CN104603600B

CN104603600B - 用于散射介质中改进的扩散发光成像或者断层照相的系统和方法

Info

Publication number: CN104603600B
Application number: CN201380035375.5A
Authority: CN
Inventors: 斯蒂芬·安德森·恩格斯; C.徐; H.刘; 庞图斯·斯文马克
Original assignee: Lumito AB
Current assignee: Lumito AB
Priority date: 2012-07-01
Filing date: 2013-07-01
Publication date: 2017-09-01
Anticipated expiration: 2033-07-01
Also published as: US20150196201A1; KR102100614B1; ZA201409381B; EP2867653B1; WO2014006012A1; CA2879769A1; CA2879769C; JP2015525587A; CN104603600A; IL236424A0; JP6443934B2; US10143380B2; EP2867653A1; AU2013285996A1; KR20150043299A; AU2013285996B2

Abstract

公开一种用于散射介质中的感兴趣区域的发光分子成像或者断层照相的方法和系统。该系统包括布置于散射介质中的非线性发光标记物材料，一个或者更多光源由至少一个光源位置定位用于通过由所述一个或者多个光源向激励体积中发射的激励光激励所述发光标记物，以及检测器在发光光检测位置检测由于所述激励光而来自所述发光标记物的发光，其中所述激励光包括脉冲的激励光。

Description

用于散射介质中改进的扩散发光成像或者断层照相的系统和方法

技术领域

本发明主要地涉及吸收和散射介质的光致发光（photoluminescence）成像或者光致发光断层照相领域，特别地，涉及用于此类成像的方法和系统。

背景技术

对于光致发光成像（简称为发光成像）或者光致发光断层照相（简称为发光断层照相）而言令人感兴趣的散射介质的例子为生物组织。组织光学是致力于研究光与此类组织交互的领域。最近十年，该领域迅速增长。随着对光-组织交互的了解与日俱增，受益于来自基础研究的成果，也出现了对将应用组织光学作为诊断工具应用的兴趣。

组织光学中的为本公开部分地涉及的领域是包括光致发光断层照相的如下光致发光成像，该光致发光成像是用于人类或者动物活体内成像的非入侵方式。这些成像方式是基于发光的并且需要用于激励发光生物标记物的外部光源。

光致发光是物质吸收光子并且然后重新辐射光子的过程。具体光致发光形式是荧光，其中通常发射的光子的能量低于用于照射的光子。因此在荧光中，关于照射光的波长，荧光波长被Stokes频移至更长的波长。

荧光成像已知并且可以例如用来研究在一段时间内来自小动物中药物的生物响应而无需牺牲它们。

Shimomura、Chalfie和Tsien由于发现和开发已经变成很重要的荧光标记物的绿色荧光蛋白质而于2008年荣获诺贝尔奖。

然而迄今为止，用于吸收和散射介质中的扩散发光成像或者断层照相的荧光分子成像和断层照相系统遭受多个缺点。它们例如具有使基于成像结果的诊断任务困难的低分辨率或者对比度。

先前技术的进一步的问题是量子产率低、成像深度浅、数据采集时间长、以及热副作用。

因此，存在对一种尤其允许通过改进前述缺陷来增加有效性的改进型扩散发光成像或者发光断层照相系统和方法。

发明内容

因而，本发明的实施例优选地寻求通过提供根据所附专利权利要求的系统、方法和用途来个别或者在任何组合中减轻、缓解或者消除本领域中的诸如上述一个或者多个缺陷、劣势或者问题。

根据本发明的第一方面，提供一种通过扩散发光分子成像对散射介质中的区域成像的方法。该区域包括在标记物位置处布置于散射介质中的至少一个发光标记物，其中发光标记物为非线性发光标记物。该方法包括：由一个或者多个光源从至少一个光源位置向激励体积（excitation volume）中发射的激励光来激励发光标记物；检测器在发光光检测位置处检测由于激励光而来自发光标记物的发光，其中激励光包括脉冲的激励光。

根据本发明的第二方面，提供一种用于散射介质中感兴趣区域的扩散发光分子成像的系统。该系统包括用于在散射介质的发光分子成像中使用的发光标记物，其中发光标记物是布置于散射介质中的非线性发光标记物。该系统包括：一个或者多个光源，由至少一个光源位置定位用于通过由一个或者多个光源向激励体积中发射的激励光来激励发光标记物。该系统包括在发光光检测位置处检测由于激励光而来自发光标记物的发光的检测器，其中激励光包括脉冲的激励光。

在实施例中，发光标记物包含于被配置成对照射波长的传入光上转换（upconvert）的一组非线性发光标记物中，这当用所述传入光照射所述发光标记物时在比所述照射波长短的发光波长处出现发光。

发光标记物在某些实施例中是生物发光标记物。

根据本发明的另一方面，提供本发明第二方面的系统的以下用途：用于片剂的发光成像或者断层照相、和/或用于扩散光学成像、和/或光力学治疗、和/或深部组织中的生物分子的远程激活、和/或单次激发（single-shot）深部组织成像、和/或用于小动物的活体内或活体外发光成像或发光断层照相、和/或通过所述发光成像或者发光断层照相的功能诊断（诸如癌症诊断）、和/或使用所述非线性发光标记物作为探针的包括受激发射损耗（STED）或单分子检测的超高分辨率显微镜术。

在一个实施例中，非线性标记物附着到用于另一成像模态（modality）的成像造影剂（imaging contrast agent）。例如非线性标记物附着到用于用诸如磁共振成像（MRI）、X射线等常规成像模态进行成像的造影剂。在一个具体实施例中，非线性标记物附着到具有顺磁（paramagnetic）性质的有机钆络合物（gadolinium complex）或者钆化合物。

在从属权利要求中限定本发明的其他实施例，其中用于本发明第二和后续方面的特征在必要的修改下同样用于第一方面。

一些实施例提供增加的发射强度。

一些实施例在扩散发光分子成像中和在荧光分子断层照相中提供增加的分辨率。

一些实施例提供确定片剂中的成分分布。例如非线性发光标记物或者荧光团可以附着到片剂中的活性成分。因此可以有利地确定活性成分的空间分布。

一些实施例在非线性标记物被用作MRI造影剂时提供用于医学磁共振成像中的增强对比度。同时可以进行发光成像或者断层照相，这提供用于同一个相同感兴趣区域并且在活体内的与高分辨率MRI组合的功能诊断信息。

一些实施例在使用上转换纳米粒子时提供增加的量子产率。

一些实施例提供单次激发深部组织成像。

一些实施例提供深的成像深度和短的数据采集时间。

一些实施例提供抑制激励光的热副作用。

一些实施例提供扩散光学成像、光力学治疗和深部组织中的生物分子的远程激活。

一些实施例提供无背景（background-free）信号。

应当强调，术语“包括”在使用于本说明书中时解释为指定存在所言特征、整体、步骤或者部件、但是并未排除存在或者添加一个或者多个其他特征、整体、步骤、部件或者其组。

附图说明

根据参照以下附图对本发明实施例的下文描述将清楚并且阐明本发明实施例能够实现的这些和其他方面、特征以及优势：

图1是Jablonski图；

图2a)-c)是a）辐射和无辐射能量转移、b）共振和非共振能量转移以及c）比较ETU（左）和ESA（右）上转换的示意图；

图3A是上转换纳米晶体（nanocrystal）的Yb³⁺-Tm³⁺离子对中的上转换过程的示意图；

图3B是示出用于图3A的上转换纳米晶体的发射谱和上转换发射的激励功率密度依赖性的图；

图4a-d是平面成像实施（即（a）-（b）用于荧光团成像（落射荧光（epi-fluorescence））的设置、（d）将用于透照法（transillumination）中的荧光团重构的设置和c）用于荧光扩散光学断层照相的另一设置）的示意图；

图5a-c是在利用线性和非线性荧光团的荧光成像之间的差异的示意图；

图6是示出用于单束激励以及组合的单束激励和双束激励的权重矩阵的归一化奇异值分布的图。

图7A-B是使用（10A）仅单束图像以及使用（10B）单束和双束图像两者的上转换纳米粒子（nanoparticle）的三维重构。

图8示出在975 nm的激励之下NaYF4:Yb³⁺, Tm³⁺纳米粒子的上转换图；

图9示出根据本发明的一个实施例确定的在975 nm的激励之下NaYF4:Yb³⁺, Tm³⁺纳米粒子的近红外、红色和蓝色上转换发射带的功率依赖性；

图10示出根据本发明的一个实施例确定的在不同的功率密度下近红外、蓝色、红色上转换发射带的量子产率；

图11示出根据本发明的一个实施例的在CW的激励和脉冲激励（具有相同的平均功率）之下NaYF4:Yb³⁺,Tm³⁺纳米粒子的谱；

图12示出根据本发明的一个实施例的在具有不同的脉冲宽度（1 ms、5 ms、10 ms）的CW激励和脉冲激励之下的上转换发射谱（在800 nm归一化）；

图13示出根据本发明的一个实施例的在CW和脉冲（具有31.04 mW的相同的平均功率）的激励之下的上转换谱；

图14示出根据本发明的一个实施例的在不同的平均激励功率之下在具有5 和10ms脉冲宽度的脉冲激励之下在800 nm的信号的增益；

图15a-f和图16示出激励功率对在800 nm的增益的影响；

图17a-c和18a-b示出激励功率对在800 nm的增益的影响；

图19a-c示出在：具有100 mW的功率的CW激光二极管（a）；具有100 mW的平均功率的脉冲激光（方波，脉冲宽度5 ms，周期250 ms）（b）；以及具有100 mW的平均功率的脉冲激光（方波，脉冲宽度10 ms，周期500 ms）（c）的激励之下在800 nm得到的发光图像；

图20说明根据本发明的实施例的包括脉冲的激励光的激励光；

图21说明根据本发明的实施例的发光以及在脉冲的激励光之后的延迟检测的发光；

图22-25说明根据本发明的实施例的标记物的相对深度坐标及其确定；

图26a-b分别说明信号增益相对于脉冲宽度和平均功率密度；

图27a-d说明根据本发明的实施例的在脉冲激励之后的来自标记物的发光（b, d）以及来自连续波（CW）激励的发光（a, c）；

图28说明根据本发明的实施例的方法的示意性流程图；

图29a-c说明模拟的量子产率（QY）相对于时间和平均功率密度；以及

图30说明上转换信号增益相对于功率密度。

具体实施方式

本公开的一些实施例涉及前述组织光学内的涉及扩散发光成像和断层照相的领域。对于多数可见光波长，光穿透到组织中不多于几毫米。但是在诊断窗（波长为600至1600nm）中，光穿透足以允许贯穿直至若干厘米的成像。这开辟对深入组织中的荧光造影剂成像的可能性。

先前技术由于量子产率低而限制了成像的深度，还导致采集时间长、噪声和热副作用。

执行具有逼真光学性质的对组织体模（phantom）的实验并且示出有可能根据本发明的实施例的以下公开改进这些前述的因素。

WO 2010/128090公开了用于扩散发光成像或断层照相的系统、方法和非线性发光标记物，之前在其中显示了此类成像的对比度和分辨率可以被改进。

下文描述了荧光成像和断层照相在生物医学成像内的若干应用。

在非生物领域中提供其他应用。用于此类领域的例子是用于材料测试（包括片剂质量控制、具有非线性标记物的介质流过的用于液体或者气体的过滤器等）的发光成像或者断层照相。

在本应用和本发明实施例的上下文中，荧光成像代表所有类型的发光成像。讨论的任何成像或者断层照相也是在高度散射介质中，这在传统上由于检测的光的扩散特性而提供不良分辨率。本发明的实施例有利地改进了此类发光成像（包括在发光断层照相中）的量子产率、对比度和分辨率。

现在将参照附图描述本发明的具体实施例。然而本发明可以用诸多不同形式来体现而不应理解为限于这里阐述的实施例；实际上，提供这些实施例使得本公开将透彻和完整并且将向本领域技术人员完全传达本发明的范围。在对附图中所示实施例的具体描述中使用的术语并非旨在于限制本发明。在附图中，同样标号指代同样元素。

下文给出荧光成像、组织光学和非线性标记物（诸如上转换纳米晶体）的基本原理概况，之后是对来自实验和仿真的结果的描述。在WO 2010/128090中给出了更多细节。

荧光对比度

可以在Jablonski图中描述从发荧光分子（荧光团）发光的过程（参见图1）。图1示出如下Jablonski图，该Jablonski图示出来自分子受激状态的各种衰变路径。在图的下部，示出来自乙醇中的血卟啉（haematoporphyrin）的荧光谱。缩写词为：Sn：单体状态；Tn：三联体状态；Abs：吸收；Sc：散射；IC：内部转换；F：荧光；IX：系统间交叉；P：磷光；A；向其他分子转移。用于一些过程的近似时间标度也在图1中的右下方示出为生命期（LT），也记为τ。

如果传入光子具有与在分子中的两个能带之间的间隙对应的能量，则它可以被吸收。光子能量将由此用于将分子激励到更高能带。受激状态不稳定，并且分子将返回到基态（ground state）。解激励可以跟随如图1中所示多个不同路径。标记的级别是与原子的能级对应的电子级别。S0、S1等是电子自旋量子数量之和为零的单体状态，而T0、T1等是一个电子的自旋具有改变的符号的三联体状态。对于大分子，在级别之间的间隔很小，并且状态由于分子交互而重叠。当光子由分子吸收时，它未必将分子激励到受激电子级中的最低振动级而是更可能激励到更高振动状态。这是如下Franck-Condon原理的结果，该原理规定：在迅速（10^-15s）吸收过程期间，原子在振动运动中不改变它们的位置。当分子被激励到高能级时，将继而为迅速驰豫（relaxation）到S1的最低旋转振动状态。该驰豫的短时间标度（10^- ¹²s）归因于旋转振动级别的高密度。分子可以通过无辐射运动（radiationless kinetic）交互从S1继续到状态S0。这称为内部转换（IC）。

替代地，解激励可以造成发射光子，并且该过程被称为荧光。由于跃迁可以在S0的任何旋转振动状态中终止，所以不同光子的能量将不具有相异值而实际上具有宽分布。因此，来自分子的荧光谱将是宽的（最常见为无任何显著结构）。谱的形式将反映向更低级别（S0）跃迁的概率。在图1的下部中示出血卟啉（该血卟啉为肿瘤标记物或者光敏剂并且后文将加以讨论）的荧光谱。一旦路径吸收-IC-荧光完成，分子就回到它的原始状态和配置。因此，荧光过程非破坏性并且可逆的，这例如在医疗诊断中是一个优势。

若干其他路径也可能用于受激分子，诸如向其他分子转移能量、电子转移、受激准分子形成和激励到造成分子离解的排斥状态。在图1中用A指示这些过程。

诸多荧光分子共有一个重要特征、也就是共轭双键（即每第二个键是双键）的未断开链。血卟啉的结构是用于该未断开链的例子（未示出）。这是用于肿瘤的荧光诊断和光力学治疗的荧光分子。

荧光成像

对照点监视设备，荧光成像系统可以检测大量点中的荧光信号。因此创建感兴趣区域的二维图像。典型系统包括相机以及可调谐滤波器（参见图4a）。在图4c中示意地图示透照法中的相似设置。利用可调谐滤波器可以容易选择所需检测波长并且可以实现约20nm宽的谱分辨率。

利用非线性荧光团的荧光成像

荧光成像的特别令人感兴趣的部分是使用非线性荧光团的部分。在本申请的上下文中，“非线性标记物”是发光标记物，其中标记物的发光（L）不线性依赖于激励光（E）的发光流量（luminous flow）。非线性标记物因此具有根据以下的发光：L=k*E^x，其中x>1并且其中k是正常数。非线性标记物也可以具有根据以下关系的发光：L=k*E^x + b，L=k(E)*E^x+ b，L=k(E)*E^x + b(E)或者L=k*E^x + b(E)，其中k和b是如下材料常数，这些材料常数恒定或者依赖于激励光（E）的局部场（即对于k(E)和b(E)）。与常规荧光成像比较，非线性标记物（或者荧光团）因此可能需要不止一个光子用于激励。这明显减少了激励体积并且提供更局部化的激励点。以该方式如下文示范的那样改进发光成像的对比度和分辨率。具体而言，改进吸收和散射介质的发光成像中的扩散光的对比度和分辨率。本发明的实施例利用该效果。

为了说明在利用线性和非线性荧光团的荧光成像之间的差异，参照图5a-c。图5a图示灰度级的线性荧光图像。每个像素（705）对应于网格图案（701）中的一个激励点（704）。图5b图示利用两个光子的非线性荧光团（即非线性发光标记物（702））获得的图像。在图5c中，用红色（较大圆圈）（703）示出荧光团（702），并且黑色点（704）指示网格图案（701）中的激励点。圆圈（703）对应于标记物（702）在网格图案（701）上的投影图像。激励点（704）对应于光源（即激光器（503））在扫描发光激光器（702）时的位置。可以清楚地看到使用非线性荧光团增加了荧光图像的对比度和分辨率。具体而言，当光源在图5c中标记为706的与标记物（702）或者标记物（702）在网格图案（701）上的对应投影图像（703）接近的位置时，激励体积充分小并且局部化到用于非线性标记物的光源位置（706），这在图5b中的对应像素（708）中未检测到发光。对于图5a中的线性发光图像，对应像素（707）由于散射介质中的激励体积增加而接收发光。两个光子的非线性依赖性提供激励体积的窄光子密度。因此基于检测的发光对激励光强度的非线性依赖性对标记物（702）成像可以增加分辨率。

非线性荧光团与线性荧光团比较一般需要更高激励强度，并且一些非线性荧光团甚至需要相干激励。在散射介质中，难以实现高强度，因为光不能聚焦而实际上在每个方向上散布。这使一些非线性荧光团比其他非线性荧光团更适合于散射介质中的荧光成像。荧光团需要具有异常高的产出，并且它们可以无需相干激励。上转换纳米粒子是一种此类具有高产出并且无需相干激励的非线性荧光团。

由于例如上转换纳米晶体中的发射荧光的二次依赖性，改进了荧光断层照相。

上转换

上转换是在吸收两个或者更多光子并且释放能量比传入光子的能量更高的光子时出现的非线性过程。

例如在包含如下亚稳定状态（meta-stable）的材料中观察到该过程，该状态可以将一个电子俘获很长时间，这增加了与另一到来光子交互的可能性。

在一些实施例中，由不同稀土离子掺杂的固体形式的发光标记物用来获得上转换。

由于诸多如下过程而发生上转换，这些过程根据离子对和激励强度而不同地影响上转换过程。

在图2a)-c)中图示一些上转换过程。

一些过程涉及到在离子之间的能量转移。该能量扩散可以是辐射或者无辐射的、共振或非共振的。

另外，在图2c中分别在图的左侧和右侧上图示能量转移上转换（ETU）和受激状态吸收（ESA）过程。当在受激状态中的离子吸收一个更多光子时发生受激状态吸收。

纳米大小（nanosized）的上转换晶体

纳米大小的上转换粒子例如是易于制作的镧系元素掺杂氧化物（Y₂O₃）。

其他纳米大小的上转换粒子例如是具有比Y₂O₃效率高的氟化物。氟化物中的低光子能量（这降低无辐射衰变的可能性）可以说明更高效率。

更多纳米大小的上转换粒子例如由Yb³⁺/Er³⁺或者Yb³⁺/Tm³⁺共同掺杂（co-doped）的四氟化钇钠（NaYF₄）制成。

NaYF₄可以在立方体或者六边形这两相（分别称α-NaYF₄和β-NaYF₄）中结晶。来自β相材料的上转换发光比来自α相的上转换发光高近似一个数量级。

非线性荧光团（诸如上转换纳米粒子）也可以被生物功能化（biofunctionalize），这向它们例如给予肿瘤寻求能力。

非线性荧光团可以是水可溶的，这允许在某些应用中（诸如在用于静脉、口腔或者肠道服用的解决方案中）易于服用。

一种提供上转换纳米粒子为水可溶的方式向粒子涂覆有极性的结构。涂层例如可以由聚合物或者硅石制成。两种合成聚合物（例如聚乙二醇（PEG）和天然聚合物）可以用于涂层。这些聚合物在生物环境中稳定并且未以任何明显负面方式干扰纳米晶体的光学性质。

可以提高水可溶的上转换纳米粒子而无涂层。羟基团可以通过化学键或者物理吸收来附着到上转换纳米粒子的表面。羟基团按照定义通过共价键合来形成，并且最终结构具有极性性质。

功能化

可以用与诸如X. Gao等人在In vivo cancer targeting and imaging withsemiconductor quantum dots, Nature Biotechnology, 22, 8:969-976, 2004（出于所有目的整体而将其全文结合于此）中描述的量子点功能化相似的方式进行上转换粒子的功能化。在Gao等人中，描述了适用于上转换稀土掺杂纳米粒子的方法。

在本公开中的一个实施例中使用的上转换纳米粒子是由Yb³⁺与Tm³⁺的组合掺杂的根据G. Yi等人在Synthesis, characterization, and biological application ofsize-controlled nanocrystalline NaYF₄:Yb, Er infrared-to-visible upconversionphosphors（Nano Letters, 4, 11:2191-2196, 2004）中描述的方法制备的NaYF₄晶体。在图3A中示出了两个离子的能量图。图3A是Yb³⁺/Tm³⁺离子对中上转换过程的示意图。用虚线箭头图示无辐射上转换过程，并且为了清楚而省略无辐射衰变。图3B是示出用于这些上转换纳米粒子的发射谱的图。在477nm的蓝色发射线仅对于更高泵浦强度而言可见。如图3B的插图中所见，使用低强度来测量800nm线的泵功率依赖性为二次，该插图在x轴上示出强度（I）而在y轴上示出计数（C），并且其中拟合线（401）的斜率（S）等于2。

在一个实施例中，非线性标记物附着到用于另一成像模态的造影剂。例如非线性标记物附着到用于用诸如磁共振成像（MRI）、X射线等常规成像模态进行成像的造影剂。在一个具体实施例中，非线性标记物附着到具有顺磁性质的有机钆络合物或者钆化合物。当用作MRI造影剂时，在医学磁共振成像中增强对比度。同时可以进行发光成像或者断层照相，这提供同一个感兴趣区域并且在活体内的与高分辨率MRI组合的功能诊断信息。

系统设置实施例

在图4a-d中示意地示出用于扩散发光分子成像的系统。图4a-b是用于荧光团成像（落射荧光）的设置的示意图；并且图4c是用于透照法中的荧光团重构的设置，它可以被用于使用非线性荧光团和传统荧光团的FMT的仿真。在后一种情况中，可以将仿真的组织体模建模为半无穷圆柱体（510），它具有在几何形状的一个平面周围均匀间隔的源检测器点（509）。

组织体模（501）可以由如下精制卵磷脂（Intralipid）墨溶液构成，该溶液具有由适当的系统（500, 600）（例如飞行时间光谱系统、频率域系统、或在稳态和时间或频率域中的其他成像系统）确定的光学性质。在内径为2.4mm的毛细管中可以包含荧光团（502）。在比较研究中，荧光团的浓度对于纳米粒子而言可以选择为1wt%而对于DY-781型传统下转换荧光团而言可以选择为1μM。可以选择纳米粒子的浓度以具有与使用量子点的研究的合理对应性、即1wt%的浓度。

使用步进马达，可以光栅扫描纤维耦合激光器（503）。激光器在光栅扫描中的位置可以由如图5中所示网格图案（701）描述。可以对于每个扫描位置获取图像而空气冷却的CCD（503）相机放在居中于800nm的两个电介质带通滤波器后面。图4c示出光栅扫描设置（507），其中激光器从下方位置（505）扫描组织体模（501）。CCD（504）可以对于激光器的每个位置（506）捕获一个图像。位置（506）描述与图5中的网格图案（701）相似的网格图案（508）。对于激光器的每个位置（506），测量来自体模（501）的整侧的发射荧光（即总发光器强度）并且求和以组成所得图像中的一个像素。因此图像中的像素数量由激励位置（506）而不是由CCD像素数量给定。分辨率因此可以由来自激光光源（505）的激励光的光子密度而不是由荧光发射光的光子密度确定。以该方式，由于激励体积中的两个光子的光子密度比单个光子的光子密度更窄，所以可以增加分辨率。当对总发光强度求和时，阈值可以应用于检测的发光。以该方式，可以增加分辨率。例如，仅当发光强度高于限定阈值时，才将它与总发光强度相加。阈值可以限定为CCD（504）中的值，例如如果发光强度低于峰值的30%，则它将被丢弃，因为它可以视为背景信号。另外，如果用于像素或者激光器的位置（506）的所得总发光低于另一阈值，则它可以视为背景信号并且被移除。替代地，可以对发光信号的二次强度求和。以该方式，可以进一步增加分辨率。例如CCD（504）检测的发光强度（该发光强度按照CCD中的峰强度值的定义可以具有在0与1之间的相对值）可以在与用于当前像素或者位置（506）的总发光强度相加之前与自身相乘。另外，总发光强度可以对于每个像素或者位置（506）与自身相乘。使用扫描成像技术，图像中的每个像素可以对应于单个激励点（即光源位置（506））诱发的荧光。

图4b示意性地说明根据本发明的一个实施例的用于扩散发光分子成像的系统600。系统600包括用于在所述散射介质中的所述发光分子成像中使用的发光标记物502，其中发光标记物是布置于散射介质中的非线性发光标记物。系统600另外包括：一个或多个光源503，由至少一个光源位置505, 506定位，用于通过由所述一个或多个光源激励向激励体积中发射的激励光来激励发光标记物；以及检测器504，在发光光检测位置检测由于所述激励光而来自发光标记物的发光，其中所述激励光包括脉冲的激励光。因此，系统600适于通过脉冲的激励光在散射介质中感兴趣区域的扩散发光分子成像，它提供提高的量子产率、由于介质发热更少而更少的热副作用、更深的成像深度和更短的采集时间。在关于通过脉冲激励来增强上转换发射和具有脉冲的激励光的单一脉冲成像的下文中将进一步描述系统600。

使用上转换纳米粒子的多束荧光扩散光学断层照相

此外，本公开示范一种在荧光扩散光学断层照相中用于利用上转换纳米粒子的独特非线性功率依赖性以通过包括同时用两个束的激励在光栅扫描设置中进一步增加信息量的方法。发现增加的信息造成更准确的重构。

荧光扩散光学断层照相（FDOT）是一种寻求重构混浊材料以内的荧光探针浓度的空间分布的相对新模态。作为成像工具，它在例如对肿瘤、蛋白酶和药物效果成像的生物医学研究中具有良好前景。

FDOT具有在数值上颇不适定的问题。在该问题中，用于荧光靶的重构质量由从边界测量获得的荧光信息数量和质量直接确定。仪器噪声和组织自发荧光是测量的主要扰动，这造成不良信号质量并且可能在重构结果中引起严重赝像。为了克服该点，可以例如运用低噪声设备、使用背景减法或者谱离析（unmixing）。然而此类方法不能解决所有问题，因为它们实质上仅以更佳方式利用当前信息而不是为重构添加新约束，即添加对于改进重构质量而言关键的新独立信息。

在基于无接触CCD的FDOT系统中，一种获得更多信息的优选方式是通过增加激励位置的数量。然而，为了保持激励束的强度在合理水平内，对激励束的最小大小存在限制。这意味着对最高激励位置密度的实际上限，因为相异（即未重叠）激励位置是重构所需要的。也有可能运用解剖成像模态（诸如磁共振成像）以提供先验结构信息。然而，这是以系统明显增加复杂度并且减少灵活性为代价的。

在本公开中，我们提出一种利用上转换纳米粒子的二次功率依赖性以通过在FDOT中将两个束同时用于激励来获得附加信息的方法。示范用双束激励拍摄的图像（即D型图像）对纳米粒子数量密度分布n重构的影响。此外进行在线性若丹明 6G与二次上转换纳米粒子之间的重构结果比较。

可以通过两个耦合扩散方程[Ref.1]对激励场和发射场建模。对于二次荧光团，在第k个束的激励之下在固定检测器位置处检测的荧光信号可以由正向模型（1）描述：

其中N表示体元（voxel）数量，

表示分别用于源、检测器和体元的坐标，并且；

是体元i的体积。

激励光的正向解由下式代表：

。

当同时使用两个束来激励介质时，检测的信号由（2）给定：

其揭示了交叉项的牵连。在光栅扫描设置（500，507）中，如果在两个位置上利用一个激励束扫描依次拍摄两个图像（称为S型图像），并且在之前两个位置之上利用两束激励拍摄第三图像（D型），交叉项的牵连意味着通过从现有S型图像的任何数学变换不能获得D型图像，这指示其是独立的并且包含附加信息。然而，对于线性荧光团（例如，若丹明 6G）D型图像仅是现有S型图像的线性组合，并且将不添加对于逆问题的更多约束。对于非线性荧光团，推导出方程（2）可以被一般化以包括更多的同时激励束。

通过对其元素由（3）给定的权重矩阵W的奇异值分析[Ref. 1]来确认利用双束激励的测量在重构中的意义：

其中：

对于二次荧光团而言；并且

对于线性荧光团而言。

使用如下NIRFAST包来执行计算，该NIRFAST包实施有限元方法。根据（4）对W分解因式：

其中U和V是如下酉矩阵，这些酉矩阵包含W的左和右奇异矢量；并且是如下对角矩阵，该对角矩阵包含W的奇异值。图像控件模式跨越V的列空间，而检测空间模式跨越U的列空间。W的奇异值表示实验设置[Ref. 2]可以多么有效地检测给定的图像空间模式。

图6示出W的归一化奇异值分布。x轴示出奇异值索引（1120）并且y轴示出归一化奇异值强度（1121）。为了清楚，仅示出每个第二奇异值。叉（1122）和加号（1124）符号代表线性荧光团（γ=1），前者用于单束激励（1122）而后者用于组合的单束激励和双束激励（1124）。可见，由于双束激励（1124）的附加奇异值的归一化强度已经降至机器精确度，这指示用双束激励的测量可能未缓解FDOT的不适定性。换而言之，D型图像可能未提供比现有S型图像更多的信息。因此它可能未改进重构的质量。然而对于二次荧光团（由图6中的星号（1123）和圆点（1125）符号表示），附加奇异值（1125）的强度仍然显著。这意味着D型图像将对重构的质量有贡献。

单个激励束可以首先用来扫描（3×3）网格，并且CCD相机对于每个扫描位置捕获一个图像。在下一步骤中，位于相同网格的两个最近邻近部位的两个激励束可以同时用来照射体模，这给出6个额外D型图像。

图7A-7B示出重构的上转换纳米粒子的三维表现。子图中的红色圆柱体相同并且表示真实荧光损伤。在图7A的重构中，仅使用S型图像。可见，荧光损伤的形状估计过高。逆问题的不适定性说明该估计过高。当添加D型图像时，如图7B中所示，明显改进荧光损伤形状的重构。D型图像对逆问题有贡献并且造成用于二次上转换纳米粒子的更好重构。

公开上转换纳米粒子的非线性功率依赖性的附加独特优势。该优势实现有可能通过使用同时用两个或者更多激励束拍摄的图像来获得用于逆问题的附加信息。当使用线性荧光团（例如若丹明6G）时不能发现相同优势。

通过脉冲的激励来增强上转换发射

图8说明了用于NaYF4:Yb³⁺, Tm³⁺的上转换谱，如在其中所示，在975 nm的激励之下上转换纳米粒子能够发射在近红外（~800 nm）、红色（~648 nm）和蓝色（~475 nm）范围内的发射带。

如上文描述，这些上转换发射带的强度对激励强度具有非线性依赖性。在低强度范围内的依赖性可以由下式描述

I_f = kI_ex ⁿ (5)

其中I_f是上转换荧光强度；k是常数；I_ex是激励强度；n是为了产生一个发射光子所需的激发光子的数目。

在图9中示出近红外、红色和蓝色发射带的功率依赖性，其说明在975 nm的激励之下NaYF4:Yb³⁺, Tm³⁺纳米粒子的近红外、红色和蓝色上转换发射带的功率依赖性。

量子产率被定义为在被发射的光子的数目和被吸收的激励光子的数目之间的比。由于它们在图9所示的非线性功率依赖性，如图10所示，上转换发射具有功率-密度依赖的量子产率而非恒定的量子产率，图10示出了在不同功率密度下近红外、蓝色、红色上转换发射带的量子产率。

根据本发明的一个实施例的通过扩散发光分子成像对散射介质中的区域成像的方法100包括（图28）：在所述区域提供101在标记物位置处散射介质中的至少一个非线性发光标记物1，通过由一个或者多个光源从至少一个光源位置向激励体积中发射的激励光激励103非线性发光标记物，以及在发光光检测位置通过检测器检测107由于激励光而来自发光标记物的发光，其中激励光包括脉冲的激励光。

量子产率随着功率密度而增加并逐渐接近常数。与具有相同平均功率的连续波激励相比，从脉冲激励提供了信号水平的增益，因为脉冲激励具有更高的峰值功率。

因此通过脉冲激励限制在窄的时间窗内相同数目的激励光子，能够提供更高效地使用激励光子从而得到更强的上转换发射光。这在图11中被确认，其示出使用具有相同的平均功率的CW或脉冲光作为激励的NaYF4:Yb³⁺,Tm³⁺纳米粒子的谱。在图11中，脉冲具有10ms的脉冲宽度和100 ms的周期，并且用于CW和脉冲激励的光束尺寸的直径都是0.70 mm。如图11所示，与具有1.94mW的相同平均功率的CW激励相比，通过使用脉冲激励得到了大约2倍的信号增益。

通过具有脉冲的激励光，相应地提供了在使用上转换纳米粒子时在量子产率的显著增加。另外，与连续波激励相比，脉冲的激励光提供单次激发深部组织成像、深的成像深度和短的数据采集时间。由于脉冲光，还抑制激励光的热副作用。

脉冲的激励光还提供扩散光学成像、光力学治疗和深部组织中的生物分子的远程激活。在下文的“单次激发成像”之下，更详细地描述了前述效果，它是本申请的一部分。

利用脉冲的激励和具有长的发射生命期的UCNPs的额外优点是，可能通过采用延迟的检测来抑制散射的激励光。这在之前并未被应用于UCNPs。对于组织内的宏观成像，UCNPs的很大的优点是光发射的反斯托克位移（anit-Stokes shift），这提供了抑制组织自发荧光的方法。这是已知的并且在理论上提供令人很感兴趣的总的无背景信号。即使能够完全抑制组织自发荧光，但是在实践中在先前技术中仍然存在这样的组织，其在光谱上过滤掉来自强得多的散射激励光的信号。通过脉冲的激励和延迟时间的检测，该抑制会更有效，并且总的无背景信号的优点会更容易地应用在具有脉冲激励的实践中。方法100因此可以包括以下步骤：在时间上延迟105发光的检测，以提供没有在介质中散射的激励光的影响的信号的检测。图21示出这样的实施例，其中具有长度(w)的激励脉冲201跟随有强度在时间间隔210期间衰减的发光。该方法因此可以包括以下步骤：检测108在所述激励光的脉冲201之后的时间间隔210期间的发光。时间间隔可以在1-100 ms的范围内。系统600可以相应地包括检测单元601，其作用来检测108在所述激励光的脉冲之后的时间间隔210期间的发光。

脉冲宽度依赖的增益：

在CW激励之下，由于二次功率依赖性，如果功率-密度是处于非饱和的功率-密度机制内，如果将激励功率加倍，则发光强度将会提高四倍（情况1）。

在脉冲的激励之下，将会花费一定时间（由中间能级的生命期确定）来达到稳定状态。在上升时间期间，荧光强度比在稳定条件下的更弱。因此，比较在脉冲持续期间具有两倍更高的峰值功率的在CW激励之下和在方波脉冲激励的荧光强度，后者将不会是四倍更高，而是比前者更小，这和情况1不同。因此，在通过脉冲激励的上转换发射强度中的增益是脉冲宽度依赖的。如果脉冲宽度太短，则上转换系统将会离脉冲持续期间的稳定状态很远，因此增益将会更小或完全没有增益。脉冲宽度应该是足够长的，并且它可以通过观察在具有不同脉冲宽度的CW激励和脉冲激励之下的上转换谱的协助来确定。如果脉冲宽度足够长来达到稳定状态，则在脉冲激励之下归一化的谱应该充分地接近在CW激励之下的。图12示出在具有不同脉冲宽度（1 ms、5 ms、10 ms）的CW激励和脉冲激励之下的上转换发射谱（在800nm归一化）。CW激励具有24 mW的平均功率（光束尺寸0.70 mm）。所有脉冲的峰值功率是24 mW（光束尺寸0.70 mm）。图12的插图示出434-674 nm的范围的放大部分。如图所示，当脉冲宽度是10 ms时，在来自CW和脉冲激励的谱之间的差异小于10%，表示达到了稳定状态或准稳定状态。

如图13（示出在具有31.04 mW的相同平均功率的CW和脉冲的激励之下的上转换谱）和图14（示出在不同的平均激励功率之下在具有5和10 ms脉冲宽度的脉冲激励之下在800 nm的信号的增益）所示，当脉冲宽度从5 ms增加到10 ms时，增益增加。

功率依赖的增益：

如图10所示，在增加功率密度时，在800 nm的发射的量子产率逐渐接近常数。因此，增益随着增加平均功率而减少。在平均功率处于量子产率为常数的范围内时，再也没有增益。如图15a-f、16所示，由于在上述上升时间期间的量子产率损失，我们甚至失去一些信号。

因为蓝色和红色发射在功率依赖性曲线中具有大的斜率（如图9所示），例如，在等式（5）中的n更大，因此功率-密度依赖的量子产率比800 nm发射（如图10所示）更高阶，并且它们更加难以得到饱和（如图9和图10所示），与此形成鲜明对比的是，它们的增益比800 nm的更大。如图17a-c、18a-b所示，即使在被考察的最大功率，对于红色和蓝色发射，仍然分别存在5.3和5.7倍的增益。

值得注意来指出的是，通过脉冲激励的增益与脉冲的参数相关。以上所有的结果都是通过方波脉冲激励得到的。不同的脉冲（例如三角形或正玄波）将会给出不同的结果，但是也可以期待信号增益。方波的工作循环（duty cycle）是另一个关键的参数，它决定可以得到怎样的最大增益。具有10 ms的脉冲宽度和100 ms的周期的脉冲具有10%的工作循环，所以对于800 nm发射的最大增益可以是10（1/工作循环）。实施例示出大约3.8倍的增益。通过使用更小的工作循环，可以显示更大的增益。因此，本公开通过使用小的工作循环来提供改进的增益，例如远低于50%的工作循环，它会仅允许2倍的增益。通过使用小的工作循环，提供实现最佳高峰值功率，以具有本文所述优点的成像能力。通过使用下文解释的单一脉冲激励，可以实现甚至更高的功率密度，从而利用上转换纳米粒子的高内在QY。当符合ANSI标准时，脉冲的激励相应地提供传递高功率密度。

功率-扫描（power-scanning）断层照相

在图9中示出的功率依赖性的变化可以被用来进行功率-扫描（power-scanning）断层照相，其使用单一的激励点和任意数量的检测点。该理念可以被简要地概括为功率-依赖性曲线的离散化，其中在每个被离散的区域，给出的斜率系数被用作输出以生成（模拟）预期的荧光。这可以被进一步用来进行断层照相重构，其以非常快的方式使用常规的优化方法，它仅利用功率-扫描激励源，而不用空间扫描。优点包括速度、无移动部分、以及简化的仪器。

总之，与具有相同的平均功率的CW激励相比，通过使用脉冲激励，上转换发射强度可以被增强。该增强源自使用具有更高效率的相同量的激励光子，其起因于上转换纳米粒子（这里为NaYF4:Yb³⁺,Tm3⁺）的功率-密度依赖的量子产率。该增益是脉冲宽度和功率依赖的。

这一提议的技术是更有效地利用上转换能力的通用方法。它不仅适用于Yb³⁺/Tm³⁺共同掺杂的上转换纳米粒子，还适用于任何上转换纳米或大块材料。它甚至更适用于更高阶的上转换发射，例如来自三光子过程的Tm³⁺的蓝色和红色发射。该方法可用于增强较短波长上转换发射，这对于生物组织中的光力学治疗是需要的。

上转换发射的功率-依赖性特征可以被用来进行使用单一激励点的功率-扫描断层照相。

通过组织体模中的脉冲激励的上转换信号增强

该技术的有效性还被组织体模中的测量确认，参考图19a-c。在由水、精制卵磷脂和墨制成的、具有减少的10 cm^-1的散射系数和0.5 cm^-1的的吸收系数的20 mm厚液体组织体模中进行实验。将具有2 mm的内径的、填充有NaYF4:Yb³⁺,Tm³⁺纳米粒子的正己烷胶体（c=1 wt%）的玻璃管插入进10 mm深的体模。使用两个激光源进行比较，分别是在975 nm的CW激光二极管和在相同波长的具有可调的脉冲宽度和周期的脉冲激光器。激光器的斑大小在直径上是1mm。对脉冲激光器使用了两个不同的设置：（a）设置1：5 ms脉冲宽度，250 ms 周期，Fig. 19b；（b）设置2: 10 ms脉冲宽度，500 ms周期，Fig. 28c。在图19a-c中示出在CW的激励或脉冲激励之下在800 nm取得的上转换发射图像。对于所有测量，保持了相同（100 mW）的平均功率。对于设置1和2，在脉冲激励之下的强度分别比在CW激励之下的强度高大约6和6.75倍。

图19a示出在具有100 mW的功率的CW激光二极管的激励之下在800 nm取得的图像。

图19b示出在具有100 mW的平均功率的脉冲激光器（方波，脉冲宽度5 ms，周期250ms）的激励之下在800 nm取得的图像。

图19c示出在具有100 mW的平均功率的脉冲激光器（方波，脉冲宽度10 ms，周期500 ms）的激励之下在800 nm取得的图像。

由脉冲的激励得到的更高强度由于上转换信号水平的提高而提供改进的成像。另外，脉冲的激励减少生物组织中的热作用，而维持提高的信号水平和改进的成像。例如，由激光器（峰值功率达到例如100W）的单次激发（10 ms – 100 ms）来生成强的峰信号，并随后关闭激励源，这将允许生物组织冷却，从而不会使组织过热但显著地提高发射信号。另外，与连续波激光二极管相比，还有可能使用具有脉冲的激励光的非常低功率的光源来对成像实现可接受的信号水平，前者会需要更高的功率来产生相同的效果。

利用脉冲的激励光的单次激发成像

上转换纳米粒子（UCNPs）的受限的量子产率（QY）（特别是在低的光条件下），是大多数潜在的生物应用的主要关注点。在该领域中的两个高效的技术是深部组织光学成像和光力学治疗（PDT），它们都需要高的QY。目前的低QY问题阻碍这些技术的潜力，其导致增加的医疗和数据采集时间和浅的适用深度。虽然，通过提高激励光水平可以一定程度上克服低QY，但这些改进对于CW激励来说是受限的，因为存在就组织发热（由ANSI标准调节）而言的副作用的风险。根据本发明的实施方式，通过采用脉冲的激励，提供突破上转换（UC）发射的低功率-密度极限但同时限制激励光的热作用。此外，可以通过利用单次激发激励方案进一步提升UCNPs的适用性。类似于多光子显微镜，脉冲的激励可以在脉冲期间提供高光子密度，同时使平均功率（意指负责发热的沉积能量）保持适中。由于UC发射的非线性功率-密度依赖性，脉冲的激励提供在本公开中讨论的有益效果。

本公开的实施例考虑到UC发射的激励动态，以克服证明低量子产率的先前技术。以下公开给出证明显著的QY提升的实验和拟真，这可以通过使用根据本发明的实施方式的方法、系统和系统应用中的脉冲的激励光而实现，例如，使用具有匹配的脉冲特征（即足够长的脉冲宽度和非饱和的跃迁）的脉冲的激励光，以提供有益效果。这使脉冲的激励成为对UCNPs的理想的激励方式，特别是对位置较深的组织体积。此外，由于增加的QY，可以实施UCNPs的单次激发成像，其中可以在数量级上缩短数据采集时间，而同时与引起相同温度提升的CW光激励相比提高成像深度。因此本公开具有从根本上拓宽UCNPs在依赖扩散光激励的深部组织区域的适用性的潜力。

可以使用速率方程来对激励动态建模。不失一般性地，在以下实施例中可以使用Yb³⁺/Tm³⁺掺杂的系统在800 nm的NIR UC发射作为模型。图29（a）示出随着不同功率密度的CW激励的在稳定状态条件的拟真QY。如图所示，QY随着激励功率-密度以复杂的方式而非纯粹线性的方式增加，并表现出逐渐饱和的特征，即在高激励功率-密度时接近常数。图29（b）呈现在第一脉冲周期在CW激励之下和在脉冲激励之下的拟真的时间累积。CW激励具有1 W/cm²的恒定的功率-密度。脉冲的激励具有2 Hz的频率和4%的工作循环，它在“打开”和“关闭”状态分别具有25 W/cm²和0 W/cm²的功率-密度，因此形成与CW激励相同的平均功率-密度。如图所示，在CW激励之下，在能级由于激励的瞬态效应而被填充时，UC发射在非常早的阶段具有恒定的QY预期。该恒定的QY与UC系统的稳定状态相关，并由在图2（a）中的1 W/cm²的功率-密度的QY给出。在脉冲的激励之下，在激光脉冲开始时QY时非常小的，然后随着时间增加。如果脉冲持续的长度允许，则QY将会超过在CW激励之下的QY，并渐进地接近最大值。该最大值受到在图29（a）中25 W/cm²的功率-密度的稳定状态的QY限制。显然，使用脉冲的激励来替代相当的CW激励的优点是，较迟的激励光子可以潜在地使用更高的能量转换效率，而代价是在每个脉冲周期较早的激励光子使用比CW激励中更低的效率。通过平衡在相同量的能量之下提高的功率-密度和降低的激励时间，可以期待总体的UC信号增益。

考察在脉冲的激励之下在多个周期中的长期QY，以确定脉冲宽度对潜在的信号增益的影响。平均的功率-密度被保持在0.1 W/cm²。除非另有说明，在该研究中使用的脉冲的激励具有相同的4%的工作周期，而它的频率被调节以实现不同的脉冲宽度。如图29（c）所示，在频率远低于50 Hz时，通过使用脉冲的激励，得到显著的UC信号增益。例如，在[0,500] ms的时间间隔中通过2-Hz方波的信号增益大约是8。信号增益随着频率而减少，即随着脉冲宽度而增加。在频率甚至更高的时候（例如达到100 Hz），由脉冲的激励产生的信号变得稍小于由相当的CW激励产生的信号。应该注意的是，信号增益随着施加的功率-密度而减少。当平均功率-密度被减少至1 W/cm²的时候，增益下降至2。如图29（a）所示，这可以归因于UC发射的逐渐饱和特性。

为了实验上验证如以上拟真所示的由于脉冲激励的信号增益，在被分散于正己烷的胶状的稳定的核-壳NaYF4:Yb³⁺,Tm³⁺@NaYF4 UCNPs上进行实验。如图3（b）所示，制备的UCNPs在975-nm光的激励之下在大约800 nm发射主要UC发射带。记录在CW激励之下和在具有不同的脉冲宽度的脉冲激励之下该NIR UC发射的强度。激励光的平均功率-密度被保持在0.12 W/cm²。如图26（a）所示，通过使用甚至具有0.8 ms的脉冲持续时间的脉冲激励，得到信号增益，它随着脉冲宽度而单调增加。当脉冲宽度达到20 ms时，增益高至8.7。这些结果与在图29中呈现的拟真的结果非常一致。值得注意来指出的是，在当前例子（∼0.8 ms）中对信号增益所需的脉冲宽度远短于UC发射的提升时间，大约是在图26（a）的插图中示出的10 ms。

还使用具有固定的20 ms的脉冲宽度和500 ms的周期的方波激励，以及相当的CW激励，考察UC信号增益对施加的功率-密度的依赖性。图26（b）示出通过在不同的平均激励功率-密度下的脉冲激励的UC信号增益，其中清楚地示出随着增加的激励功率密度的下降趋势。在被考察的最小功率-密度（~0.12 W/cm²），信号增益大约是8.6，而在最大功率-密度（~4.65 W/cm²），由脉冲的激励产生的UC信号稍弱于由CW激励产生的信号。如图26（b）的插图所示，与在CW激励之下的相比，UC发射强度对于激励功率-密度的依赖性表现出更小的斜率。这可以解释上述信号-增益趋势。增加激励功率-密度的放大效应在此从本质上源于UC发射的非线性功率-密度依赖性。因此，更高阶的功率-密度依赖性会形成更大的UC信号增益。这被对蓝色和红色UC发射的测量所证实，它们都通过三光子激励过程而生成。如图30所示，在任意给定的平均功率-密度，与NIR UC发射相比，它们表现出显著地更大的信号增益。

随后在液体组织体模中验证使用脉冲源作为激励方式来对位置较深的UCNPs成像的优点。体模由水、精制卵磷脂和墨制成，它由光子飞行时间光谱（pTOFS）系统确定以在975nm具有减少的µ’_s = 10.1 cm^-1的散射系数和µ_a = 0.52 cm^-1的吸收系数，并具有17 mm的厚度。将具有2 mm的内径的、包含胶态的核壳UCNPs（c = 1wt%）的玻璃管作为发光内含物插入进体模，以模拟真实组织内的UCNP标记的靶标（例如肿瘤）。两个975-nm激光器包括CW激光二极管和具有20 ms的脉冲宽度和500 ms的周期的脉冲激光器，将其中一个用来提供激励光。照射在组织体模的表面上的平均功率-密度对于两种激励方式都是1.2 W/cm²。将激励源和检测器放置在反照明几何形状中。

如图27（a）所示，当被埋在离源10 mm的深度的时候，即使使用10 s的暴露时间，在CW激励之下发光内含物几乎不可检测，然而如图27（b）所示，通过使用脉冲激励，在相同的检测条件之下，信号-背景比值被显著地提高大约7倍。显著的意义在于，如果将信号质量保持为相当的CW激励，则可以显著地减少数据收集时间并可以增加成像深度。通过使用提供甚至更高的功率-密度的单一脉冲作为激励，可以进一步优化UC发射的QY。例如，对于具有20 ms的脉冲宽度和2 Hz的频率的重复的脉冲激励，在975 nm对于暴露至人类皮肤的最大允许功率-密度是17.4 W/cm²，而参照补充材料，对于50-ms单一脉冲的数值高达36.9 W/cm²。这种具有比UC发射的上升时间更长的脉冲宽度的强单一脉冲使得UCNPs能够被用在就能量转换而言非常有效的方式中。这种激励方式会改进使用UCNPs的成像能力而不违反ANSI标准。

在实验上考察单次激发成像的可行性。使用50-ms单一脉冲，它提供36.9 W/cm²的激励功率-密度。如图27（d）所示，当发光内含物被置于离源13 mm的深度时，使用具有1 s的暴露时间的单一脉冲激励（即使使用落射荧光成像设置），它能够仍然被相对较好地检测。如图27（c）所示，虽然，当使用CW激光器作为激励源时，也通过ANSI标准在相同的照明区域上输出最大允许功率密度（即709.6 mW/cm²），但是即使使用10 s的长得多的暴露时间，也完全不能检测内含物。只要激励源和检测器是同步的，则对于单一脉冲激励的暴露时间可以被缩短至50 ms，而仍然没有US信号质量上的损失。在此证明的实施例显示单次激发UCNP激励在UCNP引导的深部组织光学成像中的巨大潜力。

因此可以根据本发明的实施例，通过采用脉冲的激励以显著提高QY，可以实现深部组织体模中的UCNPs的单次激发成像。脉冲的激励方法因此极大地提高了UCNPs的适用性，不仅是在扩散光学成像中，也在许多其他生物医学应用中，例如光力学治疗和深部组织中的生物分子的远程激活。另外，金属纳米结构在增强UC发射中可以是有效的，这是由于它们通过表面电浆子耦合的局部场增强效应。由于在增加激励功率-密度中的协同效应，结合脉冲的激励和通过金属纳米结构的修饰，因此可以允许在扩散光机制中使用UCNPs的主要方案。根据本发明的一个实施例的方法100因此可以包括以下步骤：在所述介质提供117金属纳米结构以暴露至所述脉冲的激励光。脉冲的激励方法还将增加来自离子（例如Eu³⁺和Tb³⁺）的迁移介导的UC发射在生物应用中的适用性，这是由于它们通过被激励的Tm³⁺的高阶多元逐步激励。此外，本公开提供用于促进非线性荧光团（包括UCNPs和基于上转换的三重态-三重态湮灭）在低光条件下的应用的通用方法，其通过增加通过受限的照明区域的激励注量率。

方法100可以因此包括以下步骤：通过第一脉冲201（即包括光的至少一个脉冲的脉冲的激励光）激励104非线性发光标记物；以及进一步包括以下步骤：检测106由于来自所述第一脉冲的所述激励光而来自发光标记物的发光，用于提供来自第一脉冲的单一脉冲发光分子成像。该单一脉冲成像提供相对于CW激励的多个上述优点。

方法100可以包括以下步骤：将所述至少一个脉冲的脉冲特征（例如脉冲的长度（w））与非线性发光标记物的能级跃迁条件进行匹配102，以基本上提供与上转换光的发射相关的所述非线性发光标记物的能级的期望的集群（population），使得能够以非常有效的方式产生所述上转换光。因此考虑在激励/发射过程中涉及的能级跃迁的动态，以适应脉冲的特征，即从而提供发光的足够和优化的强度。可以定制脉冲特征以提供特定的条件，能级的集群通过该条件遵循期望的方案，例如通过考虑在发射过程中涉及的被激励状态的生命期的持续时间。方法100因此可以包括以下步骤：确定116所述脉冲的激励光的脉冲宽度和/或脉冲波形，以提供所述非线性发光标记物的激励。

在本文中，方法100可以包括以下步骤：确定104脉冲的激励光的脉冲长度（w），使其处于对在上转换光的发射中涉及的能级提供激励的范围内。脉冲的长度可以根据能级的生命期的计算而确定。在一系列脉冲中的每个脉冲的长度可以在大约1-100 ms的范围内。系统600因此可以包括处理单元603，它作用来根据所述非线性发光标记物的能级跃迁条件的计算（诸如生命期计算）而确定所述激励光的脉冲长度。

方法100可以包括以下步骤：确定104脉冲的激励光的脉冲长度（w），使其对单一脉冲发光分子成像（例如与图27d相关地描述的）处于约20-200 ms的范围内。

方法100可以包括以下步骤：确定115被检测的发光对所述激励光的功率的依赖性，以设置所述脉冲的激励光的预定的特征。

参照图26a，通过使用短如0.8ms的脉冲宽度，可以得到信号增益。此外，最佳的脉冲宽度是材料依赖的。例如，对于Yb³⁺/Er³⁺共同掺杂的材料的最佳持续时间会比对于Yb³⁺/Tm³⁺共同掺杂的材料的短，因为与Tm³⁺离子的相比，Er³⁺离子的中间能量状态通常具有短的生命期。

具有大约100 us的脉冲宽度将通常不会提供足够的信号增益。

比相关的生命期更长的脉冲长度在提供改进的量子产率并因此改进成像能力中可以是有利的。可以通过具有0.8 ms的脉冲长度而同时具有大于0.8 ms的生命期，来依然提供增益。通过使用脉冲的激励的增益本质上源自更高的峰值功率密度。太短的脉冲长度将会“吃掉”由更高的峰值功率密度带来的利益。当对应于0.4 ms脉冲宽度使用100 Hz、50%工作循环脉冲时，不存在通过对具体纳米粒子使用脉冲激励的信号增益。用于激励上转换纳米粒子的飞秒或微秒脉冲激光器没有显示如本公开提供的信号增益。对于脉冲宽度的上限，要担心的是，如果脉冲长度很大（因为通常工作循环对于该技术来说是小的），则检测系统会等待太长的时间。例如，对于具有100 ms脉冲宽度和10%工作循环的脉冲激励，在采集由激光器产生的下个周期发光信号之前的等待时间是900 ms。这是可接受的。但是如果它更长，则在实验时间上是不经济的。

对于单一脉冲激励，提高脉冲长度可以是有利的。要担心的是，激光器在传递单一脉冲之后将休息相当一段时间，所以将仅在该间隔中产生发光信号。如果脉冲持续时间太短，则从组织的表面逃离的产生的发射光子会太少而不能给出良好的信号（但是与相当的CW激励相比，仍然存在QY增加）。对于单一脉冲的优选的持续时间的间隔可以是20-200 ms。如果单一脉冲太长，则它会太像CW源。在该情况中，根据ANSI标准不会允许优选使用高峰值功率密度。

现在参照图22-25。方法100可以包括以下步骤：改变109作为时间（t）的函数（如图23所示，参照功率密度曲线206、207）的脉冲的激励光的功率密度（I），确定110发光对所述功率密度的量子产率依赖性（(Q/I），并根据量子产率依赖性确定111在散射介质中标记物位置的相对深度坐标203。可以使用具有不同功率密度的如图20所示的一系列的脉冲（w1、w2）作为激励光。可以对每个脉冲计算量子产率，并确定如图25中所示的依赖性（Q/I）。如在图22中分别对标记物209和208示出的，根据量子产率是如何随着激励光的功率密度的改变而改变的，有可能确定标记物是位于介质中相对深的还是浅的位置。如图25中的Q/I曲线所示，与具有较深位置205的标记物209相比，随着功率密度改变，在介质中具有较浅位置204的标记物208将表现出在发光量子产率上更小的变化。方法100可以包括：根据量子产率依赖性的导数（dQ/dI）确定112相对深度坐标203。并且方法100可以相应地包括：通过分别具有第一和第二功率密度（I₁、I₂）的第一和第二脉冲201、202依次激励113非线性发光标记物，并根据来自第一和第二脉冲的量子产率中的变化来确定114相对深度坐标203。这允许在不同深度的标记物之间进行区分，而不用考虑它们的相对尺寸的影响。系统600因此可以包括控制单元602，它作用来改变作为时间（t）的函数的脉冲的激励光的功率密度，还可以包括第二处理单元604，它作用来确定发光对功率密度的量子产率依赖性（Q/I），并根据所述量子产率依赖性来确定在散射介质中标记物位置的相对深度坐标203。

系统600可以包括控制单元605，它用于执行上述方法100。另外，根据本公开提供用于执行方法100的系统600的用途。更具体地，系统600的用途被公开用于片剂的发光成像或者发光断层照相、和/或用于扩散光学成像、和/或光力学治疗和/或深部组织中的生物分子的远程激活、和/或单次激发深部组织成像、和/或用于小动物的活体内或活体外发光成像或发光断层照相、和/或通过所述发光成像或者发光断层照相的功能诊断（诸如癌症诊断）、和/或使用所述非线性发光标记物作为探针的包括受激发射损耗（STED）或单分子检测的超高分辨率显微镜术。

脉冲的激励在基于上转换纳米粒子的光力学治疗中的潜在用途

这一提议的技术是更有效地利用上转换能力的通用方法。它不仅适用于Yb³⁺/Tm³⁺共同掺杂的上转换纳米粒子，还适用于任何上转换纳米或大块材料。它甚至更适用于更高阶的上转换发射，例如来自三光子过程的Tm³⁺的蓝色和红色发射。该方法特别可用于增强较短波长上转换发射，这对于基于上转换纳米粒子的生物组织中的光力学治疗是需要的。上文已经参照具体实施例描述了本发明。然而，除了上述实施例之外的实施例在本发明的范围内同样是可能的。可以在除了上述组合之外的组合中组合本发明的不同特征和步骤。本发明的范围仅受所附专利权利书的限制。

可以对有生命的人体或者动物体在活体内执行该方法。在该情况下，可以用任何方式（诸如通过向血流中注入或者向肿瘤中皮下或者直接注入或者代之以通过局部涂敷、侵肺和其他非入侵方法）向身体中预先引入（preintroduce）标记物。可以与剩余方法分开进行此类预先引入。可以与剩余方法结合、但是在其之前不久进行此类预先引入。

替代地或者除此之外，可以对在执行该方法之后牺牲的人体或者动物体执行该方法。

替代地或者除此之外，可以对无生命的人体或者动物体或者身体的部分（例如脑部死亡的人体或者动物体）在体外执行该方法。

替代地或者除此之外，可以在非医学领域（诸如过滤器或者片剂）执行该方法。

使用UCNP作为探针的超分辨率显微镜术

超分辨率显微镜术最近已经被开发并且成为许多生物研究的非常感兴趣和有用的工具。有两种超分辨率显微镜术，一种依赖于非线性光学效应而另一种依赖于单分子检测。它们都具有的共同点是，被选择的分子提供信号，而其他分子被过滤掉。第一个类别包括受激发射损耗（STED）和饱和结构照明显微镜术（SSIM），而单分子检测包括PALM（光激活定位显微镜术）、FPALM（荧光光激活定位显微镜术）、和STORM（随机光学重建显微镜术）。超分辨率显微镜术的第一个类别利用探针能够发光，而附近的探针可以被制得不发光。对于这些附近的探针被激励的状态将会被减少数量（depopulated）。该程序对使用的探针设置要求，其中一个是，它必须是极度光稳定的（因为这是需要相对高的激励功率的非线性效应）、无闪烁（因为在激活状态的所有时间内它们应该是激活的）并且应该具有探针能够被光切换至的数个能级。UCNP可以是对STED的理想探针，它具有独有的特性，满足这些要求。

另一个类别依赖于探针能够被光切换至其他能级并变得非激活。这是具有低光级别的单分子机制。它也可以依赖于自发的光闪烁。UCNP可以成为这些技术感兴趣的探针，它具有在这些探针中的许多能级。

出于所有目的将以下参考文献通过整体引用结合于此。

[Ref. 1] C. T. Xu, J. Axelsson, and S. Andersson-Engels, Appl. Phys.Lett. 94, 251107 (2009)。

[Ref. 2] J. P. Culver, V. Ntziachristos, M. J. Holboke, and A. G.Yodh, Opt. Lett. 26, 701 (2001)。

[Ref. 3] E. Alerstam, S. Andersson-Engels, and T. Svensson, J.Biomed. Opt. 13, 041304 (2008)。

Claims

1.一种通过扩散发光分子成像对散射介质中的区域成像的方法（100），所述方法包括：

提供（101）在所述区域在标记物位置处所述散射介质中的至少一个非线性发光标记物；

一个或者多个光源从至少一个光源位置向激励体积中发射的激励光激励（103）所述非线性发光标记物，以及检测器在发光光检测位置检测（107）由于所述激励光而来自所述发光标记物的发光，其中所述激励光包括脉冲的激励光；

将所述至少一个脉冲的长度（w）与在所述非线性发光标记物的发射过程中涉及的被激励状态的生命期的持续时间匹配（102），以提供与上转换光的发射相关的所述非线性发光标记物的能级的期望的方案的集群，使得以有效的方式产生所述上转换光。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脉冲的激励光包括光的至少一个脉冲，并且所述方法包括：

通过第一脉冲（201）激励（104）所述非线性发光标记物，并且

检测（106）由于来自所述第一脉冲的所述激励光而来自所述发光标记物的发光，以提供来自所述第一脉冲的单一脉冲发光分子成像。

3.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括：确定（104）所述脉冲的激励光的脉冲长度（w），使该脉冲长度在约1-100 ms的范围内。

4.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括：确定（104）所述脉冲的激励光的脉冲长度（w），使对于所述单一脉冲发光分子成像该脉冲长度在约20-200 ms的范围内。

5.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括以下步骤：在时间上延迟（105）发光的检测。

6.根据权利要求5所述的方法，所述方法包括以下步骤：检测（108）在所述激励光的脉冲之后的时间间隔（210）期间的所述发光。

7.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括：

改变（109）作为时间（t）的函数的所述脉冲的激励光的功率密度（I），

确定（110）发光对所述功率密度的量子产率依赖性（Q/I），

根据所述量子产率依赖性确定（111）在所述散射介质中所述标记物位置的相对深度坐标（203）。

8.根据权利要求7所述的方法，所述方法包括：根据所述量子产率依赖性的导数（dQ/dI）确定（112）所述相对深度坐标。

9.根据权利要求7所述的方法，所述方法包括：

通过分别具有第一和第二功率密度（I₁，I₂）的第一和第二脉冲（201，202）依次激励（113）所述非线性发光标记物，

根据来自所述第一和第二脉冲的所述量子产率中的变化确定（114）所述相对深度坐标。

10.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括：确定（115）所述检测的发光对所述激励光的功率的依赖性，以设置所述脉冲的激励光的预定的特征。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：

提供在所述光源位置与所述标记物位置之间的移动，并且

基于所述检测的发光对激励光强度的非线性依赖性和相对于所述标记物位置的所述光源位置对所述发光标记物成像；其中所述非线性依赖性由以下关系给定：

L=k*E^x，

其中E是所述激励体积中的激励光强度，

L是来自所述发光标记物的发光光强度，

k是正常数，

x是大于一的正数。

12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，所述方法包括：在多个所述光源位置之间扫描所述激励光，使得所述光源位置相对于所述标记物位置移动。

13.根据权利要求12所述的方法，所述方法包括：

检测用于所述多个光源位置中的每个光源位置的所述发光，所述发光具有所述发光标记物的用于所述多个光源位置中的每个光源位置的总发光强度，

通过产生用于所述多个光源位置中的每个光源位置的所述总发光强度的图像对所述发光标记物成像。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述多个光源位置形成网格图案，所述发光标记物在所述网格图案上具有投影区域，其中所述投影区域少于所述网格图案覆盖的区域，并且其中所述激励体积基本上局部化为所述多个光源位置中的每个光源位置，使得如果所述光源位置与所述投影区域部分地重叠，则部分地激励所述发光标记物。

15.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，所述方法包括：

由具有第一波长的第一光源从第一光源位置激励所述发光标记物，

由具有第二波长的第二光源从第二光源位置激励所述发光标记物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一和第二光源同时激励所述发光标记物。

17.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述扩散发光成像包括扩散发光断层照相、和/或使用单一激励点的功率-扫描断层照相。

18.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，所述方法包括：在所述介质提供（117）金属纳米结构以暴露至所述脉冲的激励光。

19.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，所述方法包括：通过所述脉冲的激励光远程激活生物分子。

20.一种用于散射介质中的感兴趣区域的扩散发光分子成像的系统（600），所述系统包括用于在所述散射介质的所述发光分子成像中使用的发光标记物（502），其中所述发光标记物是布置于所述散射介质中的非线性发光标记物，所述系统包括：

一个或者多个光源（503），由至少一个光源位置（505，506）定位用于通过由所述一个或者多个光源向激励体积中发射的激励光来激励所述发光标记物，

检测器（504），在发光光检测位置检测由于所述激励光而来自所述发光标记物的发光，其中所述激励光包括脉冲的激励光，

处理单元（603），作用来根据诸如生命期计算之类的所述非线性发光标记物的能级跃迁条件的计算确定所述激励光的脉冲长度，以及

控制单元（605），将所述至少一个脉冲的长度（w）与在所述非线性发光标记物的发射过程中涉及的被激励状态的生命期的持续时间匹配（102），以基本上提供与上转换光的发射相关的所述非线性发光标记物的能级的期望的方案的集群，使得以有效的方式产生所述上转换光。

21.根据权利要求20所述的系统，所述系统包括检测单元（601），该检测单元作用来检测在所述激励光的脉冲之后的时间间隔（210）期间的所述发光。

22.根据权利要求20所述的系统，所述系统包括：

控制单元（602），该控制单元作用来改变作为时间（t）的函数的所述脉冲的激励光的功率密度，

第二处理单元（604），该第二处理单元作用来确定发光对所述功率密度的量子产率依赖性（Q/I），并根据所述量子产率依赖性确定在所述散射介质中所述标记物位置的相对深度坐标（203）。

23.根据权利要求20所述的系统，其中所述发光标记物是发光生物标记物，并且所述散射介质是人类或者动物的组织，所述发光生物标记物布置于所述组织中。

24.根据权利要求20所述的系统，其中所述发光标记物包括纳米大小的上转换粒子，所述纳米大小的上转换粒子是由Yb³⁺/Er³⁺或者 Yb³⁺/Tm³⁺共同掺杂的四氟化钇钠（NaYF₄）。

25.根据权利要求20所述的系统，其中所述发光标记物包括纳米大小的上转换粒子，所述纳米大小的上转换粒子包括水可溶的粒子、和/或由极性结构涂覆的粒子、和/或具有附着到所述上转换粒子的表面上的羟基团的粒子。

26.根据权利要求20-25中任一项所述的系统，其中所述发光标记物具有保护涂层、和/或是生物功能化的。

27.根据权利要求20-25中的任一项所述的系统，其中设计所述系统用于发光分子断层照相。

28.根据权利要求20-25中任一项所述的系统，其中所述非线性标记物附着到用于与所述发光成像的模态不同的成像模态的造影剂。

29.根据权利要求20-25中任一项所述的系统，其中所述非线性标记物附着到具有顺磁性质的有机钆络合物或者钆化合物，并且其中所述系统还包括用于通过MRI和发光分子断层照相对所述感兴趣区域同时成像的磁共振成像（MRI）装置。

30.根据权利要求20-25中任一项所述的系统，其中具有第一波长的第一光源从第一光源位置和具有第二波长的第二光源从第二光源位置提供所述激励光。

31.根据权利要求30所述的系统，其中所述第一和第二光源同时提供所述激励光。

32.根据权利要求20-25中任一项所述的系统，所述系统包括用于执行根据权利要求1-19中任一项所述的方法的控制单元（605）。

33.一种根据权利要求20-32中任一项所述的系统用于执行根据权利要求1-19中任一项所述的方法的用途。

34.一种根据权利要求20-32中任一项所述的系统用于片剂的发光成像或者发光断层照相、和/或用于扩散光学成像、和/或光力学治疗和/或深部组织中的生物分子的远程激活、和/或单次激发深部组织成像、和/或用于小动物的活体内或者体外发光成像或者发光断层照相、和/或通过所述发光成像或者发光断层照相用于诸如癌症诊断之类的功能诊断、和/或使用所述非线性发光标记物作为探针的包括受激发射损耗（STED）或单分子检测的超高分辨率显微镜术的用途。