し、所定の閾値以上の輝度の蛍光コロニーを採択することができる。

装置と解析方法
バイオチップにレーザー光を当ててオリンパス製「FV3000」で得られる自家蛍光の蛍光画像から、自家蛍光を分光して詳細な波長毎の分光スペクトルを測定する。ここで、照射するレーザー波長は405nm、445nm、488nm、514nm、561nm、594nm、640nm等がある。また、対物レンズは4倍から100倍の倍率がある。
バックグランドの影響を受けないように、バイオチップ上の目的とする付着物のみをROIで囲い、目的物のみの波長毎の分光スペクトルを測定する。また、レーザー光を当てて得られる蛍光画像内には複数の付着物があり、その全てもしくは一部をROIで囲い、分光データを平均化して1つの分光スペクトルとして表示する。または、平均化せず、それぞれ個別の分光スペクトルとして表示することも出来る。

（１）分光の具体的な「測定手順」
A）作成したバイオチップを機器へセットする（本件ではオリンパス製次世代共焦点レーザー走査型顕微鏡FV3000を用いた）。
B）対物レンズを20倍レンズにセットする。
C）励起光レーザーを405nmにセットする。
D）励起光レーザーをチップへ照射して、チップのフォーカスを合わす。
E）分光を取得する測定幅を10nmにする（０．５～３０ｎｍの範囲で任意に設定可能）。
Ｆ）分光を取得する測定波長範囲を入力する（測定範囲は任意の範囲を設定可能）。
Ｇ）ソフトウェアの測定ボタンをクリックすると設定した分光が測定される。

 （２）分光の具体的な「解析手順」
 Ａ）得られた自家蛍光の分光画像から、ROIを作成して複数のチップ付着物（コロニー）を選択する
Ｂ）選択した複数のROIの分光スペクトルをソフトウェアで個別にスペクトルをグラフに表示する
Ｃ）選択した複数のROIの分光スペクトルをソフトウェアで平均化した1つのスペクトルデータのグラフにする。
Ｄ）得られた個別もしくは平均化したスペクトルからピークトップの波長を得る。
Ｅ）得られた個別もしくは平均化したスペクトルを数値化して、ピークトップの波長を得ることもできる

実施例
（１）200ppmの金属錯体水溶液から金属基板上に電極電位差により量子結晶（ナノサイズの金属錯体結晶）を作製し、アルカリ処理（次亜塩素酸ナトリウム水溶液で処理）すると過酸化銀を含む銀酸化物が自己組織化により3次元構造体－メソ結晶が形成する。
（２）作製した過酸化銀メソ結晶へ膀胱がん、肺がん患者の検体（血清もしくは血漿）と健常者の検体を水で希釈してバイオチップへ滴下する。
（３）過酸化銀メソ結晶の負電荷により付着した目的物の自家蛍光を、オリンパス社製共焦点レーザー走査型顕微鏡「FV3000」で画像として測定し分光スペクトルを得た。
この時、405nmのレーザー光を照射し、対物レンズ20倍で蛍光画像を取得した。
また、蛍光画像から分光スペクトルを計測する際は分光幅10nmで計測を行った。
分光幅10nmの測定では、得られる分光スペクトルは10nm刻みの波形となる。
このようにして得られた分光データを分光スペクトルとしてグラフへ表示した。
その結果、健常者から得られる自家蛍光の分光スペクトルは459nmにピークトップを持つ波形として得られ、一方膀胱がん、肺がん患者から得られる自家蛍光の分光スペクトルは510nm近辺にピークトップを持つなだらかなブロードの波形として得られた。
また、作製したバイオチップは時間を空けて測定することで、自家蛍光の分光スペクトルに変化があることが分かった。作製直後のバイオチップの分光スペクトルを測定すると、健常者とがん患者の検体で優位な差が分かりにくく、識別が困難であった。しかし、時間を空けてバイオチップの分光スペクトルを測定すると、健常者とがん患者で分光スペクトルにはっきりとした違いが見られ、両者を識別することが容易であった。
上記の健常者、がん患者の分光スペクトルのピークトップ波長は、バイオチップを4時間置いた後の測定データである。このように、作製したバイオチップを時間を空けて測定することで、健常者とがん患者の分光スペクトルのピークトップが顕著に識別できることが分かった。これは、バイオチップに付着したがん患者由来のヌクレオソームの分光スペクトルのピークトップが、時間経過とともに変化していることが推測される。または、時間を空けて測定する事でバイオチップの夾雑物の蛍光が弱まり、がんに関連するヌクレオソームの蛍光がそのまま維持されていて、がん患者の分光が顕著になっていることも考えられる。このことから最適なバイオチップの測定時間が存在することが示唆された。
このように、バイオチップ上の正電荷のメチル化ヌクレオソームを分光スペクトルにより解析することで、それぞれのピークトップに違いがあることを見出した。つまり、がん細胞と正常細胞内に起こっているヌクレオソームのエピジェネティクスに違いがあり、光学スペクトルに変化があることが示唆された。がん細胞と正常細胞のそれぞれ違うエピジェネティクスを受けたヌクレオソームの自家蛍光を調べる事によって、それぞれ違う分光スペクトルが得られる事が判明した。

「標的対象とその蛍光顕微鏡で観測される捕捉標的対象の自家蛍光画像」
本発明ではガン疾患及びその他の疾患で異常に発生する断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）を検出対象とする。この種疾患に関連するタンパク結合体は、正電荷を有することよりプラズモン金属メソ結晶に選択的に捕捉され、励起光の照射によりプラズモン金属メソ結晶の表面プラズモン増強効果により増強され、蛍光顕微鏡で確認できる所定以上の輝度を有する自家蛍光を発光することが見出されている（図１）。これらのタンパク結合体は疾患の発生により血液その他体液中にアポトーシスに代表される病理的な細胞死によって放出され、図１に示す夜空の星座のように複数のコロニーが観測され、小さいものでは、２５μｍ程度の広がり、大きいものでは１５０μｍ程度の広がりとして観測される。アポトーシス細胞ではＣＡＤ（カスパーゼ活性化ＤＮase）の阻害因子が分解され、活性化したＣＡＤがＤＮＡをヌクレオソーム単位で切断するため、およそ２００bpの倍数の断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）として捕捉されるためである。詳しくは、ヒト血漿中の細胞遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）はヒストンまたはＴＦと関連するタンパク質結合として血中に放出され、優先的に生き延び、健常者では主に骨髄系リンパ系の細胞系に由来するが、特定の病状では１つまたは複数のさらなる組織からの寄与が考えられており、がんなどの病理学的状態におけるｃｆＤＮＡから細胞タイプを推測するヌクレオソームの足跡（footprint）を含み、その組織の起源を知らせる（Ｃｅｌｌ，２０１６Ｊａｎｕａｒｙ１４；１６４:Cell-free DNA comprises an in vivo nucleosome footprint that informs its tissues-of-origin）ことが明らかにされている。因みに,腫瘍の悪性度がより高度な懐死に結び付き、循環血液中に腫瘍ＤＮＡ（ctDNA）が増加することが報告されており、血漿DNAがヌクレアーゼで切断されたヌクレオソームに類似した予測可能な断片化パターンを示し、健常者とガン患者でcfＤＮＡのサイズ分布を評価でき、血漿中のｃｆＤＮＡが腫瘍形成や転移の進行に関与することも報告されており、リキッド・バイオプシィの診断バイオマーカ―としてｃｆＤＮＡの重要性が明らかにされている（Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer; Climinal Chemistry 2015;61:112-123）。

 ところで、がんの発生はがん遺伝子及びがん抑制遺伝子の異常により発生する遺伝子疾患であることは広く受入れられている事実であり、塩基配列の変異、欠失によるgeneticな遺伝子異常だけでなく、塩基への修飾によるepigeneticな遺伝子異常によってもがんの発生が起こることが明らかになっている。このepigeneticな遺伝子への影響は主に遺伝子の転写制御機構に作用すると考えられており、ゲノムＤＮＡのメチル化修飾と、ゲノムＤＮＡと複合体を形成するヒストンタンパク質のアセチル化修飾やメチル化修飾とがある。したがって、このｃｆＤＮＡのヒストンタンパクとの結合体の検出はgeneticな遺伝子異常だけでなく、塩基への修飾によるepigeneticな遺伝子異常を検出することで、健常者とがん患者を区別することができるだけでなく、がん発生部位の識別性が示唆される。

（がん関連物質の選択的捕捉）
血清中のがん関連物質として断片化ＤＮＡ（細分化ヌクレオソーム）は、ＤＮＡがひと巻きされたヒストン（ヌクレオソーム）、それらが集まりひも状になった構造のクロマチン（線維）を含む。グロブリンも正電荷を帯びるが、その増加は他のがん関連物質に比べて最大2倍以下であるのに対し、本発明で検知される物質はがん進行に伴う増加が１００倍以上に達するので、グロブリン以外の増加はがん関連物質が検知されていることを物語る。

Claims (3)

1. プラズモン金属メソ結晶領域を有する測定基板を用い、体液または細胞を含む培養液をそのまま又は希釈して作成した検体を接触させ、検体中のアポトーシス後の細分化ヌクレオソームを疾病関連物質としてプラズモン金属メソ結晶に電荷捕捉させ、このプラズモン金属メソ結晶上の捕捉された細分化ヌクレオソームに励起光を照射して、その自家蛍光を表面プラズモン増強効果により増強し、細分化ヌクレオソームの蛍光コロニーの蛍光画像を一定の測定領域（ＲＯＩ）を決め、ヌクレオソームの自家蛍光の蛍光コロニー画像を取得するリキッド・バイオプシィ法において、
   　　　　・　励起光としてプラズモン金属メソ結晶上の捕捉されたヌクレオソームを、４０９ｎｍ以上の波長領域の自家蛍光を発するように、単波長レーザー光を用いて励起する工程と、
   　　　　・　ヌクレオソームの自家蛍光の画像の所定の閾値以上の輝度を示す自家蛍光点を採択する工程と、
   　　　　・　採択された測定領域の所定の閾値以上の蛍光点を０．５ｎｍ以上３０ｎｍの波長幅で分光し、分光スペクトルを取得する工程と
   　　　　・　複数の蛍光点の分光スペクトルを平均化する工程を含み、平均化スぺクトルのピークトップの波長を検出することを特徴とする自家蛍光による分光分析法。
2. 単波長レーザーの波長として405nm、445nm、488nm、514nm、561nm、594nm、640nmから選択される単波長レーザーを用いる請求項１記載の自家蛍光による分光分析法。
3. ４０５ｎｍの単波長レーザーを用いて得られる４０９ｎｍ以上で観測する分光スペクトルにおいて、４６０ｎｍ付近にピークトップが現れる場合は検体提供者を健常者と認定する一方、５１０ｎｍ付近にピークトップが現れる場合は検体提供者をがん患者と認定する請求項１記載の自家蛍光による分光分析法。

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