ES2832880T3 - Un método de análisis de una muestra para al menos un analito - Google Patents
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Abstract
Un método para obtener imágenes de al menos un analito en una muestra biológica para histología, citología o hibridaciones usado como respaldo en el diagnóstico de un sujeto, comprendiendo el método: proporcionar dicha muestra que es un corte de tejido, una muestra de células, o un líquido obtenido de dicho sujeto; poner en contacto dicha muestra con al menos un resto o sonda de direccionamiento, en donde cada resto o sonda de direccionamiento diferentes de dicho al menos un resto o sonda de direccionamiento se une específicamente a un analito diferente del al menos un analito, y en donde cada resto o sonda de direccionamiento diferente de dicho al menos un resto o sonda de direccionamiento se marca con una partícula luminiscente diferente, en donde dicha partícula luminiscente es una partícula de conversión ascendente; y obtener una primera imagen detectando una señal de dicha partícula luminiscente asociada con dicho al menos un resto o sonda de direccionamiento unido a dicha muestra; obtener una segunda imagen de dicha muestra en donde dicha segunda imagen es una imagen de campo brillante de dicha muestra sin contratinción, o en donde dicha segunda imagen es una imagen de dicha muestra que está contrateñida o coloreada usando un colorante o una tinción, en donde dicho colorante o tinción no es una partícula de conversión ascendente; combinar dicha primera imagen con dicha segunda imagen para obtener una imagen combinada.
Description
DESCRIPCIÓN
Un método de análisis de una muestra para al menos un analito
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
Esta divulgación se refiere en general al análisis de una muestra para al menos un analito. Más particularmente, la divulgación se refiere a colorear o teñir una muestra, tal como tejido, con partículas luminiscentes para determinar la existencia o la cantidad de al menos un analito en la muestra. En especial, la divulgación se refiere a colorear o teñir una muestra con partículas luminiscentes para histología, tal como histopatología o citopatología, particularmente para inmunohistoquímica o inmunocitoquímica.
Antecedentes de la divulgación
En histología, tal como histopatología o citología, tal como citopatología, se utilizan varias técnicas para estudiar y analizar células o tejidos biológicos, por ejemplo inmunohistoquímica (IHC) o inmunocitoquímica (ICC).
En inmunohistoquímica, los antígenos, tales como proteínas, se detectan en las células de una muestra de células o de un corte de tejido. Los antígenos se detectan mediante el uso de anticuerpos marcados que se unen a antígenos específicos en las células o tejidos biológicos. En histología, tal como histopatología o citología, tal como citopatología, la coloración o tinción, por ejemplo, hematoxilina-eosina (H-E), inmunohistoquímica/inmunocitoquímica (IHC/ICC) o hibridaciones, tales como la hibridación in situ (ISH), son rutinas estándar convencionales para el diagnóstico de células biológicas atípicas, tales como en áreas con tumores o apoptosis. La coloración o tinción, tal como inmunohistoquímica o inmunocitoquímica, también se utiliza comúnmente en la investigación básica para conocer la distribución y localización de biomarcadores y genes y proteínas expresados diferencialmente en diferentes partes del tejido biológico. El vínculo entre anticuerpos y antígenos se puede visualizar de diferentes formas. La práctica más común es conjugar, por ejemplo, un anticuerpo, con una enzima, tal como peroxidasa, que puede catalizar un cambio de color en una muestra. Una alternativa es marcar los anticuerpos con un fluoróforo, tal como fluoresceína o rodamina. Los usos de los fluoróforos están restringidos debido a la autofluorescencia, es decir, la fluorescencia del propio tejido, y para que sean útiles se requieren preparaciones especiales y laboriosas de la muestra de tejido. Cuando se utilizan fluoróforos, el procedimiento convencional y preferido basado en la fijación con formalina y la inclusión en parafina adolece de niveles de autofluorescencia incluso más altos que los del tejido no procesado.
Otros inconvenientes conocidos del método tradicional de coloración y tinción son una tinción de fondo demasiado fuerte o una tinción del objetivo débil. Otros inconvenientes son que algunas tinciones o colorantes, utilizados para contratinción para IHC/ICC, pueden tener una fluorescencia que interfiera con los indicadores utilizados para localizar analitos específicos. También hay algunas tinciones o colorantes, utilizados para contratinción para IHC/ICC, que pueden absorber en un intervalo de longitud de onda que interfiere con la excitación o la emisión de algunos indicadores utilizados para localizar analitos específicos.
Estos problemas pueden disminuir el contraste y la resolución de las imágenes utilizadas para el diagnóstico de una muestra. Un ejemplo es la hematoxilina y la eosina comúnmente usadas, donde ambos cromóforos tienen una fuerte absorbancia en la región visible y la eosina es altamente fluorescente en gran parte del espectro visible. Esto significa que un solo corte no puede teñirse conjuntamente con la mayoría de los tipos de inmunofluorescencia para IHC/ICC o hibridaciones. La tinción conjunta de hematoxilina y/o eosina (H-E) con pigmento coloreado para IHC/ICC colorimétrica o hibridación también puede ser un problema, ya que pueden ser opacas y oscurecer la contratinción, tal como la tinción H-E. También existen problemas de superposición espectral tanto al realizar imágenes cromogénicas como imágenes de fluorescencia, lo que significa que los espectros de los indicadores de marcaje y el tinte de contratinción están tan cerca que no se pueden resolver o distinguir entre ellos.
Para superar estos problemas, las imágenes contrateñidas y las imágenes de IHC/ICC/hibridación se correlacionan de forma rutinaria entre sí mediante cortes en serie e imágenes de regiones complementarias en diferentes cortes de la misma muestra de tejido, pero estos métodos tienen impedimentos de alineación debido al hecho de que la tinción se completa en cortes que, en el mejor de los casos, estén a una distancia de 3-10 pm. Lo mismo sucede cuando se realiza una multiplexación para detectar más de un analito, donde cada analito a menudo requiere su propio corte. Varios cortes consecutivos no solo pueden causar problemas con el registro conjunto, sino que también requieren una muestra más grande, tal como un corte de tejido más grueso o una biopsia, o más células, de la que se obtiene normalmente.
Además de estos problemas, hay otras cosas que deben tenerse en cuenta, tal como el fotoblanqueo, y que diferentes colorantes, tinciones e indicadores pueden reaccionar entre sí y volverse químicamente inestables y perder sus propiedades.
Se ha desarrollado una amplia gama de tintes cromogénicos y fluorescentes para adaptarse a diferentes diseños
experimentales. Estos tintes pueden ser no específicos, tiñendo la mayoría de las células de la misma manera, o específicos, tiñendo selectivamente compartimentos celulares particulares o moléculas químicas dentro de las células/tejidos. También, se han desarrollado diferentes protocolos para ayudar a superar algunos de estos inconvenientes. Muchos de estos protocolos son complicados y requieren mucho tiempo e incluyen compromisos.
Se han utilizado y probado los puntos cuánticos, una alternativa a los indicadores de marcaje convencionales para IHC/ICC e hibridación. Aunque muchas publicaciones han mostrado buenos resultados y los puntos cuánticos han estado disponibles comercialmente en el mercado durante mucho tiempo (casi 20 años), todavía no se utilizan en las rutinas normales, sino que se utilizan principalmente para investigación. Se ha referido que las razones podrían ser problemas relacionados con, por ejemplo, la estabilidad en comparación con los tintes y tinciones de molécula pequeña tradicionales, especialmente para las partículas de puntos cuánticos más grandes con longitudes de onda más largas, "Evaluation of quantum dot conjugated antibodies for immunofluorescent labelling of cellular targets" Jennifer E. Francis et al, Nanotechnol. 2017, 8, 1238-1249. La mayoría de los estudios que han tenido éxito se han realizado en la región UV/azul profundo y visible (alrededor de 400 nm a 700 nm) donde la principal ventaja de los puntos cuánticos sobre los tipos más estándar de tintes y tinciones son las bandas de fluorescencia más estrechas que las que normalmente se encuentran en el intervalo de alrededor de 10 a 20 nm.
Es un deseo tener un procedimiento mejorado y simplificado que pueda ahorrar tiempo y costes para analizar analitos en muestras. Un deseo adicional sería tener la opción de realizar múltiples coloraciones o tinciones para el análisis simultáneo de una muestra para más de un analito. Otro deseo es poder realizar el examen de una pequeña cantidad de muestra.
Sumario de la invención
Por consiguiente, ejemplos de la presente divulgación buscan preferentemente mitigar, aliviar o eliminar una o más deficiencias, desventajas o problemas en la técnica, tales como los anteriormente identificados, individualmente o en cualquier combinación, proporcionando un dispositivo, sistema o método de acuerdo con las reivindicaciones de patente adjuntas para analizar una muestra para al menos un analito.
La divulgación se refiere a colorear o teñir una muestra usando restos o sondas específicos del objetivo. Los restos o sondas específicos del objetivo pueden conjugarse con partículas luminiscentes, tales como partículas fluorescentes, tales como partículas de conversión ascendente (tales como nanopartículas de conversión ascendente), u otras partículas, tales como puntos cuánticos.
Cada tipo de resto o sonda utilizado puede conjugarse con un tipo diferente de partículas luminiscentes. Por tanto, se pueden aplicar múltiples coloraciones o tinciones, de modo que se puede analizar más de un tipo de analito en la misma muestra, tal como del mismo corte. Por ejemplo, los restos o sondas de direccionamiento pueden usarse para determinar la distribución o la concentración de diferentes analitos en una muestra. Además, la distribución de los analitos en la muestra también se puede determinar en dos o tres dimensiones.
La muestra analizada puede ser una muestra de tejido o células biológicas. En algunos ejemplos, el análisis es de histopatología, en particular inmunohistoquímica, o citopatología, en particular inmunocitoquímica, o hibridación para detectar al menos un analito, tal como antígenos o proteínas, en células de una muestra, tal como en un corte de tejido. La muestra puede prepararse usando un procedimiento convencional de fijación con formalina e inclusión en parafina.
La muestra, tal como un corte de tejido, se puede observar con un microscopio u otro tipo de instrumento de adquisición de imágenes, tal como una cámara de alta resolución.
Como alternativa, en algunos ejemplos, la muestra para histopatología, en particular inmunohistoquímica, o citopatología, en particular inmunocitoquímica, o hibridación, puede prepararse usando procedimientos de congelación y corte convencionales, también puede ser un corte flotante o similar conocido por el experto en la materia.
En algunos ejemplos de la divulgación, las muestras pueden ser muestras líquidas, tales como fluidos corporales, tales como sangre o plasma. Adicionalmente, en algunos ejemplos, el análisis puede usarse para bioquímica, tal como para el uso de ELISA, tal como micro-ELISA. Adicionalmente, en algunos ejemplos, el análisis puede usarse para microbiología.
Las muestras pueden analizarse para analitos diana que sean, por ejemplo, antígenos, anticuerpos, proteínas, celulosa (membrana celular), hidratos de carbono (tales como sacáridos) o ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN).
Las muestras pueden analizarse mediante microscopía de fluorescencia. La microscopía de fluorescencia puede ser digitalizada y/o automática.
En algunos ejemplos, el análisis de la muestra puede usarse para proporcionar apoyo en el diagnóstico de un sujeto, tal como un ser humano o un animal.
En un aspecto de la divulgación, se divulga método para obtener imágenes de al menos un analito en una muestra biológica. El método comprende poner en contacto la muestra con al menos un resto o sonda de direccionamiento, en donde cada resto o sondas de direccionamiento diferentes del al menos un resto o sonda de direccionamiento puede unirse específicamente a un analito diferente del al menos un analito, y en donde cada resto o sonda de direccionamiento diferente del al menos un resto o sonda de direccionamiento puede marcarse con una partícula luminiscente diferente. La partícula luminiscente puede ser una partícula de conversión ascendente.
El método puede incluir además la obtención de una primera imagen detectando una señal de la partícula luminiscente asociada con al menos un resto o sonda de direccionamiento unido a dicha muestra.
También, el método puede incluir obtener una segunda imagen de la muestra, donde la segunda imagen es una imagen de campo brillante de la muestra sin contratinción. La segunda imagen puede ser en algunos ejemplos una imagen de la muestra contrateñida o coloreada con un colorante o tinción.
Además, el método puede incluir combinar la primera imagen con la segunda imagen para obtener una imagen combinada.
En algún ejemplo de la divulgación, la muestra puede contrateñirse o colorearse usando un colorante o tinción convencional.
En algunos ejemplos de la divulgación, el método puede estar relacionado con la histología, tal como la inmunohistoquímica (IHC), o la citología, tal como la inmunocitoquímica (ICC), o las hibridaciones, tal como la hibridación in situ (ISH).
En algunos ejemplos de la divulgación, la sonda puede ser una cadena complementaria de ADN, ARN o ácidos nucleicos modificados que localizan el al menos un analito que es una secuencia de ADN o ARN.
En algunos ejemplos de la divulgación, el método puede incluir analizar la imagen combinada para detectar una presencia o cantidad del al menos un analito.
En algunos ejemplos de la divulgación, puede obtenerse la segunda imagen de la muestra contrateñida usando microscopía con excitación de superficie ultravioleta (MUSE), de campo brillante o fluorescencia, dependiendo del tipo de contratinción utilizada.
Las principales ventajas del método divulgado son que no se puede captar ningún fondo durante la detección, ya que la luz fluorescente de las partículas puede emitir fluorescencia a una longitud de onda diferente a la de la luz autofluorescente del fondo. La luz autofluorescente puede provenir de la propia muestra, tal como del tejido, o de materiales introducidos en el proceso de preparación de la muestra, tal como de la fijación y la inclusión en parafina. La emisión de las partículas luminiscentes, tales como las partículas fluorescentes, puede sufrir desplazamiento anti-Stokes o Stokes, por ejemplo, son partículas de conversión ascendente (tales como las nanopartículas de conversión ascendente) que normalmente sufren desplazamiento anti-Stokes y los puntos cuánticos que sufren desplazamiento Stokes. El desplazamiento Stokes o anti-Stokes se puede utilizar para filtrar espectralmente la señal de las partículas del fondo. El fondo puede consistir en luz de una fuente de luz, por ejemplo, la fuente de luz que ilumina la muestra, o fuentes de luz en el entorno del laboratorio, o de la fluorescencia de la propia muestra (autofluorescencia) u otras moléculas, sustancias o partículas fluorescentes que existen intencionadamente o no intencionadamente en la muestra. Por tanto, se puede utilizar un procedimiento convencional, que ahorrará tiempo y dinero en comparación con los procedimientos que implican fluoróforos estándar.
Una ventaja adicional es que son posibles múltiples coloraciones o tinciones simultáneamente, ya que el espectro de emisión de cada tipo de partículas luminiscentes, tales como las partículas fluorescentes utilizadas, puede ser muy estrecho. Por ejemplo, mediante el uso de partículas de conversión ascendente dopadas de forma diferente (tales como las nanopartículas de conversión ascendente), se pueden obtener diferentes tipos de espectros de emisión distinguibles de puntos cuánticos. Cada espectro de emisión se relacionará con un tipo específico de partícula que se ha unido a un objetivo específico.
El uso de partículas luminiscentes, tales como partículas fluorescentes, que sufren desplazamiento anti-Stokes o Stokes puede aumentar el contraste. También, el uso de partículas luminiscentes, tales como partículas fluorescentes, que sufren desplazamiento anti-Stokes o Stokes puede aumentar la resolución. Esto se puede utilizar para mejorar los análisis digitalizados y permitir la automatización de los análisis.
Otra ventaja es que se puede prevenir el fotoblanqueo.
El método puede usarse para muestras humanas o muestras de animales.
Hay que recalcar que el término "comprende/que comprende" cuando se usa en esta memoria descriptiva se considera
para especificar la presencia de características, números enteros, etapas o componentes citados, pero no excluye la presencia o adición de una o más características, números enteros, etapas, componentes o grupos de los mismos.
Breve descripción de los dibujos
Estos y otros aspectos, características y ventajas de los que son capaces los ejemplos de la divulgación serán evidentes y se aclararán a partir de la siguiente descripción de ejemplos de la presente divulgación, haciendo referencia a los dibujos adjuntos.
La Figura 1 ilustra un ejemplo de un método de análisis de una muestra para al menos un analito;
La Figura 2 ilustra un ejemplo adicional de un método de análisis de una muestra para al menos un analito; Las Figuras 3A a 3C ilustran un ejemplo de inmunocitoquímica (ICC) usando partículas de conversión ascendente combinadas con una imagen de campo brillante;
Las Figuras 4A a 4C ilustran otro ejemplo de inmunocitoquímica (ICC) usando partículas de conversión ascendente combinadas con una imagen de campo brillante; y
Las Figuras 5A a 5C ilustran un ejemplo de inmunohistoquímica (IHC) usando partículas de conversión ascendente combinadas con una imagen de campo brillante contrateñida.
Descripción de los ejemplos
La siguiente divulgación se centra en ejemplos de la presente divulgación aplicables para determinar la concentración o distribución de analitos en las muestras. La muestra puede colocarse en portaobjetos transparentes adecuados para microscopía fluorescente. La divulgación puede ser especialmente ventajosa para histología, tal como histopatología, y en particular inmunohistoquímica (IHC). La divulgación puede ser además ventajosa para citología, tal como citopatología e inmunocitoquímica (ICC). La divulgación puede ser también ventajosa para hibridación, tal como la hibridación in situ y, en particular, la hibridación in situ fluorescente (FISH). Sin embargo, se apreciará que la descripción no se limita a esta aplicación, sino que puede aplicarse a muchos otros tipos de análisis, muestras, restos y objetivos.
La Figura 1 ilustra un método 1000 de análisis de una muestra para al menos un analito. La muestra puede ser una muestra biológica, tal como un corte de tejido, una muestra de células o muestras líquidas para su observación al microscopio, tal como en un microscopio de fluorescencia. El método comprende poner en contacto 1001 la muestra con al menos un resto o sonda de direccionamiento. Cada resto o sonda de direccionamiento diferente del al menos un resto o sonda de direccionamiento se une específicamente a un analito diferente del al menos un analito en la muestra. Además, el resto o sonda de direccionamiento del al menos un resto o sonda de direccionamiento se marca con una o varias partículas luminiscentes, tales como las conjugadas a partículas luminiscentes, tales como partículas fluorescentes, tales como partículas de conversión ascendente, tales como nanopartículas de conversión ascendente, o puntos cuánticos.
Las partículas luminiscentes son una clase de agentes de contraste para bio-imágenes. Las partículas luminiscentes, tales como las partículas fluorescentes, pueden emitir luz con desplazamiento Stokes o anti-Stokes cuando se excitan a longitudes de onda particulares. Por ejemplo, las partículas pueden emitir luz con desplazamiento anti-Stokes cuando se excitan a longitudes de onda particulares, tales como luz en el infrarrojo o infrarrojo cercano, por ejemplo a 975 nm. Adicionalmente y/o como alternativa, algunas partículas de conversión ascendente también pueden emitir luz fluorescente con desplazamiento Stokes a una longitud de onda más larga en la luz en el infrarrojo o infrarrojo cercano, tal como alrededor de 1500 nm. Esta luz también se puede usar porque está fuera del intervalo de longitud de onda de la luz autofluorescente emitida por el fondo, tal como la luz de la propia muestra biológica, tal como un tejido, o de la fijación e inclusión de la muestra. En algunos ejemplos, cuando se analiza la muestra, se puede usar la luz con desplazamiento Stokes y anti-Stokes emitida de las mismas partículas.
Los ejemplos de puntos cuánticos con desplazamiento Stokes pueden ser excitados por luz en la región UV (tal como por debajo de 350 nm). También pueden ser excitados por luz en la región roja o del IR cercano (tal como 800 nm) donde la profundidad de penetración del tejido es relativamente grande. Las partículas emitirán luz a una longitud de onda mucho más larga que la luz de excitación, preferiblemente en una región de longitud de onda donde la autofluorescencia es mucho más débil. Para las partículas excitadas en la región UV, la luz emitida puede estar en la región visible y para las partículas excitadas en la región de lectura del infrarrojo o infrarrojo cercano, tal como alrededor de 1500 nm o más.
El desplazamiento Stokes o anti-Stokes puede proporcionar una señal de contraste mejorada en comparación con los fluoróforos convencionales, ya que la autofluorescencia del tejido puede eliminarse mediante filtros. Especialmente el tejido que está incluido en parafina tiene una fuerte autofluorescencia de fondo que dificulta el uso de fluoróforos convencionales como marcadores sin preparaciones costosas y que consumen mucho tiempo de las muestras. Por tanto, además de mejorar el contraste, las partículas luminiscentes, tales como partículas fluorescentes, tales como partículas de conversión ascendente (tales como nanopartículas de conversión ascendente), o puntos cuánticos, pueden ahorrar tiempo y costes, ya que se pueden utilizar la fijación con formalina convencional y la inclusión en parafina. El resto o sondas objetivo marcados se pueden usar en histología, tal como histopatología, y en particular
inmunohistoquímica o citología, tal como citopatología, y en particular inmunocitoquímica o hibridaciones, tales como la hibridación in situ (ISH), en combinación con contratinción, tal como contratinción estándar utilizada en histología, y en particular inmunohistoquímica, citología, y en particular inmunocitoquímica o hibridaciones, tal como la hibridación in situ (ISH). Se pueden utilizar diferentes métodos de detección, tales como la fluorescencia de campo brillante o MUSE. La MUSE utiliza luz ultravioleta, por ejemplo a aproximadamente 280 nm, de un LED dispuesto para proporcionar iluminación oblicua. La luz se usa para excitar solo la capa superficial de tejido que se ha teñido brevemente (~ 10 segundos) con tintes fluorescentes. A diferencia de la luz de longitud de onda más larga, la luz de 280 nm solo penetra a una profundidad de 10 micrómetros o menos y, por lo tanto, excita señales fluorescentes, convenientemente en el intervalo visible, solo de la superficie de la muestra de corte. Las imágenes, que pueden estar limitadas por la difracción, se capturan utilizando una óptica de microscopio convencional y una cámara a color estándar. Las contratinciones estándar pueden ser cromogénicas o basadas en fluorescencia. Los tintes o tinciones pueden ser inespecíficos, tiñendo la mayoría de las células de la misma manera, o específicos, tiñendo selectivamente orgánulos o compartimentos celulares particulares o moléculas químicas dentro de las células/tejidos, tales como los nucleares al dirigirse a los ácidos nucleares, paredes o membranas celulares. Los ejemplos de contratinciones son, la tinción con hematoxilina y eosina (H-E), ya sea sola o combinada, DAPI, tinción Hoechst, verde de metilo, azul de metileno, azul de toluidina, DRAQ5, DRAQ7, rojo rápido nuclear, tinción de Gram, tinción para PAS, rodamina, azul Nilo, rojo Nilo, yoduro de propidio, verde SYTOX, y muchas otras conocidas por el experto en la materia.
La mayoría de las partículas de conversión ascendente son fluoróforos no lineales. En el contexto de la presente solicitud, un "marcador no lineal" es un marcador luminiscente, en donde una luminiscencia (L) del marcador no depende linealmente del flujo radiante de luz de excitación (E). Por tanto, los marcadores no lineales tienen una luminiscencia de acuerdo con: L=k*EAx, donde x>1, y en donde k es una constante positiva. Los marcadores no lineales también pueden tener una luminiscencia de acuerdo con las siguientes relaciones:
L=k*EAx b, L=k(E)*EAx b, L=k(E)*EAx b(E), o L=k*EAx b(E), donde k y b son constantes materiales que son constantes o dependen del campo local de la luz de excitación (E), es decir para k(E) y b(E). En comparación con la formación de imágenes de luminiscencia convencional, los marcadores no lineales (o fluoróforos) pueden requerir más de un fotón para la excitación. Esto puede disminuir drásticamente el volumen de excitación y proporciona un punto de excitación más localizado. De esta manera, se mejora el contraste y la resolución de las imágenes luminiscentes. Esto también puede mejorar el contraste y la resolución de la señal de luz fluorescente emitida en la formación de imágenes luminiscentes de medios absorbentes y dispersantes. Los ejemplos de la presente invención pueden aprovecharse de este efecto.
La luz de excitación es preferiblemente pulsada y cada pulso puede ser de unos pocos ps a un par de ms, tal como de 10 ps a 10 ms, tal como de 100 ps a 10 ms, tal como de 100 ps a 1 ms, tal como de 10 ps a 1 ms, tal como de 100 ps a 100 ms, tal como de 1 ms a 10 ms, tal como de 1 ms a 100 ms, las cuales han demostrado lograr un mayor rendimiento en la señal en relación con la potencia de excitación en comparación con señales de excitación más cortas, tales como ns, ps, fs.
Las partículas de conversión ascendente (tales como las partículas de conversión ascendente de tamaño nanométrico) son, por ejemplo, óxidos dopados con lantánidos, por ejemplo trióxido de diitrio (Y203), que son fáciles de fabricar. Otras partículas de conversión ascendente (tales como las partículas de conversión ascendente de tamaño nanométrico) son, por ejemplo, fluoruros dopados con lantánidos, que pueden tener eficiencias más altas que los óxidos. Las eficiencias más altas pueden explicarse por las bajas energías fotónicas en los fluoruros, que reducen la probabilidad de desintegración no radiactiva.
Otras partículas de conversión ascendente (tales como las nanopartículas de conversión ascendente) están hechas, por ejemplo, de tetrafluoruro de itrio de sodio (NaYF4), co-dopado con Yb3+/Er3+ o Yb3+/Tm3+. El NaYF4 puede cristalizar en dos fases, cúbica o hexagonal, denominadas a-NaYF4y p-NaYF4, respectivamente. La luminiscencia de conversión ascendente del material de la fase p es aproximadamente un orden de magnitud mayor en comparación con la luminiscencia de conversión ascendente de la fase a.
Los fluoróforos no lineales pueden ser solubles en agua, lo que permite una fácil administración en ciertas aplicaciones, tales como en soluciones para administración intravenosa, peroral o enteral.
Una forma de proporcionar partículas de conversión ascendente como solubles en agua, es recubrir las partículas con una estructura polar, tal como hidrófila. Los recubrimientos pueden estar hechos, por ejemplo, de polímeros o sílice. Para el recubrimiento se pueden usar tanto polímeros sintéticos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), como polímeros naturales. Estos polímeros son estables en entornos biológicos y no interfieren con las propiedades ópticas de los cristales, tales como los nanocristales, de forma negativa significativa.
Las partículas de conversión ascendente solubles en agua pueden proporcionarse sin recubrimientos. Los grupos hidroxilo pueden unirse a las superficies de las partículas de conversión ascendente, ya sea por enlaces químicos o por absorción física. Los grupos hidroxilo se forman por definición por unión covalente y la estructura final tiene propiedades polares.
Las ventajas de utilizar partículas de conversión ascendente son que las muestras biológicas, tales como cortes de
tejido, deben poder almacenarse preferentemente durante un tiempo prolongado y las partículas de conversión ascendente tienen una vida útil prolongada. Las partículas de conversión ascendente no se foto-blanquean fácilmente y son muy estables y no reaccionan con otros tintes y tinciones. Esto significa que una muestra puede almacenarse durante un mes o más y el análisis aún puede repetirse.
En algunos ejemplos, el al menos un resto de direccionamiento puede ser un ligando específico del analito, tal como un ligando específico de un tumor. El ligando se une a un receptor en el analito objetivo y diferentes ligandos pueden unirse a diferentes receptores en diferentes analitos objetivo. En algunos ejemplos, el al menos un resto de direccionamiento, tal como un ligando, puede ser un anticuerpo, un antígeno, una hormona, un fármaco, un fragmento de unión a antígeno, una molécula de aficuerpo, una enzima, una proteína o un péptido. El fragmento de unión a antígeno es una región de un anticuerpo que se une a un antígeno generado en el laboratorio, ejemplos son Fc, F(ab'), F(ab')2 o Fab.
Las moléculas de aficuerpo son pequeñas proteínas diseñadas para unirse a péptidos o proteínas objetivo con alta afinidad, que imitan a anticuerpos monoclonales. Por tanto, las moléculas de aficuerpo se consideran miméticos de anticuerpos que normalmente son compuestos orgánicos que, al igual que los anticuerpos, pueden unirse específicamente a antígenos pero no están relacionados estructuralmente con los anticuerpos. Suelen ser péptidos o proteínas artificiales. Los ácidos nucleicos o moléculas pequeñas a veces también se consideran miméticos de anticuerpos. Las ventajas comunes sobre los anticuerpos son una mejor solubilidad, penetración en los tejidos y bajos costos de producción.
Las sondas pueden ser cadenas de ADN complementario, ARN o ácidos nucleicos modificados que se utilizan para localizar una secuencia de ADN o ARN específica en una parte o corte de una muestra. Las sondas se utilizan normalmente para la hibridación in situ.
Al estar cada tipo diferente de resto o sondas de direccionamiento utilizados para colorear o teñir la muestra marcado, por ejemplo conjugado, con diferentes partículas de conversión ascendente (tales como nanopartículas de conversión ascendente), se pueden detectar múltiples analitos simultáneamente en una muestra. Por ejemplo, la emisión de partículas de conversión ascendente (tales como las nanopartículas de conversión ascendente) es muy estrecha en el intervalo de 10 a 20 nm, y diferentes tipos de partículas pueden tener espectros de emisión perfectamente distinguibles. Por lo tanto, las partículas pueden brindar la posibilidad de detectar y analizar múltiples analitos en una muestra simultáneamente, ya que no hay superposición en la coloración o tinción de los diferentes analitos. Normalmente, esto no es posible con las técnicas convencionales de coloración o tinción en las que se utilizan fluoróforos o tinción de color. Especialmente no cuando se utilizan técnicas de inclusión en parafina. Las alternativas al uso de parafina son los cortes congelados o flotantes.
El resto o sonda de direccionamiento se puede conjugar con las partículas de conversión ascendente usando diferentes métodos, por ejemplo, los restos de direccionamiento o la sonda se pueden conjugar directamente con la partícula de conversión ascendente mediante química covalente o no covalente. Como alternativa, y/o adicionalmente, en algunos ejemplos, el resto o sonda de direccionamiento se puede conjugar con las partículas de conversión ascendente mediante química de enlazador, tal como el uso de una molécula adaptadora para unir los restos o sonda de direccionamiento a las partículas de conversión ascendente.
Además, la funcionalización de las partículas de conversión ascendente se puede realizar de manera similar a la funcionalización de puntos cuánticos, tal como se describe en X. Gao et. al., In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots, Nature Biotechnology, 22, 8:969-976, 2004, que se incorpora en el presente documento en su totalidad para todos los fines. En Gao et. al. se describen métodos que son aplicables a la conversión ascendente de partículas dopadas con tierras raras (como nanopartículas). Las partículas de conversión ascendente usadas en un ejemplo en esta divulgación fueron cristales de NaYF4 preparados de acuerdo con el método descrito en G. Yi et. al., Synthesis, characterization, and biological application of size-controlled crystalline (such as nanocrystalline) NaYF4:Yb, Er infrared-to-visible upconversion phosphors. Nano Letters, 4, 11:2191-2196, 2004, dopados con una combinación de Yb3+ y Tm3+.
Después de que la muestra ha sido coloreada o teñida, puede detectarse una señal 1002 de las partículas de conversión ascendente asociadas con el al menos un resto o sonda de direccionamiento unido a la muestra. La presencia, distribución o cantidad de al menos un analito puede detectarse de este modo en la muestra.
Las muestras se pueden ver usando microscopía, tal como microscopía fluorescente, que puede excitar las partículas de conversión ascendente al iluminarlas con una longitud de onda de luz particular. En algún ejemplo, se utiliza un filtro para filtrar la luz fluorescente. Además, y/o alternativamente, en algunos ejemplos el filtro es un retraso de tiempo. La luz autofluorescente del fondo, tal como la de una muestra de tejido fijada con formalina e incluida en parafina, o de la propia muestra de tejido, puede emitirse durante un período de tiempo más corto que la luz fluorescente de las partículas. Al no detectar o no usar la luz fluorescente detectada desde un primer período de tiempo, tal como 1 ms, tal como 0,5 ms, tal como 0,1 ms, después de la excitación, la luz fluorescente de las partículas puede filtrarse de la luz autofluorescente del fondo, es decir, se puede suprimir la luz autofluorescente del fondo.
La microscopía fluorescente puede ser una microscopía fluorescente convencional en donde la fuente de luz y el detector se han seleccionado para su uso con las partículas luminiscentes utilizadas. Cuando se requiere un filtro, el filtro también se ajustará para adaptarse a los espectros de emisión de las partículas luminiscentes.
La microscopía de fluorescencia se puede usar en modo de reflectancia o de transmisión, o la microscopía puede ser una microscopía de fluorescencia confocal.
La microscopía fluorescente puede ser un microscopio en donde se utiliza un ocular para estudiar visualmente las muestras. En algunos ejemplos, el microscopio se encuentra en una carcasa que genera una imagen digitalizada que puede analizarse manual o automáticamente mediante algoritmos de procesamiento de imágenes.
Puede utilizarse una carcasa para proteger la muestra de la luz ambiental de fondo que puede interferir con la detección de la luz fluorescente. En algunos ejemplos, un microscopio fluorescente manual también puede tener una carcasa para proteger la muestra cuando se analiza visualmente.
Como alternativa, en algunos ejemplos, las técnicas usadas para el análisis de las muestras se describen, por ejemplo, en los documentos WO2010/128090 y WO2014/006012, los cuales se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.
La Figura 2 ilustra otro método 2000 de acuerdo con la divulgación. El método 2000 puede incluir las técnicas descritas en conexión con el método de la Figura 1. La Figura 2 ilustra en particular un método 2000 de análisis de una muestra para al menos un analito en una muestra biológica. La muestra puede fijarse con parafina o congelarse o flotar libremente. La muestra también puede ser líquida. El método 2000 se usa ventajosamente para histología, tal como la inmunohistoquímica (IHC), o la citología, tal como inmunocitoquímica (ICC). Pero también se puede utilizar para hibridaciones, tales como la hibridación in situ (ISH) y, en particular, la hibridación in situ fluorescente (FISH). El método incluye poner en contacto 2001 la muestra con al menos un resto o sonda de direccionamiento, en donde cada resto o sonda de direccionamiento diferente del al menos un resto o sonda de direccionamiento puede unirse específicamente a un analito diferente del al menos un analito. Cada resto o sonda de direccionamiento diferente del al menos un resto o sonda de direccionamiento puede marcarse con una partícula luminiscente diferente. La partícula luminiscente puede ser una partícula de conversión ascendente.
El método 2000 puede incluir además la obtención 2002 de una primera imagen detectando una señal de la partícula luminiscente asociada con al menos un resto o sonda de direccionamiento unido a la muestra.
El método 2000 puede incluir además obtener 2003 una segunda imagen de la muestra, en donde la segunda imagen puede ser una imagen de campo brillante de la muestra sin contratinción, o en donde la segunda imagen es una imagen, donde la muestra se ha contrateñido o coloreado usando un colorante o tinción.
En algunos ejemplos, la segunda imagen de la muestra contrateñida puede obtenerse utilizando, por ejemplo, MUSE, de campo brillante o fluorescencia. El método de detección utilizado depende del tipo de contratinción.
El método 2000 también puede incluir combinar 2004 la primera imagen con la segunda imagen para obtener una imagen combinada. Adicionalmente, en algunos ejemplos, la imagen combinada se analiza para detectar la presencia o la cantidad de al menos un analito. La detección puede ser cualitativa o cuantitativa y también puede basarse en la ubicación de la luz detectada de las partículas de conversión ascendente. La información se puede combinar con otra información detectada de la imagen combinada, tal como la información de otros métodos de tinción, tal como la contratinción o la tinción de inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o hibridación tradicionales. La información también puede combinarse con información de campo brillante de la muestra sin contratinción, si está disponible.
Las ventajas de este método es que la misma muestra o corte puede incluir tanto la tinción IHC, su contratinción como la tinción luminiscente para detectar el analito. La segunda imagen, que incluye la tinción IHC y/o la contratinción, puede proporcionar más información de la muestra, pero también proporcionará información sobre la morfología y/o la localización de los analitos objetivo. Dado que se puede realizar en la misma muestra, no hay problemas con el registro conjunto. El registro conjunto es un problema cuando se deben usar diferentes cortes consecutivos para la imagen no teñida o contrateñida, y la imagen fluorescente se usa para detectar los analitos objetivo. Esto aumentará el contraste y la resolución, mejorando el análisis de la muestra. Además, dado que las nanopartículas de conversión ascendente tienen picos espectrales muy estrechos, de alrededor 10 a 20 nm, el riesgo de superposición es muy bajo cuando se usa más de un marcador para detectar más de un analito de la misma muestra o corte. Por tanto, la multiplexación es posible sin utilizar varios cortes consecutivos. La multiplexación en la misma muestra, tal como el corte, se puede hacer ya sea haciendo que todos los marcadores de la tinción sean partículas de conversión ascendente o una combinación de partículas de conversión ascendente y tinción tradicional de inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o hibridación, ya que el pico espectral más estrecho combinado con la fluorescencia en longitudes de onda más largas reduce el riesgo de superposición. Esto puede ser una ventaja cuando una tinción de inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o hibridación tradicional funciona muy bien para un analito específico, pero es difícil debido a la superposición de espectros detectar más de un analito de la misma muestra utilizando la tinción tradicional.
La multiplexación puede mejorar nuevamente el contraste y la resolución, pero sobre todo reducir la cantidad de muestra biológica necesaria. Esto es una ventaja ya que la mayoría de las biopsias regulares son pequeñas. Esto se aplica especialmente a la inmunocitoquímica o la citometría de fluidos, donde se pueden analizar muy pocas células (en el intervalo de 10). Estas células se pueden extraer de un líquido de biopsia. Esto es habitual, por ejemplo, en la biopsia de pulmón cuando se emplea una aguja fina para evitar dañar los vasos sanguíneos.
El contraste y la resolución pueden mejorarse aún más, ya que no hay necesidad de utilizar métodos comunes para reducir la autofluorescencia que puede disminuir la fuerza de la fluorescencia detectada. En cambio, las partículas de conversión ascendente pueden seleccionarse para que tengan una fluorescencia que se emita a una longitud de onda más larga en la región del infrarrojo cercano o del infrarrojo donde la autofluorescencia es tan débil que es despreciable o no existe. La autofluorescencia se puede emitir durante un período de tiempo más corto que la luz fluorescente de las partículas de conversión ascendente, y al no detectar o no usar la luz fluorescente detectada en un primer período de tiempo, tal como 1 ms, tal como 0,5 ms, tal como 0,1 ms, después de la excitación, puede filtrarse la luz fluorescente de la luz de las partículas autofluorescentes mientras se sigue detectando una fuerte fluorescencia. Otros problemas relacionados con la absorbancia y/o la fluorescencia de las tinciones comunes también se reducen debido tanto a la excitación como a la emisión con longitudes de onda más altas.
Esto facilitará la selección de una contratinción o una pluralidad de contratinciones para resaltar diferentes partes de las estructuras de las células para mejorar la morfología y la localización, ya que solo puede ser necesario considerar la superposición espectral de las contratinciones.
La resolución de contraste mejorada y el multiplexado simple pueden mejorar el diagnóstico de inmunohistoquímica, inmunocitoquímica, así como de las hibridaciones. El aumento de contraste y resolución es una ventaja a la hora de realizar digitalización y/o análisis automático de las imágenes. Además, el contraste y la resolución mejorados también pueden ser una ventaja cuando se usa inteligencia artificial para el análisis combinado con una cantidad reducida de artefactos debido a que no hay problemas con el registro conjunto.
Las Figuras 3A a 3C ilustran un ejemplo del método descrito anteriormente de la Figura 2 en una muestra de células MCF-7 cultivadas usando inmunocitoquímica. La Figura 3A es una imagen de campo brillante no contrateñida de la muestra. La Figura 3B muestra una imagen de fluorescencia de nanopartículas de conversión ascendente teñidas en la muestra. El método de detección fue: mAb anti-actina beta (Hospedador: Ratón), y anti-ratón de cabra conjugado con la partícula. Las partículas fueron nanopartículas de conversión ascendente dopadas con tulio o nanopartículas de conversión ascendente de lantánidos excitadas a 974 nm y detectadas por debajo de 830 nm.
La Figura 3C muestra una imagen combinada de las Figuras 3A y 3B. Está claro de esta combinación que la combinación da una imagen clara de la localización de las partículas fluorescentes en relación con las estructuras celulares.
Las Figuras 4A a 4C ilustran un ejemplo del método descrito anteriormente de la Figura 2 en una muestra de células MCF-7 cultivadas usando inmunocitoquímica. La Figura 4A es una imagen de campo brillante no contrateñida de la muestra. La Figura 4B muestra una imagen de fluorescencia de nanopartículas de conversión ascendente teñidas en la muestra. El método de detección fue: mAb anti-actina beta (hospedador:ratón), anti-ratón de cabra biotinilado, y neutravidina conjugada con la partícula. Las partículas fueron nanopartículas de conversión ascendente dopadas con tulio o nanopartículas de conversión ascendente de lantánidos excitadas a 974 nm y detectadas por debajo de 830 nm. La Figura 4C muestra una imagen combinada de las Figuras 4A y 4B. De esta imagen combinada queda claro que la combinación da una imagen clara de la localización de las partículas fluorescentes en relación con las estructuras celulares.
Las Figuras 5A a 5C ilustran un ejemplo del método descrito anteriormente de la Figura 2 en una muestra de tejido de colon humano usando inmunohistoquímica como método de detección. La Figura 5A muestra una imagen de campo brillante de la muestra teñida con hematoxilina. La Figura 5B muestra una imagen de fluorescencia de nanopartículas de conversión ascendente teñidas en la muestra. El método de detección fue: mAb anti-PCK (hospedador: ratón), y anti-ratón de cabra conjugado con la partícula). Las partículas fueron nanopartículas de conversión ascendente dopadas con tulio o nanopartículas de conversión ascendente de lantánidos excitadas a 974 nm y detectadas por debajo de 830 nm. La Figura 5C muestra una imagen combinada de las Figuras 5A y 5B. De la imagen combinada queda claro que la combinación da una imagen de alto contraste de la localización de las partículas fluorescentes en relación con las estructuras celulares.
Ejemplos
En algunos ejemplos, los biomarcadores diana pueden ser Ku70/80, PSA, hK2 y e1HER2, todos expresados en carcinoma de próstata en diversos grados. Las partículas funcionalizadas con anticuerpos pueden dirigirse al tumor mediante el empleo de ligandos específicos del tumor, tales como anticuerpos, sus F(ab'), F(ab')2 o Fab, o moléculas pequeñas que reconocen antígenos asociados al tumor en el microambiente del cáncer de próstata. La ventaja de este direccionamiento en comparación con el direccionamiento pasivo (biomolécula no específica de tumor), son las interacciones altamente específicas entre los ligandos y los antígenos tumorales, lo que aumenta la retención tumoral
de las construcciones de partículas y al mismo tiempo minimiza la unión inespecífica a las células no objetivo. Ejemplos de ligandos son:
el anticuerpo INCA-X, un anticuerpo IgG1 humano con especificidad por epítopos asociados con el complejo Ku70/Ku80 que se ha demostrado que se une específicamente y se internaliza rápidamente en una línea celular agresiva de cáncer de próstata (PC-3).
El anticuerpo 5A10, un anticuerpo murino con especificidad por el antígeno específico de la próstata libre, fPSA, que se usa con frecuencia como en el diagnóstico del CaP. La obtención de imágenes por PET utilizando 89Zr-DFO-5A10 tuvo éxito para detectar tumores que expresan cáncer de próstata y en metástasis óseas en ratones.
El anticuerpo 11B6, tanto en versión murina como humanizada. Este anticuerpo se dirige a la calicreína 2 humana (hK2), una proteasa con aproximadamente un 80 % de homología con el PSA.
Las moléculas de aficuerpo son una clase de moléculas pequeñas que son ligandos fuertes y altamente específicos del HER2 diana, que están sobreexpresadas en el 30 % de todos los cánceres de mama y en el 12-64 % en el cáncer de próstata. Las imágenes de PET de la expresión de HER2 en el cáncer de mama utilizando moléculas de anticuerpo están bien estudiadas y actualmente se están realizando estudios clínicos.
Para marcar células objetivo, las partículas deben funcionalizarse con la molécula de direccionamiento en sus superficies. Se pueden usar anticuerpos, por ejemplo, los mencionados anteriormente, y sus fragmentos Fab, F(ab'), F(ab')2 y moléculas de aficuerpo. En general, las moléculas pequeñas son atractivas debido a su alta pureza y menor inmunogenicidad. También, las partículas de conversión ascendente funcionalizadas pueden mantenerse pequeñas (del orden de 20 nm). Las bioconjugaciones exitosas de los restos de direccionamiento a las partículas de conversión ascendente son importantes y se pueden realizar utilizando métodos tradicionales de conjugación directa: química modificada con carboxilo y modificada con amina (covalente) y química no covalente (se basa en la unión electrostática), que se aplican durante la preparación de partículas. Sin embargo, la conjugación directa con agentes de direccionamiento a base de anticuerpos no modificados da una baja eficacia de incorporación. Otro método adecuado para unir agentes de direccionamiento a partículas es el uso de la química de enlazador de, por ejemplo, SMCC, NHS-PEG-MAL, enlazador SPDP para partículas reactivas con amina y éster NHS para partículas reactivas con carboxilo. Recientemente, se ha demostrado que la evolución de las estrategias de bioconjugación basadas en la química clic proporciona una alta eficiencia de reacción y proporciona más reacciones quimioselectivas. Las moléculas de aficuerpos se han investigado utilizando este método descrito.
Si bien se han descrito e ilustrado en el presente documento varios ejemplos de la presente divulgación, los expertos en la materia visualizarán fácilmente una variedad de otros medios y/o estructuras para realizar las funciones y/o obtener los resultados y/o uno o más de las ventajas descritas en el presente documento y cada una de tales variaciones y/o modificaciones se considera que están dentro del alcance de la presente divulgación. Más generalmente, los expertos en la materia apreciarán fácilmente que todos los parámetros, dimensiones, materiales y configuraciones descritos en el presente documento son solo ejemplos y que los parámetros, dimensiones, materiales y/o configuraciones reales dependerán de la aplicación o aplicaciones específicas para las que se utilizan las enseñanzas de la presente divulgación. También, dentro del alcance de la divulgación, se pueden proporcionar etapas de método diferentes a las descritas anteriormente, realizando el método por hardware. Las diferentes características y etapas de la divulgación pueden combinarse en otras combinaciones distintas a las descritas. El alcance de la divulgación solo está limitado por las reivindicaciones de patente adjuntas.
Claims (15)
1. Un método para obtener imágenes de al menos un analito en una muestra biológica para histología, citología o hibridaciones usado como respaldo en el diagnóstico de un sujeto, comprendiendo el método:
proporcionar dicha muestra que es un corte de tejido, una muestra de células, o un líquido obtenido de dicho sujeto; poner en contacto dicha muestra con al menos un resto o sonda de direccionamiento, en donde cada resto o sonda de direccionamiento diferentes de dicho al menos un resto o sonda de direccionamiento se une específicamente a un analito diferente del al menos un analito, y en donde cada resto o sonda de direccionamiento diferente de dicho al menos un resto o sonda de direccionamiento se marca con una partícula luminiscente diferente, en donde dicha partícula luminiscente es una partícula de conversión ascendente; y
obtener una primera imagen detectando una señal de dicha partícula luminiscente asociada con dicho al menos un resto o sonda de direccionamiento unido a dicha muestra;
obtener una segunda imagen de dicha muestra en donde dicha segunda imagen es una imagen de campo brillante de dicha muestra sin contratinción, o en donde dicha segunda imagen es una imagen de dicha muestra que está contrateñida o coloreada usando un colorante o una tinción, en donde dicho colorante o tinción no es una partícula de conversión ascendente;
combinar dicha primera imagen con dicha segunda imagen para obtener una imagen combinada.
2. El método de la reivindicación 1, en donde cada partícula luminiscente diferente emite espectros de emisión distinguibles.
3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde se pulsa una luz de excitación para obtener la primera imagen.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha muestra se fija con formalina y se incluye en parafina; o en donde dicha muestra está congelada, o en donde dicha muestra es un corte flotante.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho al menos un resto de direccionamiento es un ligando específico del analito, tal como un ligando específico de un tumor.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho al menos un resto de direccionamiento es un anticuerpo, un antígeno, una hormona, un fármaco, un fragmento de unión a antígeno, una molécula de aficuerpo, una enzima, una proteína o un péptido.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho al menos un resto de direccionamiento se conjuga directamente con dicha partícula luminiscente mediante química covalente o no covalente.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho al menos un resto de direccionamiento se conjuga con dicha partícula luminiscente mediante química de enlazador, tal como usando una molécula adaptadora para unir dicho al menos un resto de direccionamiento a dicha partícula luminiscente.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende detectar dicha señal de dicha partícula luminiscente con un retardo de tiempo de una señal de excitación para suprimir la luminiscencia de fondo.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho colorante o tinción, incluye la tinción con hematoxilina y eosina (H-E) utilizadas solas o combinadas, DAPI, tinción Hoechst, verde de metilo, azul de metileno, azul de toluidina, DRAQ5, DRAQ7, rojo rápido nuclear, tinción de Gram, tinción para PAS, rodamina, azul Nilo, rojo Nilo, yoduro de propidio, verde SYTOX, colorantes cromogénicos o fluorescentes.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha sonda es un ADN complementario, ARN o ácidos nucleicos modificados que localizan dicho al menos un analito que es una secuencia de a Dn o ARN.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el método incluye analizar dicha imagen combinada para detectar la presencia o cantidad del al menos un analito.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha segunda imagen de dicha muestra contrateñida se obtiene usando, Microscopía con excitación de superficie ultravioleta (MUSE), de campo brillante o fluorescencia dependiendo del tipo de contratinción.
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde dicha muestra está contrateñida o coloreada para proporcionar información de una morfología de la muestra y/o una localización del analito unido al resto o sonda de direccionamiento.
15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la primera y la segunda imagen se obtienen utilizando el mismo corte de la muestra para evitar problemas con el registro conjunto.
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