CN110366678A - 基于激光发射的显微镜 - Google Patents

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Abstract

提供了基于激光发射的显微镜装置和使用这样的装置检测来自组织样品的激光发射的方法。扫描显微镜具有第一和第二反射表面以及保持具有至少一种荧光团/激光能量响应物质的固定的组织样品的扫描腔。扫描腔的至少一部分对应于高品质因数(Q)法布里‑珀罗谐振腔。激光泵浦源将能量引导至扫描腔，同时检测器接收并检测由荧光团或激光能量响应物质产生的发射。第二反射表面和/或激光泵浦源可相对于固定的组织样品平移，以产生组织样品的二维扫描。提供了用于检测多重发射或对组织学组织样品中的一种或更多种生物标志物进行量化(例如用于检测和诊断癌症或其他病症/疾病)的方法。

Description

基于激光发射的显微镜
政府权利
本发明在由美国国立卫生研究院(U.S.National Institutes of Health)授予的资助EB016783和美国国家科学基金会(U.S.National Science Foundation)授予的资助ECCS1607250的政府支持下完成。政府在本发明中具有一定的权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年12月27日提交的美国临时申请No.62/439,367的权益。上述申请的全部公开内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开内容涉及基于激光发射的显微镜装置，和使用这样的基于激光发射的显微镜装置检测来自组织样品中的一种或更多种激光能量响应物质(例如，荧光团)的发射的方法，和/或用于对组织学组织样品中的一种或更多种生物标志物进行量化的方法。
背景技术
本部分提供了与本公开内容相关的背景信息，其不一定是现有技术。
生物学激光器(Biological laser)或生物激光器(biolaser)是用于下一代生物化学检测和临床应用的新兴技术。生物激光器从用外部荧光团标记的生物和生物化学材料(例如蛋白质、维生素、萤光素、DNA、细胞和血液)，或者从本身可作为增益介质的材料(例如在荧光蛋白的情况下)中发出激光。生物激光器在生物传感、生物医学研究和诊断方面已显示出巨大潜力，因为它们能够放大由潜在生物过程引起的增益介质的细微变化，其组合了阈值行为、窄线宽、强激光发射和激光模式空间分布，可导致检测灵敏度、多重性和成像对比度的显著提高。最近已取得进展以实现从生物分子和单个活细胞发射激光。例如，使用内部具有荧光蛋白或外部标记染料/珠作为增益介质之单细胞的生物激光器，已应用于单细胞分析。
然而，在对组织使用生物激光器时遇到了更多困难。包含嵌入细胞外基质中的多个细胞的组织更接近地模拟活体中的实际复杂生物环境，并因此对扫描和检测具有更实际的意义。然而，生物激光器对于组织的应用非常有限，其不能从组织提供可预测和可追踪的激光发射信号，同时产生强背景发射，导致不期望的信背比(signal-to-backgroundratio，SBR)。这些缺点显著地限制了生物激光器用于在组织中扫描和检测的实用性和适用性。期望提供可用于可靠地扫描并产生任何组织样品的二维扫描的扫描显微镜。
此外，近来生物组织中特定靶标(例如，癌症抗体)的检测和分化变得非常重要。因此在组织样品中以更高的灵敏度同时检测多个靶标的能力是高度可期望的。
发明概述
本部分提供了对本公开内容的总体概述，而不是其全部范围或其所有特征的全面公开内容。
在某些方面，本公开内容提供了扫描显微镜装置。该扫描显微镜装置包含第一反射表面(其为平面的)、第二反射表面和扫描腔，所述扫描腔尺寸设置为接收具有至少激光能量响应物质(例如，至少一种荧光团)的固定的组织样品。扫描腔的至少一部分对应于限定在第一反射表面与第二反射表面之间的法布里-珀罗谐振腔(Fabry-Pérot resonatorcavity)，所述谐振腔具有大于或等于约1×102的品质因数(Q)。扫描显微镜装置还包含激光泵浦源(lasing pump source)，其配置成将能量引导至扫描腔。检测器配置成接收和检测由来自扫描腔的组织样品中的至少一种激光能量响应物质(例如，至少一种荧光团)产生的一个或更多个发射。第二反射表面或激光泵浦源中的至少一个可相对于扫描腔中的固定的组织样品平移(translatable)，以产生组织样品的二维扫描。
在某些变化形式中，固定的组织样品的第一表面设置在第一反射表面上，并且固定的组织样品的与第一表面相对的第二表面与第二反射表面的间隙小于或等于约20微米。
在另一些变化形式中，第一反射表面与第二反射表面之间的距离小于或等于约60微米。
在另一些变化形式中，第二反射表面限定凹结构。
在某些变化形式中，凹结构的曲率半径大于或等于约5微米至小于或等于约500微米。
在另一些变化形式中，第二反射表面是形成在纤维末端上的扫描镜，其相对于固定的组织样品平移。
在另一些变化形式中，第二反射表面限定平面结构，并且激光泵浦源可相对于扫描腔中的组织样品平移。
在另一些特定变化形式中，品质因数(Q)大于或等于约1×105。
在一个变化形式中，第一反射表面和第二反射表面具有宽反射带。
在另一些变化形式中，固定的组织样品包含至少两种不同的激光能量响应物质(例如，至少两种不同的荧光团)，并且检测器能够接收和检测来自每种不同荧光团或激光能量响应物质的多重发射。
在另一些变化形式中，第二反射表面是可移除的并且任选地可替换。
在另一些变化形式中，固定的组织样品的厚度大于或等于约1μm至小于或等于约50μm。
在另一些变化形式中，第一反射表面或第二反射表面中的至少一个包含一个或更多个间隔区。
在某些方面，所述一个或更多个间隔区的高度大于或等于约大于或等于约2μm至小于或等于约60μm。
在另一些变化形式中，扫描腔还包含围绕组织样品设置的至少一种折射率匹配材料。
在另一些变化形式中，固定的组织样品任选地为组织样品微阵列的形式。
在另一些特定变化形式中，固定的组织样品已被低温保存或经福尔马林固定石蜡包埋。
在另一个变化形式中，第一反射表面和第二反射表面具有可调反射带。固定的组织样品包含至少两种不同的激光能量响应物质(例如，至少两种不同的荧光团)，其包括具有第一激光射阈(lasing threshold)能量的第一激光能量响应物质和具有不同的第二激光射阈能量的不同的第二激光能量响应物质。第一反射表面和第二反射表面可配置成具有第一反射带，该第一反射带允许来自第一激光能量响应物质的激光发射经由那里传输。第一反射表面和第二反射表面还可配置成具有第二反射带，该第二反射带允许来自第二激光能量响应物质的激光发射经由那里传输。
在另一个变化形式中，第二反射表面对由组织样品中的一种或更多种激光能量响应物质产生的一个或更多个激光发射的反射率大于或等于约80％至小于或等于约99.999％。
在另一些方面，本公开内容考虑了检测来自组织样品中一种或更多种激光能量响应物质(例如，一种或更多种荧光团)的发射的方法。该方法包括将来自激光泵浦源的能量引导至固定的组织样品。该固定的组织样品设置在扫描腔内，该扫描腔的至少一部分限定形成在第一反射表面与第二反射表面之间的法布里-珀罗谐振腔，其具有大于或等于约1×102的品质因数(Q)。组织样品包含一种或更多种激光能量响应物质。第二反射表面或激光泵浦源中的至少一个相对于设置在扫描腔内的固定的组织样品平移。该方法还包括检测由组织样品中的一种或更多种激光能量响应物质产生的一个或更多个激光发射，以产生组织样品的二维扫描。
在某些变化形式中，引导来自激光泵浦源的能量包括使激光能量源在设置在扫描腔内的组织样品上平移以产生二维扫描。
在另一些变化形式中，第二反射表面限定凹结构。
在某些变化形式中，凹结构的曲率半径大于或等于约5微米至小于或等于约500微米。
在另一些变化形式中，第二反射表面是形成在纤维末端上的扫描镜，其相对于设置在扫描腔内的组织样品平移以产生二维扫描。
在另一个变化形式中，第一反射表面和第二反射表面具有宽反射带。
在又一个变化形式中，第二反射表面对由组织样品中的一种或更多种激光能量响应物质产生的一个或更多个激光发射的反射率大于或等于约80％至小于或等于约99.999％。
在一个替代变化形式中，第一反射表面和第二反射表面具有可调反射带。所述一种或更多种激光能量响应物质包含具有第一激光射阈能量的第一激光能量响应物质和具有不同的第二激光射阈能量的不同的第二激光能量响应物质。该方法还包括首先调谐第一反射表面和第二反射表面以具有第一反射带，所述第一反射带允许来自第一激光能量响应物质的激光发射经由那里传输，以使得在引导能量之后，所述检测是对由第一激光能量响应物质产生的一个或更多个发射的检测。该方法还可包括调谐第一反射表面和第二反射表面以具有第二反射带，所述第二反射带允许来自第二激光能量响应物质的激光发射经由那里传输。然后再次发生能量的引导，以使得所述检测是对由第二激光能量响应物质产生的一个或更多个发射的检测。
在另一个变化形式中，所述一种或更多种激光能量响应物质包含具有第一激光射阈能量的第一激光能量响应物质。提高引导至固定的组织样品的能量的量，以使得所述检测映射固定的组织样品内的第一激光能量响应物质的浓度分布。
在某些变化形式中，组织样品包含至少两种不同的激光能量响应物质(例如，至少两种荧光团)。所述检测包括检测由所述至少两种不同的荧光团或激光能量响应物质产生的至少两个不同的发射，以产生组织样品的多重二维扫描。
在另一个变化形式中，所述一种或更多种激光能量响应物质包含具有第一激光射阈能量的第一激光能量响应物质(例如，第一荧光团)和具有不同的第二激光射阈能量的不同的第二激光能量响应物质(例如，第二荧光团)，以使得引导来自激光泵浦源的能量包括提高能级以首先激发第一激光能量响应物质并随后激发第二激光能量响应物质。一个或更多个发射的检测检测来自第一激光能量响应物质和第二激光能量响应物质的发射，其映射固定的组织样品内第一激光能量响应物质和第二能量响应物质的分布。
在另一些变化形式中，所述一种或更多种激光能量响应物质包含第一激光能量响应物质(例如，第一荧光团)和不同的第二激光能量响应物质(例如，第二荧光团)。引导至固定的组织样品的能量小于第一激光能量响应物质的第一激光射阈能量并且大于第二激光能量响应物质的第二激光射阈能量，以使得一个或更多个发射的检测仅检测来自组织样品中的第二激光能量响应物质的激光发射。该方法还可包括将引导至组织样品的能量提高至大于第二激光射阈能量，以检测来自第二激光能量响应物质的激光发射。
在另一些方面，本公开内容提供了用于对组织学组织样品中的一种或更多种生物标志物进行量化的方法。该方法包括将来自激光泵浦源的能量引导至设置在扫描腔内的固定的组织学组织样品。扫描腔的至少一部分限定形成在第一反射表面与第二反射表面之间的法布里-珀罗谐振腔，其具有大于或等于约1×102的品质因数(Q)。组织学组织样品包含能够与至少一种生物标志物相关的一种或更多种激光能量响应物质(例如，一种或更多种荧光团)，并且第二反射表面或相干电磁辐射(coherent electromagnetic radiation)激光能量源的源中的至少一个相对于设置在扫描腔内的固定的组织样品平移。该方法还包括检测由组织学组织样品中的一种或更多种激光能量响应物质产生的一个或更多个激光发射，以对组织学组织样品中存在的至少一种生物标志物的数量进行量化。
在一个变化形式中，所述一种或更多种激光能量响应物质包含具有第一激光射阈能量的第一激光能量响应物质(例如，第一荧光团)。提高引导至组织学组织样品的能量的量，以使得所述检测映射组织学组织样品中第一激光能量响应物质的浓度分布。
在另一些变化形式中，一个或更多个发射的检测涉及组织样品的不同区域中生物标志物的浓度分布。改变引导至组织样品的能量的激发强度以测量组织样品的不同区域中生物标志物的浓度。
在某些变化形式中，组织学组织样品包含至少两种不同的激光能量响应物质(例如，至少两种荧光团)。检测包括检测由至少两种不同的激光能量响应物质产生的至少两个不同的激光发射，以产生组织学组织样品的多重二维扫描。
在某些变化形式中，所述一种或更多种激光能量响应物质包含第一激光能量响应物质(例如，第一荧光团)和不同的第二激光能量响应物质(例如，第二荧光团)，并且引导至固定的组织样品的能量小于第一激光能量响应物质的第一激光射阈能量并且大于第二激光能量响应物质的第二激光射阈能量，以使得一个或更多个发射的检测仅检测来自组织样品中的第二激光能量响应物质的激光发射。该方法还可包括将引导至组织样品的能量提高至大于第二激光射阈能量，以检测来自第二激光能量响应物质的激光发射。
在某些变化形式中，所述一种或更多种激光能量响应物质包含具有第一激光射阈能量的第一激光能量响应物质。提高引导至固定的组织样品的能量的量，以使得检测映射固定的组织样品中第一激光能量响应物质的浓度分布。
在另一些变化形式中，生物标志物与固定的组织样品内的细胞的核相关，以使得由一种或更多种激光能量响应物质(例如，一种或更多种荧光团)产生的一个或更多个发射的检测对应于由所述细胞的核产生的发射，以使得所述量化计算组织样品中细胞的核的数量。
在另一些变化形式中，由一种或更多种激光能量响应物质产生的一个或更多个发射具有小于或等于约0.7微米的空间分辨率。
在另一个变化形式中，第一反射表面和第二反射表面具有宽反射带。
在一个替代变化形式中，第一反射表面和第二反射表面具有可调反射带。所述一种或更多种激光能量响应物质包含具有第一激光射阈能量的第一激光能量响应物质和具有不同的第二激光射阈能量的不同的第二激光能量响应物质。该方法还包括首先调谐第一反射表面和第二反射表面以具有第一反射带，所述第一反射带允许来自第一激光能量响应物质的激光发射经由那里传输，以使得在引导能量之后，所述检测是对由第一激光能量响应物质产生的一个或更多个发射的检测。该方法还可包括调谐第一反射表面和第二反射表面以具有第二反射带，所述第二反射带允许来自第二激光能量响应物质的激光发射经由那里传输。然后再次发生能量的引导，以使得所述检测是对由第二激光能量响应物质产生的一个或更多个发射的检测。
在另一个变化形式中，所述一种或更多种激光能量响应物质包含具有第一激光射阈能量的第一激光能量响应物质和具有不同的第二激光射阈能量的不同的第二激光能量响应物质，以使得引导来自激光泵浦源的能量包括提高能级以首先激发第一激光能量响应物质并随后激发第二激光能量响应物质。一个或更多个发射的检测检测来自第一激光能量响应物质和第二激光能量响应物质的发射，其映射固定的组织样品内第一激光能量响应物质和第二能量响应物质的分布(例如，基于位置/定位)。
在某些方面，该方法还包括检测组织样品中产生的一个或更多个明视场发射或荧光发射，其中二维扫描是激光发射与一个或更多个明视场发射、荧光发射或者明视场发射和荧光发射二者的复合叠加(composite overlay)。
在另一些方面，检测包括检测荧光发射，并且该方法还包括首先移除第二反射表面。
在另一些方面，由组织样品中的一种或更多种激光能量响应物质产生的一个或更多个激光发射提供以下中的至少一种：癌组织亚型的鉴定、癌症的早期检测、癌症阶段的鉴定或激光发射的直方图。
通过本文中提供的描述，进一步的应用领域将变得明显。本发明概述中的描述和具体实例旨在仅用于举例说明性目的，而不旨在限制本公开内容的范围。
附图说明
本文中描述的附图仅用于所选择实施方案而不是所有可行实施的举例说明性目的，并且不旨在限制本公开内容的范围。
图1A至1B。图1A示出了举例说明根据本公开内容的某些方面制备的波长复用亚细胞免疫激光显微镜装置的示意图。图1B示出了来自单个核的传统荧光发射(顶部)和“星状”激光发射(底部)之间的比较。
图2示出了法布里-珀罗(FP)标准具(étalon)谐振腔的工作原理的示意图。
图3A至3B示出了与根据本公开内容的某些方面的激光发射检测过程相比的常规荧光检测过程的比较示意图。
图4A至4G示出了扫描显微镜装置的另一个实施方案和组织样品以及用这样的显微装置扫描/检测的结果。图4A示出了根据本公开内容的某些方面制备的扫描显微镜装置的示意图，该扫描显微镜装置包含可平移的激光泵浦源和光检测器单元。图4B，水中的FITC(蓝色曲线)和乙醇中的BODIPY(红色曲线的归一化荧光发射光谱示出了来自用图4A中的扫描显微镜装置的实验的数据。图4C至4E示出了所研究的不同类型的组织：肌肉组织(图4C)、脂肪组织(图4D)和混合组织(图4E)。图4F示出了用FITC染色的肌细胞的显微图像(从左到右)：微分干涉对比(differential interference contrast，DIC)图像、共聚焦显微术图像和重叠图像。图4G示出了用BODIPY染色的脂肪细胞的显微图像(从左到右)：DIC图像、共聚焦显微术图像和重叠图像。比例尺，20μm。
图5A至5C。图5A示出了根据本公开内容某些方面的显微镜装置的扫描腔中不同法布里-珀罗谐振腔实例的示意图，该谐振腔可限定在第一反射表面与第二反射表面之间，包括平平和平凹法布里-珀罗腔。图5B示出了第一和第二反射表面的反射率。图5C示出了根据本公开内容的某些变化形式的具有平凹(p-c)法布里-珀罗腔的显微镜装置的一部分的示意图。
图6示出了扫描显微镜装置的另一个实施方案和用这样的显微装置扫描/检测的组织样品的映射。
图7A至7F。图7A至7F一般地示出了用根据本公开内容的某些方面制备的激光发射扫描显微镜装置，在肌肉组织(纵向肌原纤维)中的激光发射。图7A示出了在多种泵浦能量密度下用FITC(2mM)染色的肌肉组织(30μm)的激光发射光谱的实例。为清晰起见，曲线垂直移动。图7B示出了作为从图7A中的光谱提取的泵浦能量密度的函数的光谱积分(545nm至560nm)激光输出。实线是高于激光射阈(其为9.2μJ/mm2)的线性拟合。图7C示出了低于(4.7μJ/mm2)和高于(12μJ/mm2)激光射阈的肌肉组织激光输出的CCD图像。该图像清楚地显示了数个肌细胞。然而，激光束仅聚焦在一个肌细胞上。比例尺，20μm。图7D示出了在35μJ/mm2下具有不同组织厚度的肌肉组织的激光发射光谱(所有这些都高于激光射阈)。为清晰起见，曲线垂直移动。图7E示出了不同组织厚度的激光射阈。用于对组织进行染色的FITC的浓度为2.0mM。误差条基于不同位置处的三个单独测量。图7F示出了用于在30μm的固定组织厚度(并且因此腔长度)处对组织进行染色的不同浓度的FITC的激光射阈。实曲线是用以引导目光的二次拟合。误差条基于不同位置处的三个单独测量。
图8A至8E。图8A至8E一般地示出了用根据本公开内容的某些方面制备的激光发射扫描显微镜装置，在肌肉组织(横向肌原纤维)中的激光发射。图8A是显示肌原纤维(肌纤维)的两种排列(纵向和横向)的示意图。箭头指示激光发射方向。FP腔未示出。图8B示出了用FITC染色的横向肌原纤维的DIC(上部)和共聚焦荧光显微镜(下部)图像。图8C示出了横向肌原纤维中组织激光发射的CCD图像。图8D示出了在多种泵浦能量密度下用FITC染色的横向肌肉组织的激光发射光谱的实例。为清晰起见，曲线垂直移动。图8E示出了作为从图8D提取的泵浦能量密度的函数的光谱积分(540nm至560nm)激光输出。实线是高于阈值的线性拟合，显示激光射阈为约22μJ/mm2。组织厚度＝30μm。[FITC]＝2.0mM。激发波长＝465nm。所有比例尺，20μm。
图9A至9F。图9A至9F一般地示出了用根据本公开内容的某些方面制备的激光发射扫描显微镜装置，在脂肪组织中的激光发射。图9A示出了在多种泵浦能量密度下用BODIPY(1.0mM)染色的脂肪组织(30μm)的激光发射光谱的实例。为清晰起见，曲线垂直移动。图9B示出了作为从图9A中的光谱提取的泵浦能量密度的函数的光谱积分(520nm至535nm)激光输出。实线是高于激光射阈(其为约20.0μJ/mm2)的线性拟合。图9C示出了低于(15μJ/mm2)和高于(31μJ/mm2)激光射阈的肌肉组织激光输出的CCD图像。该图像示出了数个脂肪细胞的清晰边界，其中激光束仅聚焦在一个脂肪细胞上。比例尺，20μm。图9D示出了高于激光射阈多种厚度的脂肪组织的激光发射光谱。图9E示出了不同组织厚度的激光射阈。用于对组织进行染色的BODIPY的浓度为1.0mM。误差条基于不同位置处的三个单独测量。图9F示出了用于在30μm的固定组织厚度(并且因此腔长度)处对组织进行染色的不同浓度的BODIPY的激光射阈。实曲线是用以引导目光的二次拟合。误差条基于不同位置处的三个单独测量。
图10A至10F示出了混合组织中的多重激光发射。图10A是一片混合组织的照片。黑色方块显示目的区域，其中肌肉组织和脂肪组织不能通过其宏观外观直接区分。图10B示出了图10A中的混合组织的DIC图像，该混合组织包含肌肉组织和脂肪组织的不规则混合物。当泵浦激光束沿虚线扫描时，分别在(位置1)肌肉组织、(位置2)脂肪组织和(位置3)肌肉组织上拍摄三个代表性位置。图10C示出了用FITC和BODIPY双重染色的混合组织的共聚焦图像。图10D示出了具有FITC的肌肉组织(位置1)、具有BODIPY的脂肪组织(位置2)和具有FITC的肌肉组织(位置3)的荧光光谱。图10E示出了当泵浦能量密度设定在肌肉组织的阈值与脂肪组织的阈值之间(20μJ/mm2)时，分别在位置1、2和3处拍摄的激光发射光谱。图10F示出了当泵浦能量密度高于肌肉组织和脂肪组织二者的阈值(60μJ/mm2)时，分别在位置1、2和3处拍摄的激光发射光谱。图10E和10F中560nm附近的背景发射光谱的提高是由于由电介质反射镜(dielectric mirror)的反射率降低引起的FP腔的荧光泄漏。图10B和10C中的比例尺为40μm。
图11A至11C。图11A至11C示出了用根据本公开内容的某些方面制备的激光发射扫描显微镜装置，在具有FITC缀合物的肌肉组织中的激光发射。图11A示出了用FITC-鬼笔环肽染色的肌肉组织的共聚焦荧光图像。肌肉纵向排列。图11B示出了作为泵浦能量密度的函数的光谱积分(530nm至545nm)激光输出。实线是高于阈值(其为约130μJ/mm2)的线性拟合。图11C示出了高于激光射阈的激光发射的CCD图像。所有比例尺，20μm。组织厚度＝30μm。[FITC-鬼笔环肽]＝10μm。激发波长＝465nm。
图12A至12J。图12A至12J示出了用根据本公开内容的某些方面制备的激光发射扫描显微镜装置，在具有核酸染色染料的肺组织中的激光发射。图12A至12B示出了在多种泵浦能量密度下，用YOPRO染色的人肺癌组织(图12A)和正常肺组织(图12B)的激光发射光谱的实例。为清晰起见，曲线垂直移动。图12C示出了作为从图12A至12B中的光谱提取的泵浦能量密度的函数的光谱积分(540nm至550nm)激光输出的比较。实线是高于激光射阈的线性拟合，显示癌组织的激光射阈为21μJ/mm2，并且正常肺组织的激光射阈为32μJ/mm2。图12D示出了用于对组织进行染色的不同浓度的YOPRO的激光射阈。误差条基于不同位置处的三个单独测量。图12E示出了肺癌核(以绿色显示)的共聚焦荧光图像。图12F至12G示出了(图12F)激光射阈附近(24μJ/mm2)和(图12G)远高于激光射阈(50μJ/mm2)，来自肺癌组织中的核的激光输出的CCD图像。该图像清楚地显示了核内的数个微小的、尖锐的“激光发射星(lasing star)”，而背景荧光被显著抑制。激光束仅聚焦在组织中的一个细胞上。图12H示出了正常肺核(绿色)的共聚焦图像。图12I至12J示出了(图12I)低于(24μJ/mm2)和(图12J)高于(50μJ/mm2)激光射阈，来自正常肺组织中的核的激光输出的CCD图像。在相同的制备条件下，用YOPRO(0.5mM，在本体染色溶液中)对图12A至12J中的所有组织进行染色。组织的厚度(腔长度)固定在15μm。所有比例尺，5μm。
图13A至13E。图13A至13E示出了根据本发明的某些方面制备的激光发射扫描显微镜装置的亚细胞组织激光器的光学分辨率。图13A是来自用YOPRO染色的人肺组织的单个激光发射点的放大的CCD图像(左)。沿黄色虚线的强度分布图(右)显示点扩散函数(PointSpread Function，PSF)的FWHM为678nm。图13B示出了两个相邻激光点的放大的CCD图像(左)。沿黄色虚线的强度分布图(右)显示了两个分辨良好的峰。估计两个激光发射之间的瑞利判据(Rayleigh criterion)(最小可分辨距离)为约1μm。图13C至13E示出了通过将泵浦能量密度从(图13C)25μJ/mm2、(图13D)35μJ/mm2提高至(图13E)65μJ/mm2的相同焦点束点内的独立亚细胞激光器的激光发射光谱。插图示出了相应激光发射的CCD图像，其中图13C是单个激光器的实例，图13D是具有不同激光射阈的两个独立激光器的实例，并且图13E是在高泵浦强度下同时出现的多个独立激光器的实例。注意，图13C至13E中超过560nm的背景发射轻微提高是由于由电介质反射镜的反射率降低引起的FP腔的荧光泄漏。NA＝0.42。激光激发＝465nm。所有比例尺，5μm。
图14A至14E。图14A至14E示出了用根据本公开内容的某些方面制备的激光发射扫描显微镜装置，在具有抗EGFR-FITC的肺组织中的激光发射。图14A示出了在多种泵浦能量密度下用抗EGFR-FITC染色的具有n-EGFR表达的人肺癌组织的激光发射光谱的实例。为清晰起见，曲线垂直移动。图14B示出了作为从图14A中的光谱提取的泵浦能量密度的函数的光谱积分(530nm至540nm)激光输出。实线是高于激光射阈的线性拟合，指示激光射阈为67μJ/mm2。图14C示出了肺癌组织中具有n-EGFR表达的细胞的共聚焦显微图像。图14D示出了在激光射阈以上(125μJ/mm2)来自相同肺癌组织的激光输出的CCD图像。该图像清楚地显示了对应于核内最高浓度的EGFR位置的数个微小激光发射。激光束主要聚焦在组织中的一个细胞上。图14E是沿黄色虚线的强度分布图(插图)，示出了PSF的FWHM测量为860nm。在相同的制备条件下，用抗EGFR-FITC(0.5mM，在本体染色溶液中)对图14A至14E中的所有组织进行染色。组织的厚度(腔长度)固定在15μm。NA＝0.42。激光激发＝465nm。所有比例尺，10μm。
图15A至15H。图15A至15H示出了用根据本公开内容的某些方面制备的激光发射扫描显微镜装置，在肺癌组织中的多重激光发射。图15A示出了没有n-EGFR的人肺癌组织(组织类型#1)的明视场IHC图像。图15B示出了用YOPRO(红色曲线)和抗EGFR-FITC(蓝色曲线)单独染色的#1型组织的激光发射光谱。YOPRO和FITC的泵浦能量密度分别为40μJ/mm2和80μJ/mm2。图15C示出了用YOPRO和抗EGFR-FITC双重染色的#1型组织的共聚焦显微图像。图15D示出了用YOPRO和EGFR-抗FITC双重染色的#1型组织的激光发射光谱。激光聚焦在肺癌组织内的单个核上。在单一激发波长下，泵浦能量密度设定在YOPRO和FITC二者的阈值以上。图15E是具有n-EGFR过表达的人肺癌组织(组织类型#2)的明视场IHC。图15F是用YOPRO(红色曲线)和抗EGFR-FITC(蓝色曲线)单独染色的2型组织的激光发射光谱。YOPRO和FITC的泵浦能量密度分别为40μJ/mm2和80μJ/mm2。图15G是用YOPRO和抗EGFR-FITC双重染色的#2型组织的共聚焦显微图像。图15H是用YOPRO和抗EGFR-FITC双重染色的组织的激光发射光谱。激光聚焦在肺癌组织内的单个核上。在单一激发波长下，泵浦能量密度设定在YOPRO和FITC二者的阈值以上。插入的CCD图像是n-EGFR激光发射的示范，其表明EGFR与核共定位。注意，图15B、15D、15F和15H中超过560nm的背景发射轻微提高是由于由电介质反射镜的反射率降低引起的FP腔的荧光泄漏。所有比例尺，20μm。
图16A至16F。图16A至16F示出了用根据本公开内容的某些方面制备的激光发射扫描显微镜装置，在具有FITC缀合的抗体的结肠癌组织中的激光发射。图16A至16C示出了具有n-EGFR(图16A)、n-p53(图16B)和n-Bcl-2(图16C)过表达的人结肠癌组织的明视场IHC和共聚焦显微图像。图16D至16F示出了用抗EGFR-FITC(图16D)、抗p53-FITC(图16E)和抗Bcl-2-FITC(图16F)制备的结肠癌组织的激光发射光谱。图16D至16F中的插图示出了当在核处泵浦时来自结肠组织的代表性“激光发射星”的CCD图像。组织厚度＝15μm。激发波长＝465nm。对于图16D至16F，泵浦能量密度分别为220μJ/mm2、280μJ/mm2和300μJ/mm2。图16A至16C的所有比例尺，50μm；图16D至16F的所有比例尺，5μm。
图17是根据本公开内容的某些方面制备的激光发射扫描显微镜装置的实验设置和结构的示意图。右边的照片示出了用465nm激发源泵浦时夹在两个镜之间的肺组织切片。
图18A至18D。图18A示出了肿瘤组织和正常组织样品的比较激光射阈。图18B示出了肿瘤组织和正常组织样品的激光射阈的中值分布。图18C示出了比较肿瘤和正常组织样品的细胞计数与激光射阈。图18D示出了在正常细胞核和癌细胞核中检测到荧光发射的示意图，但是当泵浦能量密度在肿瘤组织和正常组织的激光射阈之间时，仅在癌细胞核中检测到激光发射。
图19示出了用于扫描/检测组织样品的扫描显微镜装置的另一个实施方案。
图20A至20G举例说明了根据本公开内容的某些方面，来自同一组织样品荧光、明视场图像和激光发射图像的同时采集。图20A是组织样品的荧光显微图像。图20B是同一组织样品的明视场CCD图像。图20C是同一组织样品的激光发射CCD图像。在图20B至20C中，仅在虚线方形区域内泵浦激光。图20A和20C中的左下侧方形示出了相应图像中的虚线方形的放大图像。为了详细比较，图20D和20E分别示出了沿图20A和20C中的图像中的线的强度分布。比例尺，30μm。图20F和20G提供了另一个实例，其示出了来自组织样品的激光发射星发射。图20F示出了纯激光发射成像，而图20G示出了激光发射和明视场成像的同时采集。
图21示出了激光发射扫描显微镜装置的另一个实施方案，该装置具有可移除的第一反射表面，该第一反射表面具有用于促进扫描腔中的厚度均匀性的间隔区。
图22A至22D。图22A至22B示出了冷冻组织中癌细胞/正常细胞激光射阈的统计，而图22C至22D示出了FFPE保留的组织。图22A示出了来自标记为N1至N6的六名患者正常肺组织的正常细胞(其已被低温冷冻)激光射阈的统计。图22B示出了来自标记为T1至T6的六个个体肺癌患者的肿瘤细胞(其已被低温冷冻)激光射阈的统计。图22C示出了来自通过FFPE处理的标记为N1至N4的四名患者的正常肺组织的正常细胞激光射阈的统计。图22D示出了来自通过FFPE处理的标记为T1至T6的六个个体肺癌患者的肿瘤细胞激光射阈的统计。
图23示出了四种染料(SYTOX-Blue、EGFR-FITC、YOPRO和BOBO-1)在500nm至550nm范围内的四种独特激光发射波长的波长与强度的关系。
图24A至24D示出了由本公开内容的某些方面提供的激光发射显微术(lasingemission microscopy，LEM)技术的灵敏度和特异性。图24A至24D示出了正常组织和癌组织的每帧激光发射细胞(lasing cell)数的直方图。图24A示出了正常细胞的每帧激光发射细胞计数，而图24C示出了肿瘤细胞的每帧激光发射细胞计数。图24B示出了接受者操作特征(Receiver Operation Characteristic，ROC)曲线。图24D示出了在不同激发强度下组织中激光发射细胞的直方图。更具体地，图24D示出了肿瘤和正常细胞的每细胞计数的激光射阈(指定了肿瘤细胞计数，其余计数是正常细胞)。
图25A至25F示出了根据本公开内容的某些方面通过使用激光发射显微术技术的早期肺癌组织检测。图25A至25C中分别示出了来自诊断患有早期肺癌的三个不同患者的组织样品。用激光发射显微镜(LEM)在30μJ/mm2的固定泵浦能量密度下扫描5个切片。图25D对应于来自图25A中所示的组织样品的激光发射扫描。图25E对应于来自图25B中所示的组织样品的激光发射扫描。图25F对应于来自图25C中所示的组织样品的激光发射扫描。
图26示出了用于扫描/检测为组织微阵列形式的组织样品的扫描显微镜装置的另一个实施方案。
遍及附图的数个视图中对应的参考标记表示对应的部件。
发明详述
提供了一些示例性实施方案，以使得本公开内容透彻并将范围完全地传达给本领域技术人员。阐述了大量具体细节(例如具体组成、组分、装置和方法的实例)以提供对本公开内容的实施方案的透彻理解。对本领域技术人员明显的是不必使用具体细节，示例性实施方案可以以许多不同形式体现并且二者都不应被理解为限制本公开内容的范围。在一些示例性实施方案中，没有详细描述公知的方法、公知的装置结构和公知的技术。
本文中使用的术语仅是为了描述特定示例性实施方案的目的，而不旨在是限制性的。如本文中所用的，除非上下文另有清楚地说明，否则没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。术语“包含”、“包含的”、“包括”和“具有”是包含性的，并因此确定所述特征、要素、组成、步骤、整数、操作和/或组分的存在，但不排除一个或更多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分和/或其组的存在或添加。尽管开放式术语“包含/包括”应被理解为用于描述和要求保护本文中所阐述的多个实施方案的非限制性术语，但是在某些方面中，该术语可作为替代地被理解为是更限制的术语，例如“由......组成”或“基本上由......组成”。因此，对于记载了组成、材料、组分、要素、特征、整数、操作和/或加工步骤的任何给定实施方案，本公开内容还具体地包括由这样记载的组成、材料、组分、要素、特征、整数、操作和/或加工步骤组成或基本上由其组成的实施方案。在“由......组成”的情况下，替代性实施方案排除任何另外的组成、材料、组分、要素、特征、整数、操作和/或加工步骤，而在“基本上由......组成”的情况下，实质上影响基本特征和新特征的任何另外的组成、材料、组分、要素、特征、整数、操作和/或加工步骤被排除在该实施方案之外，但是实质上不影响基本特征和新特征的任何组成、材料、组分、要素、特征、整数、操作和/或加工步骤可被包括在实施方案中。
除非特别地确定成进行的顺序，否则本文中所述的任何方法步骤、过程和操作不应被理解为必须要求其以所讨论或举例说明的特定顺序进行。还应理解的是，除非另有说明，否则可采用作为替代或补充的步骤。
当组分、要素或层被称为在另一要素或层“上”，与另一要素或层“接合”、“连接”或“耦合”时，其可直接在另一组分、要素或层上，与其接合、连接或耦合，或者可存在中间要素或层。相反，当要素被称为直接在另一要素或层“上”，与另一要素或层“直接接合”，“直接连接”或“直接耦合”时，可不存在中间要素或层。用于描述要素之间关系的其他词语应以相同方式解释(例如，“在......之间”相对于“直接在......之间”、“相邻”相对于“直接相邻”，等)。如本文中所用的，术语“和/或”包括一个或更多个相关列举项目的任何和所有组合。
除非另有说明，否则虽然在本文中术语第一、第二、第三等可用于描述不同步骤、要素、组分、区域、层和/或部分，但是这些步骤、要素、组分、区域、层和/或部分应不受这些术语限制。这些术语可仅用于区分一个步骤、要素、组分、区域、层和/或部分与另一步骤、要素、组分、区域、层和/或部分。除非上下文明确说明，否则在本文中使用时术语(例如“第一”、“第二”和其他数字术语)不意指顺序或次序。因此，在不脱离示例性实施方案的教导下，下文所讨论的第一步骤、要素、组分、区域、层或部分可被称为第二步骤、要素、组分、区域、层或部分。
在本文中为了便于描述，可使用空间或时间相关术语(例如“之前”，“之后”，“内部”，“外部”，“下面”，“下方”，“下部”，“上方”，“上部”等)来描述如附图中所示的一个要素或特征相对于其他要素或特征的关系。空间或时间相关术语可旨在包括除了附图中描绘的取向之外的装置或系统在使用或操作中的不同取向。
贯穿本公开内容，数值表示范围的近似测量或限制以包括与给定值的较小偏差和具有约所提及的值的实施方案以及具有确切所提及的值的实施方案。除了在发明详述的最后提供的工作实施例中，在本说明书(包括所附权利要求书)中参数(例如，量或条件)的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“约”修饰，无论在数值之前是否实际出现“约”。“约”表示所述数值允许一些轻微的不精确性(用一些方法达到该值精确；近似或合理地接近该值；差不多)。如果由“约”提供的不精确性在本领域中没有以这种普通含义理解，则本文中所用的“约”至少表示可由测量和使用这些参数的普通方法引起的变化。例如，“约”可包括以下的变化：小于或等于5％，任选地小于或等于4％，任选地小于或等于3％，任选地小于或等于2％，任选地小于或等于1％，任选地小于或等于0.5％，并且在某些方面，任选地小于或等于0.1％。
此外，范围的公开包括整个范围内的所有值和进一步划分的范围的公开，包括范围所给出的端点和子范围。
现在将参照附图更全面地描述一些示例性实施方案。
包含嵌入细胞外基质中的多个细胞的组织更接近地模拟活体中的实际复杂生物环境。然而，常规生物激光器在传感组织中的成功使用受到限制。已用于扫描组织的许多生物激光器是随机激光器(random laser)，其依赖于强散射(即，组织不均匀性)以提供用于激光发射的光学反馈并且不具有固定的腔。因此，这样的生物激光器不能在组织样品上提供具有精确定位的可预测和可追踪的激光发射信号。另外，由于随机激光器的性质，激光特征(例如，强度和阈值)从一个组织样品到另一个组织样品或在同一组织样品中从一个点到另一个点显著变化。
另一些生物激光器是基于回音壁模(whispering-gallery mode，WGM)的脂滴激光器(lipid droplet laser)，其仅可用于非常有限的细胞和组织，需要脂肪细胞的内部球形结构，这意味着WGM激光器仅可用于脂肪组织。此外，在随机激光器和脂滴激光器二者中，来自不参与激光作用的荧光团和组织本身的强背景发射可与实际的激光信号一起耦合到检测系统(例如光谱仪或光检测器)中。因此，显著损害了信背比(SBR)，并因此显著降低了检测灵敏度和成像对比度。这些缺点显著地限制了用于扫描组织样品的目前可用生物激光器的实用性和适用性。
在某些方面，本公开内容考虑了一种新的扫描显微镜装置，其中激光发射而不是常规荧光可用于成像。这样的扫描显微镜装置特别适用于组织样品内的扫描和检测。因此，这样的扫描显微镜装置能够产生全组织样品的二维扫描和图像。例如，在图1A中所示的一个变化形式中，扫描显微镜装置10可包含第一反射表面12和第二反射表面14。第一反射表面12可以是平面的。第二反射表面14可以是平面的或弓形的。如图1A中所示，第二反射表面14是平面的。在一些替代变化形式中，第二反射表面14可以是弓形的，例如凹的，如以下进一步描述的。第一和第二反射表面对于电磁辐射的选择波长或波长范围可具有高反射率，例如，大于约80％的反射率，任选地大于约90％的反射率，任选地大于约95％的反射率，任选地大于约97％的反射率，任选地大于约98％的反射率，任选地大于约99％的反射率，任选地大于约99.9％的反射率，任选地大于约99.99％的反射率，并且在某些变化形式中，对于波长或波长范围，任选地大于99.999％的反射率。此外，第一和第二反射表面可同时允许电磁辐射的不同波长或波长范围透射并经由那里通过。电磁辐射的选择波长或波长范围的透射率可大于80％的透射率，任选地大于90％的透射率，任选地大于95％的透射率，任选地大于97％的透射率，任选地大于98％的透射率，并且在某些变化形式中，对于不同的波长或波长范围，任选地大于99％的透射率。
扫描显微镜装置10还包含扫描腔20，其尺寸为接收固定的组织样品22。第一反射表面12与第二反射表面14之间的厚度(例如，腔间距)大于或等于约1微米至小于或等于约50微米。组织样品22可接触或设置在第一反射表面12上，而第二反射表面14可与组织样品22间隔开。因此，固定的组织样品22的第一下表面可设置在第一反射表面12上，并且固定的组织样品22的与第一下表面相对的第二表面与第二反射表面14的间隙小于或等于约20微米。在某些变化形式中，组织样品22可具有大于或等于约1微米(μm)至小于或等于约50μm，任选地大于或等于约5μm至小于或等于约μm的厚度。
在某些变化形式中，组织样品22包含至少一种荧光团或激光能量响应物质。例如，组织样品22可用至少一种激光能量响应物质或荧光团24(在本文中称为荧光团)染色或者天然地包含至少一种激光能量响应物质或荧光团24(在本文中称为荧光团)。荧光团24或其他激光能量响应物质可用作增益介质，其可对例如来自激光能量泵浦源的外部能量源作出反应。组织样品可以是包含细胞和细胞外基质的任何类型的组织，包括植物或动物组织，例如哺乳动物组织。组织样品可以是通过活检或其他医疗程序已收集的组织学样品。例如，组织样品可以是人癌组织的活体组织切片。扫描腔20的至少一部分对应于限定在第一反射表面12与第二反射表面14之间的法布里-珀罗谐振腔。
作为非限制性实例，理论法布里-珀罗标准具装置28在图2中示为法布里-珀罗组合体30。法布里-珀罗组合体30限定第一侧32和第二相对侧34。法布里-珀罗组合体30包含第一透射基板或层40和与透射层40相邻设置的第一反射表面42。第二反射表面46设置在与第一反射表面42相对的一侧。第一和第二反射表面可通过在基底(例如熔融石英)上施加介电材料作为涂层而形成。作为非限制性实例，介电材料可包含多个层并且可包括选自Ti2O5和/或SiO2的材料。第一反射表面42和第二反射表面46一起形成一对平行的反射表面，其夹着至少一种材料44，该材料可以是介电材料或高折射率材料。
电磁辐射或能量的源52被沿第一侧32引导至法布里-珀罗组合体30。法布里-珀罗组合体30能够将来自源52的电磁辐射的谱的一部分传输到组合体30中。因此，电磁辐射的一部分通过第一透射层40进入并通过第一反射层42进入介电材料层44。干涉滤光器内部的电磁能路径取决于该装置是否被设计为透射型腔、反射型腔或者透射和反射型腔。如图2的基于透射型法布里-珀罗的滤光器中所示，进入介电材料44的电磁能部分由于用作基于法布里-珀罗的标准具干涉滤光器的一对平行反射表面42、46之间的内反射而谐振。电磁能52的一部分在法布里-珀罗组合体30内谐振，并且可通过第二反射表面46和第二透射层48传输，产生离开法布里-珀罗组合体30的输出60。
因此，根据本公开内容的某些方面制备的扫描显微镜装置具有限定扫描腔区域中的法布里-珀罗谐振腔的第一反射表面和第二反射表面。更具体地，在第一反射表面与第二反射表面之间形成高Q法布里-珀罗微腔。这样的法布里-珀罗谐振腔可具有大于或等于约1×102的品质因数(Q)。在某些变化形式中，Q因数可大于或等于约1×103，任选地大于或等于约1×104，任选地大于或等于约1×105，任选地大于或等于约1×106，并且在某些变化形式中，任选地大于或等于约1×107。在某些方面，Q因数可大于或等于约任选地大于或等于约1×102至小于或等于约1×107。
重新参照图1A，根据本公开内容的某些方面制备的扫描显微镜装置10还包含激光能量或激光能量泵浦源25，其将能量引导至扫描腔20。激光泵浦是能量从外部源转移到激光的增益介质中的行为。能量可在产生原子的激发态的增益介质中被吸收。当能量从激发态下降至基态时，发射光。激光发射通常在增益介质的激光射阈之上发生。通过使用泵浦光源可光学地实现激光泵浦，所述泵浦光源发射对应于作为增益介质的组织样品22中存在的荧光团或其他激光能量响应物质的一个或多个吸收带的波长范围的激发光。可用的泵浦源25包括纳秒激光器、飞秒激光器、脉冲或连续波激光器、手电筒和可调光学参量振荡器(optical parametric oscillator)源，例如脉冲光学参量振荡器(OPO)。激光泵浦源可产生高度定向的相干电磁辐射或能量。或者，通过荧光共振能量转移、电注入电流、生物发光或化学发光可使泵浦成为可能。对于脉冲激光，脉冲速率的范围可从每秒单脉冲至数千脉冲。泵浦波长取决于荧光团或激光能量响应物质的吸收带。在某些变化形式中，荧光团或激光能量响应物质的激光射阈可以是约0.1至约1,000微焦耳每毫米平方(mJ/mm2)。因此，激光系统可包含三个元件，即泵浦源、增益介质和光学腔(例如，谐振器)。谐振腔可以是在第一反射表面12与第二反射表面14之间产生的上述法布里-珀罗谐振腔。包含至少一种荧光团或激光能量响应物质的组织样品22可用作增益介质，当能量被从激光泵25引导至那里时，该增益介质通常放大光。第二反射表面14或激光能量源25中的至少一个可相对于扫描腔20中的固定的组织样品22平移。
此外，在第一与第二反射表面之间限定法布里-珀罗谐振腔微腔的扫描腔的部分可使用等离子体效应来增强局部光-物质相互作用并且更有效地接收泵浦光。可选择激光腔的谐振波长或波长范围以与用作增益介质的荧光团或激光能量响应物质的一个或多个发射带重叠。
扫描显微镜装置还具有用于检测在扫描腔20内产生的发射27的检测器26，例如光检测器或/和光谱成像系统。光检测器可包含电荷耦合器件(charge coupled device，CCD)成像器、CMOS成像器、光电倍增管(photo-multiplier tube，PMT)、雪崩光电二极管(avalanche photodiode，APD)等。光谱成像系统可包含电荷耦合器件(CCD)成像器、光谱仪、其组合等。例如，这样的检测器可向计算机处理单元提供输出。
组织样品22可用至少一种激光能量响应物质染色或以其他方式包含至少一种激光能量响应物质，所述激光能量响应物质可以是至少一种荧光团。根据本公开内容的某些示例性实施方案，生物介质(例如组织样品)可用作增益介质。可用作增益介质并且响应于激光能量的一类生物介质的一个实例包括荧光团，如天然荧光化合物(例如，叶绿素和维生素)、荧光蛋白、荧光聚合物、由酶-底物反应产生的荧光产物、以及染料、量子点等。荧光蛋白可以是溶液的形式。特别地，作为非限制性实例，蛋白质可被添加至或天然存在于活生物体内(例如组织中的细胞内)，其可通过编码荧光蛋白的基因的表达或者包含荧光蛋白的颗粒的内化或内吞作用在细胞质、细胞核和/或细胞器中包含蛋白质。荧光蛋白也可以是固体形式，例如聚集体(例如，在溶液干燥后)或晶体。蛋白质晶体可具有低传输损耗的优点。在组织样品包含荧光团的情况下，荧光团用作激光增益介质。在外部激发时，通过激发来自荧光团或其他激光能量响应物质的激光发射，在泵浦光的焦点周围局部地实现组织激光。
在检测器26是光检测器的情况下，该光检测器可接收和检测由来自扫描腔的组织样品中的至少一种激光能量响应物质(例如，至少一种荧光团)产生的一个或更多个发射(例如，激光发射)。如上所述，第二反射表面14或激光能量泵浦源25中的至少一个可相对于包含在扫描腔20中的固定的组织样品22平移或移动。以这种方式，在组织样品22上平移之后，由扫描显微镜装置10产生组织样品的二维扫描。
因此，扫描显微镜装置10可用作波长复用亚细胞免疫激光器。组织样品22可以是任何类型的组织，例如夹在由第一反射表面12和第二反射表面14限定的高Q法布里-珀罗(FP)腔内的人癌组织(活体组织切片)。在来自激光能量泵浦源25的外部激发下实现来自荧光团或激光能量响应物质的发射。固定的组织样品可以是用一种或更多种激光能量响应物质(例如，一种或更多种荧光团)染色的组织学组织样品，该激光能量响应物质能够与组织的细胞内的至少一种生物标志物相关。激光能量响应物质(例如荧光团)可以是位置特异性的，这意味着它优选地与组织中的某些位置/定位(例如核酸，细胞膜等)结合。激光能量响应物质(例如荧光团)也可与抗体和DNA连接，以优选地与组织内的抗原和DNA结合。
在某些变化形式中，固定的组织样品22包含与至少两种不同的生物标志物相关的至少两种不同的激光能量响应物质(例如，至少两种不同的荧光团)。图1A的插图示出了使用响应于激光能量的两种不同物质的细节。第一探针物质62是抗体-缀合的荧光团染料(因此并入荧光团24和抗体64)，其与可与细胞70的核68一起存在的抗原66结合。第二探针物质72是核酸染色染料，其能够与核68上的双链DNA分子74结合。以这种方式，第一探针物质62和第二探针物质72伴随地通过组织学组织样品22实现多重激光发射。只有当探针物质(62或72)与组织内的核68或靶核生物标志物(64、74)结合时才实现激光发射。因此，光检测器26能够接收和检测来自与相应生物标志物相关或结合的每个不同荧光团或激光能量响应物质(例如，第一探针物质62或第二探针物质71的多重发射。
图1B示出了来自单个核的传统荧光发射(在顶部显示)和“星状”选择激光发射(底部)之间的比较。在图1B中，细胞100包含细胞核102。在上图和下图二者中，激发光束104被引导至细胞100。在上图中，产生荧光发射106，其通常对应于整个核102。在下图中，在核102的局部区域内产生激光发射108。更特别地，图3A和3B示出了用于比较目的的示意图。图3A示出了传统的荧光发射过程，其中能量80引导至细胞82并发生自发发射。应当注意，细胞82仅代表多种生物标志物，其可以是体外、细胞内部、细胞表面上和/或组织样品中的细胞/组织中的分子。能量80可引起细胞82内的荧光团84的激发。当荧光团84通过暴露于能量80而被激发时，它们产生荧光发射86。
图3B示出了根据本公开内容的某些方面产生的激光发射的举例说明，其中光学微腔和增益介质在相同的环境中组合。为了激发，将能量90引导至可见于组织样品中的细胞92。通过暴露于能量90来激发细胞92内的荧光团94。荧光团产生受激激光发射96，其具有由一对反射介电组合体98限定的谐振腔内的预定波长范围。因此，代替图3A中的广义荧光(即，自发发射)，图3B中的光学激光器采用激光发射(即，受激发射)作为传感信号。因此，具有预定波长或波长范围的相干电磁能的激光发射99因此离开谐振腔。
由于由激光腔提供的光学反馈，由潜在的生物相互作用/过程的小变化引起的增益介质的小改变导致激光输出特性的显著变化。例如，图3B中的光学激光器类型中的增益介质在体外(例如，细胞/组织外)的生物分析中比相应的基于荧光的方法灵敏20至100倍。
图4A至4G示出了扫描显微镜装置110的另一个实施方案和组织样品，以及用这样的显微装置扫描/检测的结果。提供均为平面的第一反射表面120和第二反射表面122。扫描腔130尺寸设置为接收具有至少一种激光能量响应物质(例如，至少一种荧光团)的固定的组织样品132。组织的厚度(例如，腔间距)表示为d。如上所述，第一反射表面120与第二反射表面122之间的厚度d大于或等于约1微米至小于或等于约60微米，任选地大于或等于约1微米且小于或等于约50微米。组织样品132可接触或设置在第一反射表面120上，而第二反射表面122可与组织样品132间隔开。因此，固定的组织样品132的第一下表面133可设置在第一反射表面120上，并且固定的组织样品132的与第一下表面133相对的第二表面135与第二反射表面122的间隙小于或等于约20微米。
扫描腔130的至少一部分对应于限定在第一反射表面120与第二反射表面122之间的高Q法布里-珀罗谐振腔，其具有大于或等于约1×102或以上所讨论的那些中的任何一个的品质因数(Q)。可平移单元140包含激光泵浦源并提供光检测器。可平移单元140中的激光泵浦源配置成将能量引导至扫描腔130。在一个变化形式中，组织样品132可由脉冲光学参量振荡器(OPO)激发。光检测器与扫描显微镜装置110一起使用，并且配置成接收和检测由来自扫描腔130的组织样品132中的至少一种激光能量响应物质(例如，至少一种荧光团)产生的一个或更多个发射。在扫描显微镜装置110中，可平移单元140中的激光泵浦源相对于扫描腔130中的固定的组织样品132移动/平移，以产生组织样品的二维扫描。
图4B示出了来自实验的数据，其中具有荧光团的组织样品被脉冲光学参量振荡器(OPO)激发(脉冲宽度＝5ns；波长＝465nm)。水中的FITC(蓝色曲线)和乙醇中的BODIPY(红色曲线)的归一化荧光发射光谱。图4C至4E示出了所研究的不同类型的组织，包括肌肉组织(图4C)、脂肪组织(图4D)和混合组织(图4E)。图4F示出了用FITC染色的肌细胞的显微图像(从左到右)：微分干涉对比(DIC)图像、共聚焦显微术图像和重叠图像。图4G示出了用BODIPY染色的脂肪细胞的显微图像(从左到右)：DIC图像、共聚焦显微术图像和重叠图像。比例尺，20μm。
图5A至5C示出了根据本公开内容某些方面的显微镜装置的扫描腔中不同法布里-珀罗谐振腔的实例，该谐振腔可限定在第一反射表面与第二反射表面之间。在一个变化形式中，法布里-珀罗腔可通过使用用作第一和第二反射表面的两个定制的电介质反射镜而形成。顶镜(由Qingdao NovelBeam Technology Co.Ltd，China制造)在500nm至555nm的光谱范围内具有高反射率，以提供光反馈和465nm左右的高透射率，以使泵浦光通过，而底镜(由Evaporated Coating Inc.，USA制造)具有稍宽的反射带，如图5B中所示。大多数顶镜是平的或平面的，从而形成具有平底镜的平-平(plano-plano，p-p)法布里-珀罗腔。顶镜也可具有弓形结构，更具体地，在其中形成的凹结构，其可通过计算机控制的CO2激光烧蚀(在施加电介质涂层之前)制成，从而形成平凹(plano-concave，p-c)法布里-珀罗腔，与p-p法布里-珀罗腔相比，其具有更好的腔稳定性和更高的Q因数。在一个实例中，在腔长度为30μm(在不存在任何组织的情况下)时，p-p和p-c法布里-珀罗腔的Q因数分别为约1×104和1×105。
在图5C中，示出了泵，其中示出了p-c法布里-珀罗腔，其中激光泵浦源通过平面的第一反射表面将能量引导到扫描腔中，穿过凹区域中的第二反射表面，以便产生激光发射。
图6示出了激光发射扫描显微镜装置200的另一种变化形式，以及用这样的显微装置200扫描/检测得到的结果。激光能量泵浦源202将能量/电磁辐射引导至扫描腔210。如同所示，扫描腔210包含第一反射表面212。可移动/可平移单元220以光纤222的形式提供。可平移单元220包含形成在光纤222末端上的凹电介质反射镜形式的扫描镜224(如插图1中所示)。例如，可通过使用CO2激光烧蚀在纤维小面的中心上产生微孔，并随后将其用多层电介质反射镜覆盖来制造凹镜。可平移单元220设计成选择性地在扫描腔210的不同区域上移动。可平移单元220还包含光检测器226。因此，凹扫描镜224限定第二反射表面。在某些方面，限定镜的凹结构的曲率半径可大于或等于约5微米至小于或等于约500微米，任选地大于或等于约50微米至小于或等于约100微米。在这样的变化形式中，腔内激光束腰仅约1微米。扫描镜224的直径可大于或等于约10微米至小于或等于约100微米。
可平移单元220包含扫描镜224，其可期望地相对于扫描腔210中的固定的组织样品230平移。固定的组织样品230可包含放置在平的或平面的第一反射表面212上扫描腔210内的细胞和/或组织。当可移动单元220上的扫描镜224移动到扫描腔中的组织样品230上方的不同位置时，它在选择区域中限定法布里-珀罗谐振腔(其中第一反射表面和第二反射表面将组织样品夹在中间)。因此，形成具有高品质因数的平凹法布里-珀罗谐振腔。例如，激光发射扫描显微镜装置200可具有大于或等于约1×104并且任选地大于或等于约1×105的品质因数(Q)。
当来自激光能量泵浦源202的激光能量被泵浦到对应于法布里-珀罗腔的区域中的组织样品230中(参见插图2)时，增益介质被激活并产生激光能量232。增益介质可包含一种或更多种激光能量响应物质(例如，一种或更多种荧光团)，其能够与受激光能量激发的组织细胞内的至少一种生物标志物相关。如上所述，增益介质可以是天然荧光材料、由细胞合成的荧光蛋白或外部添加/标记的染料。由细胞内(或细胞表面上)的生物活性诱导的增益介质的变化(参见用于举例说明的插图2，其示出了如何在发生结合处的生物相互作用下改变增益)引起激光输出特性(例如强度、激光射阈和横模分布等)的显著变化，这种变化可由光检测器226或/和光谱成像系统234检测以提取高光谱信息。固定的组织样品230可任选地包含至少两种不同的激光能量响应物质(例如，至少两种不同的荧光团)，并且检测器(例如，光检测器226和/或光谱成像系统234)能够接收和检测来自每种不同的荧光团/激光能量响应物质的多重发射。示例性和非限制性光谱成像系统234包含光谱仪236和CCD成像器单元238以及用于引导激光能量束的多种透镜/分光器(splitter)238。插图3示出了通过包含成像器和光谱仪的光谱成像单元获得的高光谱信息。因此，固定的组织样品230内的细胞可基于样品内发射的位置和强度用关于发射的信息进行映射。
在该设计中，包含荧光材料(例如染料、荧光蛋白和量子点)或用其标记或掺杂的样品夹在两个反射镜之间，并如此用作增益介质。外部泵浦用于在固定的组织样品的小区域中激发能量响应材料。由镜提供的光学反馈可产生激光发射。来自激发下区域的激光信号可由光谱仪检测到强度和模式分布信息二者。为了构建成像，样品可四处移动，但是在某些方面，外部泵浦或者一个或两个镜可穿过整个固定的样品被扫描。可将具有不同发射光谱的多种荧光材料添加至同一样品用于多重检测。镜反射带可以一次针对一个特定的发射光谱进行定制，在这种情况下，将出现来自仅一种荧光材料的激光发射，或者一次针对多个发射光谱，在这种情况下，同时出现来自多种荧光材料的激光发射。激光模式可用于分析样品的详细结构。
图19示出了用于扫描/检测组织样品的激光发射扫描显微镜装置250的另一个实施方案。激光能量泵浦源252将能量/电磁辐射引导至扫描腔254。扫描腔254设置在扫描台256上，扫描台256可由与其可操作地连接的计算机处理单元258控制(例如，平移或移动)。如同所示，扫描腔254包含扫描腔254底部的第一反射表面260和顶部的第二反射表面262。如同所示，第一反射表面260和第二反射表面262都是平面的。固定的组织样品264设置在扫描腔254内第一反射表面260与第二反射表面262之间。固定的组织样品264可包含放置在扫描腔254内的细胞和/或组织。第一反射表面260和第二反射表面262限定法布里-珀罗谐振腔，因为它们将组织样品264夹在中间。
扫描台256可以是固定的或任选地移动扫描腔254并因此使扫描腔相对于激光能量泵浦源252平移。或者，激光能量泵浦源252可相对于扫描腔254平移。与另一些变化形式一样，激光发射扫描显微镜装置250可具有大于或等于约1×104的品质因数(Q)。来自激光能量泵浦源252的激光能量270被泵浦到对应于法布里-珀罗腔的区域中的组织样品264中，增益介质被激活并产生激光能量272。与先前的实施方案一样，增益介质可包含能够与受激光能量激发的组织细胞内的至少一种生物标志物相关的一种或更多种激光能量响应物质(例如，一种或更多种荧光团)中的任何一种。如上所述，由细胞内(或细胞表面上)的生物活性诱导的增益介质的变化引起激光输出特性(例如强度、激光射阈和横模分布等)的显著变化，这种变化可由光检测器274(例如，电荷耦合器件(CCD))或/和光谱成像系统276检测以提取高光谱信息。固定的组织样品264可任选地包含至少两种不同的激光能量响应物质(例如，至少两种不同的荧光团)，并且检测器(例如，光检测器274和/或光谱成像系统276)能够接收和检测来自每种不同的荧光团/激光能量响应物质的多重发射。示例性和非限制性光谱成像系统包含光谱仪278和CCD成像器单元274，用于引导激光能量270和/或产生的激光能量272束的多个分束器280和/或一个或更多个透镜282。激光能量270可通过物镜284经由254中的顶镜聚焦到组织样品。与先前的一些变化形式一样，固定的组织样品264内的细胞可基于样品内发射的位置和强度用关于发射的信息进行映射。在一个变化形式中，焦束尺寸(光谱的空间采样区域)的直径可以为约30μm。右侧的放大图示出了当由465nm激发源泵浦时夹在两个镜之间的肺组织切片的图片。测量了在激光发射波长附近(535nm至555nm)第一反射表面260和第二反射表面262的反射率为99.98％(对于第一反射表面260(底镜))和99.80％(对于第二反射表面262(顶镜))。
因此，本公开内容考虑了通过使用以上或本文中所述的任何激光发射显微镜检测来自组织样品中的一种或更多种激光能量响应物质(例如，一种或更多种荧光团)的发射的方法。在一个变化形式中，该方法包括将来自激光泵浦源的能量引导至设置在扫描腔内的固定的组织样品，所述扫描腔的至少一部分限定法布里-珀罗谐振腔。形成在第一反射表面与第二反射表面之间的法布里-珀罗谐振腔具有大于或等于约1×102的品质因数(Q)。组织样品包含一种或更多种激光能量响应物质(例如，一种或更多种荧光团)或用其染色。第二反射表面或激光泵浦源中的至少一个可相对于设置在扫描腔内的固定的组织样品平移。检测由组织样品中的一种或更多种激光能量响应物质产生的一个或更多个受激激光发射，以产生组织样品的二维扫描。
在某些方面，从激光泵浦源引导能量包括在设置在扫描腔内的组织样品上平移激光能量源以产生二维扫描。在另一些方面，第二反射表面是形成在纤维末端上的扫描镜，其相对于设置在扫描腔内的组织样品平移以产生二维扫描。第二反射表面可限定凹结构。
在一个变化形式中，第一反射表面和第二反射表面具有宽反射带(意味着镜在宽的波长范围内具有高反射率)。利用这样的变化，可实现波长复用的成像和/或检测。当扫描显微镜穿过整个组织(包括其中包含的细胞)扫描时，法布里-珀罗腔可在整个组织样品上的任何地方形成。因为反射表面是宽带的并且来自激光能量响应物质的激光发射在光谱上非常窄，所以来自激光能量响应物质的激光发射是可以实现的，并且可在光谱上很好地分辨，即使那些激光发射可能来自相同的位置或彼此非常接近的位置(意指无法在空间上分辨的位置)。
在另一个变化形式中，通过使用具有窄但可调的反射带(意味着高反射带可从一个波长范围调谐至另一个波长范围)的反射表面来提供实现多重检测的另一种方法。在这样的变化形式中，第一反射表面和第二反射表面具有可调反射带。所述一种或更多种激光能量响应物质包含具有第一激光射阈能量的第一激光能量响应物质和具有不同的第二激光射阈能量的不同的第二激光能量响应物质。在该方法中，首先将窄带、可调镜设置为对第一激光能量响应物质的发射(但不对第二激光能量响应物质的发射具有高反射率)具有高反射率，从而形成对于第一激光能量响应物质而不是第二激光能量响应物质的法布里-珀罗腔。法布里-珀罗腔促进来自第一激光能量响应物质的激光发射，其可通过至少一个反射表面传输，因为其中来自第二激光能量响应物质的发射不被反射或透射。因此，可记录和成像来自第一激光能量响应物质的激光发射。然后将可调反射表面调谐至另一波长范围，以对第二激光能量响应物质的发射具有高反射，从而形成对于第二激光能量响应物质而不是对于第一激光能量响应物质的法布里-珀罗腔。对于第二激光能量响应物质的激光发射是可以实现的，并且可记录和成像。两个图像可叠加在彼此之上以实现多重检测。
因此，这样的方法还可包括首先调谐第一反射表面和第二反射表面以具有第一反射带，所述第一反射带允许来自第一激光能量响应物质的激光发射经由那里传输，以使得在引导能量之后，所述检测是对由第一激光能量响应物质产生的一个或更多个发射的检测。所述方法还可包括调谐第一反射表面和第二反射表面以具有第二反射带，所述第二反射带允许来自第二激光能量响应物质的激光发射经由那里传输，其中然后进行能量的引导，以使得所述检测是对由第二激光能量响应物质产生的一个或更多个发射的检测。
在一个方面，所述一种或更多种激光能量响应物质包含具有第一激光射阈能量的第一激光能量响应物质。引导至固定的组织样品的能量的量(例如，能量强度水平)可随时间提高，以使得检测映射固定的组织样品中第一激光能量响应物质的浓度分布。激光能量响应物质(例如，荧光团)的激光射阈取决于激光能量响应物质所在的局部环境(例如，荧光团浓度可基于生物标志物浓度而变化)。激光泵浦能量可从低到高扫描，因此具有最高激光能量响应物质浓度的位置将首先发出激光。随着泵浦能量的提高，具有第二高激光能量响应物质浓度的另外的位置将发出激光，依此类推。因此，可在组织样品内映射激光能量响应物质(并因此生物标志物)浓度分布。
在另一些方面，组织样品可包含至少两种不同的激光能量响应物质(例如，至少两种不同的荧光团)或用其染色，并且检测包括检测由至少两种不同激光能量响应物质产生的至少两种不同的受激激光发射，以产生组织样品的多重二维扫描。
在另一些特定方面，所述一种或更多种激光能量响应物质(例如，一种或更多种荧光团)包含第一激光能量响应物质(例如，第一荧光团)和不同的第二激光能量响应物质(例如，第二荧光团)，并且引导至固定的组织样品的能量小于第一激光能量响应物质的第一激光射阈能量，但大于第二激光能量响应物质的第二激光射阈能量，以使得一个或更多个受激激光发射的检测仅检测来自组织样品中的第二激光能量响应物质的激光发射。
在另一些方面，所述一种或更多种激光能量响应物质包含具有第一激光射阈能量的第一激光能量响应物质(例如，第一荧光团)和具有不同的第二激光射阈能量的不同的第二激光能量响应物质(例如，第二荧光团)。来自激光泵浦源的能量的引导可包括提高能级以首先激发第一激光能量响应物质并随后激发第二激光能量响应物质。以这种方式，随着引导至组织样品的能量水平提高，一个或更多个发射的检测检测来自第一激光能量响应物质和随后的第二激光能量响应物质的发射，其可映射固定的组织样品内第一激光能量响应物质和第二能量响应物质的分布(位置/定位)。
在另一些方面，本公开内容还考虑了用于对组织学组织样品中的一种或更多种生物标志物进行量化的方法。该方法可包括将来自激光泵浦源的能量引导至设置在扫描腔内的固定的组织学组织样品。扫描腔的至少一部分限定形成在第一反射表面与第二反射表面之间的法布里-珀罗谐振腔，其具有大于或等于约1×102的品质因数(Q)。组织学组织样品包含能够与至少一种生物标志物相关的一种或更多种激光能量响应物质(例如，一种或更多种荧光团)。此外，第二反射表面或激光能量源的源(例如，相干电磁辐射的源)中的至少一个相对于设置在扫描腔内的固定的组织样品平移。一个或更多个受激发射(例如，激光发射)由组织学组织样品中的一种或更多种激光能量响应物质产生并因此被检测，以便对组织学组织样品中存在的至少一种生物标志物的数量进行量化。
因此，在不同方面，本公开内容提供了在组织样品中计数和映射具有不同生物标志物水平的细胞的方法。
在另一些变化形式中，一个或更多个发射的检测涉及生物标志物在组织样品的不同区域中的浓度分布。改变引导至组织样品的能量的激发强度以测量组织样品的不同区域中的生物标志物的浓度。具有较高浓度生物标志物的组织内的位置(或位置)(因此激光能量响应物质/荧光团的较高浓度)将首先发出激光并且可记录它们的定位或位置。随着能量激发强度的提高，更多的位置开始产生激光发射，这可被再次记录。使用该方法，可在组织样品上映射生物标志物浓度分布。
在某些方面，所述一种或更多种激光能量响应物质包含第一激光能量响应物质(例如，第一荧光团)和不同的第二激光能量响应物质(例如，第二荧光团)，并且引导至固定的组织样品的能量小于第一激光能量响应物质的第一激光射阈能量并且大于第二激光能量响应物质的第二激光射阈能量，以使得一个或更多个发射的检测仅检测来自组织样品中的第二激光能量响应物质的激光发射。
在另一些方面，当生物标志物与固定的组织样品内的细胞的核相关时，由一种或更多种激光能量响应物质(例如，一种或更多种荧光团)产生的一个或更多个发射的检测对应于由细胞的核产生的发射，以便计数和量化组织样品中细胞的核的数量。在另一些方面，一个或更多个发射的检测涉及组织样品的不同区域中生物标志物的浓度。改变引导至组织样品的能量的激发强度以测量组织样品的不同区域中生物标志物的浓度。由所述一种或更多种激光能量响应物质(例如，一种或更多种荧光团)产生的一个或更多个发射具有多于约700nm(0.7微米)的空间分辨率。在某些方面，激光发射装置提供亚细胞和/或亚微米的分辨率，例如，小于或等于约700nm的空间分辨率。与使用荧光的常规显微镜相比，这种使用激光发射的显微镜的优点包括高信背比和窄发射带，以使得多个荧光材料可在同一样品上使用而没有串扰。因此，本技术提供高对比度、高分辨率成像技术。
基于具有激光射阈并且激光模式具有一定的空间分布的激光发射的独特特征，可用不同的生物标志物(例如，核酸)浓度对不同的组织/细胞进行分类。例如，本公开内容考虑了通过激光射阈将癌细胞(例如，癌组织)与正常细胞(例如，正常组织)区分开的方法，如图18A至18C中所示。图18A至18D示出了肿瘤组织和正常组织样品的比较激光射阈，其中通过使用由本公开内容的多个方面提供的激光发射扫描技术可容易地将两种类型的组织彼此区分开。图18D显示，虽然在正常细胞核(300)和癌细胞核(310)二者中都检测到荧光发射，但是当泵浦能量密度设定在Pc(癌细胞激光射阈)和Pn(正常细胞激光射阈)之间时，仅在癌细胞核330中检测到仅激光发射，而在正常细胞核320中检测不到。
本公开内容还提供了基于不同类型组织的激光模式分布将其彼此区分开的能力。例如，图7C、8C和9C示出了肌肉组织与脂肪组织的不同激光模式分布，提供了使用根据本公开内容的多个方面制备的装置来辨别不同组织类型的能力。
作为关于本技术的多个方面的进一步细节，如下进行并探索多个实验。使用相同的泵浦波长以约10μJ/mm2的激光射阈实现来自用异硫氰酸荧光素(FITC)染色的肌肉组织、用硼二吡咯亚甲基(BODIPY)染色的脂肪组织，以及用FITC和BODIPY双重染色的混合肌肉/脂肪组织的不同激光发射。进一步系统地研究了对于多种组织结构/几何形状、组织厚度和染色染料浓度的组织激光的激光特征。最后，还实现了来自特异性靶向肌肉组织中的F-肌动蛋白的FITC缀合物(FITC-鬼笔环肽)的激光发射。
与使用常规荧光的装置相比，根据本公开内容的某些方面包含具有品质因数(Q)的法布里-珀罗谐振腔的激光发射扫描显微镜装置显示出改进的检测。尽管两个荧光团之间存在大的荧光光谱重叠(约100nm)，但是来自肌肉和脂肪组织的FITC和BODIPY激光带可通过其良好分离的激光带和不同的激光射阈被清楚地区分开，从而实现高度多重的光谱检测。另外，与荧光相比，激光发射在SBR方面具有两个数量级的改进，显著增强了成像对比度。用于扫描组织的激光发射扫描显微镜可容易且广泛地适用于几乎任何类型的组织/疾病，并且胜过先前的随机组织激光器和WGM脂滴激光器，具有低激光射阈、高的样品至样品和位置至位置可重复性、高SBR、高空间分辨率(高达数微米，受腔内激光束尺寸限制)、多重检测能力，以及靶向组织中特定生物标志物的能力。这样的激光发射扫描显微镜可用于医学诊断和组织筛查方面的广泛应用，以及组织工程中生物转化的鉴定和监测。
在某些方面，本公开内容考虑了从组织样品内的细胞同时采集明视场成像和激光发射图像。可通过第一反射表面(或顶镜)直接获得明视场图像。由于第一反射表面对于某个选择的波长带(例如，510nm至550nm)具有高反射率，因此该波长带将不会出现或呈现在明视场中。然而，其他波长带(例如，小于约510nm或大于约550nm)仍然可透过第一反射表面顶镜传输并形成明视场图像。以这种方式，明视场图像也可与激光发射图像同时收集并且彼此叠加。
此外，组织样品的荧光图像可通过移除第一反射表面/顶镜或通过稍微降低第一反射表面的反射率来获得。例如，第一反射表面/镜反射率可从99.9％降低至95％，以使得约5％的荧光可透过顶镜传输以形成荧光图像。因此，在某些变化形式中，第一反射表面对由组织样品中的一种或更多种激光能量响应物质产生的一个或更多个激光发射的反射率可大于或等于约80％至小于或等于约99.999％，并且在某些变化形式中，任选地大于或等于约95％至小于或等于约99.5％。本公开内容的激光发射显微镜可用于产生合成图像，其中可获得激光发射图像与荧光图像的叠加。
在图20A至20D中，示出了根据本公开内容的某些方面的可用于形成复合叠加图像的多个图像。图20A是荧光显微图像，图20B是明视场CCD图像，并且图20C是同一组织的激光发射CCD图像。对于图20B至20C，仅在虚线方形区域内泵浦激光。图20A和20C中的左下侧方形示出了相应图像中的虚线方形的放大图像。为了详细比较，图20D和20E分别示出了沿图20A和20C中的图像中的线的强度分布。图20F和20G提供了另一个实例，以显示组织样品中的激光发射星。图20F示出了纯激光发射成像，而图20G示出了激光发射和明视场成像的同时采集。注意，由于具有以530nm为中心的高反射率的第一反射表面/镜阻挡了绿色的事实，明视场图像显示出红色。因此，利用本公开内容的激光发射显微镜可获得叠加的合成图像，其包含激光发射图像、荧光图像和/或明视场图像中的一个或更多个。
在图21中，扫描激光发射显微镜装置350具有激光能量泵浦源352，其将能量/电磁辐射引导至扫描腔354。扫描腔包含第一反射表面360和第二反射表面362。类似于以上先前所述的多种实施方案，固定的组织样品364设置在第一反射表面360与第二反射表面362之间。在该设计中，第一反射表面360具有替代设计，其中它可以是可移除组件。上面的第一反射表面360可以是可移除的。在某些变化形式中，该上面的第一反射表面360(例如，镜)可多次重复使用。如上所述，还可通过移除第一反射表面360并随后拍摄组织样品的图像来拍摄荧光图像。在某些变化形式中，折射率匹配材料366(例如油或凝胶)可包含在组织样品364周围，包括在第一反射表面360与组织样品362之间或在组织样品364的侧面上。
另外，第一反射表面360还可具有一个或更多个间隔区370以优化扫描激光发射显微镜装置350。所述一个或更多个间隔区370可具有固定的预先设计的高度以确保每次进行测量时扫描腔354的长度(其由间隔区370的高度确定)保持相同。一个实例是由SU-8聚合物制成的间隔区370，其通过在第一反射表面360上旋涂和固化SU-8并使用光刻法获得具有期望几何形状的间隔区370。在一个变化形式中，间隔区370的高度为约12μm，其中组织厚度为5μm或10μm。如上所述，组织样品364的厚度范围可为大于或等于约1μm至小于或等于约50μm，或者任选地大于或等于约1微米(μm)至小于或等于约50微米(μm)，因此，间隔区370的高度可以比组织样品厚度大大约1μm至大约10μm，例如，比组织样品厚度大大约1μm至5μm。例如，间隔区370的高度可为大于或等于约2μm至小于或等于约60μm。应注意，间隔区可附接至第一反射表面360或第二反射表面362。
在另一些特定方面，本公开内容考虑使用多种组织样品，举例来说，包括已经冷冻(例如，低温保存)或用FFPE(经福尔马林固定石蜡包埋)固定的那些。图22A至22D显示，用本教导提供的激光发射显微镜，可利用癌细胞与正常细胞的激光射阈的差异来确定癌细胞的活性，即使在低温处理和/或FFPE保存之后。图22A至22B示出了冷冻组织中癌细胞/正常细胞激光射阈的统计，而图22C至22D示出了FFPE组织。图22A示出了来自标记为N1至N6的六名患者的正常肺组织的正常细胞(其已被低温冷冻)激光射阈的统计。图22B示出了来自标记为T1至T6的六个个体肺癌患者的肿瘤细胞(其已被低温冷冻)激光射阈的统计。图22C示出了来自通过FFPE处理的标记为N1至N4的四名患者的正常肺组织的正常细胞激光射阈的统计。图22D示出了来自通过FFPE处理的标记为T1至T6的六个个体肺癌患者的肿瘤细胞激光射阈的统计。对于每名患者，随机选择至少20个细胞并对其进行测量。可以看出，图22A和22C中来自癌细胞的激光发射显示出激光射阈与图22B和22D中来自正常细胞的显著差异，即使在低温或FFPE保存之后。
在另一些特定方面，本教导提供了从组织样品内的多个不同靶标(例如，从核和标记有增益介质的抗体)产生激光发射的方法。在某些方面，该方法将来自激光泵浦源的能量引导至设置在扫描腔内的固定的组织样品，其中所述扫描腔的至少一部分限定形成在第一反射表面与第二反射表面之间的法布里-珀罗谐振腔，其具有大于或等于约1×102的品质因数(Q)。组织样品包含一种或更多种激光能量响应物质，其包含第一激光能量响应物质和不同的第二激光能量响应物质。第一能量响应物质可在细胞的核中，并且第二能量响应物质可与靶向细胞的内部、细胞的膜上或组织样品的细胞外基质中的抗原的抗体相关。此外，第二反射表面或激光泵浦源中的至少一个相对于设置在扫描腔内的固定的组织样品平移。该方法包括检测由组织样品中的一种或更多种激光能量响应物质产生的一个或更多个激光发射，以产生组织样品的二维扫描。
例如，示例性方法可从靶向核酸的增益介质(例如染料)和从抗体上标记的增益介质(例如染料，量子点等)产生激光发射，所述抗体靶向细胞的内部、细胞的膜上和/或细胞外基质内的特定抗原。在一个非限制性实例中，拾取选定的组织切片并将其置于聚-L-赖氨酸涂覆的电介质反射镜/反射表面的顶部，首先将其清洁并用赖氨酸清洗以获得更好的组织黏附。然后用PBS清洗组织并风干，然后染色/标记。最后，用顶部电介质反射镜/反射表面覆盖组织。对于核酸标记，然后将制备的染料溶液(YO-PRO-1)施加至组织切片，持续10分钟，并在测量前用PBS溶液清洗三次。对于肺组织的抗体-荧光团标记，将组织与200μl稀释的一抗在4℃下孵育过夜。用1∶50溶液制备一抗，终浓度为0.01mg/ml。与一抗孵育后，用PBS彻底清洗组织，然后是FITC缀合的二抗(室温下2小时)。在激光实验之前，用PBS再次清洗组织。最后，使用折射率匹配凝胶来密封组织与顶镜/反射表面。
在另一些方面，本教导提供了多重检测的方法。由于激光发射光谱的超窄线宽，根据本公开内容某些方面的基于激光发射的显微术能够在窄波长带内容纳另外的荧光团，尽管来自那些荧光团的荧光光谱具有强光谱重叠并且很难将它们与荧光光谱区分开来。例如，如图23中所示，在500nm至550nm范围内可清楚地将至少四种独特的激光发射波长区分开，其中使用全部都是绿色的四种染料(SYTOX-Blue、EGFR-FITC、YOPRO和BOBO-1)。因此，虽然荧光发射彼此重叠并因此不能被区分开，但是在此来自这些相同染料的激光发射是清楚的，所以可容易地将不同的峰彼此区分开。
在另一些方面，本公开内容提供了用于区分正常组织与癌组织的算法。例如，可斜升激发强度以建立来自激光发射的激光发射星的直方图。为了确定由本公开内容的某些方面提供的激光发射显微术(LEM)技术的灵敏度和特异性，随机选择八名癌症患者并对其正常组织和癌组织二者进行LEM。通过使用相同的实验条件和量化方法，对于每个患者的癌组织和正常组织二者扫描了五个组织切片(帧)(总共80帧)。在图24A至24D中绘制了正常组织和癌组织的每帧激光发射细胞数的直方图。基于图24A(正常细胞)或图24C(肿瘤细胞)中的每帧激光发射细胞数，在图24B中生成接受者操作特征(ROC)曲线，其曲线下面积为0.998。在某些方面，鉴定癌组织的最佳阈值是“每帧5个激光发射细胞”，其对应于97.5％的灵敏度。实际上，可以调节阈值以获得更高的灵敏度或更高的特异性。表征这些细胞的另一种方式是使激发强度斜升以建立激光发射星或细胞的直方图。例如，图24D示出了在不同激发强度下组织中激光发射细胞的直方图。该直方图可用于更好地理解和表征组织。
在另一些方面，本教导提供了对癌组织进行分亚型的方法。例如，由本公开内容的某些方面提供的激光发射显微术可向亚型癌组织提供另外的信息。例如，发现癌组织的分化越高，激光射阈就越高。由于核活动的程度不同，激光发射显微术可区分癌组织的分化阶段或亚型。
在另一些方面，本教导提供了用于从组织样品中检测早期癌症的方法。使用以上确定的阈值，由本公开内容的某些方面提供的激光发射显微术的重要应用可包括检查早期癌组织。例如，早期肺癌组织被认为是临床组织病理学中最关键但具有挑战性的任务。早期癌症，通常意指该癌症发生在I期癌症之前。在该实施例中，分析了来自被诊断为早期肺癌(进展中的肺癌)的三名患者的三个样品。通过使用LEM技术，可在组织内以高对比度明确地鉴定癌细胞。对于每个患者，在30μJ/mm2的固定泵浦能量密度下用LEM扫描5个切片，如图25A至25F中所示。可以看出，LEM扫描显示出早期癌症检测，其中来自患者组织的每个截面图像中出现激光发射星。
在另一个方面，还可使用根据本公开内容的多个方面的扫描激光发射显微镜(LEM)装置400来分析组织微阵列，如图26中所示。LEM装置400具有激光能量泵浦源410，其将能量/电磁辐射引导至扫描腔412。扫描腔412包含第一反射表面420和第二反射表面422。组织样品以包含多个不同的薄组织样品432的组织样品微阵列430的形式提供在第一反射表面420与第二反射表面422之间。组织样品微阵列可包含来自不同来源(例如，患者)的许多小的代表性组织样品432，每个样品的尺寸范围为直径大于或等于约0.6mm至小于或等于约3mm。小组织样品可以以任意阵列形式(例如，5乘5，6乘8等)排列，以使得组织微阵列的总面积范围为大于或等于约5mm乘5mm至小于或等于约25mm×25mm。组织样品微阵列430的薄切片可包含来自不同来源(例如，患者)的许多小的代表性组织样品432，其可封固在第二反射表面422的表面434上并经受激光发射成像。切片的厚度范围可为大于或等于约1μm至小于或等于50μm。因此考虑了在相同条件下同时对多个样品432进行高通量分析。
在某些方面，根据本教导的多个方面的扫描激光发射显微镜装置可产生由组织样品中的一种或更多种激光能量响应物质产生的一个或更多个激光发射，以提供作为非限制性实例的以下中的至少一种：癌组织亚型的鉴定、癌症的早期检测、癌症阶段的鉴定或激光发射的直方图。
为了进一步举例说明激光发射扫描显微镜的操作概念，参照图4A中的装置。
实施例A
首先，如图5A中所示并且如上所述，法布里-珀罗(FP)谐振腔由两个定制的电介质反射镜形成。因此，FP腔由两个电介质反射镜形成。简单地说，顶镜(由Qingdao NovelBeamTechnology Co.Ltd，China制造)在500nm至555nm的光谱范围内具有高反射率，以提供光反馈和465nm左右的高透射率，以使泵浦光通过，而底镜(由Evaporated Coating Inc.，USA制造)具有稍宽的反射带。大多数顶镜是平的，从而形成具有平底镜的平-平(p-p)FP腔。顶镜还具有凹结构阵列，其通过计算机控制的CO2激光烧蚀(在电介质涂层之前)制成，从而形成平凹(p-c)FP腔，其具有更好的腔稳定性和更高的Q因数。在腔长度为30μm(存在组织的情况下)时，p-p和p-c FP腔的Q因数分别为约104和105。p-p和p-c FP腔的制造和表征的细节描述于Wang，W.等Optofluidic laser array based on stable high-Q Fabry-Pérotmicrocavities.Lab Chip 15，3862-3869，(2015)中，其相关部分通过引用并入本文。
FITC和BODIPY(组织染色中两种常用的染料)在此用作示例性增益介质。它们的荧光发射光谱在图4B中给出，图4B显示出超过100nm的强光谱重叠。此外，选择三种主要类型的组织(即肌肉组织、脂肪组织和混合组织)作为模型系统，如图4C至4E中所示。FITC和BODIPY分别用于对肌肉组织(肌细胞)和脂肪组织(棕色脂肪细胞)进行染色。
组织和装置制备
所有新鲜猪组织均获自当地屠宰场。肌肉和脂肪组织选自猪肋骨而无需任何加工或固定。在-20℃下将新鲜组织立即冷冻并包埋在OCT(最佳切割温度)化合物中以形成OCT组织块。然后通过使用低温恒温器(Leica 3000)将组织切片切成薄切片(厚度为20μm、30μm和40μm)。拾取选定的切片并将其置于聚-L-赖氨酸(Sigma-Aldrich#P8920)涂覆的电介质反射镜的顶部，首先将其清洁并用赖氨酸清洗以获得更好的组织黏附。然后用PBS清洗组织并风干，然后染色。染色(下面讨论)并再次适当清洗后，将组织用PBS(磷酸盐缓冲溶液，R&DSystems#841380，#896009)封固并用顶部电介质反射镜覆盖。对于共聚焦显微镜，将组织首先沉积在载玻片(Thermo-Fisher#3021-002)的顶部，然后进行相同的染色过程，并随后用Fluoromount(Sigma-Aldrich#4680)进行封固并在扫描之前盖上盖玻片。
染色和材料
对于肌肉组织，将FITC粉末(Sigma-Aldrich#F6377)以3.0mM的浓度溶解在去离子(DI)水中，并随后稀释至较低浓度。然后将FITC溶液施加至肌肉组织10分钟，并在测量前用PBS溶液清洗3次。对于脂肪组织，将BODIPY(Life-Tech#D3922)以3.0mM的浓度溶解在纯乙醇中，并随后用乙醇稀释至较低浓度。然后将BODIPY溶液施加至脂肪组织20分钟，并在测量前用PBS溶液清洗3次。对于混合组织的双重染色，将2mM FITC溶液施加至组织10分钟并用PBS清洗3次，然后将1.0mMBODIPY溶液施加20分钟并用PBS溶液清洗3次。对于使用FITC-鬼笔环肽(Thermo Fisher#F432)的特异性染色，将本体溶液用甲醇稀释以形成10μm溶液，并如所建议的那样施加至肌肉组织切片20分钟。然后在测量之前将组织用PBS清洗3次。
光学成像技术
通过使用具有488nm激光源激发的Nikon A1光谱共聚焦显微镜拍摄DIC和共聚焦荧光显微图像。通过使用直接集成在物镜顶部的CCD(Thorlabs#DCU223C)捕获组织激光的明视场图像。
实验设置
使用典型的共聚焦设置来激发样品并收集来自FP腔的发射光(图4A)。使用具有465nm的脉冲OPO激光(脉冲宽度：5ns，重复频率：20Hz)作为激发源来激发染色的组织。通过连续可变的中性密度滤光片调节泵浦强度，通常平均为1μJ/mm2～200μJ/mm2。通过相同的透镜收集发射光并将其送至光谱仪(Horiba iHR550，光谱分辨率～0.2nm)进行分析。
图4F示出了用FITC染色的肌肉组织的微分干涉对比(DIC)图像和共聚焦荧光显微术图像。由于FITC是非特异性染料，因此在整个组织中染料的物理吸收作为主要的染色机制发生。然而，仍然可清楚地观察到，由于肌细胞对蛋白质的伯胺基团的轻微结合能力，每个肌细胞的内部被更多的FITC染色。在图4G中给出了用BODIPY染色的脂肪组织的DIC和共聚焦图像。因为BODIPY是亲脂性染色剂，它可标记随机分布在整个棕色脂肪细胞中的所有脂滴。
如图7A至7F中所示，进一步研究了在多种肌肉组织厚度和FITC浓度下组织激光可行性和特征。制备所有肌肉组织切片，以使得肌纤维(肌原纤维)在纵向上(即，肌原纤维垂直于镜面并平行于激光发射排列)。图7A中示出了在多种泵浦强度下用2mM FITC染色的30μm厚的肌肉组织的激光发射光谱。尖锐和周期性激光发射峰开始出现在553nm附近，总激光带仅为约10nm(545nm至555nm)，比相应的荧光带(在图4B中大于50nm)窄得多，这是典型的激光发射。每个激光发射峰的光谱线宽为0.2nm，受光谱仪分辨率的限制。最终，当激光器处于单模工作下时，激光发射带可与激光发射光谱线宽一样窄。应注意的是，与不存在肌肉组织的情况下的纯FITC的激光波长(以525nm为中心)相比，观察到在FITC染色的组织激光中的30nm红移，这应归于肌肉组织中的肌红蛋白，其在555nm处具有比在525nm处更低的消光系数。图7B中呈现了从图7A提取的光谱积分激光发射与泵浦能量密度，从中得出激光射阈为约9.2μJ/mm2，类似于理论分析和模拟。通过图7C中的CCD图像可更好地可视化低于和高于阈值的发射的不同变化。在激光射阈以下(4.7μJ/mm2)，在整个组织上的焦点，发射在空间上无特征。在激光射阈以上(12μJ/mm2)，激光输出通常由因斯-高斯模(Ince-Gaussianmode)描述。由于腔内肌原纤维的准圆对称性，图7C中的激光发射看起来更像拉盖尔-高斯模(Laguerre-Gaussian mode)。
进一步研究组织厚度和染色FITC浓度如何影响激光特征，这对于组织激光器在生物学和生物医学中的未来实际用途是重要的。图7D示出了在用于对组织进行染色的FITC的浓度固定(2mM)的情况下，通过改变肌肉组织厚度的激光发射光谱。腔长度为20μm、30μm和40μm的相应FSR分别为5.3nm、3.5nm和2.7nm，其给出平均有效肌肉组织折射率为1.43，接近报道值1.41。尽管由于FP腔的多模性质激光模式的数量随着组织厚度的提高而提高，但是激光带仍然保持在10nm左右。认为560nm附近的背景略微提高(参见图7A，7D)是由FP腔的电介质反射镜的反射率降低引起的。图7E绘制了多种组织厚度的组织激光的激光射阈，显示最佳肌肉组织厚度为30μm左右。
此外，在图7F中，研究了在固定组织厚度(30μm)下，激光射阈对FITC浓度的依赖性。当用于对组织进行染色的FITC浓度从0.25mM提高至2mM时，激光射阈单调下降。实验结果与模拟数据之间的总体一致性表明，在染色期间，肌肉组织内FITC的浓度与组织外溶液中FITC的浓度为约1∶1的比例。这显示出是合理的，因为在染色期间FITC分子仅迁移到组织基质中并随后非特异性地被其捕获。然而，当FITC浓度超过2mM时，阈值再次开始上升，这可能是由于在高浓度下染料的自猝灭效应。实际上，当FITC从0.5mM提高至2mM时，具有纯FITC(在没有肌肉组织的情况下)的FP激光显示出类似的阈值降低，并且当FITC浓度从2mM提高至3mM时类似的阈值提高。
为了全面地理解组织几何结构如何影响激光特性和阈值，比较了具有在横向和纵向方向上的肌原纤维的肌肉组织的激光发射，其示于图8A中。箭头指示激光发射方向。FP腔未示出。图8B中给出了用FITC染色的横向肌原纤维的DIC和共聚焦荧光图像。组织切片(30μm)从与图7A至7F中相同的组织片切割(但具有不同的切割方向)并夹在相同的FP腔中。横向肌肉的激光特征表现出与纵向肌肉的那些显著不同。首先，由于肌原纤维排列，激光发射的空间模式(图8C)类似于线性厄米-高斯模(Hermite-Gaussian mode)。其次，横向肌肉的激光射阈为约22μJ/mm2(图8D至8E)，比纵向肌肉的大大约2至3倍，这是由于沿横向肌原纤维的激光发射方向散射损失(34cm-1相对于9cm-1)高大约4倍。
为了进一步证明根据本公开内容的某些方面制备的激光发射扫描显微镜装置的多功能性，在图9A至9F中，进一步研究了用BODIPY染色的棕色脂肪组织的激光特性。图9A中示出了在多种泵浦能量密度下用1mM BODIPY染色的30μm棕色脂肪组织的激光发射光谱。周期性激光发射峰开始出现在528nm附近，并且总激光带为约15nm(520nm至535nm)，仍然比相应的荧光带窄得多。由于不存在肌红蛋白，脂肪组织的激光带相对于来自纯BODIPY激光的激光带仅红移10nm，远小于对于先前讨论的肌肉激光所观察到的30nm红移。图9B中呈现的光谱积分激光发射与泵浦能量密度显示激光射阈为约20μJ/mm2。通过图9C中的CCD图像获得低于和高于阈值的输出发射的显著变化。在激光射阈以下(15μJ/mm2)，在整个组织上的焦点，发射在空间上无特征。在激光射阈以上(31μJ/mm2)，由于在泵浦光的焦点内随机分布的多种尺寸的脂滴，空间输出表现出比纵向或横向排列的肌肉组织更不规则的图案。
还研究了组织厚度和BODIPY浓度对激光特征的作用。图9D示出了固定BODIPY浓度为1mM的情况下多种组织厚度的激光发射光谱。腔长度为20μm、30μm和40μm的测得的FSR分别为4.5nm、2.9nm和2.2nm，这使得平均有效组织折射率为1.55，接近报道值1.48。图9E中示出了多种组织厚度的激光射阈，显示最佳组织厚度为约30μm，类似于肌肉组织的厚度。图9F示出了在固定的脂肪组织厚度下激光射阈对BODIPY浓度的依赖性。激光射阈在0.5mM至2mM之间逐渐降低。然而，由于BODIPY的自猝灭作用，当浓度超过2mM时，激光射阈升高，这也与对于用FITC的肌肉组织所观察到的相似。
在用单独类型的组织研究单独染料后，从混合组织实现选择性和多重激光(图10A)，该混合组织允许从同一片组织上的肌细胞和脂肪细胞产生激光信号。组织是双重染色的，即FITC主要用于将蛋白质(肌细胞)和BODIPY与脂质(脂肪细胞)结合。DIC和共聚焦显微图像用于确认组织中的双重染色过程(图10B至10C)。通过调节泵浦光焦点位置，实现了通过朝一个方向沿组织扫描的激光发射，如图10B和10C中的虚线中所示。选择3个位置代表两种不同的组织：位置1(用2mM FITC染色的肌肉组织)、位置2(用1mM BODIPY染色的脂肪组织)和位置3(用2mM FITC染色的肌肉组织)。图10D示出了在位置1、2和3处测量的常规荧光光谱(在通过移除顶镜而不存在FP腔的情况下)。显然地，由于FITC与BODIPY之间的巨大光谱重叠，这三个位置中的组织类型显示无法通过其荧光来确定。相反，在图10E和10F中，通过将同一组织置于激光发射扫描显微镜装置的法布里-珀罗(FP)谐振腔中(通过将顶镜放回)，可区分这三个位置的激光信号(以及因此组织类型)。图10E示出了仅来自一种类型的组织(和染料)的选择性激光发射。在这种情况下，泵浦能量密度(20μJ/mm2)设置在FITC和BODIPY的阈值之间。产生仅来自FITC(位置1和位置3)的激光信号。从BODIPY(位置2)无法检测到激光信号。因为镜阻挡了大量的荧光背景并仅允许激光发射通过，所以可实现位置1与2之间的极高对比度(约103)。为了比较，位置1与位置2之间的荧光对比度几乎一致(参见图10D)。图10F示出了来自多种染料的多重激光发射。在这种情况下，使用更高的泵浦能量密度(60μJ/mm2)来获得FITC和BODIPY二者的激光发射。尽管荧光中存在强烈的光谱重叠，但FITC和BODIPY的激光发射光谱在光谱上有很大差异，因此允许肌肉组织与脂肪组织之间的清楚区分。以上两个实例证实了根据本发明的某些方面制备的组织激光在存在多种染料的情况下控制和区分激光信号的能力。这样的能力源于激光特征(例如激光发射波长和激光射阈，以及输出强度和偏振化)对染料的发射/吸收特性及其生化和物理环境(例如染料对组织上的特定标志物的组织散射/吸收和结合亲和力等)的敏感依赖性，这使得能够使用多种荧光团对组织进行高度多重分析。除了光谱分辨两种非常相似的染料外，组织激光器还提供另一个好处，即高SBR。组织激光器中的SBR为500，比常规的基于荧光的检测提高约50倍。注意，由于随机激光器没有镜，因此仍然可检测到强荧光或散射背景而不会被阻挡，从而显著降低了SBR。
在许多应用中，荧光团与生化分子缀合，以与组织中的靶标特异性结合。为了证明组织激光技术可应用于荧光团-缀合物，在图11A至11C中，FITC-鬼笔环肽用作模型系统，其对肌肉组织中的F-肌动蛋白具有高亲和力。在该实验中，通过使用仅10μm FITC-鬼笔环肽染色肌肉组织可实现激光发射。与FITC的非特异性结合相比(图4F)，FITC-鬼笔环肽与F-肌动蛋白的特异性结合在共聚焦显微镜下实现细胞膜附近的局部荧光(图11A)，并使肌肉组织中的FITC浓度比原始染色的FITC-鬼笔环肽浓度(10μM)高得多。因此，在阈值为约130μJ/mm2的情况下可实现FITC的激光发射(图11B)，而在相同的条件下并且使用相同的染色FITC浓度(10μm)，即使在300μJ/mm2下，肌肉组织中的非特异性FITC也没有观察到激光发射。基于模拟，组织内有效的FITC-鬼笔环肽浓度估计为约200μm。在图11C中，激光轮廓的空间分布表明激光发射是广义的高阶因斯-高斯模。
在迄今为止讨论的所有实验中，将平-平(p-p)FP腔用于激光发射扫描显微镜装置。在某些环境中，即使有轻微的未对准，p-p腔也可能不稳定和/或易受Q因数降级的影响，并且可能有助于图7E中不同组织厚度的激光射阈的变化。由于细胞的透镜效应，在单细胞激光器的情况下，这样的Q因数降级不太重要。不幸的是，当细胞嵌入细胞外基质中时，组织激光器可能不存在这种透镜效应。然而，激光发射扫描显微镜装置中的平凹(p-c)FP腔非常稳定，并且即使在FP组织激光器的组装期间未对准也可维持高Q因数。
在相同的顶镜上使用CO2激光烧蚀形成微米尺寸的凹镜阵列(在两个相邻凹镜之间间隔3mm)并且用相同的FITC染色的肌肉组织对其进行测试。那些p-c FP腔的Q因数超过1×105。实现了约2μJ/mm2的激光射阈，这比图7A至7F中相应p-p FP腔低约10倍，并且比随机组织激光器(90至380μJ/mm2)低约100倍。可在光纤的尖端上形成高Q扫描凹镜以检查整个组织，这允许扫描整个组织样品。
在该实例中，提供了并入了高Q FP腔的高度通用组织激光发射扫描显微镜。尽管仅测试了两种染料和两种类型的组织，但组织激光器平台可容易地转化为其他荧光团(例如量子点和荧光蛋白)和其他类型的组织。这样的激光发射组织显微镜提供窄光谱带宽、强发射强度和大本底扣除，再加上激光腔提供的正反馈，可显著提高组织表征中的灵敏度、特异性、多重性和成像对比度。除发射强度之外，来自组织的激光输出包含许多非常规参数，这些参数可被监测并用作传感信号，例如激光射阈、激光效率和激光模式空间分布。总之，多参数分析使得能够更好地理解组织内/组织间生物学活动和结构。
如上所述，激光发射扫描显微镜装置可包含扫描凹镜形式的第二反射表面，其可在光纤小平面上制造，允许扫描整个组织样品。此外，成像光谱仪可与激光发射扫描显微镜装置一起使用，用于具有更高光谱分辨率和空间信息的高级组织映射。与抗体缀合的荧光团可用于靶向组织中的多种生物标志物。以这种方式，激光发射扫描显微镜装置提供了新的光谱工具，用于从医学诊断和临床前药物测试到组织工程中生物转化的监测和鉴定的大量应用。
实施例B
根据本公开内容的某些方面制备的激光发射扫描显微镜装置可用于检测癌症或其他病症、异常或疾病。核生物标志物的检测对癌症诊断和预后是重要的。常规方法依赖于比色免疫组织化学测定和基于荧光的光谱学，但由于强光吸收、宽发射带和针对背景的低对比度而远非令人满意。
在该实例中，描述了第一波长复用免疫激光器，其利用激光发射作为传感信号，以分析具有高强度、高对比度以及高光谱和空间分辨率的核生物标志物。研究了肺癌组织和结肠癌组织二者，其中用与核酸和核生物标志物(EGFR、p53和Bcl-2)结合的位置特异性染料和抗体-缀合的染料标记的组织夹在法布里-珀罗微腔中。显著地，观察到来自癌细胞核的亚细胞激光发射，阈值为数十μJ/mm2，亚微米分辨率(＜700nm)，并且激光带仅为数nm。还实现双激光发射以表示核酸和核生物标志物的共定位。免疫组织激光提供了与常规方法互补的新的分析工具，用于改善癌组织的表征并更好地理解基础细胞生物学。
作为背景，癌症是全世界死亡的主要原因之一，每年导致超过800万人死亡。对于癌症诊断，广泛使用病理学家对微观组织病理学载片的临床评价，其定义了癌症类型和等级。同时，对于癌症预后和引导治疗，最近发现癌症突变的精确检测和相关预后蛋白质生物标志物的确定在个体化癌症管理中发挥重要作用。在癌症相关蛋白质组学中，细胞核中特定蛋白质(例如表皮生长因子受体(EGFR)、细胞肿瘤抗原p53、细胞调节蛋白Bcl-2和细胞分裂周期蛋白CDK-1)的存在具有特定的预后意义。例如，发现EGFR的核表达(n-EGFR)是最常见但新的预后生物标志物，其与在数种类型的癌症(例如肺癌、三阴性乳腺癌、结直肠癌、成釉细胞瘤和卵巢癌)中患者的存活率高度相关。除n-EGFR之外，临床研究还揭示核Bcl-2(n-Bcl-2)与胃癌和结直肠癌显著相关，而突变核p53(n-p53)是早期乳腺癌伴内脏转移生存的重要预后生物标志物。鉴定这些核生物标志物不仅可帮助科学家更好地了解癌症中的信号传导途径，而且更重要的是，提供与疾病预后、恶性转化、复发时间框架和治疗相关的关键信息。
然而，由于许多生物标志物也在细胞膜和细胞质中表达，因此那些生物标志物的核表达的检测是一项艰巨的任务。H&E(苏木精和伊红)染色用于提供癌组织的形态学评估，而免疫组织化学(IHC)广泛用于分析特定抗原，尤其是诊断、预后和预测生物标志物。IHC依赖于比色检测来鉴定组织内给定生物标志物的位置。虽然简单，但由于非线性光学效应和低动态范围，IHC在区分细胞核中的生物标志物与周围背景方面表现不佳。因此，具有过表达的核生物标志物的细胞可能被误诊。当要分析核中的多个靶时，这一问题会加剧。
与比色检测相比，免疫荧光(IF)是使用不同荧光标记来标记不同生物标志物的技术，因此得到相对于IHC改善的对比度和多重能力。然而，尽管在晚期癌症的细胞核中生物标志物浓度升高，但来自核生物标志物的荧光信号时常嵌入来自也可具有相同生物标志物的表达的细胞膜和细胞质的大片背景荧光中。另外，IF显著地受到荧光团的宽发射光谱的影响，这为将生物标志物与具有相似发射波长的附近特征区分开来提出了另一个障碍。结果，准确地鉴定具有生物标志物表达的细胞核并精确地确定细胞核内的确切生物标志物位置变得具有挑战性，这可能导致癌组织表征中的显著失真和随后的曲解。
在该实例中，提供激光发射扫描显微镜装置，其提供具有亚细胞和亚微米分辨率的波长复用免疫激光器平台，以分析人癌组织内的核生物标志物。图1A示出了根据本公开内容的某些方面的激光发射扫描显微镜装置，其可用作“免疫组织激光器”，其中用位置特异性荧光团(例如，核酸染色剂)和/或抗体-缀合的荧光团标记的癌组织夹在由两个高反射表面(例如，镜)形成的法布里-珀罗(FP)微腔内。荧光团用作激光增益介质，其设计成响应细胞内结合和组织内活动，从而以激光发射的形式产生传感信号。如图1B中所示，虽然来自核的荧光(顶部图示)通常提供“空间模糊”信号，其覆盖具有低空间分辨率和具有高与低生物标志物表达的位置之间的低对比度的大区域，但激光发射(底部图示)由于其高强度/灵敏度、高荧光背景抑制和高光谱/空间分辨率而具有明显的优势，因此能够在亚细胞水平上多重检测核生物标志物。
为了证明用作免疫组织激光器的激光发射扫描显微镜装置的广泛适用性，选择肺癌组织和结肠癌组织二者作为模型系统。选择EGFR、p53和Bcl-2作为示例性核生物标志物。核酸染料、YO-PRO-1碘化物(YOPRO)和与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗体(例如抗EGFR)分别用于鉴定细胞核和细胞核内相应生物标志物的位置。从YOPRO和FITC实现亚细胞激光发射，激光射阈为约数十μJ/mm2。尽管YOPRO与FITC之间存在大的荧光光谱重叠(＞100nm)，但由于它们的窄发射带(数nm)，它们的激光发射可在光谱上很好地分离，因此能够进行细胞核和核生物标志物的多重检测和共定位。另外，由于荧光背景的显著抑制，具有高生物标志物表达和高浓度核酸的位置可通过具有亚微米分辨率(＜700nm)的激光发射清楚地鉴定。使用这里描述的免疫激光发射扫描显微镜装置提供了与IHC和IF互补的新工具，以改善癌症诊断、预后和治疗，以及对医学/细胞生物学的基本理解。
组织和装置制备
在相同条件下制备所有人组织切片(癌性和正常)，厚度为15μm。所有人肺和结肠组织均以OCT(最佳切割温度)冷冻组织块的形式购自OriGene Technologies。这些组织由病理学家用完整的病理验证数据、临床注释(包括患者年龄、性别和最小阶段分组)、抽象病理报告和数字H&E图像进行验证。对于图5A至5H中使用的组织，两种组织均由病理学家检查并用肺腺癌验证：#1型组织(OriGene No.CB537726)和#2型组织(OriGene No.CB543346)。
收到后，通过使用低温恒温器(Leica 3050S)将所有组织块切成15μm厚的切片。拾取选定的组织切片并将其置于聚-L-赖氨酸(Sigma-Aldrich#P8920)涂覆的电介质反射镜的顶部，首先将其清洗并用赖氨酸清洗以获得更好的组织黏附。然后用PBS(磷酸盐缓冲溶液，ThermoFisher#10010023)清洗组织并风干，然后染色/标记(参见下一部分中的染色/标记细节)。最后，用顶部电介质反射镜覆盖组织。对于共聚焦IF显微术，将组织首先沉积在superfrost载玻片(ThermoFisher#3021-002)的顶部，然后进行相同的染色过程，并随后用Fluoromount(Sigma-Aldrich#4680)进行封固并在扫描之前盖上盖玻片。
染色和标记
所有人组织切片用YOPRO染色以靶向细胞内的核酸或者用与EGFR、p53或Bcl-2特异性结合的FITC缀合的抗体染色，其可在细胞膜、胞质细胞器(内质网、高尔基体和内体)和细胞核上表达。
对于IHC染色，通过将组织浸入预冷却的丙酮(-20℃)中3分钟并在室温下干燥来将组织固定在superfrost载玻片(ThermoScientific#15-188-48)上。然后用PBS清洗载玻片两次。接下来，将组织首先用BSA缓冲液封闭10分钟以防止非特异性结合并用PBS彻底清洗。然后将组织与200μl稀释的一抗(抗人EGFR抗体(abcam#52894)在4℃下孵育过夜。用1∶50溶液制备一抗，终浓度为0.005mg/ml。与一抗孵育后，用PBS清洗组织，然后在室温下用HRP缀合的抗Rb IgG二抗(abcam#6721)染色30分钟，稀释度为1∶200(终浓度＝0.01mg/ml)。然后将DAB底物溶液(abcam#64238)施加至组织5分钟以显示抗体染色的颜色。清洗5次后，将组织载片通过纯酒精脱水，然后用封固剂(abcam#ab64230)封固，并且最后用盖玻片覆盖。对肺和结肠组织二者施加同样的操作。对于结肠组织，使用两种另外的一抗，抗p53(abcam#32049)和抗Bcl-2(abcam#182858)。
对于核酸染色，将YOPRO溶液(Thermofisher#Y3603)以0.5mM的浓度溶解在PBS中，并随后用PBS稀释至较低浓度。然后将制备的YOPRO溶液施加至组织切片20分钟，并在测量前用PBS溶液清洗两次。上述过程对于IF和组织激光测量二者都是相同的。
对于肺组织的抗体-荧光团标记，首先用PBS清洗载玻片两次并用BSA缓冲液封闭10分钟以防止非特异性结合，然后用PBS再次清洗。接下来，将组织与200μl稀释的一抗(抗人EGFR抗体(abcam#52894))在4℃下孵育过夜。用1∶50溶液制备一抗，终浓度为0.01mg/ml。在与一抗孵育后，用PBS彻底清洗组织，然后是FITC缀合的抗Rb IgG二抗(在室温下染色2小时)。以1∶10稀释制备二抗(ThermoFisher#65-6111)以达到0.2mg/ml的终浓度。最后，在激光实验之前用PBS再次清洗组织。对结肠组织施加相同的操作，其中使用一抗(抗EGFR抗体(abcam#52894)、抗p53抗体(abcam#32049)和抗Bcl-2抗体(abcam#182858)，然后是FITC缀合的抗Rb IgG二抗(在室温下染色2小时)。上述过程对于IF和组织激光测量二者都是相同的。
对于抗EGFR-FITC和YOPRO的双重染色，首先将抗EGFR-FITC施加(与对于一抗和二抗标记所述的相同操作)至肺组织切片，然后将0.5mM YOPRO溶液施加至同一组织20分钟，并在测量前用PBS溶液清洗两次。
光学成像技术
使用Nikon-E800宽场显微镜拍摄明视场IHC图像。通过使用具有488nm激光源激发的Nikon A1光谱共聚焦显微镜拍摄共聚焦荧光显微图像。通过使用直接集成在实验设置中的物镜顶部的CCD(Thorlabs#DCU223C)捕获组织中激光发射(“激光发射星”)的明视场图像。
法布里-珀罗(FP)腔
通过使用两个定制的电介质反射镜形成FP腔。顶镜(由Qingdao NovelBeamTechnology Co.Ltd，China制造)在500nm至555nm的光谱范围内具有高反射率，以提供光反馈和465nm左右的高透射率，以使泵浦光通过，而底镜(由Evaporated Coating Inc.，USA制造)具有稍宽的反射带。FP腔的Q因数为约1×104，腔长为15μm(不存在组织的情况下)。FP腔的制造和表征的细节与实施例A中上述相同。
实验设置
典型的共聚焦设置用于激发样品并收集来自FP腔的发射光，如图17中所示。使用465nm的脉冲OPO激光(脉冲宽度：5ns，重复频率：20Hz)来激发染色的组织。在通过衰减井和分束器之后，聚焦的激光束直径为25μm。通过连续可变的中性密度滤光片调节泵浦能量密度，通常为1μJ/mm2至200μJ/mm2。通过相同的透镜收集发射光并将其发送到光谱仪(HoribaiHR550，光谱分辨率约0.2nm)用于分析。
首先研究仅用YOPRO染色的肺组织。图12A至12B示出了当使用0.5mM YOPRO溶液对组织进行染色时，在多种泵浦能量密度下癌性和正常肺组织的激光发射光谱。在547nm左右出现尖锐的激光发射峰。作为对照实验(未示出)，用0.5mM的纯YOPRO溶液(没有任何组织)未观察到激光发射，这是预期的，因为在不存在核酸的情况下YOPRO实际上没有发射。从图12A和12B提取的光谱积分的激光发射与泵浦能量密度均在图12C中呈现，可从图12C得出癌性和正常组织的激光射阈分别为21μJ/mm2和32μJ/mm2。此外，在图12D中，针对癌性组织和正常组织二者研究了在固定的谐振器长度(15μm)下，激光射阈对用于对组织进行染色的YOPRO溶液浓度的依赖性。当YOPRO溶液浓度从0.5mM降至0.05mM时，预期核内的有效YOPRO浓度相应降低，这导致激光射阈急剧提高，尤其是对于YOPRO浓度低于0.25mM。对于所有YOPRO浓度，发现癌组织的激光射阈始终低于正常组织的激光射阈，这可能是由于癌细胞内核染色质含量较高(并因此YOPRO浓度较高)(由于DNA复制活性较高)。另一种可能的解释是核酸染色(YOPRO)倾向于在癌细胞的松散核染色质中比在正常细胞的高度紧密的核染色质中更容易与DNA结合。
另外，在图12A至12B中，即使在显著高于相应激光射阈的泵浦能量密度下，组织激光器仍保持单模操作。激光发射的半峰全宽(full-width-at-half-maximum，FWHM)仅为0.16nm，受光谱仪分辨率的限制。这样的单模激光发射带比相应的荧光的窄约400倍，因此能够进行高度地波长复用检测。尽管泵浦能量密度极高(5倍阈值)，但YOPRO染色的组织激光器可支持多模激光操作，整体激光带小于10nm，证明了YOPRO的固有窄增益曲线，尽管荧光带大于60nm。
图12E示出了来自肺癌组织的癌细胞中的核的共聚焦荧光显微术图像。由于细胞核内荧光发射的对比度低，不能提取具有高核酸浓度的确切位置。然而，正如图12F和12G中的CCD图像所示，只能从具有最高核酸丰度(以及因此YOPRO浓度)的特定位置观察到针对周围背景具有明显和强烈输出的微小、尖锐的激光发射。随着泵浦能量密度的提高，具有略低的核酸丰度的更多位置开始激发。注意，可能存在从具有相对低浓度的核酸的位置发射的荧光背景，因此不能产生激光发射。然而，荧光被具有大于或等于约99％的反射率的顶镜完全阻挡，而实际的激光发射仍然可以以几乎100％的效率传输通过顶镜。因此，那些像黑暗天空中明亮的星(激光发射星)出现的微小激光发射斑点与周围的荧光背景具有极高的对比度。类似地，在图12H至12J中，使用正常肺组织进行一系列平行实验，并观察到与图12F至12G中相同的现象，不同之处在于，在较高的泵浦能量密度下开始出现激光发射星并且在给定的泵浦能量密度下观察到更少的激光发射星，这两者都反映了正常组织中核酸丰度较低，如先前在图12D中所讨论的。
为了进一步表征“激光发射星”，图13A绘制了在CCD上捕获的来自肺癌组织的单个激光发射星的点扩散函数(PSF)。测量PSF的FWHM为约678nm，表明亚衍射(NA＝0.42)和亚微米光学分辨率。图13B举例说明可很好地分辨出两个相隔仅1.3μm的相邻激光发射星。激光发射星具有高空间分辨率，而“荧光云”仅具有低空间分辨率。图13C至13E的插图表明，当泵浦能量密度逐渐提高时，亚细胞激光发射星从同一泵浦光束点内的单个至多个激光发射星逐渐出现。图13C至13E中的光谱分析表明那些激光发射星相互独立。它们中的每一个都处于单激光模式操作，但可能由于不同的局部环境(例如核厚度、折射率和增益分布等)而具有稍微不同的激光发射波长。
图13A至13E中的结果提供了通过使泵浦能量密度斜升来以亚微米空间分辨率对组织(或细胞)中的分析物浓度进行量化(或半量化)的新方法。如图13C至13E中所示，在相对低的泵浦能量密度下，仅具有最高分析物浓度的那些位置发出激光。随着泵浦能量密度提高，可观察到更多位置的激光发射。可记录每个泵浦能量密度的图像，以便可映射分析物相对浓度的分布，并且可构建具有不同分析物浓度水平的位置的直方图，从而能够对组织和细胞进行更详细和更定量的表征。
向前移动一步，在图14A至14E中，研究了使用与FITC缀合的EGFR抗体(抗EGFR-FITC)靶向在图12A至12D中使用的相同肺癌组织中表达的n-EGFR的激光发射。类似于图12A中的YOPRO情况，图14A示出了当泵浦能量密度略高于阈值时具有约0.16nm的FWHM的单模激光发射。虽然随着泵浦能量密度的提高第二种模式出现，但激光带仅为约8nm(531nm至539nm)，比相应的荧光带(60nm以上)窄得多。图14B中示出了从图12A中提取的泵浦能量密度与光谱积分的激光发射，显示激光射阈为约67μJ/mm2。虽然已知FITC浓度与EGFR表达相关，但常规IF显微镜(图14C中所示)难以精确定位具有高EGFR浓度的核内确切位置。类似于先前研究的YOPRO激光情况，利用激光发射，在成像对比度和以亚微米分辨率定位高EGFR浓度光点的能力方面实现了显著改善，如图14D至14E中所示。
虽然在图14A至14E中，亚细胞激光是从肺癌组织内的n-EGFR获得的，但激光信号可能可从细胞的其他位置(例如细胞膜和细胞质)中的EGFR产生。为了正确鉴定具有高临床意义的n-EGFR，EGFR和核理想地共定位，这涉及波长复用检测。为了证明根据本公开内容的激光发射的复用能力，制备了两种类型的肺癌组织，没有n-EGFR的腺癌(组织类型#1：图5a至5d)和具有n-EGFR的腺癌(组织类型#2：图5e至5h)。对两种组织都进行了很好的表征，并由病理学家验证。图15A和15E中两种类型组织的相应IHC图像证实，#1型组织在细胞核内没有任何EGFR表达(但在细胞膜上具有EGFR表达)，而#2型组织在大多数细胞核内具有大量的EGFR。
为了进一步表征那些组织，图15B示出了当用YOPRO(红色曲线)和抗EGFR-FITC(蓝色曲线)单独染色时#1型组织的激光发射光谱。虽然当组织在细胞核处被泵浦时可观察到YOPRO的激光发射，但是观察到用抗EGFR-FITC标记的组织没有激光发射，表明仅在膜或其他胞质细胞器上具有EGFR表达的细胞由于EGFR(和因此FITC)的丰度相对较低而不能够为激光发射提供足够的增益。将相同的表征操作也施加于#2型组织。在这种情况下，如图15F中所示，当组织在细胞核处被泵浦时，分别获得在547nm处的用YOPRO染色的组织的激光发射和在537nm处的用抗EGFR-FITC染色的组织的激光发射。
虽然图15B与15F之间的比较已经表明FITC激光发射是来自细胞核中EGFR的表达，但EGFR和核激光发射信号的共定位提供了n-EGFR存在的重要验证。为了实现共定位，#1型组织和#2型组织二者均用YOPRO和抗EGFR-FITC双重染色。在图15C和15G中呈现双重染色组织的共聚焦荧光显微图像(通过移除FP腔中的顶镜)。对于两种组织，可观察到来自细胞核的强YOPRO荧光以及来自细胞膜和细胞质上的EGFR的FITC荧光。特别地，图15G中的细胞核在视觉上呈现出比图15C的细胞核更高的荧光强度，这表明在#2型组织的细胞核内可存在高丰度的n-EGFR。然而，很明显，由于YOPRO与FITC之间的巨大光谱重叠，亚细胞位置不能通过它们的荧光清楚地确定，也不能用于区分细胞核和细胞质中的EGFR表达。相反，通过将相同的组织放置在FP腔中(通过将顶镜放回)，可观察到两种染料的激光信号并对其在光谱上进行区分。图15D和15H分别呈现双重染色的#1型和#2型组织的激光发射光谱。对于#1型组织(图15D)，当组织在核处被泵浦时，仅获得来自YOPRO的激光发射光谱，未观察到来自EGFR的激光信号，表明核中不存在EGFR或存在低EGFR。然而，对于#2型组织(图15H)，当组织在核处被泵浦时，在537nm和547nm处出现两个尖锐的激光发射峰，这是来自EGFR和核酸二者的双重激光发射的证据。图15H的插图示出了CCD图像，其证实了核中EGFR的存在。注意，由于FITC的激光射阈远高于YOPRO的激光射阈，因此在相同的泵浦能量密度下，来自FITC的激光强度低于来自YOPRO的激光强度。还要注意，即使在可能出现更高阶模的较高泵浦能量密度下，由于其非常窄的发射带，仍然可区分YOPRO和FITC的激光发射光谱。
最后，将用作免疫组织激光器的激光发射扫描显微镜装置应用于其他类型的组织和核生物标志物，以验证其广泛的效用。在图16A至16F中，在结肠癌组织中检查三种不同的核生物标志物(EGFR、p53和Bcl-2)。出于组织表征的目的，图16A至16C呈现了用相应抗体(即，抗EGFR、抗p53和抗Bcl-2)标记的结直肠癌组织的IHC和共聚焦IF图像，显示各组织细胞核中高的EGFR、p53和Bcl-2量。与先前使用的操作类似，当用核被泵浦时，在图16D至16F中实现了用抗EGFR-FITC、抗p53-FITC和抗Bcl-2-FITC标记的那些结肠组织的激光发射。尽管在高泵浦能量密度下存在多个激光发射峰，但激光发射带仍然为约仅5nm，显示出多重检测的潜在能力。激光射阈为约200μJ/mm2。
因此，提供了用作具有亚微米分辨率的免疫组织激光器的新的波长复用激光发射扫描显微镜装置，并将其成功应用于人肺癌和结肠癌组织中的多种核生物标志物(EGFR、p53和Bcl-2)的检测和鉴定。该方法利用激光发射的高强度、高背景抑制和高光谱/空间分辨率，在生物医学应用中实现激光发射(而不是荧光)。激光发射扫描显微镜装置可用于免疫激光成像技术以映射癌组织(和其他患病组织)。这基本上是基于激光发射的显微镜，其中可通过在整个组织上扫描泵浦光束来构建图像。另外，还考虑了与用于组织的高光谱成像的成像光谱仪的集成。
此外，常规的诊断性IHC和IF方法，其已知是主观的并且导致从一个病理学家到另一个病理学家的组织评价的显著变化。本公开内容的方法提供了通过在使泵浦能量密度斜升的同时映射组织来对细胞内具有不同生物标志物表达水平的位置数量和表达高的核生物标志物的细胞数量进行量化的方法。结果是，可构建癌细胞的直方图。这样的量化方法与常规IHC和IF一起将为癌症诊断、预后和个性化治疗提供癌组织的更好评估。
除癌细胞之外，相同的免疫激光技术可扩展至具有过表达的生物标志物的基质细胞(癌症相关的成纤维细胞)。例如，可检测用Bcl-2表达的结肠组织。最近的报道已显示，基质细胞与肿瘤细胞之间的相互作用在癌症生长和进展中起主要作用。此外，也已证明基质基因表达定义数种癌症中不良预后亚型。因此，观察肿瘤基质激光发射的能力可帮助预测临床结局和加强临床预后因素。
虽然在该实施例中已显示了双重检测(2重检测)，但是激光发射扫描显微镜装置能够容纳另外的能量响应物质(例如，另外的荧光团)。例如，使用FITC、YOPRO和高亲和力核酸染料SYTOX Blue已实现三种染料体系的激光发射，SYCDX Blue以500nm为中心，带宽小于5nm。因此，可在500nm至550nm的范围内清楚地区分至少三个激光发射波长。
提供实施方案的上述描述用于举例说明和描述目的。其不旨在是穷举性的或限制本公开内容。一个特定实施方案的单独的要素或特征通常不限于该特定实施方案，而是在适用的情况下是可互换并且可用于一个所选择的实施方案中，即使没有具体示出或描述。同样的还可以以多种方式改变。这样的变化形式不被认为是背离本公开内容，并且所有这样的修改旨在被包含在本公开内容的范围内。

Claims (39)

1.扫描显微镜装置，其包含：
第一反射表面，其是平面的；
第二反射表面；
扫描腔，其尺寸设置为接收具有至少一种激光能量响应物质的固定的组织样品，其中所述扫描腔的至少一部分对应于限定在所述第一反射表面与所述第二反射表面之间的法布里-珀罗谐振腔，所述谐振腔具有大于或等于约1×102的品质因数(Q)；
激光泵浦源，其配置成将能量引导至所述扫描腔；以及
检测器，其配置成接收和检测由来自所述扫描腔的组织样品中的至少一种激光能量响应物质产生的一个或更多个发射，其中所述第二反射表面或激光泵浦源中的至少一个可相对于所述扫描腔中的固定的组织样品平移，以产生所述组织样品的二维扫描。
2.根据权利要求1所述的扫描显微镜装置，其中所述固定的组织样品的第一表面设置在所述第一反射表面上，并且所述固定的组织样品的与所述第一表面相对的第二表面与所述第二反射表面的间隙小于或等于约20微米。
3.根据权利要求1所述的扫描显微镜装置，其中所述第一反射表面与所述第二反射表面之间的距离小于或等于约60微米。
4.根据权利要求1所述的扫描显微镜装置，其中，所述第二反射表面是形成在纤维末端上的扫描镜，其相对于所述固定的组织样品平移。
5.根据权利要求4所述的扫描显微镜装置，其中所述第二反射表面限定凹结构，并且所述凹结构的曲率半径大于或等于约5微米至小于或等于约500微米。
6.根据权利要求1所述的扫描显微镜装置，其中所述第二反射表面限定平面结构，并且所述激光泵浦源可相对于所述扫描腔中的所述组织样品平移。
7.根据权利要求1所述的扫描显微镜装置，其中所述品质因数(Q)大于或等于约1×105。
8.根据权利要求1所述的扫描显微镜装置，其中所述固定的组织样品包含至少两种不同的激光能量响应物质，并且所述检测器能够接收并检测来自每种不同激光能量响应物质的多重发射。
9.根据权利要求1所述的扫描显微镜装置，其中所述第二反射表面是可移除的。
10.根据权利要求1所述的扫描显微镜装置，其中所述固定的组织样品的厚度大于或等于约1μm至小于或等于约50μm。
11.根据权利要求1所述的扫描显微镜装置，其中所述第一反射表面或第二反射表面中的至少一个包含一个或更多个间隔区。
12.根据权利要求11所述的扫描显微镜装置，其中所述一个或更多个间隔区的高度大于或等于约大于或等于约2微米至小于或等于约60微米。
13.根据权利要求11所述的扫描显微镜装置，其中，所述扫描腔还包含围绕所述组织样品设置的至少一种折射率匹配材料。
14.根据权利要求1所述的扫描显微镜装置，其中所述固定的组织样品为组织样品微阵列的形式。
15.根据权利要求1所述的扫描显微镜装置，其中所述固定的组织样品已被低温保存或经福尔马林固定石蜡包埋。
16.根据权利要求1所述的扫描显微镜装置，其中所述第二反射表面对由所述组织样品中的一种或更多种激光能量响应物质产生的一个或更多个激光发射的反射率大于或等于约80％至小于或等于约99.999％。
17.检测来自组织样品中一种或更多种激光能量响应物质的发射的方法，其中所述方法包括：
将来自激光泵浦源的能量引导至设置在扫描腔内的固定的组织样品，所述扫描腔的至少一部分限定形成在第一反射表面与第二反射表面之间的法布里-珀罗谐振腔，所述谐振腔具有大于或等于约1×102的品质因数(Q)，其中所述组织样品包含一种或更多种激光能量响应物质，并且所述第二反射表面或激光泵浦源中的至少一个相对于设置在所述扫描腔内的所述固定的组织样品平移；以及
检测由所述组织样品中的一种或更多种激光能量响应物质产生的一个或更多个激光发射，以产生所述组织样品的二维扫描。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，对来自所述激光泵浦源的能量的引导包括使激光能量源在设置在所述扫描腔内的组织样品上平移以产生所述二维扫描。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二反射表面限定凹结构，所述凹结构是形成在纤维末端上的扫描镜，其相对于设置在所述扫描腔内的所述组织样品平移以产生所述二维扫描。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述组织样品包含至少两种不同的荧光团或激光能量响应物质，并且所述检测包括检测由所述至少两种不同的荧光团或激光能量响应物质产生的至少两个不同的发射以产生所述组织样品的多重二维扫描。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述一种或更多种激光能量响应物质包含第一激光能量响应物质和不同的第二激光能量响应物质，并且引导至所述固定的组织样品的能量小于所述第一激光能量响应物质的第一激光射阈能量并且大于所述第二激光能量响应物质的第二激光射阈能量，以使得所述一个或更多个发射的检测仅检测来自所述组织样品中的所述第二激光能量响应物质的激光发射。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述一种或更多种激光能量响应物质包含具有第一激光射阈能量的第一激光能量响应物质和具有不同的第二激光射阈能量的不同的第二激光能量响应物质，以使得对来自所述激光泵浦源的能量的引导包括提高能级以首先激发所述第一激光能量响应物质并随后激发所述第二激光能量响应物质，以使得对所述一个或更多个发射的检测检测来自所述第一激光能量响应物质和所述第二激光能量响应物质的发射，其映射所述固定的组织样品内第一激光能量响应物质和第二能量响应物质的分布。
23.根据权利要求17所述的方法，其中所述一种或更多种激光能量响应物质包含具有第一激光射阈能量的第一激光能量响应物质，其中提高引导至所述固定的组织样品的能量的量，以使得所述检测映射所述固定的组织样品中第一激光能量响应物质的浓度分布。
24.根据权利要求17所述的方法，其中所述一种或更多种激光能量响应物质包含第一激光能量响应物质和不同的第二激光能量响应物质，其中所述第一能量响应物质在细胞的核中并且所述第二能量响应物质与靶向位于所述细胞的内部、所述细胞的膜上或所述组织样品的细胞外基质中的抗原的抗体相关。
25.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一反射表面和第二反射表面具有宽反射带。
26.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一反射表面和第二反射表面具有可调反射带，并且所述一种或更多种激光能量响应物质包含具有第一激光射阈能量的第一激光能量响应物质和具有不同的第二激光射阈能量的不同的第二激光能量响应物质，其中所述方法还包括首先调谐所述第一反射表面和第二反射表面以具有第一反射带，其允许来自所述第一激光能量响应物质的激光发射经由那里传输，以使得在能量的引导之后，所述检测是对由所述第一激光能量响应物质产生的一个或更多个发射的检测，并且所述方法还包括调谐所述第一反射表面和第二反射表面以具有不同的第二反射带，其允许来自所述第二激光能量响应物质的激光发射经由那里传输，其中然后进行能量的引导，以使得所述检测是对由所述第二激光能量响应物质产生的一个或更多个发射的检测。
27.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二反射表面对由所述组织样品中的一种或更多种激光能量响应物质产生的一个或更多个激光发射的反射率大于或等于约80％至小于或等于约99.999％。
28.根据权利要求17所述的方法，其还包括检测在所述组织样品中产生的一个或更多个明视场发射或荧光发射，其中所述二维扫描是所述激光发射与所述明视场发射、荧光发射或者所述明视场发射和所述荧光发射二者的复合叠加。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述检测包括检测荧光发射，并且所述方法还包括首先移除所述第二反射表面。
30.根据权利要求17所述的方法，其中由所述组织样品中的一种或更多种激光能量响应物质产生的一个或更多个激光发射提供以下中的至少一种：癌组织亚型的鉴定、癌症的早期检测、癌症阶段的鉴定或激光发射的直方图。
31.用于对组织学组织样品中的一种或更多种生物标志物进行量化的方法，所述方法包括：
将来自激光泵浦源的能量引导至设置在扫描腔内的固定的组织学组织样品，所述扫描腔的至少一部分限定形成在第一反射表面与第二反射表面之间的法布里-珀罗谐振腔，所述谐振腔具有大于或等于约1×102的品质因数(Q)，其中所述组织学组织样品包含能够与至少一种生物标志物相关的一种或更多种激光能量响应物质，并且所述第二反射表面或相干电磁辐射激光能量源的源中的至少一个相对于设置在所述扫描腔内的所述固定的组织样品平移；以及
检测由所述组织学组织样品中的一种或更多种激光能量响应物质产生的一个或更多个激光发射，以对所述组织学组织样品中存在的至少一种生物标志物的数量进行量化。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述一种或更多种激光能量响应物质包含第一激光能量响应物质和不同的第二激光能量响应物质，并且引导至所述固定的组织样品的能量小于所述第一激光能量响应物质的第一激光射阈能量并且大于所述第二激光能量响应物质的第二激光射阈能量，以使得所述一个或更多个发射的检测仅检测来自所述组织样品中的第二激光能量响应物质的激光发射。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述至少一种生物标志物与所述固定的组织样品内的细胞的核相关，以使得由所述一种或更多种激光能量响应物质产生的一个或更多个发射的检测对应于由所述细胞的核产生的发射，以使得所述量化计算所述组织样品中细胞的核的数量。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述一个或更多个发射的检测涉及所述组织样品的不同区域中至少一种生物标志物的浓度分布，其中改变引导至所述组织样品的能量的激发强度以测量所述组织样品的不同区域中生物标志物的浓度。
35.根据权利要求31所述的方法，其中所述一种或更多种激光能量响应物质包含具有第一激光射阈能量的第一激光能量响应物质和具有不同的第二激光射阈能量的不同的第二激光能量响应物质，以使得对来自所述激光泵浦源的能量的引导包括提高能级以首先激发所述第一激光能量响应物质并随后激发所述第二激光能量响应物质，以使得所述一个或更多个发射的检测检测来自所述第一激光能量响应物质和所述第二激光能量响应物质的发射，其映射所述组织学组织样品内第一激光能量响应物质和第二能量响应物质的分布。
36.根据权利要求31所述的方法，其中所述一种或更多种激光能量响应物质包含具有第一激光射阈能量的第一激光能量响应物质，其中提高引导至所述组织学组织样品的能量的量，以使得所述检测映射所述组织学组织样品中第一激光能量响应物质的浓度分布。
37.根据权利要求31所述的方法，其中由所述一种或更多种激光能量响应物质产生的一个或更多个发射具有小于或等于0.7微米的空间分辨率。
38.根据权利要求31所述的方法，其中所述第一反射表面和第二反射表面具有宽反射带。
39.根据权利要求31所述的方法，其中所述第一反射表面和第二反射表面具有可调反射带，并且所述一种或更多种激光能量响应物质包含具有第一激光射阈能量的第一激光能量响应物质和具有不同的第二激光射阈能量的不同的第二激光能量响应物质，其中所述方法还包括首先调谐所述第一反射表面和第二反射表面以具有第一反射带，其允许来自所述第一激光能量响应物质的激光发射经由那里传输，以使得在能量的引导之后，所述检测是对由所述第一激光能量响应物质产生的一个或更多个发射的检测，并且所述方法还包括调谐所述第一反射表面和第二反射表面以具有不同的第二反射带，其允许来自所述第二激光能量响应物质的激光发射经由那里传输，其中然后进行能量的引导，以使得所述检测是对由所述第二激光能量响应物质产生的一个或更多个发射的检测。
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