JP6443934B2 - 散乱媒体中の改善された拡散ルミネセンスイメージングまたは断層撮影法のためのシステム - Google Patents

Description

本発明は、一般的に吸収若しくは散乱媒体中のフォトルミネッセンス・イメージング又はフォトルミネッセンス・断層撮影法、及びとりわけそのようなイメージングのための方法およびシステムに関する。

光ルミネセンスイメージング（簡単に言えば、ルミネセンスイメージング）または光ルミネセンス断層撮影（簡単に言えば、ルミネセンス断層撮影）にとって興味のある散乱媒体の一例は生体組織である。組織光学は、光とそのような組織との相互作用の研究に専念する分野である。最近の数十年にわたり、この分野は急速に発展してきた。光−組織相互作用の知見が増大するとともに、組織光学を診断ツールとして応用することへの関心も出て来ており、基礎研究からの成果が得られている。

本開示が部分的に扱っている組織光学の分野は、ヒトまたは動物の生体内イメージングのための非侵襲的手法である光ルミネセンス断層撮影を含む光ルミネセンスイメージングである。これらのイメージング手法はルミネセンスベースであり、ルミネセンス生物学的マーカーの励起のための外部光源を必要とする。

光ルミネセンスは、物質が光子を吸収し、次に光子を再放射するプロセスである。ルミネセンスの特定の形態がルミネセンスであり、一般に放出される光子は照明に使用されたものよりも低いエネルギーのものである。したがって、ルミネセンスでは、ルミネセンス波長が、照明した光の波長を基準としてより長い波長にストークスシフトされる。

ルミネセンスイメージングは既知であり、例えば、ある期間にわたって小動物内での薬からの生物学的応答を研究するのに小動物を犠牲にする必要なしに使用することができる。

Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ、Ｃｈａｌｆｉｅ、およびＴｓｉｅｎは、非常に重要なルミネセンスマーカーになった緑色ルミネセンスタンパク質の発見および発展に対して２００８年にノーベル賞を授与された。

しかしながら、これまで、吸収及び散乱媒体での拡散ルミネセンスイメージング又は断層撮影法のためのルミネセンス分子イメージングおよび断層撮影は、多くの欠点に苦しんでいる。それらは例えば低分解能又はコントラストを有しており、それはイメージング結果に基づく診断のタスクを困難にしている。

前の技術に関するさらなる問題は、低い量子収量、浅いイメージング深度、長いデータ収集回および熱の副作用である。Ｃｈｒｓｔｉａｎ Ｆ．Ｇａｉｎｅｒらの「Ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｕｐｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ＮａＹＦ４： Ｅｒ３＋， Ｙｂ３＋ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ」（ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ ＯＦ ＳＰＩＥ， ｖｏｌ． ８２３１，１〜８頁）は、ナノ粒子から発光された光の色を制御する方法を開示している。この論文は色を変化させるための励起光の繰り返し率を制御することに焦点を当てている。赤色発光に対する緑色発光の割合（ＧＰＲ）は、回析制限スポットの周辺で繰り返し率が１４０Ｈｚから８０ＭＨｚまで増加するにつれて、減少する。
Ｌ Ｍａｒｔｉｎｎｅｚ Ｍｅｓｔｒｏらの「Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ」（Ｏｐｔｉｃｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ， ２０１０−１１−０８， ２３５４４〜２３５５３頁）は、蛍光発光バイオイメージングにおけるアップコンバーティング・ナノ粒子の研究であって、前述のナノ粒子の赤外線から可視光線の変換効率はＣｄＳｅ量子ドットと金のナノロッドの変換効率を超える。
Ｃａｎ Ｔ．Ｘｕらの「Hｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｆｌｉｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｗｉｔｈ Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｕｐｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」（ＡＣＳ ＮＡＮＯ， ｖｏｌ． ６， ｎｏ． ６， ４７８８〜４７９５頁）は、剛性され、造影剤として採用されたアップコンバーティングナノ粒子を開示しており、発光は励起のパワーに二次的に依存していることを示している。
Ｌｕｉ Ｈらの「Ｍｕｌｔｉｂｅａｍ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｉｆｆｕｓｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｕｓｉｎｇ ｕｐｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」（ＯＰＴＩＣＳ ＬＥＴＴＥＲＳ， ＴＨＥ ＯＰＴＩＣＡＬ ＳＯＣＩＥＴＹ， ｖｏｌ． ３５， ｎｏ．５， ７１８〜７２０頁）アップコンバーティングナノ粒子を用いる蛍光拡散光学断層写真術を開示している。
Ｃｈｒｓｔｉａｎ Ｆ．Ｇａｉｎｅｒらの「Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ａｎｄ ｒｅｄ ｕｐｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ＮＹＦ４：Ｙｂ３＋，Ｅｒ３＋ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｂｙ ｅｘｃｉａｔｔｋｉｏｎ ｍｏｄｕａｌｔｉｏｎ」（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ．２１，ｎｏ．４６， １ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１１ （２０１１−０１−０１），１８５３０頁）は、ナノ粒子から発光された光の色を制御する方法を開示している。ＧＲＲ率は、中間及び低いレンジの周波数値に対するパルス長が増加するにつれて減少する。この依存性は、パルス幅の増加に伴って減じ、〜４００ｎｓより長いパルスに対しては略存在しなくなる。

Ｘ．Ｇａｏ等、"Ｉｎ ｖｉｖｏ ｃａｎｃｅｒ ｔａｒｇｅｔｉ ｎｇ ａｎｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｑｕａｎ ｔｕｍ ｄｏｔｓ"、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２２、８：９６９〜９７６、２００４ Ｇ．Ｙｉ等、"Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｚｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ＮａＹＦ４：Ｙｂ，Ｅｒｉｎｆｒａｒｅｄ−ｔｏ−ｖｉｓｉｂｌｅ ｕｐ−ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｓ"、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４、１１：２１９１〜２１９６ 、２００４ Ｃ．Ｔ．Ｘｕ、Ｊ．Ａｘｅｌｓｓｏｎ、およびＳ．Ａｎｄｅｒｓｓ ｏｎ−Ｅｎｇｅｌｓ、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．９４、２５１１０７ （２００９） Ｊ．Ｐ．Ｃｕｌｖｅｒ、Ｖ．Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ、Ｍ．Ｊ．Ｈｏｌｂｏｋｅ、およびＡ．Ｇ．Ｙｏｄｈ、Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．２６、７０１（２００１） Ｅ．Ａｌｅｒｓｔａｍ、Ｓ．Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ−Ｅｎｇｅｌｓ、およびＴ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．１３、０４１３０４（２００８）

したがって、前述の欠点の改善による増大した有効性を特に可能にする改善された拡散ルミネセンスイメージングあるいはルミネセンス断層撮影装置および方法に対するニーズがある。

したがって、本発明の実施形態は、好ましくは、単独または任意の組合せで、添付の特許請求の範囲によるシステム、方法、および使用法を提供することによって、上述で確認されたような当技術分野における１つまたは複数の欠陥、欠点、または問題を緩和、軽減、または除去しようと努力するものである。

本発明の第１の態様によれば、拡散ルミネセンス分子イメージングによって散乱媒体中の領域を画像化する方法が提供される。この領域は、散乱媒体中でマーカー位置に配置された少なくとも１つのルミネセンスマーカーを含み、ルミネセンスマーカーは非線形ルミネセンスマーカーである。前記方法は、ルミネセンス光検知位置で検出器によって励起光によりルミネセンスマーカーからのルミネセンスを検知して、少なくとも１つの光源位置から１つ以上の光源によって励起容積部に発せられた励起光によってルミネセンスマーカーを励起することを含み、該励起光はパルス励起光を含む。

本発明の第２の態様によれば、散乱媒体中の注目する領域の拡散ルミネセンス分子イメージングのためのシステムが提供される。このシステムは散乱媒体のルミネセンス分子イメージングで使用するためのルミネセンスマーカーを含み、ルミネセンスマーカーは散乱媒体中に配置された非線形ルミネセンスマーカーである。このシステムは、１つまたは複数の光源によって励起体積中に放出された励起光によってルミネセンスマーカーを励起するために、少なくとも１つの光源位置によって位置づけられた１つまたは複数の光源を備える。システムは、励起光によりルミネセンスマーカーからのルミネセンスを検知するルミネセンス光検知位置で検出器を含み、該励起光はパルス励起光を含む。

実施形態では、ルミネセンスマーカーは、照明波長の入射光をアップコンバートするように構成された非線形ルミネセンスマーカーの群に含まれ、その結果、前記ルミネセンスマーカーが前記入射光で照明されると、ルミネセンスが前記照明波長よりも短いルミネセンス波長で生じる。

ルミネセンスマーカーは、いくつかの実施形態では、生物学的ルミネセンスマーカーである。

発明の別の態様によれば、発明の第２の態様のシステムの使用は、タブレットのルミネセンスイメージング又は断層撮影のため、及び／又は拡散光学イメージング及び／又は光線力学療法及び／又は深い組織内の生体分子の遠隔活性のため及び／又は小動物のｉｎ−ｖｉｖｏ又はｉｎ−ｖｉｔｒｏのルミネセンスイメージングあるいはルミネセンス断層撮影法及び／又は前述のルミネセンスイメージングあるいはルミネセンス断層撮影法及び／又はによる癌診断、および（または）プローブとして前記非線形のルミネセンスマーカーを使用する誘発発光減損（ＳＴＥＤ）あるいは単一の分子検出を含む高分解顕微鏡法などの機能的診断法のために提供される。

一実施形態では、非線形マーカーが別のイメージングモダリティのために画像化造影剤に付加される。例えば、非線形マーカーは、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、Ｘ線などのような従来のイメージングモダリティで画像化するために造影剤に付加される。特定の実施形態では、非線形マーカーは、常磁性を有する有機ガドリニウム複合体またはガドリニウム化合物に付加される。

本発明のさらなる実施形態が従属クレームで規定され、本発明の第２およびそれに続く態様の特徴は準用して第１の態様と同様である。

いくつかの実施形態は増加したエミッション強度を提供する。

いくつかの実施形態は、拡散ルミネセンス分子イメージングおよびルミネセンス分子断層撮影の解像度の向上を可能にする。

いくつかの実施形態はタブレットの成分の分布の決定を可能にする。例えば非線形ルミネセンスマーカーまたはルミネセンス体はタブレットの活性成分に付加することができる。それに
より、活性成分の空間分布を有利には決定することができる。

いくつかの実施形態は、非線形マーカーがＭＲＩ造影剤として使用される場合、医用磁気共鳴映像のコントラストの増強を可能にする。同時に、ルミネセンスイメージングまたは断層撮影を行い、注目する生体内の全く同一の領域の高解像度ＭＲＩと組み合わせた機能的診断情報を可能にすることができる。

いくつかの実施形態は、ナノ粒子をアップコンバートすることを用いるときに、増加した量子収量を提供する。

いくつかの実施形態は、シングルショットの深い組織イメージングを提供する。

いくつかの実施形態は大きなイメージング深さと短いデータ収集回数を提供する。

いくつかの実施形態は、励起光の熱の副作用の抑えることを提供する。

いくつかの実施形態は、拡散光学イメージング、光線力学療法および深い組織における生体分子の遠隔活性を提供する。

いくつかの実施形態は、バックグラウンドなしの信号を提供する。

「備える、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）／備えている、含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用されるとき、述べられるフィーチャ、整数、段階、または構成要素の存在を明示するために使用されるが、１つまたは複数の他のフィーチャ、整数、段階、構成要素、またはそれらのグループの存在または追加を排除しないことが強調されるべきである。

本発明の実施形態が可能にするこれらおよび他の態様、特徴、および利点は、添付図面
を参照する本発明の実施形態の以下の説明から明らかであり、解明されるであろう。

図１はシャブロンスキー図である； （ａ）は放射エネルギー及び非放射エネルギー伝達の概要の例証図であり、（ｂ ）は共振エネルギー伝達及び非共振エネルギー伝達の概要の例証図であり、（ｃ）はＥＴ Ｕ（左）およびＥＳＡ（右）のアップコンバージョンの比較の例証図である。 図３Ａは、アップコンバージョンナノクリスタルのＹｂ３＋−Ｔｍ３＋イオン 対中のプロセスの概要の例証図； 図３Ｂは図３Ａのアップコンバージョンナノクリスタルおよびアップコンバー ジョンエミッションの励起パワー密度依存性の発光スペクトルを示すグラフである； 面映像法インプリメンテーションの概要の例証図であり、（ａ）〜（ｂ）は発ルミネセンス団イメージング（ｅｐｉ−ルミネセンス）に使用されたセットアップ、（ｃ） はルミネセンス拡散光断層撮影用の他のセットアップの例証図、（ｄ）は透視法で発ルミネセンス団再構築に使用されるセットアップ。 （ａ）は線形及び非線形の発ルミネセンス団によるルミネセンスイメージングの 違いの概要の例証図であり、（ｂ）は線形及び非線形の発ルミネセンス団によるルミネセンスイメージングの違いの概要の例証図であり、（ｃ）は線形及び非線形の発ルミネセンス団によるルミネセンスイメージングの違いの概要の例証図である。 図６は、単光束方式励起および結合した単光束方式励起および２重のビームの励 起のための、ウエイトマトリクスＷの正規化された単一値分布を示すグラフである。 ７ａは単光束方式イメージだけを用いる（１０Ａ）ナノ粒子をアップコンバート する三次元の再構築であり、７ｂは単光束方式および２重のビーム像の両方を使用する（ １０Ｂ）三次元の再構築である。 図８は、７５ｎｍの励起の下のＮａＹＦ４：Ｙｂ３＋、Ｔｍ３＋ナノ粒子のアッ プコンバージョンスペクトルを示す。 図９は、本発明の実施形態によって決定された９７５ｎｍの励起下のＮａＹＦ４：Ｙｂ３＋、Ｔｍ３＋ナノ粒子の近赤外線、赤色及び青色赤いアップコンバージョン発光 帯のパワー依存性を示す。 図１０は、本発明の実施形態によって決定された様々なパワー密度での近赤外 線、赤色及び青色のアップコンバージョン発光帯の量子収量を示す。 図１１は、本発明の実施形態による、ＣＷ及びパルス励起（同一の平均パワー を備えた）の励起下のＮａＹＦ４：Ｙｂ３＋、Ｔｍ３＋ナノ粒子のアップコンバージョン スペクトルを示す。 図１２は、本発明の実施形態による異なるパルス幅（１ミリ秒、５ミリ秒、１ ０ミリ秒）を備えたＣＷ励起およびパルス励起下のアップコンバージョン発光スペクトル （８００ｎｍで正規化された）を示す。 図１３は、本発明の実施形態によるＣＷおよびパルス（３１．０４ｍＷの同じ 平均パワーを備えた）の励起下のアップコンバージョンスペクトルを示す。 図１４は、本発明の実施形態による異なる平均励起パワー下の５および１０ミ リ秒のパルス幅を備えたパルス励起下での８００ｎｍでの信号の利得を示す。 １５ａは８００ｎｍでの利得に対する励起パワーの影響を示し、１５ｂは８０ ０ｎｍでの利得に対する励起パワーの影響を示し、１５ｃは８００ｎｍでの利得に対する 励起パワーの影響を示し、１５ｄは８００ｎｍでの利得に対する励起パワーの影響を示し 、１５ｅは８００ｎｍでの利得に対する励起パワーの影響を示し、１５ｆは８００ｎｍで の利得に対する励起パワーの影響を示す。 図１６は８００ｎｍでの利得に対する励起パワーの影響を示す。 １７ａは８００ｎｍでの利得に対する励起パワーの影響を示し、１７ｂは８０ ０ｎｍでの利得に対する励起パワーの影響を示し、１７ｃは８００ｎｍでの利得に対する 励起パワーの影響を示す。 １８ａは８００ｎｍでの利得に対する励起パワーの影響を示し、１８ｂは８０ ０ｎｍでの利得に対する励起パワーの影響を示す。 図１９ａ は１００ｍＷの平均パワーを持つＣＷレーザダイオードザの励起 下で８００ｎｍにおいて得られたルミネセンス・イメージを示す； 図１９ｂは１００ｍＷの平均パワーを持つパルスレーザ（方形波、パルス幅 ５ミリ秒、期間２５０ミリ秒）の励起下で８００ｎｍにおいて得られたルミネセンス・イ メージを示す； 図１９ｃは１００ｍＷの平均パワーを持つパルスレーザ（方形波、パルス幅 １０ミリ秒、期間５００ミリ秒）の励起下で８００ｎｍにおいて得られたルミネセンス・ イメージを示す； 図２０は、本発明の実施形態によるパルス化された励起光を含む励起光を例証 する； 図２１は、本発明の実施形態によるパルス励起光に続くルミネセンスおよびルミネセンスの遅れた検出を例証する； 図２２は本発明の実施形態による、マーカーの深さ座標とその測定を例証する 。 図２３は本発明の実施形態による、マーカーの深さ座標とその測定を例証する 。 図２４は本発明の実施形態による、マーカーの深さ座標とその測定を例証する 。 図２５は本発明の実施形態による、マーカーの深さ座標とその測定を例証する 。 （ａ）−（ｂ）は信号利得対パルス幅および平均パワー密度をそれぞれ例証する； （ａ）−（ｄ）は、発明（ｂ、ｄ）の実施形態に従ってパルス化された励起から続くマーカーからのルミネセンスと持続波（ＣＷ）の励起（ａ、ｃ）からのルミネセンスとを例証する； 図２８は、発明の実施形態による方法の概要のフローチャートを例証する； （ａ）−（ｃ）は時間および平均パワー密度に対してシミュレートされた量子収量（ＱＹ）を例証する； 図３０はアップコンバージョン信号利得対パワー密度を例証する。

本開示のいくつかの実施形態は、拡散ルミネセンスイメージングおよび断層撮影を扱う前述の組織光学の分野に関する。最も良く見える波長では、光は組織内に数ミリメートルを超えて透過しない。しかし、診断ウィンドウ（波長６００〜１６００ｎｍ）では、光透過は数センチメートルまでによるイメージングを可能にするのに十分である。これにより、組織中深くのルミネセンス造影剤を画像化する可能性が開かれる。

従来技術は、低い量子収量によりイメージングを制限し、長い獲得時間、ノイズおよび熱の副作用へと導く。

現実的な光学的特性をもつ組織ファントムでの実験が行なわれ、本発明の実施形態の以下の開示に従って、前述の要因を改善することが可能であることが示された。国際出願第 ２０１０／１２８０９０号パンフレットにおいて、以前、そのようなイメージングのコントラストと分解能が改善され得ることが示されおり、該パンフレットは拡ルミネセンスイメージング又は断層撮影のためのシステム、方法及び非線形のルミネセンスマーカーを開示している。

ルミネセンスイメージング又は断層撮影法の生物医学的イメージングでのいくつかの適用を以下に述べる。

他の用途は非生物学分野で提供される。そのような分野の例は、タブレット、非線形マーカーをもつ媒体を流す液体または気体用のフィルタなどの品質管理を含む材料試験のためのルミネセンスイメージングまたは断層撮影である。

本発明の本用途および実施形態の関連において、ルミネセンスイメージングはルミネセンスのすべてのタイプのイメージングを意味する。さらに、説明される任意のイメージングまたは断層撮影は高度に散乱する媒体中にあり、伝統的には、検出される光の拡散特性のために解像度が不十分である。本発明の実施形態は、ルミネセンス断層撮影法におけるコントラスト及び分解能を含むそのようなルミネセンスイメージングの量子収量、コントラストおよび分解能を有利に改善する。

以下に、ルミネセンスイメージング、組織光学、およびナノクリスタルをアップコンバートするなど非線形のマーカーの原理の概要が与えられ、ついで実験及びシミュレーションからの結果を記載した。より多くの詳細が国際公開第２０１０／１２８０９０号パンフレットに与えられる。次に、本発明の特定の実施形態が添付図面を参照しながら説明される。

ルミネセンスコントラスト
ルミネセンスを発する分子（ルミネセンス体）からの光放出のプロセスはヤブロンスキー図で説明することができる（図１Ａを参照）。図１Ａは、分子の励起状態からの様々な減衰経路を示すヤブロンスキー図を示す。図の下部に、エタノール中のヘマトポルフィリンからのルミネセンススペクトルが示される。省略形は、Ｓｎ：一重項状態、Ｔｎ：三重項状態、Ａｂｓ：吸収、Ｓｃ：散乱、ＩＣ：内部変換、Ｆ：ルミネセンス、ＩＸ：項間交差、Ｐ：燐光、Ａ：他の分子への移動である。さらにいくつかのプロセスの近似の時間スケールが寿命（ＬＴ）として図１に右下に示され、さらにτと表記される。

入射光子が分子の２つのエネルギー帯間のギャップに対応するエネルギーを有する場合、入射光子は吸収され得る。それによって、光子エネルギーはより高いエネルギー帯への分子の励起に使用されることになる。励起状態は不安定であり、分子は基底状態に戻ることになる。下方遷移は、図１に示されるようにいくつかの異なる経路に従うことができる。ラベル付けされた準位は、原子のエネルギー準位に対応する電子レベルである。Ｓ０、Ｓ１などは、電子スピン量子数の和が０である一重項状態であり、一方、Ｔ０、Ｔ１などは、１個の電子のスピンが符号を変えている三重項状態である。大きい分子では準位間の間隔は非常に小さく、状態は分子相互作用のために重なる。光子が分子に吸収される場合、励起電子準位の最も低い振動準位に分子を必ずしも励起するのではなく、より高い振動状態に励起する可能性が高い。これは、迅速な（１０−１５ｓ）吸収プロセスの間に、原子は振動運動中に場所を変えないことを述べるフランク−コンドン原理の結果である。分子が高エネルギー準位に励起されると、Ｓ１の最も低い回転−振動状態への迅速な緩和が後続することになる。この緩和の短い時間スケール（１０−１２ｓ）は高密度の回転振動準位に起因する。分子は、Ｓ１から、無放射動力学的相互作用により状態Ｓ０に進むことができる。これは内部転換（ＩＣ）と呼ばれる。

代わりに、下方遷移は光子の放出をもたらすことができ、このプロセスはルミネセンスと呼ばれる。遷移はＳ０の回転振動状態のいずれかで終了することができるので、様々な光子のエネルギーは明確な値ではなくむしろ広い分布を有することになる。したがって、分子からのルミネセンススペクトルはほとんど場合いかなる有意な構造もなしに幅広いものとなることになる。スペクトルの形態はより低い準位（Ｓ０）への遷移の確率を反映することになる。図１Ａの下部に、腫瘍マーカーまたは光感作物質であり、後に説明されるヘマトポルフィリンのルミネセンススペクトルが示される。吸収−ＩＣ−ルミネセンスの経路が完了した後、分子は当初の状態および構成に戻る。したがって、ルミネセンスプロセスは非破壊であり、可逆的であり、それは例えば医学的診断では利点である。

励起された分子には、いくつかの他の経路、例えば、他の分子へのエネルギー移動、電子移動、エキシマー形成、および分子の解離をもたらす反発状態への励起などがあり得る。これらのプロセスは図１のＡで示される。

多くのルミネセンス分子は１つの重要な特徴を共通に有しており、それは、共役二重結合の完全な鎖である、すなわち、１つおきの結合が二重結合であることである。ヘマトポルフィリンの構造はこれの一例である（図示せず）。これは、腫瘍のルミネセンス診断および光線力学療法に使用されるルミネセンス分子である。

ルミネセンスイメージング
ポイントモニタ装置とは対照的に、ルミネセンスイメージングシステムは多数のポイントのルミネセンス信号を検出することができる。したがって、注目する区域の２次元画像が生成される。典型的なシステムはチューナブルフィルタと共にカメラを含む（図４の（ａ）を参照）。透照での同様のセットアップが図５の（ｂ）に概略的に示される。チューナブルフィルタにより所望の検出波長を容易に選択することができ、約２０ｎｍ幅のスペクトル解像度を達成することができる。

非線形ルミネセンス体によるルミネセンスイメージング
ルミネセンスイメージングのうちの特に興味あるサブセクションは非線形ルミネセンス体を使用するものである。本用途の関連において、「非線形マーカー」はルミネセンスマーカーであり、マーカーのルミネセンス（Ｌ）は励起光（Ｅ）の光束に線形には依存しない。したがって、非線形マーカーは、Ｌ＝ｋ^＊Ｅ＾ｘに従うルミネセンスを有し、ここで、ｘ＞１であり、ｋは正の定数である。非線形マーカーは、さらにＬ＝ｋ^＊Ｅ＾ｘ＋ｂ、Ｌ＝ｋ（Ｅ）^＊Ｅ＾ｘ＋ｂ、Ｌ＝ｋ（Ｅ）^＊Ｅ＾ｘ＋ｂ（Ｅ）、またはＬ＝ｋ^＊Ｅ＾ｘ＋ｂ（Ｅ）の関係に従うルミネセンスを有することがあり、ここで、ｋおよびｂは一定であるか、または励起光（Ｅ）の局所場に依存する（すなわちｋ（Ｅ）およびｂ（Ｅ））材料定数であるしたがって、従来のルミネセンスイメージングと比較して、非線形マーカー（またはルミネセンス体）は励起に１つよりも多くの光子を必要とすることがある。これは励起体積を強烈に減少させ、より局在化した励起ポイントを与える。このようにして、以下で実証されるように、ルミネセンスイメージングのコントラストおよび解像度が改善される。さらに詳細には、吸収および散乱媒体のルミネセンスイメージングにおける散乱光のコントラストおよび解像度が改善される。本発明の実施形態はこの効果を利用する。

線形ルミネセンス体によるルミネセンスイメージングと非線形ルミネセンス体によるルミネセンスイメージングとの間の差を示すために、図５の（ａ）〜（ｃ）が参照される。図５の（ａ）はグレイスケールの線形ルミネセンス画像を示す。各画素（７０５）は格子パターン（７０１）中の１つの励起ポイント（７０４）に対応する。図７ｂは、２光子非線形ルミネセンス体、すなわち非線形ルミネセンスマーカー（７０２）で得られた画像を示す。図７ｃにおいて、ルミネセンス体（７０２）は赤（より大きい円）（７０３）で示され、黒い点（７０４）は格子パターン（７０１）中の励起のポイントを示す。円（７０３）は、格子パターン（７０１）上のマーカー（７０２）の投影画像に対応する。励起ポイント（７０４）は、ルミネセンスマーカー（７０２）を走査するときの光源、すなわち、レーザ（５０３）の位置に対応する。非線形ルミネセンス体を使用すると、ルミネセンス画像のコントラストおよび解像度が向上することが明確に分かる。特に、光源が、図５の（ｃ）において、マーカー（７０２）、または格子パターン（７０１）上のマーカー（７０２）の対応する投影画像（７０３）の近くの７０６として印を付けられた位置にある場合、励起体積は十分に小さく、非線形マーカー用の光源位置（７０６）に局在化されており、その結果、ルミネセンスは図５の（ｂ）の対応する画素（７０８）で検出されない。図５の（ａ）の線形ルミネセンス画像では、対応する画素（７０７）は、散乱媒体中での増大した励起体積に起因するルミネセンスを受け取る。２光子非線形依存は励起体積の狭い光子密度を与える。したがって、励起光強度への検出ルミネセンスの非線形依存に基づいてマーカー（７０２）を画像化することによって、解像度を向上させることができる。

非線形ルミネセンス体は、一般に、線形ルミネセンス体と比較してより高い励起強度を必要とし、いくつかの非線形ルミネセンス体はコヒーレント励起さえも必要とする。散乱媒体では、光は集束されるのではなくむしろ全方向に広がるので、高い強度を達成するのは困難である。このために、ある非線形ルミネセンス体は他のものと比較して散乱媒体のルミネセンスイメージングにより好適になる。ルミネセンス体は特別高い収率を有する必要があるが、コヒーレント励起を必要としないことがある。アップコンバートナノ粒子は、高い収率と非コヒーレント励起の１つのそのような非線形ルミネセンス体である。

アップコンバージョン
アップコンバージョンは、２つ以上の光子が吸収され、入射光子よりも高いエネルギーの光子が解放されるときに生じる非線形プロセスである。

このプロセスは、例えば、長い時間の間１つの電子をトラップすることができる準安定状態を含み、別の到着光子との相互作用確率を増加させる材料で観測される。

実施形態によっては、異なる希土類元素イオンでドープされた固体の形態のルミネセンスマーカーがアップコンバージョンを得るために使用される。

アップコンバージョンは、イオン対および励起強度に応じてアップコンバージョンプロセスに違うように影響を与える多数のプロセスにより生じることができる。

いくつかのアップコンバージョンプロセスが図２ａ）〜ｃ）に示される。

プロセスのうちのいくつかはイオン間のエネルギー移動を含む。このエネルギー拡散は、放射性または非放射性、共振的または非共振的であることがある。

さらに、エネルギー移動アップコンバージョン（ＥＴＵ）および励起状態吸収（ＥＳＡ）プロセスが、図２ｃで、図の左側と図の右側にそれぞれ示される。励起状態吸収は、励起状態にあるイオンがもう１つの光子を吸収するときに生じる。

ナノサイズ化アップコンバート結晶

ナノサイズ化アップコンバート粒子は、例えば、製作するのが容易であるランタニドドープ酸化物（Ｙ_２Ｏ_３）である。

他のナノサイズ化アップコンバート粒子は、例えば、Ｙ_２Ｏ_３よりも高い効率を有するフッ化物である。より高い効率は、非放射減衰の確率を低下させるフッ化物のフォノンエネルギーによって説明することができる。

さらに、ナノサイズ化アップコンバート粒子は、例えばＹｂ^３＋／Ｅｒ^３＋又はＹｂ^３＋／Ｔｍ^３＋のいずれかと同時ドープされたナトリウムイットリウム四フッ化物（ＮａＹＦ_４）で製作される。

ＮａＹＦ_４は、それぞれα−ＮａＹＦ_４およびβ−ＮａＹＦ_４と呼ばれる２つの相、すなわち立方相および六方相で結晶化する。β相材料からのアップコンバートルミネセンスは、α相からのアップコンバートルミネセンスと比較して約１桁高い大きさである。

アップコンバートナノ粒子などの非線形ルミネセンス体は、さらに、生物的機能化することができ、それにより、例えば腫瘍探索能力を非線形ルミネセンス体に付与することができる。

非線形ルミネセンス体は水溶性とすることができ、静脈、経口、または腸への投与のための溶液などでいくつかの用途での投与を容易にすることができる。

アップコンバートナノ粒子を水溶性として提供する方法は、極性である構造をもつ粒子を被覆することである。被覆は、例えば、高分子またはシリカで行うことができる。合成高分子、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および天然高分子の両方を被覆に使用することができる。これらの高分子は生物学的環境で安定であり、顕著に悪い形でナノ結晶の光学的性質に影響を与えることはない。

水溶性アップコンバートナノ粒子は被覆なしで供給することができる。化学結合または物理吸収のいずれかによって水酸基をアップコンバートナノ粒子の表面に付着させることができる。水酸基は当然のことながら共有結合によって形成され、最終構造は極性の性質を有する。

機能化
アップコンバートナノ粒子の機能化は、全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれるＸ． Ｇａｏ等、Ｉｎ ｖｉｖｏ ｃａｎｃｅｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔｓ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２２、８：９６９〜９７６、２００４に記載されているような量子ドットの機能化と同様の方法で行うことができる。Ｇａｏ等では、アップコンバート希土類元素ドープナノ粒子に適用可能である方法が記載されている。

本開示の一実施形態で使用されるアップコンバートナノ粒子は、Ｇ． Ｙｉ等、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｚｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ＮａＹＦ４：Ｙｂ，Ｅｒ ｉｎｆｒａｒｅｄ−ｔｏ−ｖｉｓｉｂｌｅ ｕｐ−ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｓ、Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４、１１：２１９１〜２１９６、２００４に記載されている方法に従って準備され、Ｙｂ^３＋およびＴｍ^３＋の組合せでドープされたＮａＹＦ_４結晶であった。２つのイオンのエネルギー準位図が図３Ａに示される。図３Ａは、Ｙｂ^３＋／Ｔｍ^３＋イオン対のアップコンバージョンプロセスの概略図である。非放射アップコンバートプロセスが破線矢印で示され、非放射減衰は明確にするために省略されている。図３Ｂはアップコンバートナノ粒子の放出スペクトルを示すグラフである。４７７ｎｍの青色放出ラインはより高いポンプ強度でのみ見える。８００ｎｍラインのポンプパワー依存は、ｘ軸に強度（Ｉ）およびｙ軸にカウント（Ｃ）を示し、適合ライン（４０１）の勾配（Ｓ）が２に等しい図３Ｂの差込み図で分かるように、低い強度を使用して二次であることが計測された。

一実施形態では、非線形マーカーが別のイメージングモダリティのために画像化造影剤に付加される。例えば非線形マーカーは、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、Ｘ線などのような従来のイメージングモダリティによる画像化のために造影剤に付加される。特定の実施形態では、非線形マーカーは、常磁性を有する有機ガドリニウム複合体またはガドリニウム化合物に付加される。ＭＲＩ造影剤として使用されると、医用磁気共鳴映像法のコントラストが強化される。同時に、ルミネセンスイメージングまたは断層撮影を行い、注目する生体内の全く同一の領域の高解像度ＭＲＩと組み合わせた機能的診断情報を可能にすることができる。

他の用途は非生物学分野で提供される。そのような分野の例は、タブレット、非線形マーカーをもつ媒体を流す液体または気体用のフィルタなどの品質管理を含む材料試験のためのルミネセンスイメージングまたは断層撮影である。

システム・セットアップ例
拡散ルミネセンス分子イメージング用システムは、図４ａ−ｄで概略的に示される。図４ａ−ｂは、発蛍光団イメージング（ｅｐｉ−ルミネセンス）用セットアップの概要の例証である；及び、図４ｃは透視中の発蛍光団再構築用のセットアップであり、該セットアップは非線形の発蛍光団および従来の発蛍光団を使用して、ＦＭＴのシミュレーションに使用することができる。後者の場合、シミュレートされた組織ファントムは、幾何学上の１つの面のまわりに一様に離間された検出器先端部（５０９）を有する半無限のシリンダー（５１０）としてモデル化され得る。

組織ファントム（５０１）は、飛行時間の分光法システムなどの適切なシステム（５００、６００）、周波数領域システムあるいは定常状態及び時間あるいは周波数領域中の他の画像システムによって決定された光学的性質を備えたイントラリピッド（ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ）インクの溶液を含み得る。発蛍光団（５０２）は２．４ｍｍの内径を備えた毛管内に含まれ得る。 発蛍光団の濃度は、ナノ粒子用に１重量％が選択され得、比較実験のＤＹ−７８１型の従来のダウンコンバート（ｄｏｗｎｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ）発蛍光団用に１μΜが選択され得る。ナノ粒子の濃度は、量子ドット（すなわち１体重％の濃度）を使用した研究との合理的な対応を持つように選択され得る。

ステップモータを使用して、ファイバーにつながれたレーザ（５０３）はラスタースキャンされ得る。ラスター走査中のレーザの位置は図５に示されたような格子パターン（７０１）で記述することができる。画像は、８００ｎｍに中心がある２つの誘電体帯域通過フィルタの後ろに位置する空気冷却ＣＣＤ（５０４）カメラにより走査位置ごとに取得された。図４の（ｃ）はラスター走査セットアップ（５０７）を示し、レーザは下の位置（５０５）から組織ファントム（５０１）を走査している。ＣＣＤ（５０４）はレーザの位置（５０６）ごとに１つの画像を取り込むことができる。位置（５０６）は図５の格子パターン（７０１）と同様の格子パターン（５０８）を記述する。レーザの位置（５０６）ごとに、ファントム（５０１）の全側面から放出されたルミネセンス、すなわち全ルミネセンス強度が、測定され得、かつ合計することができ、得られる画像中の１つの画素を構成した。したがって、画像中の画素の数は、ＣＣＤ画素の数によってではなく励起位置（５０６）の数によって与えられた。したがって、解像度は、ルミネセンス放出光の光子密度によってではなくレーザ光源（５０５）からの励起光の光子密度によって決定することができる。このようにして、励起体積中の２光子の光子密度は単一光子の光子密度よりも狭いので、解像度を向上することができる。全ルミネセンス強度を合計するとき、検出されたルミネセンスに閾値値を適用することができる。このようにして、解像度を向上することができる。例えば、ルミネセンス強度が事前定義閾値よりも上にある場合にのみ全ルミネセンス強度に追加されることになる。閾値はＣＣＤ（５０４）の値として定義することができ、例えばルミネセンス強度がピーク値の３０％未満である場合バックグラウンド信号と見なすことができるので廃棄されることになる。さらに、画素、またはレーザの位置（５０６）で得られる全ルミネセンスが別の閾値値未満である場合バックグラウンド信号と見なして除去することができる。代わりに、ルミネセンス信号の二次強度を合計することができる。このようにして、解像度をさらに向上することができる。例えば、ＣＣＤのピーク強度値の定義による０と１との間の相対値を有することができるＣＣＤ（５０４）によって検出されたルミネセンス強度は、現在の画素または位置（５０６）の全ルミネセンス強度に追加される前にそれ自体を乗算することができる。さらに、全ルミネセンス強度は画素または位置（５０６）ごとにそれ自体を乗算することができる。走査イメージング技術を使用して、画像中の各画素は、単一の励起ポイント、すなわち光源位置（５０６）によって誘起されたルミネセンスに対応することができる。

再構築された結果
図４ｂは、概略的に発明の実施形態による拡散したルミネセンス分子イメージング用のシステム（６００）を例証する。システム（６００）は、前述の散乱性媒質のルミネセンス分子イメージングで使用するためのルミネセンスマーカー（５０２）を含み、前記ルミネセンスマーカーは散乱性媒質で構成された非線形のルミネセンスマーカーである。システム（６００）は、さらに１又は２以上の光源（５０３）をさらに含み、該光源（５０３）は前記１又は２以上の光源によって発光された励起光によって励起容積部内でルミネセンスマーカーを励起するために少なくとも１つの光源位置（５０５）、（５０６）で位置づけられ、前記システム（６００）はさらに、前記励起光によりルミネセンスマーカーからのルミネセンスを検知するルミネセンス光検知位置において検出器（５０４）を含む。従って、システム（６００）は、パルス励起光によって散乱性媒質中の関心領域の拡散ルミネセンス分子イメージングに適し、媒質の少ない加熱により少ない副作用、より深いイメージング媒体をより熱くならないことにより改善された量子収量、それほど熱でない副作用、より深いイメージング深度、およびより短い獲得時間を提供する。システム（６００）はパルス励起によるアップコンバージョンエミッションを増強し、パルス励起光による単一パルスイメージングに関する以下の開示でさらに記載される。

この比較は、非線形ルミネセンス体の使用が提供する有利な効果、すなわち、線形ルミネセンス体よりも高いコントラストおよび解像度を示している。この強化は、以下の式（１）で見られるような二次生成項を使用するときのより狭い感受性による。これは、異なる光源位置に対して収集された信号を考慮に入れることによって視覚化することができる。二次ルミネセンス体を使用すると、光源位置がルミネセンス体自体の近くにある場合にのみ信号は強くなることになる。したがって、この信号は、線形ルミネセンス体の場合よりもルミネセンス体の場所に関する多くの情報を提供することができる。これは、さらに、図９に示されるように、例えば、線形ルミネセンス体を使用して分解できない２つの接近して位置するルミネセンス体を分解する可能性を与えることができる。

アップコンバートナノ粒子を使用するマルチビームルミネセンス拡散光学断層撮影
さらに、本開示は、アップコンバートナノ粒子の独特な非線形パワー依存を利用して、同時に２つのビームで励起することを含むことによってラスター走査セットアップの情報量をさらに増加させるためのルミネセンス拡散光学断層撮影の方法を実証する。情報の増加がより正確な再構成をもたらすことが見いだされた。

ルミネセンス拡散光学断層撮影（ＦＤＯＴ）は、不明瞭な材料内部のルミネセンスプローブの濃度の空間分布を再構築しようする比較的新しいモダリティである。それは、イメージングツールとして、例えば、腫瘍、タンパク質分解酵素、薬効果を画像化するための生物医学的研究に良好な見通しを有する。ＦＤＯＴは数値的に極めて不良設定な問題を有する。この問題では、ルミネセンス性標的の再構成の品質は、境界測定から得られたルミネセンス情報の量および品質によって直接決定される。計器雑音および組織自己ルミネセンスが測定の主な擾乱であり、不十分な信号品質をもたらし、再構築結果に深刻な偽画像を引き起こすことがある。これを克服するために、例えば、低雑音の装置を使用すること、およびバックグラウンド除去またはスペクトル分離を使用することができる。しかし、そのような方法がすべての問題を解決できるとは限らないが、それは、そのような方法が、再構成の品質を改善するのに決定的である再構成のための新しい制約を追加する、すなわち、新しい独立した情報を追加するのではなく、より良好方法で現在の情報を利用しているだけであるからである。非接触ＣＣＤベースＦＤＯＴシステムにおいて、より多くの情報を獲得するための好ましい１つの方法は励起位置の数を増加させることによるものである。しかし、励起ビームの強度を妥当なレベル内に保持するために、励起ビームの最小サイズに限界がある。これは、別個の、すなわち重複しない励起位置が再構成には要望されるので、励起−位置の最高密度に対する現実的な上限を意味する。さらに、先験的構造情報を提供するために磁気共鳴映像法などの解剖学的イメージングモダリティを使用することが可能である。しかし、これは、システムの複雑さの著しい増加と柔軟性の低下とを犠牲にする。

本開示で、発明者は、ＦＤＯＴの励起のために２つのビームを同時に利用することによって追加情報を獲得するのにアップコンバートナノ粒子の二次パワー依存を利用する手法を提示する。二重ビーム励起で得られる画像（タイプＤ画像と命名される）のナノ粒子数密度分布ｎの再構成への効果が実証される。さらに、線形ローダミン６Ｇと二次アップコンバートナノ粒子との間で再構築結果の比較が行われる。励起場および放出場は２つの結合拡散方程式によってモデル化することができる［非特許文献３］。二次発蛍光団のために、ｋ番目のビームの励起下で固定された検出器位置で検知された螢光信号は、フォワードモデル（１）によって記述することができる；

ここで、Ｎはボクセルの数を表し、ｒ_{ｓ，ｄ，ｋ}は、それぞれ光源、検出器、およびボクセルの座標を表し、ΔＶｉはボクセルｉの体積である。
励起光のフォワード解は、

によって示される。２つのビームを同時に使用して媒体を励起すると、検出される信号は（２）によって与えられ、

これは交さ項の関与を示す。ラスター走査セットアップ（５００、５０７）では、２つの画像が２つの位置にわたって１つの励起ビーム走査で連続して得られ（タイプ−Ｓ画像と命名される）、第３の画像が前の２つの位置の上で２つのビーム励起（タイプＤ）で得られる場合、交さ項の関与は、タイプＤ画像が既存のタイプ−Ｓ画像からいかなる数学的動作によっても得ることができないことを意味し、タイプＤ画像は独立であり、追加情報を含むことを示している。しかし、線形ルミネセンス体、例えばローダミン６Ｇでは、タイプＤ画像は既存のタイプ−Ｓ画像の線形結合のみであり、逆問題のためのより多くの制約を追加しないことになる。非線形ルミネセンス体では、式（２）は多くの同時励起ビームを含むように一般化することができることが演繹される。

再構成における二重ビーム励起による測定の重要性は、重み行列Ｗの特異値解析によっ
て確認されており、その要素は（３）によって与えられ［非特許文献３］、
Ｗ_{（ｓ，ｄ），ｉ}＝Ｕ^＊ _ｆ（ｒ_ｄ，ｒ_ｉ）［Ｕ_ｅ（ｒ_ｓ，ｒ_ｉ）］^γΔＶｉ （３）
ここで、
二次ルミネセンス体ではγ＝２、
線形ルミネセンス体ではγ＝１である。
計算は有限要素法を実行するＮＩＲＦＡＳＴパッケージを使用して行われた。Ｗは（４）に従って因数分解され、
Ｗ＝ＵΣＶ^＊ （４）
ここで、ＵおよびＶはＷの左および右の特異ベクトルを含むユニタリ行列であり、
Σ
はＷの特異値を含む対角行列である。Ｖの列空間は画像空間モードによって張られ、一方、Ｕの列空間は検出空間モードによって張られる。Ｗの特異値は、どれくらい効率よく所与の画像像空間モードが実験装置によって検出され得るかを表す［非特許文献４］。

図６は、Ｗの正規化特異値分布を示す。ｘ軸は特異値指数（１１２０）を示し、ｙ軸は正規化特異値強度（１１２１）を示す。明確にするために、１つおきの特異値のみが示されている。クロス符号（１１２２）およびプラス符号（１１２４）は線形ルミネセンス体（γ＝１）を示し、前者は単一ビーム励起（１１２２）の場合であり、一方、後者は単一ビーム励起と二重ビームの励起（１１２４）の組合せの場合である。見て分かるように、二重ビームの励起（１１２４）による追加の特異値の正規化強度は機械精度まで降下しており、それは、二重ビーム励起による測定がＦＤＯＴの不良設定を緩和できないことを示している。言い換えれば、タイプＤ画像は既存のタイプ−Ｓ画像よりも多くの情報を提供できない。したがって、それは再構成の品質を改善できない。しかし、二次ルミネセンス体（図６のアスタリスク符号（１１２３）および点符号（１１２５）で表された）では、追加の特異値（１１２５）の強度は依然として効果がある。これは、タイプＤ画像が再構成の品質に寄与することになることを意味する。

まず、（３×３）格子にわたって走査するために、単一の励起ビームを使用し得、１つの画像を走査位置ごとにＣＣＤカメラで取り込む。次のステップで、ファントムを照明するために、同じ格子の２つの最近接部位に位置づけられた２つの励起ビームを同時に使用することができ、６個の追加のタイプＤ画像が与えられた。

図７ａ〜７ｂは再構築されたアップコンバートナノ粒子の３次元再現を示す。副図の赤い円柱は同一であり、真のルミネセンス性傷害を示す。図７ａの再構成では、タイプ−Ｓ画像のみが使用された。見て分かるように、ルミネセンス性傷害の形状が過大評価されている。この過大評価は逆問題の不良設定によって説明することができる。タイプＤ画像を追加すると、図７ｂに示されるように、ルミネセンス性傷害形状の再構成は著しく改善される。

アップコンバートナノ粒子の非線形パワー依存追加の独特の利点が開示される。この利点により、同時に２つ以上の励起ビームを用いて得られた画像を使用することによって逆問題のための追加情報を得る可能性が与えられる。同じ利点は、線形ルミネセンス体、例えばローダミン６Ｇを使用した場合には見いだすことができなかった。

パルス励起によるアップコンバージョンエミッションの増強
ＮａＹＦ_４：Ｙｂ^３＋、Ｔｍ^３＋のためのアップコンバージョンスペクトルを例証している図８に示されるように、ナノ粒子をアップコンバーティングすることは、９７５ｎｍの励起下の近赤外線（−８００ｎｍ）、赤色（−６４８ｎｍ）および青色（−４７５ｎｍ）の範囲中の発光帯を放射し得る。

上述されるように、これらのアップコンバーティングの発光帯の強度は励起強度への非線形の依存性を持っている。
低い強度範囲の依存性は、次式によって記述することができる：
Ｉ_ｆ＝ｋｌ_ｅｘ ^ｎ （５）

ここで、Ｉｆはアップコンバージョン蛍光強度であり；
ｋは定数であり；
ｌｅｘは励起強度であり；ｎは１つのエミッション光子を生成するために要求される励起光子の数である。

近赤外線、赤色および青色発光帯のパワー依存性は図９に示され、９７５ｎｍの励起下のＮａＹＦ_４：Ｙｂ^３＋、Ｔｍ^３＋ナノ粒子の近赤外線、赤色及び青色のアップコンバージョン発光帯のパワー依存性を例証している。

量子収量は、放射された光子の数と吸収された励起光子の数の間の比として定義される。図９に示されるそれらの非線形のパワー依存性のために、アップコンバージョンエミッションは、図１０で示されるように、一定の量子収量の代わりにパワー密度に依存する量子収量を持っており、近赤外線、青色、赤色の様々なパワー密度でのアップコンバージョン発光帯の量子収量を示している。

本発明の一実施形態による拡散ルミネセンス分子イメージングによる散乱媒質中の領域のイメージング方法（１００）は、（図２８）前記領域のマーカー位置での散乱媒体中の少なくとも１つの非線形の発光マーカーを提供する工程（１０１）、少なくとも１つの光源位置から１又は２以上の光源によって発光された励起光によって励起容積部内で非線形のルミネセントマーカーを励起する工程（１０３）、及びルミネセント光検出位置で検出器による励起光により、ルミネセンスマーカーからのルミネセンスを検知する工程（１０７）を含み、前記励起光はパルス励起光を含む。

量子収量はパワー密度と共に増加し定数に徐々に接近する。パルス励起は高いピークパワーを有しているので、信号レベルにおける利得は、同じ平均パワーをもつ持続波励起と比較されるパルス励起から提供される。

パルス励起によって狭い時間窓に励起光子の同じ数を閉じ込めることは、それゆえ、より強いアップコンバージョンエミッション光を得るために、励起光子を使用して、より効率的に提供され得る。これは、ＣＷを用いてＮａＹＦ_４：Ｙｂ^３＋、Ｔｍ^３＋ナノ粒子、あるいは励起と同じ平均パワーを持つパルス光を示している図１１において確認される。パルスは、１０ミリ秒のパルス幅および１００ミリ秒の期間を有しており、およびＣＷ及びパルス励起の両方のためのビームサイズは図１１における直径で０．７０ｍｍである。図１１に示されるように、約２の因数だけ信号利得は、１．９４ｍＷの同じ平均パワーを備えたＣＷ励起と比較してパルス励起を使用することにより得られる。

励起光をパルス化したことによって、アップコンバーティングナノ粒子を使用する場合の量子収量の著しい増加が提供される。さらに、パルス化した励起光は、持続波励起と比較して、シングルショットの深い組織イメージング、大きなイメージング深度および短いデータ収集時間を提供する。励起光の熱の副作用もパルス光ゆえに抑えられる。

パルス励起光は、さらに深い組織中の生体分子の拡散光学イメージング、光線力学療法および遠隔の活性化を提供する。前述の効果は、以下の「単安定素子イメージング」の下で詳細に記載するが、これは本出願の一部である。

パルス励起による追加の利点および長いエミッション寿命のＵＣＮＰは、遅延した検出を採用することにより散乱励起光を抑えることが可能であるということである。これは従来ＵＣＮＰのためには利用されていない。組織の内部の肉眼的イメージングのめのＵＣＮＰの大きな利点は発光のアンチストークス（ａｎｔｉ−Ｓｔｏｋｅｓ）シフトであり、組織自己蛍光を抑える手段を証明している。これは知られており、理論上トータルバックグラウンドのない信号を提供し、大きな関心がある。たとえ組織自己蛍光をトータルで抑えることができても、はるかに強い散乱励起光からの信号をスペクトル的にろ過する先行技術に問題が実際上存在する。パルス励起および時間遅延した検出で、この抑制はより効率的になるだろう。そして、トータルバックグラウンドのない信号の利点は、パルス励起で実際上利用するのがより簡単であろう。方法（１００）は、媒質中で励起光の影響のない信号の検出に提供するルミネセンスの検出を時間遅延する工程（１０５）を含み得る。る１０５の工程をこのように含むかもしれない。図２１は、時間間隔（２１０）の間に衰える強度のルミネセンスが、長さ（ｗ）の励起パルス（２０１）に続く例を示している。当該方法は、それゆえ、前述の励起光のパルス（２０１）に続く時間間隔（２１０）の間のルミネセンスを検出する工程（１０８）を含み得る。時間間隔は１−１００ミリ秒の範囲にあリ得る。システム（６００）は、従って前述の励起光のパルスに続く時間間隔（２１０）の間にルミネセンスを検知するために動作可能な検出器ユニット（６０１）を含み得る。

パルス幅依存性の利得：
ＣＷ励起の下では、励起パワーが２倍になれば、二次パワー依存性ゆえに（ケース１）、パワー密度が非飽和パワー密度レジームにあればフルオレセント強度は４倍高いであろう。

パルス励起の下では、定常状態に達するには一定時間（中間のエネルギー準位の寿命までに決定される）を必要とする。立ち上り時間の間のフルオレセント強度は、定常状態条件のフルオレセント強度より弱い。パルス持続時間の期間に、このように、ＣＷ励起の下、および２倍高いピークパワーを持つ方形波パルス励起の下でのフルオレセント強度と比較して、後者は４倍より高くないが、前者未満ではなく、それがケース１とは異なる。従って、パルス脱励起（ｄｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）によるアップコンバージョンエミッション強度における利得はパルス幅依存性である。パルス幅が短かすぎれば、アップコンバージョンシステムはパルス持続時間中の定常状態からずっと離れるであろうし、それゆえ利得はより小さくなるか、あるいは利得は全くない。パルス幅は十分に長くあるべきで、それは、ＣＷ励起および異なるパルス幅をもつパルス励起の下でのアップコンバージョンスペクトルの観察の支援により決定することができる。パルス幅が定常状態に達するのに十分に長い場合、パルス励起の下で正規化されたスペクトルは、ＣＷ励起の下で正規化されたスペクトルに充分接近するであろう。図１２は、異なるパルス幅（１ミリ秒、５ミリ秒、１０ミリ秒）をもつＣＷ励起およびパルス励起の下でのアップコンバージョン発光スペクトル（８００ｎｍで正規化された）を示す。ＣＷ励起は２４ｍＷ（ビームサイズ０．７０ｍｍ）の平均パワーを有する。すべてのパルスのピークパワーは、２４ｍＷ（ビームサイズ０．７０ｍｍ）である。図１２の挿入図は、４３４−６７４ｎｍの範囲の部分拡大図を示す。見られるように、パルス幅が１０ミリ秒である時、ＣＷ励起からのスペクトルおよびパルス励起からのスペクトルの間の相違点は１０％未満であり、定常状態あるいは疑似定常状態に達したことを示している。パルス幅が５ミリ秒から１０ミリ秒に増加されると、図１３（３１．０４ｍＷの同じ平均パワーをもつＣＷ励起およびパルス励起の下でのアップコンバージョンスペクトルを示す）および図１４（異なる平均励起パワーの下での５及び１０ミリ秒のパルス幅をもつパルス励起の下で８００ｎｍにおける信号の利得を示す）に示されるように、利得が増加される。

パワー依存性の利得：
図１０に示されるように、パワー密度を増加させる場合、８００ｎｍのエミッションの量子収量は徐々に定数に接近する。したがって、利得は平均パワーを高めることとともに減少する。平均パワーが、量子収量が定数である範囲にある場合、利得はまったくない。図１５の（ａ）−（ｆ）、図１６に示されるように、上述した立ち上り時間の間の量子収量ロスにより、我々はさらにいくつかの信号を失う。

青色発光及び赤色発光は、パワー依存性曲線において大きな傾斜を有し（図９に示されるように）、例えば式（５）においてｎがより大きく、（図１０に示さるたように）８００ｎｍの発光より高いオーダーのパワー密度依存性の量子収量を有し、それらは（図９および図１０に示されるように）飽和することがより困難であるので、際立った対照で、その利得は８００ｎｍより大きい。調査された最大のパワー時においてさえ、図１７の（ａ）−（ｃ）、図１８の（ａ）−（ｂ）に示されるように、赤色発光および青色発光に対する５．３と５．７の因数による利得が存在する。

パルス励起による利得がパルスのパラメーターに関連づけられることを指摘することは注目すべきである。上記の結果はすべて方形波パルス励起で得られる。三角形または正弦波のような異なるパルスは異なる結果を与えるだろう。しかし、信号利得も期待され得る。方形波のデューティサイクルは別の主要パラメーターであり、それは、どれだけ極大ゲインが得られるかを決める。１０ミリ秒のパルス幅および１００ミリ秒の期間を備えたパルスは、１０％のデューティサイクルを持っている。したがって、極大ゲインは８００ｎｍのエミッションのために１０（１／デューティサイクル）でありえる。実施例は、約３．８の因数だけ利得を示す。より小さなデューティサイクルの使用によって、より大きな利得が示され得る。従って、本開示は、小さなデューティサイクル、例えば２の因数の利得のみを可能にする５０％を下回るデューティサイクル、を使用することにより改善された利得を提供する。小さなデューティサイクルの使用によって、本明細書に記載された利点をもつ改善されたイメージング能力のための高ピークパワーを最良に達成するための利得が提供される。以下に説明されるような単一パルス励起の使用によって、さらに高いパワー密度が、アップコンバージョンナノ粒子の高い内因性のＱＹを開発するために達成され得る。従って、パルス励起はＡＮＳＩ標準に適合する一方で高パワー密度を送達する。

パワースキャニング断層撮影
図９に示されるパワー依存性の変更は、単一の励起点およびいかなる数の検出点を使用して、パワースキャニング断層撮影を行なうために使用することができる。そのコンセプトはパワー依存性曲線として簡単に要約することができ、各離散的になった領域では、与えられた傾斜係数が予期されたルミネセンスを生成（シミュレート）するための入力として使用される。これは、空間的スキャニングなしに励起源を単にパワースキャニングすることで極めて迅速なやり方で従来の最適化方法を使用して、断層撮影の再構築を行なうためにさらに使用することができる。利点は、スピードと、可動部がないこと、及び単純化した器具を含んでいることである。

結論として、パルス励起を使用することで、同じ平均パワーをもつＣＷ励起と比較して、アップコンバージョン発光強度が増強され得る。増強は、より高い効率を備えた同じ量の励起光子の使用から始まり、それはアップコンバージョンナノ粒子、ＮａＹＦ_４：Ｙｂ^３＋、Ｔｍ^３＋のパワー密度依存性の量子収量に起因する。利得はパルス幅とパワー依存性である。

この提案された技術は、アップコンバージョン能力をより効率的に利用するための一般的なアプローチである。それは、Ｙｂ^３＋／Ｔｍ^３＋共ドープされたアップコンバーティングナノ粒子に対して作用するだけでなく、任意のアップコンバーティングナノ粒子或いはアップコンバーティングバルク材料に対しても作用する。それは、３つの光子プロセスからのＴｍ^３＋の青色発光及び赤色発光などのより高いオーダーのアップコンバージョン発光に対して作用する。このアプローチは、生物学的組織における光線力学療法に必要とされた短波長アップコンバージョン発光を増強するのに役立ち得る。

アップコンバージョン発光のパワー依存性の特徴は、単一の励起点を使用して、パワースキャニング断層撮影を行なうために使用することができる。

組織ファントム中のパルス励起によるアップコンバージョン信号増強
この技術の有効性も組織ファントム中での測定によって確認される、図１９ａ、１９ｂ、１９ｃ参照。実験は、水、資質内およびインクから製造された１０ｃｍ−１の減じられた散乱係数と、０．５ｃｍ^−１の吸収係数とを備えた２０ｍｍ厚さの液体組織ファントム中で実行された。ＮａＹＦ_４：Ｙｂ^３＋、Ｔｍ^３＋ナノ粒子（ｃ＝１重量％）のコロイド状のヘキサンで充填された２ｍｍの内径のガラス管が、１０ｍｍの深さを備えたファントムに挿入された。９７５ｎｍのＣＷレーザダイオード、及び調整可能なパルス幅と同じ波長の期間をもつパルスレーザの２つのレーザ源が、比較のために使用された。レーザのスポットサイズは直径１ｍｍだった。異なる２つのセッティングがパルスレーザに使用された：（ａ）セッティング１：５ミリ秒のパルス幅、２５０ミリ秒の期間、図１９ｂ；（ｂ） セッティング２：１０ミリ秒のパルス幅、５００ミリ秒の期間、図２８ｃ。ＣＷ励起又はパルス励起の励起下で、８００ｎｍで得られたアップコンバージョン発光イメージは、図１９ａ、１９ｂ、１９ｃで示される。平均パワーはすべての測定に対して同一（１００ｍＷ）に維持された。パルス励起下の強度は、セッティング１と２のためにＣＷ励起下の強度よりそれぞれ約６倍および６．７５倍高い。

図１９ａは、１００ｍＷのパワーをもつＣＷレーザダイオードの励起下で８００ｎｍにおいて得られたイメージを示す。

図１９ｂは、１００ｍＷの平均パワーをもつパルスレーザ（方形波、パルス幅５ミリ秒、期間２５０ミリ秒）の励起下で８００ｎｍにおいて得られたイメージを示す。

図１９ｃは、１００ｍＷの平均パワーをもつパルスレーザ（方形波、パルス幅１０ミリ秒、期間５００ミリ秒）の励起下で８００ｎｍにおいて得られたイメージを示す。

パルス励起から得られるより高い強度は、アップコンバージョン信号レベルの増加による改善されたイメージングを提供する。さらに、パルス励起は、増加した信号レベルと改善されたイメージングを維持しつつ、生物学的組織中の熱効果を減じる。例えば、強いピーク信号を生成するレーザ（ピークパワーは、例えば１００Ｗまで）による単安定素子（１０ミリ秒−１００ミリ秒）は、その後励起源を切ることで、組織を過熱しないが、劇的にエミッション信号を増加させるために、生物学的組織が冷めることを可能にするだろう。さらに、イメージングのために受容できる信号レベルを達成するために、同じ結果を生じるためにより多くのパワーを要求する連続波レーザダイオードと比較して、パルス励起光を備えた非常に低出力の光源を使用することは可能だろう。

パルス励起光をもつ単安定素子イメージング
アップコンバーティングナノ粒子（ＵＣＮＰ）の制限された量子収量（ＱＹ）は、特に低い光の条件で、最も潜在的な生物学的適用のための主な関心事である。当該分野での非常に有力な２つの技術は、深い組織光学イメージングと光線力学療法（ＰＤＴ）であり、その両方は高いＱＹを要求する。現在の低いＱＹの問題は、増加した治療およびデータ収集時間、および浅い適用可能な深度を生じることにより、これらの技術の可能性を妨害する。低いＱＹは励起光レベルを上げることによりある程度まで克服されるが、そのような改善は組織加熱（ＡＮＳＩ基準によって規制される）の点から副作用の危険性によってＣＷ励起のために制限される。本発明の実施形態によれば、パルス励起の採用によって、励起光の熱効果を制限しつつ、アップコンバージョン（ＵＣ）発光の低いパワー密度限界を克服する低いＱＹが提供される。さらに、ＵＣＮＰの適用可能性は、単安定素子励起のスキームの利用によりさらに高められ得る。多光子の顕微鏡法に似ている、パルス励起は、平均パワー（加熱の原因である蓄積されたエネルギーを意味する）を適度に維持しつつ、パルス中に高い光子密度を提供し得る。ＵＣ発光の非線形のパワー密度依存性により、パルス励起は本開示で述べられるような有益な効果を奏する。

本開示の実施例は、低い量子収量を実証する従来技術での問題を克服するために、ＵＣ発光の励起動態を考慮する。以下の開示は著しいＱＹ増加を実証する実験とシミュレーションの実施例を挙げており、著しいＱＹ増加は本発明の実施形態による方法、システム及びシステムの使用で、パルス励起光を使用することにより達成することができる。例えば、パルス励起光は、一致したパルス特性、すなわち有利な効果を奏するために、充分に長いパルス幅と非飽和遷移によって使用される。これはパルス励起を、ＵＣＮＰのため、とりわけ深く位置付けられた組織体積のため、理想的な励起アプローチにする。加えて、ＵＣＮＰの単安定素子イメージングは、増加したＱＹにより実行することができ、同じ温度増加を引き起こすＣＷ光励起と比較して、イメージング深さを改善しつつ、大きさのオーダーによってデータ収集時間は短くされ得る。したがって、本開示は、拡散光励起に依存する深い組織領域のＵＣＮＰの適用可能性を基本的に広げる可能性がある。励起動態はレート式（ｒａｔｅ ｅｑｕａｔｉｏｎ）を用いてモデル化され得る。一般化を失わずに、Ｙｂ^３＋／Ｔｍ^３＋共ドープシステムの８００ｎｍでのＮＩＲ ＵＣ発光は、以下の実施例でモデルとして使用され得る。図２９（ａ）は、ＱＹが異なるパワー密度のＣＷ励起が続く、定常状態の条件でシミュレートされＣＷ励起を示す。見られるように、純粋に線形的ではなく複雑に励起パワー密度と共にＱＹが増加し、徐々に飽和する特徴、つまり、高い励起パワー密度で定数に接近する特徴を示す。図２９（ｂ）は、ＣＷ励起の下で、および第１のパルス持続時間でのパルス励起の下で、一時的にシミュレートされた累積的なＱＹを示す。ＣＷ励起は、１Ｗ／ｃｍ^２の一定パワー密度を持っている。２Ｈｚの周波数および４％のデューティサイクルを有するパルス励起は、それぞれ、「オン」状態及び「オフ」状態で、２５Ｗ／ｃｍ^２および０Ｗ／ｃｍ^２のパワー密度を持っている。それゆえ、ＣＷ励起と同じ平均パワー密度に帰着する。見られるように、エネルギー準位が励起の一時的な影響により占められる場合、ＣＷ励起の下では、ＵＣエミッションはまさにその初期段階の場合以外は一定のＱＹを持っている。この一定のＱＹは、ＵＣシステムの定常状態に関係していて、図２（ａ）中の１Ｗ／ｃｍ^２のパワー密度でのＱＹによって与えられる。パルス励起の下では、ＱＹは、レーザパルスの開始時には非常に小さく、その後、経時的に増加する。パルス持続時間の長さが許せば、ＱＹはＣＷ励起下のＱＹを越えて、漸近的に、最大値に接近するだろう。この最大値は、図２９（ａ）中の２５Ｗ／ｃｍ^２のパワー密度の定常状態でＱＹに制限される。明らかに、等価なＣＷ励起に置き換えるためにパルス励起を使用する利点は、より高いエネルギー転換効率と共に潜在的に遅い励起光子を使用することができることである一方で、損失は、各パルス持続時間の早期励起光子がＣＷ励起の間よりも低い効率で使用されることである。同じエネルギー量の下の増加したパワー密度と、減少した励磁時間の平衡を保つことによって、全面的なＵＣ信号利得が期待され得る。

パルス励起の下の多数の期間の長期的なＱＹは電位信号利得におけるパルス幅の影響を決定するために調査された。平均パワー密度は０．１Ｗ／ｃｍ^２で維持された。この研究で使用されるパルス励起は、別段の定めがない限り、４％の同じデューティサイクルを持っており、その周波数は異なるパルス幅を達成するために調節された。図２９（ｃ）に示されるように、顕著なＵＣ信号利得は、周波数が５０Ｈｚを充分に下回る場合に、パルス励起を使用することにより得られる。例えば、［０および５００］ミリ秒の時間間隔中の２Ｈｚの方形波による信号利得は、およそ８である。信号利得は周波数とともに減少する。つまりパルス幅と共に増加する。周波数がさらに高い（例えば１００Ｈｚまで）場合、パルス励起によって生成された信号は等価なＣＷ励起によって生成された信号よりわずかに小さくなる。信号利得が応用のパワー密度とともに減少することは注目されるべきである。平均パワー密度が１Ｗ／ｃｍ^２に増加される場合、利得は２まで減少する。図２９（ａ）に示されるように、これはＵＣ発光の徐々の飽和特性に帰着され得る。

実験的に上記のシミュレーションによって示されるようなパルス励起による信号中の利得を有効にするために、実験は、ヘキサン中で分散したコロイド状の安定した安定したコア−シェルＮａＹＦ_４：Ｙｂ^３＋、Ｔｍ^３＋＠ＮａＹＦ_４ＵＣＮＰに対して実行された。図３（ｂ）に示されるように、準備したＵＣＮＰは９７５ｎｍ光の励起下で約８００ｎｍで主なＵＣ発光帯を発光する。異なるパルス幅を備えたＣＷ励起およびパルス励起の下でＮＩＲ ＵＣ発光の強度が記録された。励起光の平均パワー密度は０．１２Ｗ／ｃｍ^２に維持された。図２６（ａ）に示されるように、パルス幅と共にモノトーン（ｍｏｎｏｔｏｎｉｃａｌｌｙ）で増加する信号利得は、０．８ミリ秒のパルス持続時間を有するパルス励起の使用により得られた。パルス幅が２０ミリ秒に達すると、利得は８．７もの高さである。これらの結果は、図２９に示された、シミュレートされた結果によく合う。本実施形態（〜０．８ミリ秒）における信号利得のために必要なパルス幅が、図２６（ａ）の挿入図中に示されるように、およそ１０ミリ秒のＵＣ発光の立ち上り時間よりはるかに短いことを指摘することは注目すべきである。

印加パワー密度へのＵＣ信号利得の依存性は、等価なＣＷ励起と共に、２０ミリ秒の固定パルス幅および５００ミリ秒のパルス持続時間を備えた方形波励起を使用して調査された。図２６（ｂ）は、様々な平均の励起パワー密度でのパルス励起によるＵＣ信号利得を示しており、励起パワー密度の増加につれて減少する傾向がはっきり見られる。調査された最小のパワー密度（〜０．１２Ｗ／ｃｍ^２）において、信号利得はおよそ８．６である一方で、最大パワー密度（〜４．６５Ｗ／ｃｍ^２）において、パルス励起によって生成されたＵＣ信号はＣＷ励起によって生成されたそれよりわずかに弱い。図２６（ｂ）の挿入図に示されるように、励起パワー密度へのＵＣエミッション強度の依存性は、ＣＷ励起の下でよりも小さな傾斜を示す。これは上記の信号利得傾向について説明することができる。
励起パワー密度を増加させる増幅結果は、本質的にＵＣ放射の非線形のパワー密度依存から始まる。したがって、高いオーダーのパワー密度依存性はより大きなＵＣ信号利得に帰着するだろう。これは、青色発光および赤色発光での測定によって確認され、両方とも３つの光子励起作用を介して生成された。図３０に示されるように、それらは所定のいかなる平均パワー密度でもＮＩＲ ＵＣエミッションより著しく大きな信号利得を示す。

深く位置づけられたＵＣＮＰをイメージングするための励起アプローチとしてパルス源を使用するメリットは、その後、液体組織ファントム中で有効になった。
水、イントラリピッドおよびインクで作られたファントムは、μ´_ｓ＝１０．１ｃｍ^−１の減少した散乱係数と、９７５ｎｍでμ_ｓ＝０．５２ｃｍ^−１の吸収係数を持つために、光子タイム・オブ・フライト分光法（ｐＴＯＦＳ）システムによって決定され、厚さは１７ｍｍだった。コロイド状のコア−シェルＵＣＮＰ（ｃ＝１重量％）を含む２ｍｍの内径をもつガラス管が、実際の組織の内部でラベルがＵＣＮＰに付けられた標的（例えば腫瘍）を模倣するために、発光取りこみとしてファントムに挿入された。２０ミリ秒のパルス幅および５００ミリ秒の期間を備えた、ＣＷレーザダイオードおよびパルスレーザを含む、２つの９７５ｎｍのレーザのうちの１つのレーザは、励起光を提供するために使用された。組織ファントムの表面上に当たる平均パワー密度は、両方の励起アプローチに対して１．２Ｗ／ｃｍ^２だった。励起源と検出器はトランス・イルミネーション幾何学で位置づけられた。

励起源から１０ｍｍの深さで埋められると、図２７（ａ）に示されるように、図２７（ｂ）で示されるように、発光介在物は、１０秒の露光時間でさえＣＷ励起の下でかろうじて検知できるが、パルス励起の使用によりＳＢ比は、同じ検出条件下のおよそ７倍も著しく増加された。明白な意味は、著しくデータ収集時間を減少することができることであり、等価なＣＷ励起として信号品質を維持する場合、イメージング深さが増加され得ることである。ＵＣエミッションのＱＹは、さらに高いパワー密度を提供する励起として単一パルスを使用することによりさらに最適化され得る。例えば、９７５ｎｍにおけるヒトの皮膚への接触用の最大許容パワー密度は、２０ミリ秒のパルス幅および２Ｈｚの周波数を備えた反復パルス励起のための１７．４Ｗ／ｃｍ^２である一方で５０ミリ秒の単一パルスのための数の高さは補足の材料に帰する３６．９Ｗ／ｃｍ^２もある。ＵＣ発光の立ち上り時間より長いパルス幅を備えたそのような強い単一パルスは、ＵＣＮＰがエネルギー変換の点から非常に効率的な方法で使用されることを可能にする。この励起アプローチは、ＡＮＳＩ標準を違反せずに、ＵＣＮＰを使用するイメージング能力を高めるだろう。

単安定素子イメージングのフィージビリティはこのように実験的に調査された。３６．９Ｗ／ｃｍ^２の励起パワー密度を提供する５０ミリ秒の単一パルスが使用された。ルミネセント介在物がパルス源から１３ｍｍの深さに置かれた時、図２７（ｄ）に示されるように、ｅｐｉ−蛍光イメージング・セットアップをさらに使用して、１秒の露光時間をもつ単一パルス励起を使用することを検知することができた。しかしながら、ＣＷレーザが励起源として使用された時、同じ照明面積領域（即ち、７０９．６ｍＷ／ｃｍ^２）でのＡＮＳＩ標準による最大の許容可能なパワー密度を出力して、図２７（ｃ）に示されるように、介在物は、１０秒よりさらに長い露光時間でさえ検知できなかった。励起源と検出器が同期される限り、単一パルス励起のための露光時間はＵＣ信号品質の損害なしに５０ミリ秒までも短縮され得る。ここで実証された例は、ＵＣＮＰにガイドされた深い組織で単安定素子ＵＣＮＰにガイドされる光学的イメージングにおける大きい励起のポテンシャルを示す。

深い組織ファントム中のＵＣＮＰの単安定素子イメージングは、ＱＹを著しく増加するためにパルス励起を使用して、本発明の実施形態にしたがってこのように達成され得る。これによってパルス励起のアプローチは、拡散光学イメージングのみならず、光線力学療法および深い組織中の生体分子の遠隔活性など他の多くの生物医学的な応用へのＵＣＮＰの適用可能性を著しく増加させる。さらに、金属のナノ構造体は、表面のプラズモン結合によってそれらの局所場増強効果に起因するＵＣ発光を増強するのに有効であり得る。それゆえ、パルス励起とデコレーションと金属のナノ構造体との組合せは、励起パワー密度を増加させる相乗効果により、拡散光レジメでのＵＣＮＰを使用する主なスキームを可能にし得る。本発明の一実施形態による方法（１００）は、それゆえ、前記パルス励起光に露出させるために前記媒体に金属ナノ構造体を提供する工程（１１７）を含み得る。かかるパルス励起アプローチは、励起したＴｍ^３＋を介してそれらの高いオーダーの多段式の励起の性質による生物学への適用におけるＥｕ^３＋およびＴｂ^３＋などのイオンからの移動を媒介としたＵＣ発光の適用可能性をさらに増加させる。加えて、本開示は、限定された照明領域を介して励起フルエンス率を増加させることにより、低い軽荷状態で非線形の発蛍光団（ＵＣＮＰおよびトリプレット・トリプレット消滅に基づいたアップコンバーターを含む）のアプリケーションを促進するために一般法を提供する。

方法（１００）は、それゆえ、第１のパルス（２０１）によって非線形のルミネセンスマーカー（１０４）を励起させる工程を含む。すなわち、パルス励起光は少なくとも１つの光のパルスを含む。さらに、方法（１００）は、前記第１のパルスから単一パルスルミネセンス分子イメージングを提供するために前記第１パルス光からの励起光により、ルミネセンスマーカーからのルミネセンスを検知する工程（１０６）を含む。この単一パルスイメージングは、ＣＷ励起に対する上記利点のいくつかのものを提供する。

方法（１００）は、アップコンバートされた光が非常に効率的なやり方で出力されるように、アップコンバートされた光の発光に関連付けられた非線形のルミネセンスマーカーのエネルギー準位の所望の母集団に実質的に供給するために、パルスの長さ（ｗ）などの少なくとも１つのパルスのパルス特性を、非線形のルミネセンスマーカーのエネルギーレベルの遷移条件とマッチングさせる工程（１０２）を含み得る。励起／発光・プロセスに関与するエネルギー準位遷移のダイナミクスは、それによって、パルスの特性を適応させるために、考慮に入れられる。つまり、ルミネセンスの適切かつ最適化された強度を提供するために、パルス特性が特定の条件で提供するように調整することができ、該特定の条件、例えば、発光・プロセスに関係する励起状態の寿命の期間を考慮に入れることによって、エネルギー準位の母集団が希望のスキームに従う。それゆえ、方法（１００）は、前記非線形のルミネセンスマーカーの励起を提供するために、前記パルス光のパルス幅および／またはパルス波形を決定する工程（１１６）を含み得る。

この文脈では、方法（１００）は、アップコンバートされた光の発光に含まれるエネルギー準位まで励起を供給する範囲にあるようにパルス励起光のパルス幅（ｗ）を決定する工程（１０４）を含み得る。パルスの長さはエネルギー準位の寿命の計算に基づいて決定され得る。連発パルス中の各パルスの長さは約１−１００ミリ秒の範囲にあり得る。システム（６００）は、それゆえ、寿命計算など前述の非線形のルミネセンスマーカーのエネルギー準位遷移条件の計算に基づいて、前述の励起光のパルス幅を決定するために動作可能な演算処理装置（６０３）を含み得る。

方法（１００）は、図２７の（ｄ）に関して記述されたような単一パルスルミネセンス分子イメージングのために約２０−２００ミリ秒の範囲にある、パルス励起光のパルス幅（ｗ）を決定する工程（１０４）を含み得る。

方法（１００）は、予め定義したパルス励起光の特性を設定するために前述の励起光のパワーについて検知されたルミネセンスの依存性を決定する工程（１１５）を含み得る。

図２６の（ａ）を参照して、信号利得は０．８ミリ秒という短いパルス幅を使用して得られ得る。加えて、最適なパルス幅は材料に依存する。例えば、Ｙｂ^３＋／Ｅｒ３＋共ドープ材料のための最適な持続時間はＥｒ^３＋Ｔｍ^３＋共ドープ材料のための最適な持続時間より短い。なぜならＥｒ^３＋イオンの中間のエネルギー状態はＴｍ^３＋イオンのエネルギー状態より通常短い寿命を有しているからである。

約１００ｕｓのパルス幅を有することは、典型的には十分な信号利得を提供しない。関連する寿命より長いパルス幅は、改善された量子収量を提供し、それによってイメージング能力を改善することにおいて有利であり得る。利得は０．８ミリ秒のパルス幅を有する一方で０．８ミリ秒以上の寿命を有することで提供され得る。パルス励起の使用による利得は、本質的により高いピークパワー密度から始まる。あまりにも短いパルス幅は、より高いピークパワー密度によってもたらされた有益性を「食べ尽くす」。０．４ミリ秒のパルス幅に対応する１００Ｈｚ、５０％のデューティサイクルパルスを使用するとき、特定のナノ粒子に対するパルス励起を使用することによる信号利得は存在しない。ナノ粒子をアップコンバートするように励起するフェムト秒あるいはマイクロ秒パルスレーザは、本開示によって提供されるような信号利得を示さない。パルス幅の上限については、関心事は、パルス幅が大きければ（一般に、デューティサイクルがこの技術には小さいので）、検出システムの待ち時間長すぎることである。例えば、１００ミリ秒のパルス幅および１０％のデューティサイクルを備えたパルス励起については、レーザによって生成された次の期間のルミネセンス信号を集める前の待ち時間は、９００ミリ秒である。それは受けいれられない。しかし、待ち時間があまりに長ければ、実験における時間で経済的ではない。

単一パルス励起については、パルス幅を増加させることは有利かもしれない。関心事は、レーザは、単一パルスの送達後にかなりの時間休止するので、ルミネセンス信号はそのような区間の中でのみ生成されるということである。パルス持続時間が短すぎれば、組織の表面から逃げる、生成された発光光子は、良好な信号を与えるには少なすぎる（しかし、ＱＹの増加は、それで等価なＣＷ励起と比較される）。単一パルスのための持続時間の望ましい区間は２０−２００ミリ秒でありえる。単一パルスがあまりに長いと、それはあまりにＣＷソースを望むであろう。その場合、ＡＮＳＩ標準にしたがって、好ましくは高いピークパワー密度を使用することは許されない。

ここで図２２−２５に言及する。方法（１００）は、（パワー密度曲線２０６、２０７に関して図２３に例証されているように）時間（ｔ）の関数としてのパルス励起光のパワー密度（Ｉ）を変化させる工程（１０９）、パワー密度へのルミネセンスの量子収量の依存性（Ｑ／Ｉ）を決定する工程（１１０）、及び量子収量の依存性に基づいた散乱性媒質中のマーカー位置の相対的な深さ座標（２０３）を決定する工程（１１１）を含み得る。異なるパワー密度について図２０に例証されているように、一連のパルス（ｗ１、ｗ２）は、励起光として使用され得る。量子収量がパルスのおのおのについて計算することができ、図２５に例証される依存性（Ｑ／Ｉ）が決定され得る。励起光のパワー密度が変えられるにつれて量子収量がどのように変わるかに依存して、図２２の中のマーカー２０９および２０８についてそれぞれ例証されているように、媒体中にマーカーが比較的深く位置するか、浅く位置するかを決定することができる。媒体中のより浅い位置（２０４）を有するマーカー（２０８）は、図２５中のＱ／Ｉ曲線で示されるように、より深い位置（２０５）を有するマーカー（２０９）と比較して、パワー密度が変えられるにつれて、ルミネセンス量子収量に、より少ない分散を示すだろう。方法（１００）は量子収量依存の導関数（ｄＱ／ｄＩ）に基づいた相対的な深さ座標（２０３）を決定する工程（１１２）を含み得る。そして、方法（１００）は、それぞれ第１及び第２パワー密度（ｌ１， ｌ２）を有する第１及び第２パルス（２０１、２０２）を備えた非線形の発光マーカーを順に励起する工程（１１３）と、当該第１及び第２パルスからの量子収量における変化に基づいて総体的な深さ座標（２０３）を調整する工程（１１４）を含み得る。これは、それらの相対的な大きさの影響を考慮に入れずに、異なる深さマーカーを区別することを可能にする。

システム（６００）は、それゆえ、時間（ｔ）の関数としてパルス励起光のパワー密度を変化するように動作可能な制御ユニット（６０２）と、パワー密度へのルミネセンスの量子収量の依存性（Ｑ／Ｉ）を決定し、かつ前記量子収量依存性に基づいた散乱媒体中のマーカー位置の相対的な深さ座標（２０３）を決定するために動作可能な第２の処理装置（６０４）を含み得る。システム（６００）は叙上のとおりの方法（１００）を実行するための制御ユニット（６０５）を含み得る。さらに、方法（１００）を実行するためのシステム（６００）の使用は、本開示に従って提供される。より詳しくは、システム（６００）の使用は、タブレットのルミネセンス画像診断か発光断層撮影法のため、および／または拡散光学画像診断のため、および／または光力学療法および／または深い組織中の生体分子の遠隔の活性化および／または小さな動物のインビボ（ｉｎ−ｖｉｖｏ）若しくはインビトロのルミネセンス画像診断あるいは発光断層撮影法のためのおよび／または前記ルミネセンス画像診断あるいは発光断層撮影法によって癌診断などの機能的診断法のため、および／または探針として前記非線形の発光マーカーを使用する誘導放出消耗（ＳＴＥＤ）あるいは単一の分子の検知を含む超高解像度の顕微鏡検査法のために開示される。

光力学療法に基づくナノ粒子をアップコンバートするパルス励起の潜在的な使用
この提案された技術は、アップコンバージョン能力をより効率的に利用するための一般的なアプローチである。それは、Ｙｂ^３＋／Ｔｍ^３＋共ドープされたアップコンバーティングナノ粒子に対して作用するだけでなく、任意のアップコンバーティングナノ粒子或いはアップコンバーティングバルク・ 材料に対しても作用する。それは、３つの光子プロセスからのＴｍ３＋の青色発光及び赤色発光などのより高いオーダーのアップコンバージョン発光に対して作用する。このアプローチはより短い波長のアップコンバージョン（ｕｐｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）放射を増強するのに有用であり、生物の組織中のナノ粒子に基づいた光力学療法をアップコンバーとするために必要とされる。

本発明が特定の実施形態を参照して上に述べた。しかし、上述以外の実施形態が本発明の範囲内で同様に可能である。本発明の異なる特徴および段階は説明されたもの以外の組合せで組み合わせることができる。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

本方法は、生きているヒトまたは動物の体で生体内にて行うことができる。この場合、マーカーは、血液循環への注入、または皮下的もしくは直接的な腫瘍への注入による、あるいは代替として、局所適用、肺性および他の非侵襲的方法によるなどの任意の方法で体に事前導入することができる。そのような事前導入は残りの方法とは別々に行うことができる。そのような事前導入は残りの方法に関連して、しかしその直前に行うことができる。

代替としてまたは追加として、本方法は、本方法が行われた後犠牲となるヒトまたは動物の体で行うことができる。

代替としてまたは追加として、本方法は、生きていないヒトもしくは動物の体、または体の一部、例えば脳死のヒトもしくは動物の体で生体外にて行うことができる。

代替としてまたは追加として、本方法は、フィルタまたはタブレットなどの非医学的分野で行うことができる。

探針としてＵＣＮＰを使用する超高解像度顕微鏡検査法
超高解像度顕微鏡検査法は最近開発され、および多くの生物学の研究に非常に興味深く、かつ有用なツールになった。２つのタイプの超高解像度顕微鏡検査法があり、一つは非線形の光学効果に依存するものであり、他の一つは単一の分子検知に依存するものである。
それらは両方とも選択された分子が信号を提供する点で共通し、その一方で、他方がフィルタにかけられている。第１のカテゴリーは、ＳＴＥＤ（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）とＳＳＩＭ（ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を含み、一方で、単一の分子検知は、ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｅｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ （ＰＡＬＭ）， ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｅｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ５ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ （ＦＰＡＬＭ）および ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ （ＳＴＯＲＭ）を含んでいる。第１のカテゴリーの超高解像度顕微鏡検査法は、近くの探針が非発光にされ得る間、当該探針が発光し得ることを利用している。励起状態は近くの探針のために減らされる。この処置は使用される探針のための要件を設定し、１つは、それが非常に光安定性でなければならず（これは比較的高い励起パワーを要求する非線形の効果であるからである）、非明滅であること（活性状態である間に、それらが終始活性でなければならないから）および探針が光スイッチ動作され得るいくつかのエネルギー準位を持つべきである。ＵＣＮＰはこれらの要件を満たす特有の特性を備えた、ＳＴＥＤのための理想的な探針でありえる。

別のカテゴリーは、他のエネルギー準位に探針が光スイッチ動作することができ、不活性になることができることに依存する。これは低い光レベルを持つ単一の分子のレジメである。さらに、それは自発的な写真明滅に依存することができる。ＵＣＮＰは、これらの探針中の多くのエネルギー準位を備えたこれらの技術用の興味深い探針になり得る。

つぎの参考文献は、すべての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる。
［参考文献１］ Ｃ． Ｔ． Ｘｕ， Ｊ． Ａｘｅｌｓｓｏｎ， ａｎｄ Ｓ． Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ−Ｅｎｇｅｌｓ， Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓ． Ｌｅｔｔ． ９４， ２５１１０７ （２００９）．
［参考文献２］ Ｊ． Ｐ． Ｃｕｌｖｅｒ， Ｖ． Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ， Ｍ． Ｊ． Ｈｏｌｂｏｋｅ， ａｎｄ Ａ． Ｇ． Ｙｏｄｈ， Ｏｐｔ． Ｌｅｔｔ． ２６， ７０１ （２００１）．

［参考文献３］ Ｅ． Ａｌｅｒｓｔａｍ， Ｓ． Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ−Ｅｎｇｅｌｓ， ａｎｄ Ｔ． Ｓｖｅｎｓｓｏｎ， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｏｐｔ． １３， ０４１３０４ （２００８）．

Claims (12)

1. 散乱媒体中の関心領域の拡散ルミネセンス分子イメージング用のシステム（６００）であって、
   前記システムは、
   散乱媒体の前記ルミネセンス分子イメージングで使用するルミネセンスマーカー（５０２）であって、前記ルミネセンスマーカーは散乱媒体に配置された非線形のルミネセンスマーカーである、ルミネセンスマーカー（５０２）と、
   １又は２以上の光源（５０３）であって、励起光によって前記ルミネセンスマーカーを励起するための少なくとも１つの光源位置（５０５と５０６）によって位置づけられ、該励起光は前記１又は２以上の光源によって励起容量部内へ発光されてなる１又は２以上の光源（５０３）と、
   前記励起光によるルミネセンスマーカーからのルミネセンス光を検知する位置における検出器（５０４）
   を備え、前記励起光がパルス励起光を含んでなるシステムであって、
   前記システムが、さらに、
   寿命計算などの前記非線形のルミネセンスマーカーのエネルギーレベル遷移条件の計算に基づいて前記励起光のパルスの長さを決定するために動作可能である演算処理装置（６０３）と、パルスの長さ（ｗ）などの少なくとも１つのパルスのパルス特性を、前記非線形のルミネセンスマーカーの発光・プロセスに関与する励起状態の寿命と一致させる制御ユニット（６０５）を備え、これによって、アップコンバートされた光の発光に関連する非線形のルミネセンスマーカーのエネルギー準位の所望の個体群に実質的に供給し、アップコンバーターで変換された光が効率的なやり方で出力されることを特徴とするシステム。
2. 前記励起光のパルスに続く時間間隔（２１０）の間にルミネセンスを検知するために動作可能な検出器ユニット（６０１）を含む請求項１記載のシステム。
3. 時間（ｔ）の関数として前記パルス励起光のパワー密度を変化させるために動作可能な制御ユニット（６０２）と、前記パワー密度へのルミネセンスの量子収量依存性（Ｑ／ｌ）を決定し、かつ量子収量依存に基づいた前記散乱ミディアム中の前記マーカー位置の相対的な深さ座標（２０３）を決定するために動作可能な第２の処理装置（６０４）を含む請求項１又は２に記載のシステム。
4. 前記ルミネセンスマーカーはルミネセンス生物学マーカーであり、前記散乱媒体がヒト又は動物の組織であり、前記ルミネセンス生物学マーカーが前記組織内に配置される請求項１乃至３のいずれかに記載のシステム。
5. 前記ルミネセンスマーカーはナトリウムイットリウム四弗化素（ＮａＹＦ_４）のナノサイズのアップコンバーティング粒子であり、Ｙｂ^３＋／Ｅｒ^３＋又はＹｂ^３＋／Ｔｍ^３＋のいずれかで共ドープされた請求項１乃至４のいずれかに記載のシステム。
6. 前記ルミネセンスマーカーは、水溶性である粒子を含むナノサイズのアップコンバーティング粒子および／または極性を有する構造で覆われた粒子および／または水酸基を有しアップコンバーティング粒子の表面に付けられた粒子を含む請求項１乃至５のいずれかに記載のシステム。
7. 前記ルミネセンスマーカーは保護コーティングを有する請求項１乃至６のいずれかに記載のシステム。
8. 前記システムはルミネセンス分子断層撮影法のために用いられる請求項１乃至７のいずれかに記載のシステム。
9. 前記ルミネセンスイメージング用のモダリティと異なるイメージングモダリティのためのイメージングコントラストに前記非線形のマーカーが付けられている請求項１乃至８のいずれかに記載のシステム。
10. 前記非線形のマーカーは、常磁性を有する、有機ガドリニウム複合体又はガドリニウム化合物に付けられ、および、前記システムは、さらにＭＲＩとルミネセンス分子断層撮影法によって関心領域の同時イメージング用の磁気共鳴画像（ＭＲＩ）装置を含む請求項１乃至９のいずれかに記載のシステム。
11. 前記励起光は前記第１光源位置からの第１の波長を有する第１光源と、および前記第２光源位置からの第２の波長を有する第２の光源によって提供される請求項１乃至１０のいずれかに記載のシステム。
12. 前記励起光は、前記第１と第２光源によって同時に提供される請求項１１に記載のシステム。