CN110720040A - 分析至少一种分析物的样本的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了一种用于在组织学，如组织病理学，或细胞病理学，特别是免疫组织化学或免疫细胞化学中分析至少一种分析物的样本的方法。该方法包括使样本与至少一个靶向部分或探针接触，其中，至少一个靶向部分或探针中的每个不同的靶向部分或探针特异性地结合至少一种分析物中的不同分析物。所述至少一个靶向部分或探针中的每个不同的靶向部分或探针被偶联到不同的发光粒子。检测来自与和样本结合的至少一个靶向部分相关联的发光粒子的信号。由此可以在样本中检测至少一种分析物的存在或量。

Description

分析至少一种分析物的样本的方法
技术领域
本公开总体涉及分析至少一种分析物的样本。更具体地，本公开涉及使用发光粒子对样本(例如组织)进行着色或染色以确定样本中的至少一种分析物的存在或含量。特别地，本公开涉及用发光粒子对样本进行着色或染色，以用于组织学、例如组织病理学或细胞病理学，特别是用于免疫组织化学或免疫细胞化学。
背景技术
在组织学(例如组织病理学)或细胞学(例如细胞病理学)中，使用了多种技术来研究和分析生物细胞或组织，例如免疫组织化学(IHC)或免疫细胞化学(ICC)。
在免疫组织化学中，在细胞样本或组织切片上的细胞中检测到抗原、例如蛋白质。通过使用与生物细胞或组织中特定抗原结合的、标记的抗体来检测抗原。在组织学(例如组织病理学)或细胞学(例如细胞病理学)中，着色或染色(例如苏木精-曙红(H&E)，免疫组化/免疫细胞化学(IHC/ICC)或杂交、例如原位杂交(ISH))是用于诊断非典型生物细胞(例如在肿瘤或凋亡区域中)的常规标准程序。着色或染色(例如免疫组织化学或免疫细胞化学)也常用于基础研究中，以了解生物标记物以及差异表达的基因和蛋白质在生物组织的不同部分中的分布和定位。抗体和抗原之间的结合可以以不同的方式显现。最常见的做法是将例如抗体与酶(例如过氧化物酶)偶联，该酶可以催化样本中的颜色变化。另一种替代方法是用荧光团(例如荧光素或若丹明)来标记抗体。由于自发荧光(即来自组织本身的荧光)，荧光团的使用受到限制，并且需要特殊且费时的组织样本制备才能使用。使用荧光团时，基于福尔马林固定和石蜡包埋的常规和优选程序比未经处理的组织遭受更高水平的自发荧光。
传统着色和染色方法的其他已知缺点是背景染色太强或目标染色太弱。其他缺点是，例如用于IHC/ICC复染色的某些染色剂或染料可能会发出荧光，其干扰用于定位特定分析物的报告分子。还有例如用于IHC/ICC的复染色的一些染色剂或染料，它们可能会在一定波长范围内吸收，该波长范围干扰某些用于定位特定分析物的报告分子的激发或发射。
这些问题可能会降低用于样本诊断的图像的对比度和分辨率。一个例子是常用的苏木精和曙红，这两个生色团在可见光区域中都具有很强的吸收性，并且曙红在大部分可见光谱中具有很高的荧光性。这意味着单个切片无法与用于IHC/ICC或杂交的大多数类型的免疫荧光共染色。将苏木精和/或曙红(H&E)与用于比色IHC/ICC或杂交的着色颜料共染色也可能是一个问题，因为它们可能使复染色(例如H&E染色)不透明且模糊。在进行显色成像或荧光成像时，也存在光谱重叠的问题，这意味着标记报告分子和复染色染料的光谱非常接近，以至于无法在其间进行分辨或区分。
为了克服这些问题，通过对同一组织标本的不同部分的互补区域进行连续切片和成像来将复染色的图像和IHC/ICC/杂交图像彼此常规关联，但这些方法由于在彼此相距最佳3-10μm隔开的切片上完成染色的事实而存在对齐障碍。当复用以检测多于一种的分析物时，这同样适用，其中每种分析物通常需要其自己的切片。多个连续切片可能不仅导致配准问题，而且需要比正常获得的样本更大的样本，例如较厚的组织切片或活检，或更多的细胞。
除了这些问题之外，还需要考虑其他事项，例如光漂白，以及不同的染料、染色剂和报告分子可能彼此反应并变得化学不稳定并失去它们的特性。
已经开发出大量的生色和荧光染料以适合不同的实验设计。这些染料可以是非特异性的，以相同的方式染色大多数细胞，或者可以是特异性的，选择性地染色细胞/组织内的特定的细胞区室或化学分子。而且，已经开发了不同的协议来帮助克服其中一些缺点。这些协议中的许多是复杂且耗时的，并且包括折衷方案。
对IHC/ICC和杂交的常规标记报告分子的替代方法，已经使用并尝试了量子点。即使许多出版物已经显示了良好的结果，并且量子点可从市场上容易且商业购得已有很长时间(将近20年)，但它们仍未在常规例程中使用，而是主要用于研究。已经有许多报道称原因可能与例如与传统的小分子染料和染色剂相比的稳定性有关，尤其是对于具有较长波长的较大量子点粒子而言，“用于免疫荧光标记细胞靶点的量子点结合抗体(Evaluation ofquantum dot conjugated antibodies for immunofluorescent labeling of cellulartargets)”，Jennifer E.Francis等，纳米技术，2017，8，1238-1249。大多数成功的研究都是在紫外线/深蓝色和可见光区域(约400nm至700nm)内完成的，其中与更标准的染料和染色剂相比，量子点的优点是通常在10至20nm左右的更窄的荧光带。
希望有一种改进和简化的程序，其在分析分析物的样本时可以节省时间和成本。另一个需求是可以选择进行多种着色或染色以同时分析多于一种分析物的样本。另一个需求是能够执行少量样本的检查。
发明内容
因此，本公开的示例优选通过提供一种根据所附专利权利要求所述的用于分析至少一种分析物的样本的装置、系统或方法，来寻求单独地或以任何组合的方式减轻、缓和或消除本领域中的例如上面所认定的一个或多个缺陷、缺点或问题。
本公开涉及使用靶向特异性部分或探针对样本着色或染色。靶向特异性部分或探针可以偶联到发光粒子，例如荧光粒子，例如上转换粒子(例如上转换纳米粒子)或其他粒子，例如量子点。
所使用的每种类型的部分或探针可以与不同种类的发光粒子偶联。因此，可以应用多种着色或染色，从而可以在同一样本中(例如来自同一切片)分析一种以上类型的分析物。例如，靶向部分或探针可用于确定样本中不同分析物的分布或浓度。此外，还可以在二维或三维上确定样本中分析物的分布。
被分析的样本可以是生物细胞或组织的样本。在一些示例中，分析是组织病理学、特别是免疫组织化学，或者是细胞病理学、特别是免疫细胞化学，或者是用于检测样本(例如组织切片)的细胞中的至少一种分析物(例如抗原或蛋白质)的杂交。可以使用福尔马林固定和石蜡包埋的常规方法制备样本。
然后可以使用显微镜或其他类型的成像仪器(例如高分辨率相机)来观察样本、例如组织切片。
可选地，在一些示例中，可以使用常规的冷冻和切片程序来制备用于组织病理学、特别是免疫组织化学，或细胞病理学、特别是免疫细胞化学，或杂交的样本，它也可以是自由浮动的切片或本领域技术人员已知的类似物。
在本公开的一些示例中，样本可以是液体样本，例如体液，例如血液或血浆。另外，在一些示例中，该分析可以用于生物化学，例如使用ELISA，例如微ELISA。另外，在一些示例中，该分析可以用于微生物学。
可以针对目标分析物，例如，抗原、抗体、蛋白质、纤维素(细胞膜)、碳水化合物(例如糖)或核酸(例如DNA或RNA)来分析样本。
可以使用荧光显微镜分析样本。荧光显微镜可以是数字化的和/或自动化的。
在一些示例中，样本的分析可以用于在诊断诸如人或动物之类的对象时提供支持。
在本公开的一个方面中，公开了一种对生物样本中的至少一种分析物进行成像的方法。该方法包括使样本与至少一个靶向部分或探针接触，其中，至少一个靶向部分或探针中的每个不同的靶向部分或探针特异性地可以结合至少一种分析物中的不同分析物，并且其中，至少一个靶向部分或探针中的每个不同的靶向部分或探针可以用不同的发光粒子标记。发光粒子可以是上转换粒子。
该方法可以进一步包括通过检测来自与结合于所述样本的至少一个靶向部分或探针相关联的发光粒子的信号来获得第一图像。
而且，该方法可以包括获得来自样本的第二图像，其中，第二图像是没有复染色的样本的明场图像。在一些示例中，第二图像可以是使用染料或染色剂复染或着色的样本的图像。
此外，该方法可以包括将第一图像与第二图像组合以获得组合图像。在本公开的一些示例中，可以使用常规染料或染色剂对样本进行复染色或着色。
在本公开的一些示例中，该方法可以涉及组织学、例如免疫组织化学(IHC)，或细胞学、例如免疫细胞化学(ICC)，或杂交、例如原位杂交(ISH)。
在本公开的一些示例中，探针可以是定位于至少一种分析物的互补的DNA、RNA或修饰的核酸链，至少一种分析物为DNA或RNA序列。
在本公开的一些示例中，该方法可以包括分析组合图像以检测至少一种分析物的存在或量。
在本公开的一些示例中，可以根据所使用的复染色的类型使用MUSE、明场或荧光来获得复染色的样本的第二图像。
所公开的方法的主要优点是在检测期间不会拾取背景，因为来自粒子的荧光可以以与来自背景的自发荧光不同的波长发出荧光。自发荧光可以源自样本本身，例如来自组织，或者源自在制备样本的过程中引入的材料，例如来自固定和石蜡包埋。发光粒子(例如荧光粒子)的发射可以是反斯托克斯位移或斯托克斯位移，例如通常是反斯托克斯位移和量子点斯托克斯位移的上转换粒子(例如上转换纳米粒子)。斯托克斯位移或反斯托克斯位移可用于从背景中滤掉来自粒子的信号。背景可以由来自光源的光(例如，照亮样本的光源，或实验室环境中的光源)或来自样本本身的荧光(自发荧光)或样本中有意或无意存在的其他荧光分子、物质或粒子组成。由此可以使用常规程序，其与涉及标准荧光团的程序相比将节省时间和成本。
另一个优点是，可以同时进行多种着色或染色，因为来自每种发光粒子(例如使用的荧光粒子)的发射光谱可以非常窄。例如，通过使用不同掺杂的上转换粒子(例如上转换纳米粒子)或者不同类型的量子点，可以获得可区分的发射光谱。每一发射光谱将与结合到特定目标的特定类型的粒子有关。
使用是反斯托克斯位移或斯托克斯位移的发光粒子(例如荧光粒子)可以提高对比度。使用是反斯托克斯位移或斯托克斯位移的发光粒子(例如荧光粒子)可以提高分辨率。这可以用于改善数字化分析并允许自动化分析。
另一个优点是可以防止光致褪色。
该方法可以用于人类样本或来自动物的样本。
应该强调的是术语“包括/包含”在本说明书中使用时是用来指定所述的特征、整数、步骤或部件的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、部件或组的存在或增加。
附图说明
参考附图，根据本公开示例的以下描述，本公开的示例的这些和其他方面、特征和优点将变得明显并得到阐明。
图1示出了分析至少一种分析物的样本的方法的一种示例；
图2示出了分析至少一种分析物的样本的方法的另一示例；
图3A至图3C示出了使用上转换粒子结合明场图像的免疫细胞化学(ICC)的一种示例；
图4A至图4C示出了使用上转换粒子结合明场图像的免疫细胞化学(ICC)的另一示例；和
图5A至图5C示出了使用上转换粒子结合被复染色的明场图像的免疫组织化学(IHC)的一种示例。
具体实施方式
以下公开内容集中于本公开的适用于确定样本中分析物的浓度或分布的示例。可以将样本放在适用于荧光显微镜的透明载玻片上。本公开对于组织学，例如组织病理学，并且特别是免疫组织化学(IHC)，是尤其有利的。本公开对于细胞学(例如细胞病理学)和免疫细胞化学(ICC)可以进一步是有利的。本公开对于例如杂交(例如原位杂交，并且特别是原位荧光)也可以是有利的。然而，将理解的是，该描述不限于本申请，而是可以应用于许多其他类型的分析、样本、部分(moieties)和靶标。
图1示出了分析至少一种分析物的样本的方法1000。样本可以是生物学样本(例如组织切片)、细胞样本或要在显微镜下(例如荧光显微镜)观察的液体样本。该方法包括使样本与至少一个靶向部分或探针接触1001。该至少一个靶向部分或探针中的每个不同的靶向部分或探针特异性地结合样本中至少一种分析物中的不同分析物。此外，至少一个靶向部分或探针中的靶向部分或探针用一种或几种发光粒子标记，例如结合至发光粒子，例如荧光粒子，例如上转换粒子，例如上转换纳米粒子或量子点。
发光粒子是用于生物成像的一类造影剂。当以特定波长激发时，诸如荧光粒子之类的发光粒子可以发射斯托克斯或反斯托克斯位移光(Stokes or anti-Stokes shiftedlight)。例如，当在特定波长(比如红外或近红外光)下(例如在975nm下)激发时，粒子可发出反斯托克斯位移光(例如可见光)。另外和/或替代地，一些上转换粒子还可能在红外或近红外光(例如1500nm附近)中的更长波长下发射斯托克斯位移荧光。当该光在从背景(例如从生物样本本身(如组织)或从样本的固定和包埋)发射的自发荧光的波长范围之外时，也可以使用该光。在一些示例中，当分析样本时，可以使用从相同粒子发射的斯托克斯和反斯托克斯位移光。
斯托克斯位移量子点的示例可以由UV区域(例如350nm以下)中的光激发。它们也可能由组织穿透深度较大的红色或近红外区域(例如800nm)中的光激发。粒子将优选在自发荧光弱得多的波长区域中比激发光长得多的波长下发射光。对于在UV区域中激发的粒子来说，发射的光可以在可见光区域中，而对于在红色或近红外读取区域中激发的粒子来说，发射的光可以在近红外或红外区域中，例如在约1500nm或更长。
与传统的荧光团相比，斯托克斯或反斯托克斯位移可以提供改进的对比度信号，因为可以使用过滤器消除来自组织的自发荧光。特别是石蜡包埋的组织具有很强的背景自发荧光，其使得难以使用常规的荧光团作为标记物，而不耗时且不昂贵地制品制备样本。因此，除了改善对比度之外，由于可以使用常规的福尔马林固定和石蜡包埋，因此发光粒子(例如荧光粒子，例如上转换粒子(例如上转换纳米粒子))或量子点可以节省时间和成本。标记的靶向部分或探针可用于组织学(例如组织病理学，并且特别是免疫组织化学)或细胞学(例如细胞病理学，尤其是免疫细胞化学)或杂交(例如原位杂交(ISH))，可与复染色相结合使用，复染色例如是在组织学，并且特别是免疫组织化学、细胞学，并且特别是免疫细胞化学、或杂交(例如原位杂交(ISH))中所使用的标准复染色。可以使用不同的检测方法，例如明场荧光或MUSE。MUSE使用来自被布置为提供倾斜照明的LED的紫外光，例如在约280nm。光用于仅激发已使用荧光染料被短暂(～10秒)染色的组织的表面层。与更长波长的光不同，280-nm光只能穿透到10微米或更小的深度，并且因此仅从被切割的样本表面激发方便在可见光范围内的荧光信号。可以受衍射限制的图像是使用常规显微镜光学器件和标准彩色相机捕获的。标准的复染色可能是发色的或基于荧光的。染料或染色剂可以是非特异性的，以相同的方式染色大多数细胞，或者可以是特异性的，选择性地染色细胞/组织内的特定细胞器或细胞区室或化学分子，例如，靶向核酸细胞壁或膜的核。复染色的示例是苏木精和曙红(H&E)染色(每个单独或组合)、DAPI、Hoechst染色、甲基绿、亚甲基蓝、甲苯胺蓝、DRAQ5、DRAQ7、Neuclear固红、革兰氏染色、PAS染色、罗丹明、尼罗蓝、尼罗红、碘化丙啶、SYTOX绿以及许多本领域技术人员已知的那些。
大多数上转换粒子是非线性的荧光团。在本申请的上下文中，“非线性标记物”是发光标记物，其中，标记物的发光度(L)并不线性地依赖于激发光(E)的辐射通量。非线性标记物因此根据以下发光：L＝k*E^x，其中x＞1，并且其中k是正常数。非线性标记物还可以根据以下关系发光：
L＝k*E^x+b,L＝k(E)*E^x+b,L＝k(E)*Ε^x+b(E)或者L＝k*E^x+b(E)，其中k和b是恒定的或依赖于激发光(E)的局部场的材料常数，即用于k(E)和b(E)。相比于常规的发光成像，非线性标记物(或荧光团)可因此需要用于激发的一个以上的光子。这可大大降低激励体积，并提供一个更局部的激发点。以这种方式，提高了发光成像的对比度和分辨率。这在吸收和散射介质的发光成像中也可以提高发射的荧光信号的对比度和分辨率。本发明的示例可以利用这种效果。
激发光优选是脉冲的，并且每个脉冲可以是从几μs到几ms，例如10μs到10ms，例如100μs到10ms，例如100μs到1ms，例如10μs到1ms，例如100μs到100ms，例如1ms到10ms，例如1ms到100ms，与较短的激发信号(如ns、ps、fs)相比，这在相对于激发功率的信号中已显示出获得更高的产率。
上转换粒子(例如纳米上转换粒子)例如是易于制造的镧系元素掺杂的氧化物，例如三氧化二钇(Y2O3)。其他上转换粒子(例如纳米上转换粒子)例如是镧系元素掺杂的氟化物，其可具有比氧化物高的效率。较高的效率可以通过氟化物中的低声子能量来解释，其降低了非辐射衰减的可能性。
另外的上转换粒子(例如上转换纳米粒子)例如由四氟化钇钠(NaYF4)制成，并与Yb3+/Er3+或Yb3+/Tm3+共掺杂。NaYF4可以结晶成立方或六方的两个相，分别称为α-NaYF4和β-NaYF4。与来自α相的上转换发光相比，来自β相材料的上转换发光大约高一个数量级。
非线性荧光团可以是水溶性的，从而允许在某些应用中容易地施用，例如在用于静脉内、经口或肠内施用的溶液中。
将上转换粒子提供为水溶性的方法是用极性(例如亲水性)结构涂覆粒子。涂层可以例如由聚合物或二氧化硅制成。合成聚合物(例如，聚乙二醇(PEG))和天然聚合物都可以用于该涂层。这些聚合物在生物环境中是稳定的，并且不会以任何明显的负面方式干扰晶体(例如纳米晶体)的光学特性。
可以提供没有涂层的水溶性上转换粒子。羟基可通过化学键或物理吸收连接至上转换粒子的表面。羟基是由共价结合形成的定义，并且最终结构具有极性。
使用上转换粒子的优点在于，生物样本(例如组织切片)应优选能够长时间保存，并且上转换粒子具有长的寿命。上转换粒子将不容易光致褪色，并且非常稳定，并且不会与其他染料和染色剂发生反应。这意味着样本可以保存一个月或更长的时间，并且分析可能仍然重复。
在一些示例中，至少一个靶向部分可以是分析物特异性配体，例如肿瘤特异性配体。配体结合目标分析物处的受体，并且不同的配体可能结合至不同的目标分析物处的不同受体。在一些示例中，至少一个靶向部分(例如配体)可以是抗体、抗原、激素、药物、片段抗原结合、亲和体分子、酶、蛋白质或肽。片段抗原结合是结合到实验室产生的抗原的抗体区域，示例是Fc、F(ab')、F(ab')2或Fab。
亲和体分子是被设计为以高亲和力结合至目标肽或蛋白质结合的小蛋白质，从而模仿单克隆抗体。因此，亲和体分子被认为是抗体模拟物，其通常是像抗体一样可以特异性地结合抗原但在结构上与抗体无关的有机化合物。它们通常是人工肽或蛋白质。核酸或小分子有时也被视为抗体模拟物。与抗体相比的共同优点是更好的溶解性、组织渗透性和低生产成本。
探针可以是用于在样本的一部分或切片中定位特定DNA或RNA序列的互补DNA、RNA或修饰的核酸链。探针通常用于原位杂交。
通过使用于着色或染色样本的每种不同类型的靶向部分或探针被标记(例如偶联)到不同的上转换粒子(例如上转换纳米粒子)，可以在样本中同时检测多种分析物。例如，来自上转换粒子(例如上转换纳米粒子)的发射在10至20nm的范围内非常窄，并且不同种类的粒子可能具有非常可区分的发射光谱。因此，粒子可以提供同时检测和分析样本中的多种分析物的可能性，因为不同分析物的着色或染色没有重叠。这对于使用荧光团或颜色染色的常规着色或染色技术来说通常是不可能的。使用石蜡包埋技术时尤其不可能。对使用石蜡的替代方法是冷冻的或自由浮动的切片。
可以使用不同的方法将靶向部分或探针与上转换粒子偶联，例如，可以通过共价或非共价化学将靶向部分或探针直接与上转换粒子偶联。可替代地，和/或另外地，在一些示例中，可以通过链接化学，例如使用衔接分子将靶向部分或探针链接至上转换粒子，来将靶向部分或探针偶联至上转换粒子。
此外，上转换粒子的功能化可以与功能化量子点类似的方式来形成，例如“X.Gao等，使用半导体量子点进行体内肿瘤靶向和成像(In vivo cancer targeting andimaging with semiconductor quantum dots)，自然生物技术，22，8：969-976，2004”中所描述的，其全部内容出于所有目的被并入本文。Gao等的方法中描述了其适用于上转换稀土掺杂粒子(例如纳米粒子)。在本公开的示例中使用的上转换粒子是根据“G.Yi等、尺寸控制的晶体(例如纳米晶体)NaYF4：Yb，Er红外到可见光上转换磷光体的合成、表征和生物学应用(Synthesis,characterization,and biological application of size-controlledcrystalline(such as nanocrystalline)NaYF4:Yb,Er infrared-to-visibleupconversion phosphors)，纳米快报，4，11：2191-2196，2004”所述的方法制备的NaYF4晶体，掺有Yb3+和Tm3+的组合。
在样本已被着色或染色后，可以从与样本结合的至少一种靶向部分或探针相关联的上转换粒子检测1002到信号。由此可以在样本中检测至少一种分析物的存在、分布或量。
可以使用诸如荧光显微镜之类的显微镜观察样本，该显微镜可以通过用特定波长的光照射来激发上转换粒子。在一些示例中，滤光器用于滤除荧光。另外地，和/或可替代地，在一些示例中，滤光器是时间延迟。来自背景(例如来自福尔马林固定和石蜡包埋的组织样本或组织样本本身)的自发荧光被发射持续比来自粒子的荧光更短的时间段。通过在激发之后从第一时间段(例如1ms，例如0.5ms，例如0.1ms)不检测或不使用检测到的荧光，可以将来自粒子的荧光从来自背景的自发荧光中滤掉，即来自背景的自发荧光可以被抑制。
荧光显微镜可以是常规的荧光显微镜，其中光源和检测器已被选择为与所使用的发光粒子一起使用。当需要滤光片时，也将调整滤光片以适合发光粒子的发射光谱。
荧光显微镜可以以反射模式或透射模式使用，或者该显微镜可以是共聚焦荧光显微镜。
荧光显微镜可以是使用目镜来视觉研究样本的显微镜。在一些示例中，显微镜位于外壳中，该外壳生成可手动或自动使用图像处理算法来分析的数字化图像。
可以使用外壳来保护样本免受可干扰荧光检测的环境背景光的影响。在一些示例中，手动荧光显微镜还可以具有用于在视觉上分析时保护样本的壳体。
可选地，在一些示例中，描述了用于分析样本的技术，例如，在WO2010/128090和WO2014/006012中，其全部内容通过引用被并入本文。
图2示出了根据本公开的另一种方法2000。方法2000可以包括关于图1的方法所描述的技术。图2特别地示出了分析生物样本中的至少一种分析物的样本的方法2000。可以使用石蜡固定样本，或者将样本冷冻或自由浮动。样本也可以是液体。方法2000有利地用于组织学(例如免疫组织化学(IHC))或细胞学(例如免疫细胞化学(ICC))。但也可用于杂交，例如原位杂交(ISH)，并且特别是荧光原位杂交(FISH)。该方法包括使样本与至少一个靶向部分或探针接触2001，其中该至少一个靶向部分或探针中的每个不同的靶向部分或探针可以特异性地结合该至少一种分析物中的不同分析物。该至少一个靶向部分或探针中的每个不同的靶向部分或探针可以用不同的发光粒子标记。发光粒子可以是上转换粒子。
方法2000还可以包括：通过检测来自与结合于样本的至少一个靶向部分或探针相关联的发光粒子的信号来获得2002第一图像。
方法2000可以进一步包括：获得2003来自样本的第二图像，其中第二图像可以是没有复染色的样本的明场图像，或者其中第二图像是使用染料和染色剂着色或复染色的样本的图像。
在一些示例中，可以使用例如MUSE、明场或荧光获得复染色的样本。所用的检测方法取决于复染色的类型。
方法2000还可包括将第一图像与第二图像组合2004以获得组合图像。另外，在一些示例中，分析组合图像以检测至少一种分析物的存在或量。该检测可以是定性的或定量的，并且还可以基于检测到来自上转换粒子的光的位置。该信息可以与来自组合图像的其他检测到的信息进行组合，例如来自其他染色方法的信息，例如复染色或传统的免疫组织化学、免疫细胞化学或杂交染色。如果可用的话，信息也可以与没有复染色的样本的明场信息组合。
该方法的优点是同一样本或切片可能同时包含IHC染色、其复染色和荧光染色来检测分析物。包含IHC染色和/或复染色的第二图像不仅可以提供样本的进一步信息，而且还可以提供有关目标分析物的形态和/或的定位的信息。由于它可以在同一样本上完成，因此配准没有问题。当必须将不同的连续切片用于未染色或复染色的图像并且将荧光图像用于检测目标分析物时，配准是一个问题。这将增加对比度和分辨率，以改善样本的分析。此外，由于上转换纳米粒子具有非常窄的光谱峰，约为10至20nm，因此当使用多于一个标记物来检测来自同一样本或同一切片的多于一种的分析物时，发生重叠的风险非常低。因此，在不使用多个连续切片的情况下，复用是可能的。在同一样本(例如切片)上的复用可以通过使染色的所有标记物均为上转换粒子来完成，或者通过上转换粒子和传统免疫组织化学、免疫细胞化学或杂交染色的组合来完成，因为较窄的光谱峰与较长波长的荧光进行组合降低了重叠的风险。当传统的免疫组织化学、免疫细胞化学或杂交染色法对特定的分析物非常有效时，这可以是优点，但是由于光谱重叠，难以使用传统的染色法来检测来自同一样本的多于一种的分析物。
复用可以再次提高对比度和分辨率，但最重要的是减少了所需的生物样本数量。这是优点，因为大多数常规活检都很小。这尤其适用于免疫细胞化学或流式细胞术，其中可以分析很少的细胞(在10个范围内)。这些细胞可以从活检液中提取。例如，当使用细针头以避免损伤血管时，这对于肺活检是很常见的。
对比度和分辨率可以进一步提高，因为不需要使用常见的方法来减少会降低检测到的荧光强度的自发荧光。相反，可以选择上转换粒子以具有在近红外或红外区域中以较长波长发射的荧光，在近红外或红外区域处，自发荧光是如此弱以至于其可以忽略或不存在。自发荧光可以被发射比来自上转换粒子的荧光更短的时间段，并且通过不检测或不使用在激发后自第一时间段(比如1ms，比如0.5ms，比如0.1ms)检测到的荧光，可以被滤掉来自粒子的荧光、自发荧光，同时仍然检测到强荧光。由于较高波长的激发和发射，与常见染色的吸收和/或荧光有关的其他问题也减少了。
这将使选择用于突出显示细胞结构的不同部分的一次或多次复染色以改善形态和定位更容易，因为仅需要考虑复染色的光谱重叠。提高的对比分辨率和简单的复用可以改善用于免疫组织化学、免疫细胞化学以及杂交的诊断。当执行图像的数字化和/或自动分析时，提高的对比度和分辨率是一个优点。此外，当使用人工智能进行分析时，提高的对比度和分辨率也可是一个优点，其结合有减少的伪像(artifact)数量，因为配准没有问题。
图3A至3C示出了使用免疫细胞化学在培养的MCF-7细胞样本上的上述图2方法的一个示例。图3A是样本的未经复染色的明场图像。图3B显示了染色到样本的上转换纳米粒子的荧光图像。检测方法为：mAb抗β肌动蛋白(宿主：小鼠)以及偶联到粒子的山羊抗小鼠。粒子是在974nm激发并在830nm以下检测的镧系元素上转换纳米粒子或铥掺杂的上转换纳米粒子。
图3C示出了图3A和图3B的组合图像。从这种组合清楚可见的是该组合给出荧光粒子相对于细胞结构的定位的清晰图像。
图4A至图4C示出了使用免疫细胞化学在培养的MCF-7细胞样本上的上述图2的方法的一个示例。图4A是样本的未经复染色的明场图像。图4B显示了染色到样本的上转换纳米粒子的荧光图像。检测方法是：mAb抗β肌动蛋白(宿主：小鼠)，生物素化的山羊抗小鼠和偶联到粒子的中性抗生物素蛋白。粒子是在974nm激发并在830nm以下检测的镧系元素上转换纳米粒子或铥掺杂的上转换纳米粒子。图4C示出了图4A和图4B的组合图像。从该组合图像清楚可见，该组合给出了荧光粒子相对于细胞结构的定位的清晰图像。
图5A至图5C示出了使用免疫组织化学作为检测方法在人体结肠组织样本上的上述图2的方法的一个示例。图5A显示了用苏木精复染色的样本的明场图像。图5B示出了染色到样本的转换纳米粒子的荧光图像。检测方法为：mAb抗PCK(宿主：小鼠)以及偶联到粒子的山羊抗小鼠。粒子是在974nm处激发并在830nm以下检测的镧系元素上转换纳米粒子或铥掺杂的上转换纳米粒子。图5C示出了图5A和图5B的组合图像。从该组合图像可以清楚地看出，该组合给出荧光粒子相对于细胞结构的定位的高对比度图像。
示例
在一些示例中，靶向生物标记物可以是Ku70/80、PSA、hK2和HER2，它们均在前列腺癌中以不同程度表达。通过使用肿瘤特异性配体(例如抗体，其F(ab')，F(ab')2或Fab)或在前列腺癌微环境中识别肿瘤相关抗原的小分子，抗体功能化的粒子可以是靶向肿瘤。与被动靶向(非肿瘤特异性生物分子)相比，这种靶向的优点是配体与肿瘤抗原之间的高度特异性相互作用，增强了粒子构造的肿瘤保留，并同时最小化与非靶细胞的非特异性结合。配体的示例是：
INCA-X抗体，一种对与Ku70/Ku80复合物相关联的表位具有特异性的人类IgG1抗体，其已经显示出与侵袭性前列腺癌细胞系(PC-3)特异性结合并在其中迅速内化。
5A10抗体，一种对游离前列腺特异性抗原fPSA具有特异性的鼠源抗体，其在PCa诊断中经常使用。使用89Zr-DFO-5A10的PET成像成功地发现了表达肿瘤的前列腺癌以及小鼠中的骨转移。
11B6抗体，在小鼠和人体内都有。该抗体以人激肽释放酶2(hK2)-一种与PSA具有约80％同源性的蛋白酶为靶点。
亲和体分子是一类对靶点HER2具有高度特异性和强结合力的小分子，其在所有乳腺癌的30％和前列腺癌中的12-64％中过表达。使用亲和分子在乳腺癌中的HER2表达的PET成像已得到充分研究，并且正在进行临床研究。
为了标记靶细胞，粒子必须在其表面上被靶向分子功能化。可以使用抗体，例如上面提到的那些，以及它们的Fab、F(ab')和F(ab')2片段和亲合体分子。通常，小分子由于高纯度和较少的免疫原性而具有吸引力。而且，可以将功能化的上转换粒子保持很小(约20nm)。靶向部分与上转换粒子的成功生物偶联是重要的，并且可以使用以下传统的直接偶联方法来完成：在粒子制备过程中应用的羧基修饰和胺修饰化学(共价)和非共价化学(依靠静电结合)。但是，与未修饰的基于抗体的靶向剂直接偶联呈现低的掺入效率。用于将靶向剂连接到粒子上的另一种合适方法是使用例如用于胺反应性粒子的SMCC、NHS-PEG-MAL、SPDP链接和用于羧基反应性粒子的琥珀酰亚胺(NHS-ester)的链接化学。最近，基于点击化学的生物偶联策略的演变已显示出高的反应效率并提供更多的化学选择性反应。已经使用所述的这种方法研究了亲和体分子。
尽管已经在本文中描述和示出了本公开的几个示例，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行功能和/或获得本文描述的结果和/或一个或多个优点的多种其他手段和/或结构，并且这些变化和/或修改的每一个都视为在本公开的范围内。更一般而言，本领域技术人员将容易理解本文描述的所有参数、尺寸、材料和配置仅是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于使用本公开教导的一种或多种特定应用。而且，可以在本公开的范围内提供与上面描述的通过硬件执行方法的方法步骤不同的方法步骤。本公开的不同特征和步骤可以以不同于所描述的那些的其他组合来组合。本公开的范围仅由所附专利权利要求书限制。

Claims (15)

1.一种对生物样本中的至少一种分析物进行成像的方法，所述方法包括：
使所述样本与至少一个靶向部分或探针接触，其中，所述至少一个靶向部分或探针中的每个不同的靶向部分或探针与所述至少一种分析物中的不同的分析物特异性地结合，并且其中，所述至少一个靶向部分或探针中的每个不同的靶向部分或探针用不同的发光粒子标记，其中，所述发光粒子是上转换粒子；以及
通过检测来自与结合于所述样本的所述至少一个靶向部分或探针相关联的所述发光粒子的信号来获得第一图像；
从所述样本获得第二图像，其中，所述第二图像是没有复染色的所述样本的明场图像，或者其中，所述第二图像是使用染料或染色剂进行着色或复染色的所述样本的图像；
将所述第一图像与所述第二图像组合以获得组合图像。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，每个不同的发光粒子发射能够区分的发射光谱。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述样本是组织样本，生物细胞样本或例如血液的体液。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述样本是福尔马林固定的并且石蜡包埋的；或者其中，所述样本是冷冻的，或者其中，所述样本是自由浮动的切片。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述至少一个靶向部分是分析物特异性配体、例如肿瘤特异性配体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述至少一个靶向部分是抗体、抗原、激素、药物、抗原结合片段、亲和体分子、酶、蛋白质或肽。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述至少一个靶向部分通过共价或非共价化学直接偶联到所述发光粒子。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述至少一个靶向部分通过链接化学偶联到所述发光粒子，例如使用衔接分子将所述至少一个靶向部分链接到所述发光粒子。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述发光粒子是上转换纳米粒子。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，包括：以与激发信号的时间延迟来检测来自所述发光粒子的所述信号以抑制背景发光。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，使用常规染料或染色剂对所述样本进行复染色或着色。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，对所述第一图像的染色涉及组织学、例如免疫组织化学(IHC)，或者细胞学、例如免疫细胞化学(ICC)，或者杂交、例如原位杂交(ISH)。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述探针是定位于所述至少一种分析物的互补的DNA、RNA或修饰的核酸链，所述至少一种分析物为DNA或RNA序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述方法包括分析所述组合图像，用于检测所述至少一种分析物的存在或者所述至少一种分析物的量。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，根据复染色的类型使用MUSE、明场或荧光来获得所述复染色的样本的所述第二图像。
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