JP3766421B2 - 生体試料光学測定方法及び生体試料光学測定装置 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、生体試料の蛍光画像及び透過光画像を撮像する生体試料光学測定方法及び生体試料光学測定装置に関する。
背景技術
感染症原因ウイルスやガンなどの細胞を蛍光標識抗体や核酸プローブと反応させ、感染や異常の検知を行う方法が、広く細胞診や感染症検査の手法として用いられている（『臨床検査 増刊号＜細胞診−２１世紀への展望＞Vol.44,No.11』医学書院,東京、2000年10月刊行参照）。しかし、蛍光標識物は対象物以外の物体や壁面に非特異的に吸着することもあり、細胞や組織に確実に対象ウイルスや遺伝子が存在することを検知するには、細胞や組織などの実構造を示す画像との対照が望まれる。このような蛍光画像と実画像とを撮像することは、従来の蛍光顕微鏡でも可能であるが、その場合には蛍光測定用の試料と実画像（染色画像）用の試料を別々に用意するのが一般的である。組織切片のように近接した細胞の薄片では試料間の相違はわずかであるが、塗沫標本のように、同一の試料片を用意するのが困難な試料の場合、このような別個の試料では正確な判定が困難である。
そこで同一の試料から蛍光標識画像と染色画像を得ることを試みると、染色用の色素のために蛍光測定が影響を受けることがあり、これを回避する方法を考案する必要がある。例えば、位相差を利用し、染色を行わず、細胞の透過画像を得ることも可能であるが、染色画像のような鮮明なコントラストが得にくい。また実細胞像と蛍光画像を精度よく位置を対比させることは、手作業の顕微鏡操作では困難を極める。
また、細胞計測を目的とする手段として特開2000-310637号公報があるが、化学発光物質を標識とし、発光画像から検出した発光位置に顕微鏡の視野をあわせ、染色された細胞構造を観察するとしているが、発光、染色各画像を個別に評価することから、発光している標識と細胞との対応関係の判別が上述のように困難である問題がある。
さらに、特開平8-112099号公報には、トンネル走査型電子顕微鏡で生体試料の微細映像を撮像しつつ、微細電子ビーム等の照射により発する蛍光を光電変換装置で捕らえ、微細画像に光電変換装置で得られた画像データを重ね合わせる方法が開示されている。しかしながら、この公開公報では、トンネル走査型電子顕微鏡で微細画像を撮像しながら蛍光を検出しているため、最終的な画像を得るための装置構成が非常に複雑になるという問題がある。
したがって、従来において、上記のような臨床検査作業は、顕微鏡操作、染色操作とも手作業で行うこととなり、作業者の肉体的な疲労等によりエラーを生じがちであった。
発明の開示
そこで、本発明は、このような実状に鑑みて案出されたものであり、生体試料の所定の部位における蛍光又は発光について正確な位置を検出することができる生体試料光学測定方法及び生体試料光学測定装置を提供することを目的としている。
上記目的を達成した本発明は、以下を包含する。
（１）生体試料の少なくとも一部の蛍光又は発光画像を撮像し、上記生体試料の少なくとも一部の透過光画像を撮像し、上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像とを、上記生体試料の上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像とを対応づけて重ね合わせて表示することを特徴とする生体試料光学測定方法。
（２）上記透過光画像は、上記蛍光又は発光画像と比較して高解像度であることを特徴とする（１）記載の生体試料光学測定方法。
（３）上記透過光画像の解像度を、上記蛍光又は発光画像の解像度と比較して２〜２０倍とすることを特徴とする（１）記載の生体試料光学測定方法。
（４）上記蛍光又は発光画像を撮像した後、上記生体試料に染色処理を施し、その後、上記透過光画像を撮像することを特徴とする（１）記載の生体試料光学測定方法。
（５）上記生体試料を保持する保持部に設けられた光学識別マークを基準にして、上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像とを位置決めして撮像することを特徴とする（１）記載の生体試料光学測定方法。
（６）生体試料の少なくとも一部を測定した蛍光又は発光画像と当該生体試料の少なくとも一部を測定した透過光画像とを記憶する画像データ記憶機能と、上記蛍光又は発光画像の画像データと上記透過光画像の画像データと演算する演算機能とを備え、上記画像データ記憶機能に記憶した上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像とを、上記演算機能により演算処理した上で、上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像と重ね合わせて表示することを特徴とする生体試料光学測定装置。
（７）上記蛍光又は発光画像及び上記透過光画像を測定する光学測定手段を備えることを特徴とする（６）記載の生体試料光学測定装置。
（８）上記光学測定手段は、上記透過光画像と比較して上記蛍光又は発光画像を高解像度で撮像することを特徴とする（７）記載の生体試料光学測定装置。
（９）光学識別マークが設けられ、上記生体試料を保持する保持部を備え、上記保持部の光学識別マークを基準として上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像とを位置決めして撮像することを特徴とする（６）記載の生体試料光学測定装置。
（１０）上記光学識別マークは複数のリング状パターンであり、当該光学識別マークの画像データからそれぞれのリング状パターンの中心点座標を取得した後、当該中心点座標を基準点として、上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像とを位置決めして撮像することを特徴とする（９）記載の生体試料光学測定装置。
（１１）上記光学測定手段は、先ず、上記蛍光又は発光画像を撮像し、次いで透過光画像測定のための生体試料の染色処理が実施された後、上記透過光画像を撮像することを特徴とする（７）記載の生体試料光学測定装置。
（１２）上記生体試料に対して染色処理を行う染色処理手段を備えることを特徴とする（６）記載の生体試料光学測定装置。
（１３）蛍光物質又は発光物質が結合した生体試料から蛍光又は発光画像を取得し、染色処理を施した上記生体試料から透過光画像を取得することを特徴とする（６）記載の生体試料光学測定装置。
（１４）生体試料から発せられた蛍光又は発光を検出する蛍光又は発光検出部と、上記生体試料に対して光を照射するとともに当該光の照射により当該生体試料を透過した透過光を検出する透過光検出部と、上記蛍光又は発光測定部で測定した蛍光又は発光画像及び上記透過光検出部で測定した透過光画像の各画像データを記憶する画像記憶部と、上記画像記憶部に記憶された蛍光又は発光画像の画像データ及び透過光画像の画像データを演算する画像データ演算部と、上記画像データ演算部で蛍光又は発光画像の画像データ及び透過光画像の画像データを演算し、当該蛍光又は発光画像及び当該透過光画像を重ね合わせて表示する画像表示部とを有することを特徴とする生体試料光学測定装置。
（１５）上記蛍光又は発光検出部は、上記生体試料に対して光学的ビームを走査しながら照射するとともに当該光学的ビームの照射により当該生体試料から励起された蛍光を検出することを特徴とする（１４）記載の生体試料光学測定装置。
（１６）上記蛍光又は発光検出部は、上記生体試料に対して発光処理を施すことにより発する発光を検出することを特徴とする（１４）記載の生体試料光学測定装置。
（１７）上記蛍光又は発光検出部は、上記生体試料から励起された蛍光を２次元画像情報として入力し、上記透過光検出部は、上記蛍光又は発光検出部に入力した２次元画像情報よりも高解像度の透過光画像情報を入力することを特徴とする（１４）記載の生体試料光学測定装置。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明を適用した生体試料光学測定装置を示す要部構成図である。
図２（a）は、生体試料保持部の要部上面図である。
図２（b）は、他の生体試料保持部の要部上面図である。
図２（c）は、更に他の生体試料保持部の要部上面図である。
図３（a）は、位置合わせを説明するための概念図であり、識別マークの透過光画像を示す概念図である。
図３（b）は、位置合わせを説明するための概念図であり、デジタイズした透過光画像を示す概念図である。
図３（c）は、位置合わせを説明するための概念図であり、「row」側の強度分布を示す特性図である。
図３（d）は、位置合わせを説明するための概念図であり、「column」側の強度分布を示す特性図である。
図４（a）は、蛍光画像と透過光画像との合成過程を説明するための概念図であり、測定対象の細胞を示す概念図である。
図４（b）は、蛍光画像と透過光画像との合成過程を説明するための概念図であり、蛍光画像を示す概念図である。
図４（c）は、蛍光画像と透過光画像との合成過程を説明するための概念図であり、透過光画像を示す概念図である。
図４（d）は、蛍光画像と透過光画像との合成過程を説明するための概念図であり、合成した画像の一例を示す概念図である。
図４（e）は、蛍光画像と透過光画像との合成過程を説明するための概念図であり、合成した画像の他の例を示す概念図である。
図４（f）は、蛍光画像と透過光画像との合成過程を説明するための概念図であり、合成した画像の更に他の例を示す概念図である。
図５は、本発明を適用した他の生体試料光学測定装置を示す要部構成図である。
図６は、本発明を適用した他の生体試料光学測定装置を示す要部構成図である。
図７は、図６に示した生体試料光学測定装置の試料染色部を示す要部斜視図である。
符号の説明
１……検体、1-1a、b、c、d……識別マーク、２……生体試料保持部、３……生体試料保持部駆動系、3-1……支持ガイド、3-2……θ軸調整用ステージ、3-3……X軸方向微動ステージ、3-4……Y軸方向微動ステージ、3-5……X軸方向粗動ステージ、3-6……駆動制御部、４……蛍光励起用レーザ光源、５……励起光光学系、６……ロングパスフィルタ、７……蛍光光学系、８……蛍光検出部、９……透過光光源、10……透過光光学系、11……２次元カラーイメージセンサ、12……蛍光画像記憶部、13……透過光画像記憶部、14……画像バッファ、15……画像データ演算部、16……画像表示部、17……水銀ランプ、18……バンドパスフィルタ、19……２次元単色イメージセンサ、20……識別マーク付き生体試料保持部、21……試料染色部、22……染色液噴霧部、23……染色液回収部、24……洗浄液噴霧部、25……洗浄液回収部、26……染色液容器群、26-1……染色液Ａ容器、26-2……染色液Ｂ容器、26-3……透徹液容器、26-4……配管洗浄液容器、27……洗浄液容器群、27-1……洗浄液容器、27-2……分別液容器、27-3……親和液Ａ容器、27-4……親和液Ｂ容器、28……電磁弁、29……電磁弁、30……電磁弁、31……電磁弁、32……染色液供給ポンプ、33……染色液回収ポンプ、34……洗浄液供給ポンプ、35……洗浄液回収ポンプ、36……染色液配管系、37……洗浄液配管系、38……洗浄液廃液容器
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は、これらの形態にその技術的範囲を限定するものではない。
本発明を適用した生体試料光学測定装置を図１に示す。生体試料光学測定装置は、検体１を保持した生体試料保持部２と、生体試料保持部２を所望の位置に駆動する生体試料保持部駆動系３とを備えている。生体試料光学測定装置は、検体１に対してウィルス、例えばHPV、HCV、HIV等が感染しているか否かを判別するとともに、ウィルスの感染部位を同定するものである。検体１としては、検査対象となる生体組織切片、培養細胞、あるいは塗沫標本をあげることができ、プローブDNAによるハイブリダイゼーション処理をされているものとする。プローブDNAは、判別対象のウィルス由来DNAにハイブリダイズできる塩基配列を含み、蛍光標識物質が結合されている。蛍光標識物質としては、特に限定されないが、例えば所定の波長の励起用レーザが照射されると当該励起用レーザの波長よりも長波長の蛍光を発するものを使用することができる。具体的に、蛍光標識物質としては、アマシャム ファルマシア バイオテク社製の蛍光体であるCy-2、Cy-3、Cy-5、Cy-7等を例示することができる。また、プローブDNAに対しては、蛍光標識物質の替わりに化学又は生物発光物質を結合させても良い。化学又は生物発光物質としては、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、ペルオキシダーゼ及びルミノール等を使用することができる。
生体試料保持部駆動系３は、生体試料保持部２を支持する支持ガイド3-1と、生体試料保持部２を面内方向（θ軸）で回転させるθ軸調整用ステージ3-2と、生体試料保持部２を面内の所定の方向（X軸）に移動させるX軸方向微動ステージ3-3と、生体試料保持部２を面内のX軸と直交する方向（Y軸）に移動させるY軸方向微動ステージ3-4と、生体試料保持部２をX軸方向に比較的大きく駆動するX軸方向粗動ステージ3-5とを備える。また、生体試料保持部駆動系３は、これらθ軸調整用ステージ3-2、X軸方向微動ステージ3-3、Y軸方向微動ステージ3-4及びX軸方向粗動ステージ3-5の駆動を制御する駆動制御部3-6を備えている。駆動制御部3-6がX軸方向微動ステージ3-3及びY軸方向微動ステージ3-4の駆動を制御することによって、検体１を保持した生体試料保持部２を所望の方向に走査させることができる。
生体試料光学測定装置は、生体試料保持部２に保持された検体１の蛍光画像を測定するための蛍光励起用レーザ光源４と励起光光学系５とロングパスフィルタ６と蛍光光学系７と蛍光検出部８とを備えている。蛍光励起用レーザ光源４は、例えば、半導体レーザ装置、YAGレーザ装置、He-Neレーザ装置又はArレーザ装置等からなり、所定の波長の励起用レーザを出射することができる。蛍光励起用レーザ光源４は、プローブDNAに結合した蛍光標識物質の種類に応じて、所望の波長の励起用レーザを出射するものを選択する。例えば、複数種類の蛍光標識物質を使用した場合、蛍光励起用レーザ光源４としては、それぞれの蛍光標識物質に応じた複数の波長のレーザを出射するレーザ装置か、或いは、それぞれの蛍光標識物質に応じた波長のレーザを出射する複数のレーザ装置を使用する。励起光光学系５は、レンズ等を有し、蛍光励起用レーザ光源４から出射された励起用レーザを検体１上に集光することができる。ロングパスフィルタ６は、所定の波長を越える波長成分のみを透過することができる。蛍光光学系７は、集光レンズを有し、ロングパスフィルタ６を透過した蛍光を集光することができる。蛍光検出部８は、例えば、光電子増倍管又はCCD等の光センサを有し、蛍光光学系７で集光した蛍光を検出するとともに、検出した蛍光の蛍光強度をデジタルデータに変換する。
生体試料光学測定装置は、生体試料保持部２に保持された検体１の透過光画像を測定するための透過光光源９、透過光光学系10、２次元カラーイメージセンサ11を備えている。透過光光源９は、例えば、ハロゲンランプであり、検体１を透過する透過光を出射することができる。透過光光学系10は、レンズ等を有し、検体１を透過した透過光を集光することができる。２次元カラーイメージセンサ11は、透過光光学系10で集光された透過光を検出するとともに、検出した透過光のカラー画像をＲ、Ｇ、Ｂ各色の画像データに変換する。
生体試料光学測定装置は、蛍光検出部８で得られた蛍光画像に関するデジタルデータを記憶する蛍光画像記憶部12と、２次元カラーイメージセンサ11で得られた画像データを記憶する透過光画像記憶部13と、これら蛍光画像記憶部12及び透過光画像記憶部13に記憶されたデジタルデータ及び画像データを読み出して保存する画像バッファ14と、画像バッファ14に保存されたデジタルデータ及び画像データを演算して表示画像データを合成する画像データ演算部15と、画像データ演算部15で合成され画像バッファに保存された表示画像データから蛍光画像及び透過光画像を重ね合わせた画像を表示する画像表示部16とを備えている。
一方、生体試料保持部２は、図２（a）〜（c）に示すように、測定対象領域Ｒと、生体試料光学測定装置において正確に位置決めを行うための識別マークとを有している。なお、図２（a）〜（c）は、生体試料保持部２のバリエーションをそれぞれ示している。
図２（a）に示す生体試料保持部２は、基板と、基板の略中心部に配置された測定対象領域Ｒと、この測定対象領域Ｒを挟み込むように配設された一対の識別マーク1-1a、1-1bとから構成されている。基板は、例えば、厚さ0.5〜1.5ｍｍの石英ガラス板又は少なくとも測定対象領域Ｒが上述した励起用レーザに対して透明である材料から構成されている。識別マーク1-1a、1-1bは、それぞれ、直径5〜100μｍの同心円状を呈してなり、基板に対するエッチング処理等でリング部を形成した後に当該リング部内側に蛍光剤をプリントすることにより形成される。識別マーク1-1a、1-1bをこのように形成することによって、蛍光検出部８と２次元カラーイメージセンサ11のいずれからも認識することができる。
また、図２（b）に示した生体試料保持部２は、例えば市販のスライドグラスに対して、検体に関する情報をバーコード1-3で記録し、当該バーコード1-3をプリントしたタグシール1-2上に２個所の識別マーク1-1a、1-1bを設けたものである。すなわち、図２（b）に示した生体試料保持部２は、市販のスライドグラス等における測定対象領域Ｒ以外の位置にタグシール1-2を貼り付けることによって形成される。
さらに、図２（c）に示した生体試料保持部２は、基板と、基板の略中心部に配置された測定対象領域Ｒと、この測定対象領域Ｒの四隅に配設された４つの識別マーク1-1a、1-1b、1-1c、1-1dとから構成されている。すなわち、図２（c）に示した生体試料保持部２では、４つの識別マーク1-1a、1-1b、1-1c、1-1dをこの順で結んで囲まれた領域が測定対象領域Ｒとなっている。
これら図２（a）〜（c）に示した生体試料保持部２の位置合わせは、識別マーク1-1a、1-1b（1-1c、1-1d）を基準として以下の手順で行われる。まず、識別マーク1-1aを透過光画像の測定範囲に位置するよう移動し、識別マーク1-1aの透過光画像の測定を行う（図３（a））。次いで、駆動制御部3-6から得られるX軸方向微動ステージ3-3及びY軸方向微動ステージ3-4の原点位置と識別マーク1-1aの中心位置との距離を求める。
具体的には、得られた識別マーク1-1aの透過光画像をデジタイズし、識別マーク1-1aのｍ×ｎマトリックス状ピクセルのデジタル画像（図３（b））を得る。次に、得られたデジタル画像における「row」側の強度分布を求める（図３（c））。すなわち、図３（c）に示した信号強度とX座標との関係を示すグラフにおいて、信号強度の最大値の間隔が最大となるようにWを設定し、W/2となるX座標を識別マーク1-1aのX軸方向の中心点（Xa-center）とする。同様に、得られたデジタル画像における「column」側の強度分布を求め（図３（d））、識別マーク1-1aのY軸方向の中心点（Ya-center）を求める。このように、識別マーク1-1aについて、中心点が座標（Xa-center,Ya-center）として求められる。求められた識別マーク1-1aの中心座標（Xa-center,Ya-center）を、後述する画像測定における原点とする。識別マーク1-1aの中心座標は、駆動制御部3-6に記録する。
次にX軸方向微動ステージ3-3及びY軸方向微動ステージ3-4を駆動し、識別マーク1-1bの透過光画像を測定し、当該識別マーク1-1bについて中心座標を求める。識別マーク1-1bの中心座標は、上述した識別マーク1-1aと同様に、（Xb-center,Yb-center）として求めることができる。
次に、θ軸調整用ステージ3-2を駆動して、識別マーク1-1a及び1-1bの中心点を結ぶ直線がX軸とを平行にする。言い換えると、識別マーク1-1a及び1-1bの中心点を結ぶ直線とX軸とのなす角θが０となるように、θ軸調整用ステージ3-2を駆動する。具体的には、識別マーク1-1aの中心座標（Xa-center,Ya-center）と識別マーク1-1bの中心座標（Xb-center,Yb-center）とにおいて、Ya-centerとYb-centerとが一致するようにθ軸調整用ステージ3-2を駆動する。
そして、生体試料保持部２の原点を識別マーク1-1aの中心座標とし、透過光画像の撮像及び蛍光画像の撮像を行う。以上のようにして、透過光画像の撮像及び蛍光画像の撮像の際に用いる原点を得ることができる。図２（a）に示した生体試料保持部２では、位置合わせの際の識別マーク1-1a及び1-1bの確認を高精度且つ短時間で行うことができる。また、図２（b）に示した生体試料保持部２は、消耗品となる市販のスライドグラスを用いることができるため低コスト化を図ることができる。図２（b）に示した生体試料保持部２は、一旦、生体試料光学測定装置から取り外された場合でも、バーコードに記録された検体情報等をバーコードで記録しているため、検体１の管理を容易に行うことができる。このとき、撮像した透過光画像及び/又は蛍光画像の画像データを関連づけて記録することによって、検体１の管理とともに生体試料保持部２を容易に管理することが可能となる。図２（c）に示した生体試料保持部２は、測定対象領域Ｒの四隅にそれぞれ識別マーカ1-1a、1-1b、1-1c、1-1dを配設しているため、上述した位置合わせと同時に、測定対象領域Ｒを高精度に且つ迅速に認識することができる。また、生体試料保持部２が異なる形状であっても、測定対象領域Ｒを容易に確認することができる。
なお、生体試料保持部としては、図２（a）〜（c）に示したものに限定されず、生体試料保持部２の端面を基準面として位置合わせを行うもの、或いは検体１を固定する際に測定対象領域Ｒ付近の任意の箇所に蛍光ビーズ等によりマーキングを行い、これを原点とするものであってもよい。このような場合、生体試料保持部２としては、予め特殊な処理を施すことなく画像測定の位置合わせを行うことができる。
以上のように、生体試料保持部２を位置合わせした生体試料光学測定装置を用いて、以下のように検体１の蛍光画像及び透過光画像を撮像する。本例では、ウィルス由来DNAに対してハイブリダイズする塩基配列を有するDNAプローブに蛍光標識物としてアマシャム ファルマシア バイオテク社製のCy-5(R)を結合させ、当該DNAプローブを用いて細胞に対する上記ウィルスの感染判定及び感染部位の同定を行う。
先ず、生体試料光学測定装置では、検体１の蛍光画像を撮像する。蛍光画像を撮像する際には、レーザ光源４から励起用レーザを検体１に対して照射する。本例では、蛍光標識物としてアマシャム ファルマシア バイオテク社製のCy-5(R)を使用しているため、波長635nm蛍光励起用レーザを出射する半導体レーザをレーザ光源４として用いる。当該励起用レーザを照射すると、細胞中に670nm以上の波長の蛍光が観察される。細胞で観察される蛍光は、ロングパスフィルター６を透過することができ、蛍光光学系７を介して集光され、蛍光検出部８に入射する。なお、蛍光励起用レーザは、ロングパスフィルター６により遮蔽され、蛍光検出部８に入射することはない。
これにより、検体１における蛍光検出が可能となる。検出した蛍光強度は、例えば、16bitのデジタルデータに変換し、蛍光画像記憶部12に保存する。このとき、例えば、励起用レーザを励起光光学系５により集光して直径10μｍ以内のスポット径とする。そして、生体試料保持部２の裏面から検体１に対して当該励起用レーザを照射し、生体試料保持部駆動系３により生体試料保持部２を移動させることにより励起用レーザ照射部分を走査しながら蛍光検出部８で蛍光を検出する。これにより、蛍光検出部８では、解像度10μｍの蛍光画像を得ることができる。
このとき、検体１は、検査対象のウイルスに対応したプローブDNAによりハイブリダイゼーション処理されているため、検体１中の蛍光の有無を調べることで対象とするウイルスに感染しているか否かの一次スクリーニングを行うことができる。この一次スクリーニングによって検体１中に蛍光が観察された場合、その位置を駆動制御部3-6において記憶し、後述する透過光画像測定の位置合わせの際に基準測定位置とする。本例において、蛍光の励起を直径10μｍ以内に集光した励起用レーザで行うことにより、蛍光標識物質に対する照射光強度を向上することができ、その結果、蛍光標識物質の発する蛍光量を増大させ蛍光の検知感度を向上させることができる。
また、本例において、複数のプローブDNAそれぞれに対して異なる蛍光標識物質を用いた場合には、異なる波長の励起用レーザを出射できる蛍光励起用レーザ光源４を用いる。これにより、検体１中に観察される複数の蛍光を検出することができ、これら複数の蛍光についての蛍光画像を得ることができる。
次に、蛍光画像により蛍光標識物質の存在が確認された検体１について、透過光画像の測定を行う。透過光画像の測定に先だって、蛍光画像測定後の検体１を生体試料保持部２ごと生体試料光学測定装置から分離し、検体１に含まれる細胞構造を観察可能とするための染色処理を行うことが好ましい。染色処理後、生体試料保持部２を生体試料保持部駆動系３に装着する。
このとき、生体試料保持部２の識別マーク1-1a、1-1bを二次元イメージセンサ11により観察しながら、図３を用いて説明した生体試料保持部２の位置合わせと同様に、θ軸調整用ステージ3-2を駆動して識別マーク1-1a及び1-1bの中心点を結ぶ直線とX軸とのなす角θが０となるように補正するとともに、識別マーク1-1aの中心座標すなわち、原点を一致させる。具体的に、二次元イメージセンサ11で観察した識別マーク1-1aの中心が駆動制御部3-6に記録された識別マーク1-1aの中心座標と一致するように、X軸方向微動ステージ3-3及びY軸方向微動ステージ3-4を駆動する。
次に、検体１の透過光画像を撮像する。透過光画像の撮像に際しては、X軸方向粗動ステージ3-5を駆動し、上記蛍光画像の撮像に際して蛍光が観察された位置（基準測定位置）が少なくとも視野に入るように生体試料保持部２を移動する。透過光画像は、可視光域において連続したスペクトルを透過光光源９から出射し、検体１の透過光を２次元カラーイメージセンサ11によって検出することによって撮像する。２次元カラーイメージセンサ11によって検出された透過光画像は、Ｒ、Ｇ、Ｂ各色８bitずつの画像データとして透過光画像記憶部13に保存される。
このとき、透過光画像の撮像は、蛍光が観察された周辺領域のみに限定して行えばよい。したがって、透過光画像を高解像度に撮像することができる。例えば、２次元カラーイメージセンサ11を1000×1000画素、一片12mmサイズのCCDにより構成し、透過光光学系10による拡大倍率が30倍である場合、0.4mmの正方形領域について最小で0.4μｍの画素で透過光画像を得ることができる。ただし、この場合、透過光光学系10で決まる光学的解像度は0.4μｍ以下とする。これに対して、上述した蛍光画像の撮像に際しては、検体１の全領域について測定する必要があるため、検体１の測定対象領域を20×40mm、蛍光画像の画素数を2000×4000画素とすると、解像度、つまり画素の大きさは10μｍとなる。
透過光画像の解像度としては、一般的な細胞の大きさが10μｍ程度、細胞核の大きさが２μｍ程度であるため、透過光画像が少なくとも細胞核を解像可能である必要があるため、0.1〜1μｍであることが好ましい。一方、蛍光画像の解像度としては、プローブDNAに結合した蛍光標識物質の蛍光が細胞核の核内又は核外にあるか、若しくは細胞内又は外にあるかどうかの判定ができれば良いことから透過光画像の解像度よりも低くて良い。具体的に、透過光画像の解像度を蛍光画像の解像度の２〜20倍とすることが好ましい。
次に、蛍光画像記憶部12に記録された蛍光画像と透過光画像記憶部13に記録された透過光画像とを対応づけて重ね合わせ、画像表示部16に表示する。このとき、先ず、蛍光画像記憶部12から蛍光画像を読み出し画像バッファ14に蓄積するとともに、透過光画像記憶部12から透過光画像を読み出し画像バッファ14に蓄積する。次に、画像バッファ14に蓄積された蛍光画像及び透過光画像を、画像データ演算部15で合成して表示画面データを作製する。
ここで、「対応づけ」とは、例えば、蛍光画像と透過光画像とが生体試料又はそれを保持する生体試料保持部２の位置情報により、相互の位置が仮想的に調整又は制御されることを意味する。
例えば、図４（a）に示す細胞を、図４（b）に示すように画素サイズ２μｍで蛍光画像を撮像し、図４（c）に示すように画素サイズ１μｍで透過光画像を撮像した場合、蛍光画像の解像度は透過光画像に対して２倍であるので、蛍光画像記憶部12中の画像データ１画素を、2×2=4画素に分割した上で読み出しを行う。
画素の分割数は蛍光画像と透過光画像の解像度の比に応じて決まり、前述のように蛍光画像の解像度が10μｍ、透過光画像の解像度が0.5μｍの場合には、蛍光画像の１画素は20×20=400画素に分割される。また、画像バッファ14は、透過光画像の画素に合わせて１画素あたりＲ、Ｇ、Ｂ各色８bitで構成される。一方、蛍光画像の単色16bitの画像データは、24bit階調のデータに写像されるように画像データ演算部15で変換処理されるものとする。表示画面データは、画像データ演算部15で、画像バッファ14内の蛍光画像と透過光画像の対応する各24bitの画素データとの論理和をとることによって得られる。得られた表示画像データは、画像バッファ14に再度保存する。画像バッファ14内の表示画面データを画像表示部16で表示することにより、蛍光画像と透過光画像の合成した画面を観察することができる。
蛍光画像及び透過光画像を重ね合わせた結果としては、例えば、図４（d）、（e）及び（f）に示すように、画像表示部16に表示画面データが表示される。図４（d）は、蛍光標識物質の蛍光が検出されない場合であり、検出対象のウィルス由来DNAが存在しないことを示唆している。また、図４（e）は、蛍光標識物質の蛍光が細胞質に検出された場合であり、検出対象のウィルス由来DNAが細胞質に存在することを示唆している。また、図４（f）は、蛍光標識物質の蛍光が核に検出された場合であり、検出対象のウィルス由来DNAが核内に存在することを示唆している。
本例によれば、蛍光標識物質の蛍光を検出することによって陽性/陰性などの判定において、透過光画像と蛍光画像を合成して表示することにより、表示画像からより多くの情報を得ることができる。詳しくは、蛍光の検出に基づく陽性/陰性の判定のみならず、蛍光を発する部位を詳細に同定することができる。特に、生体試料光学測定装置では、透過光画像を蛍光画像と比較して高解像度に撮像している。この場合には、蛍光を発する部位を更に詳細に同定することができる。
また、本例では、蛍光画像を撮像した後に透過光画像の撮像を行っており、少なくとも蛍光が検出された部位を含むように透過光画像を撮像している。すなわち、透過光画像としては、判定対象の細胞全体にわたって撮像する必要が無く、当該細胞の一部のみを撮像すればよい。このため、透過光画像の解像度が高くても、透過光画像記憶部に記録するデータ量を少なくすることができる。
また、本例では、励起用レーザを検体１に対して照射して蛍光標識物質からの蛍光を検出している。このため、検体１に対する照射光量密度を上げることができ、蛍光標識物質の蛍光を高感度に検出することができる。したがって、本例においては、検出対象のウィルス由来DNAを有する細胞の発見確率を高めることができる。また、本例で説明した生体試料光学測定装置では、励起用レーザを走査する際にX軸方向微動ステージ3-3及びY軸方向微動ステージ3-4を用い、蛍光画像の撮像と透過光画像の撮像とを切り替える際にX軸方向粗動ステージ3-5を用いている。このため、生体試料光学測定装置によれば、精密な位置合わせと上記切り替えとを迅速且つ高精度に行うことができる。
ところで、本発明は上述したような生体試料光学測定装置に限定されず、図５に示すような生体試料光学測定装置であってもよい。図５に示す生体試料光学測定装置は、蛍光標識物質を励起させる拡散光を出射する水銀ランプ17と、当該拡散光に含まれる波長のうちで蛍光標識物質が発する蛍光と重複する波長成分を除去するバンドパスフィルタ18と、検体１において励起された蛍光標識物質からの蛍光を検出するCCD等の２次元単色イメージセンサ19とを備えている。本生体試料光学測定装置において、拡散光を出射するために水銀ランプ17を用いたが、これに限定されず、拡散光を出射できるものであればキセノンランプ、水銀−キセノンランプ等の拡散光光源を適宜使用することができる。また、バンドパスフィルタ18は、例えば前述のCy-5(R)を使用した場合、600〜650nm以外の波長成分をカットするものを使用する。なお、本例で説明する生体試料光学測定装置は、これらの構成以外は図１に示した生体試料光学測定装置と同じ構成となっている。
以上のように構成された生体試料光学測定装置では、蛍光画像を撮像するに際してバンドパスフィルタ18を透過した拡散光を検体１に対して照射する。そして、生体試料保持部２における所定の領域の蛍光を２次元単色イメージセンサ19で検出する。２次元単色イメージセンサ19で検出した蛍光画像は、蛍光画像記憶部12に保存される。
この生体試料光学測定装置では、拡散光を検体１に対して照射するとともに２次元単色イメージセンサ19を用いて蛍光を検出するため、図１に示した生体試料光学測定装置と異なり、生体試料保持部駆動系３を駆動させて拡散光を走査する必要がない。したがって、図５に示した生体試料光学測定装置は、検体１における蛍光を非常に短時間に検出することができる。
特に、この生体試料光学測定装置は、いかなる蛍光標識物質を用いた場合であっても、拡散光光源である水銀ランプ17を交換する必要が無く、蛍光標識物質を励起する励起光の波長に応じてバンドパスフィルタ18を交換するだけでよい。すなわち、この生体試料光学測定装置は、単にバンドパスフィルタ18を交換することによって、水銀ランプ17から出射した拡散光に含まれる波長のうち所望の波長のみを透過させることができ、いかなる蛍光標識物質であっても励起させることができる。
さらに、この生体試料光学測定装置によれば、励起波長の異なる複数の蛍光標識物質を用いて検体１中の蛍光を測定する場合、これら励起波長に応じて複数のバンドパスフィルタ18を順次用いることによって、複数の蛍光標識物質からの蛍光を順次検出することができる。
複数種類のウイルス、例えばHPVではhigh-、low-、intermediate-の３種類のrisk群に分類されることから、これら３種類のウイルスに対応し、異なる蛍光標識物質を結合したプローブDNAにより検体１に対してハイブリダイゼーション処理を行うこともできる。この場合、バンドパスフィルタ18として３種類の蛍光標識物質に応じて複数種類用意し、測定中に複数のバンドパスフィルタ18を随時切り替えることによって、検体１における複数波長の蛍光画像を個別に測定することができる。これにより、生体試料光学測定装置によれば、検体１に感染したウィルスの種類を判別することができ、また、３種類のウィルスの感染部位を同定することができる。
本例で蛍光画像を測定する場合、例えば測定対象領域Ｒの大きさを20×40mmとすると、２次元単色イメージセンサ19の画素数を1000×1000とし、蛍光光学系７の倍率を1/10の縮小光学系とし、微動ステージ3-3で移動しながら２回に分けて測定対象領域Ｒの画像測定を行うことにより、画素サイズ10μｍで蛍光画像を撮像することができる。
蛍光画像を撮像した後、図１に示した生体試料光学測定装置と同様にして、透過光画像の撮像、蛍光画像と透過光画像との合成・表示を行うことができる。特に、本例によれば、蛍光の励起を拡散光源である水銀ランプ17で行い、かつ蛍光検知を2次元イメージセンサ19で行うことにより、検体１の広い領域の蛍光画像の撮像を短時間に行うことが可能で、検体１の数が多い場合に一次スクリーニングのスループットを向上できる効果がある。
一方、図１及び図５に示した生体試料光学測定装置においては、プローブDNAに対して蛍光標識物質を結合し、検体１の蛍光画像を撮像する例を説明したが、プローブDNAに対して化学又は生物発光物質を結合してもよい。この場合、化学又は生物発光物質の発光反応は溶液中で行われることから、生体試料光学測定装置には当該試薬を検体１に対して滴下する試薬滴下部を設けることが好ましい。
また、この場合、発光画像測定中はカバーグラス等により検体１に滴下した液表面を平坦化し、焦点のずれを防止することが好ましい。ただし、生体試料保持部２の下部から発光画像を測定するように発光画像検出系を配置すれば、カバーグラス等による液表面の平坦化をする必要はない。この場合、生体試料保持部２は、化学又は生物発光物質の発光に対して透明である必要がある。蛍光標識物質の替わりに化学又は生物発光物質を標識とした場合には、蛍光標識物質を励起するための蛍光励起用レーザ光源４、励起光光学系５、ロングパスフィルタ６及びバンドパスフィルタ18等を配設する必要がない。従って、化学又は生物発光物質を標識として使用する場合には、生体試料光学測定装置の光学系を簡略化することができ、装置全体を小型化することができ、且つ低コスト化することができる。
ところで、本発明を適用した生体試料光学測定装置としては、図６及び図７に示すように、透過光画像の撮像に先立って検体１に対して染色処理を施すための試料染色部21を備えるものであっても良い。本例では、検体１が識別マーク付き生体試料保持部20に保持されている。図６及び図７に示す生体試料光学測定装置において、試料染色部21は、染色液噴霧部22及び染色液回収部23からなる染色処理部と、洗浄液噴霧部24及び洗浄液回収部25からなる洗浄処理部とを備える。また、生体試料光学測定装置は、図示しないが、識別マーク付き生体試料保持部20を図６中矢印Aで示す方向に移動する移動制御手段を備えている。
染色液噴霧部22は、染色液回収部23に対向する側に穿設された複数の噴霧口を有する筒状部材からなる。複数の噴霧口は、移動制御手段によって識別マーク付き生体試料保持部20を移動した時に、少なくとも検体１全体に対して染色液等を噴霧できるように穿設されている。洗浄液噴霧部24は、洗浄液回収部25に対向する側に穿設された複数の噴霧口を有する筒状部材からなる。複数の噴霧口は、移動制御手段によって識別マーク付き生体試料保持部20を移動した時に、少なくとも検体１全体に対して洗浄液等を噴霧できるように穿設されている。染色液回収部23及び洗浄液回収部25は、それぞれ最低部に形成された廃液口と、廃液口に向かって下に傾斜した傾斜面とで構成されている。また、染色液回収部23及び洗浄液回収部25の間には、染色液と洗浄液との混合を防止するための突条部が形成されている。
染色液噴霧部22は、染色液配管系36を介して染色液容器群26と連結されている。染色液配管系36は、一方の端部が染色液噴霧部22と連結され、他方の端部が染色液回収部23の廃液口と連結されている。また、染色液噴霧部22と染色液溶液群26との間の染色液配管系36には、染色液供給ポンプ32と電磁弁29とが配設されている。染色液回収部23と染色液溶液26との間の染色液配管系36には、染色液供給ポンプ33と電磁弁28（28-1、28-2、28-3及び28-4）とが配設されている。
また、洗浄液噴霧部24は、同様に、洗浄液配管系37を介して洗浄液容器群27と連結されている。洗浄液回収部25の廃液口は、洗浄液配管系37を介して洗浄液廃液容器38と連結されている。洗浄液噴霧部24と洗浄液容器群27との間の洗浄液配管系37には、洗浄液供給ポンプ34と電磁弁31とが配設されている。洗浄液回収部25と洗浄液廃液容器38との間の洗浄液配管系37には、洗浄液供給ポンプ35と電磁弁30（30-1、30-2、30-3及び30-4）とが配設されている。
染色液容器群26は、例えば図７に示すように、染色液A容器26-1、染色液B容器26-2、透徹液容器26-3及び配管洗浄液容器26-4とから構成されている。すなわち、染色液容器群26は、検体１の透過光画像を撮像するための染色工程に必要な試薬や、染色液配管系36を洗浄するための洗浄液等を別個に保存した複数の容器を備えている。これら染色液A容器26-1、染色液B容器26-2、透徹液容器26-3及び配管洗浄液容器26-4は、それぞれ、染色液配管系36の中途部に配設された電磁弁28-1、28-2、28-3及び28-4により染色液配管系36との導通が制御されている。
洗浄液容器群27は、例えば図７に示すように、洗浄液容器27-1、分別液容器27-2、親和液A容器27-3及び親和液B容器27-4とから構成されている。すなわち、洗浄液容器群27は、染色工程の終了後に行う洗浄処理、分別処理及び親和処理に必要な試薬等を別個に保存した複数の容器を備えている。これら洗浄液容器27-1、分別液容器27-2、親和液A容器27-3及び親和液B容器27-4は、それぞれ、洗浄液配管系37の中途部に配設された電磁弁30-1、30-2、30-3及び30-4により洗浄液配管系37との導通が制御されている。洗浄液廃液容器38は、電磁弁31により洗浄液廃液容器38との導通が制御されている。
以上のように構成された生体試料光学測定装置では、上述した例と同様に蛍光画像を撮像した後、透過光画像を撮像するのに先立って、検体１に対して染色処理を施す。以下では、染色処理の一例として、ヘマトキシリン・エオジン重染色法を用いた場合について説明する。ヘマトキシリン・エオジン重染色法では、ヘマトキシリンにより主として細胞内の核を青紫色に染色するとともに、エオジンにより細胞質、細胞間質及び繊維素等を赤褐色又は暗褐色に染色する方法である。本染色法よれば、細胞内の一般的な情報を過不足なく透過光画像として得ることができる。したがって、本染色法は、病理診断において多用されている細胞染色法である。本染色法を用いることによって、高精度な透過光画像を得ることができ、ウィルス感染の診断等において感染の有無及び感染部位の同定について精度の高い診断が可能となる。
染色処理では、先ず、図示しない移動制御手段によって生体試料保持部２を図６中矢印Aで示す方向に移動させ、当該生体試料保持部２を試料染色部21における染色処理部に搬送する。
次に、検体１に対して染色液A容器26-1から供給されるヘマトキシリン液を、染色液噴霧部22から約４分間噴霧して染色する。ヘマトキシリン液を噴霧する際には、電磁弁28-1及び29-1のみを開放状態としながら染色液供給ポンプ32及び染色液回収ポンプ33を動作させる。これにより、染色液A容器26-1以外の容器に入った他の染色液等を混入させることなくヘマトキシリン液のみを噴霧させることができ、且つ、噴霧されたヘマトキシリン液を染色液回収部23で回収することができる。回収されたヘマトキシリン液は、染色液A容器26-1に移送され循環して再使用される。
次に、図示しない移動制御手段によって生体試料保持部２を洗浄処理部に移動し、検体１に対して洗浄液容器26-1より供給される蒸留水を洗浄液噴霧部24から約５分間供給して水洗する。蒸留水を供給する際には、電磁弁30-1及び31のみを開放状態としながら洗浄液供給ポンプ34及び洗浄液回収ポンプ35を動作させる。これにより、洗浄液容器26-1以外に入った他の溶液等を混入させることなく蒸留水のみを供給することができ、且つ、供給された蒸留水を洗浄液回収部25を介して洗浄液廃液容器38に回収することができる。
なお、上述した水洗の際には、電磁弁28-1及び29-1を閉鎖状態とし、電磁弁28-4及び29-4を開放状態としながら、洗浄液供給ポンプ34及び洗浄液回収ポンプ35を動作させる。これにより、染色液噴霧部22及び染色液配管系36内に配管洗浄液容器26-4から蒸留水を供給することができ、染色液噴霧部22及び染色液配管系36中のヘマトキシリン液を除去することができる。染色液噴霧部22及び染色液配管系36に供給された蒸留水は、染色液回収部23で回収する。
次に、検体１に対して分別液容器27-2より供給される0.2％塩酸、70％アルコール混合溶液を洗浄液噴霧部24から供給して分別処理を施す。分別処理の際には、電磁弁28-2及び29-2を開放状態とし、洗浄液供給ポンプ34及び洗浄液回収ポンプ35を動作させる。分別処理の後、再度、上述した水洗と同様にして洗浄処理部で蒸留水による水洗を行う。
次に、検体１に対して親和液A容器27-3より供給される95％アルコール液を噴霧して、親和処理を行う。親和処理の際には、電磁弁28-3及び29-3を開放状態とし、洗浄液供給ポンプ34及び洗浄液回収ポンプ35を動作させる。この分別処理を施すことによって、ヘマトキシリンによる染色工程を完了する。
ヘマトキシリンによる染色工程の後、エオジン液による染色工程を実施する。エオジン液による染色工程では、先ず、図示しない移動制御手段によって生体試料保持部２を染色処理部に移動し、染色液B容器26-2より供給されるエオジン・フロキシンＢ液を７分間噴霧して染色を行う。エオジン・フロキシンＢ液を噴霧する際には、電磁弁28-2及び29-2のみを開放状態としながら染色液供給ポンプ32及び染色液回収ポンプ33を動作させる。これにより、染色液B容器26-2以外の容器に入った他の染色液等を混入させることなくエオジン・フロキシンＢ液のみを噴霧させることができ、且つ、噴霧されたエオジン・フロキシンＢ液を染色液回収部23で回収することができる。回収されたエオジン・フロキシンＢ液は、染色液B容器26-2に移送され循環して再使用される。
次に、図示しない移動制御手段によって生体試料保持部２を洗浄処理部に移動し、ヘマトキシリン液による染色工程の際と同様に、検体１に対して水洗をほどこすとともに、染色液噴霧部22及び染色液配管系36中のエオジン・フロキシンＢ液を除去する。
次に、検体１に対して先ず（95％アルコール）、続いて親和液B容器27-4より供給される純アルコールを噴霧することによって、分別・脱水処理を行う。分別・脱水処理の際には、電磁弁28-4及び29-4を開放状態とし、洗浄液供給ポンプ34及び洗浄液回収ポンプ35を動作させる。
次に、図示しない移動制御手段によって生体試料保持部２を染色処理部に移動し、検体１に対して透徹液容器26-3より供給されるキシロールを噴霧して透徹処理を行う。透徹処理の際には、電磁弁28-3及び29-3のみを開放状態としながら染色液供給ポンプ32及び染色液回収ポンプ33を動作させる。透徹処理の後、上述した水洗と同様にして、染色液噴霧部22及び染色液配管系36中のキシロールを除去する。
以上により検体１に対する全ての染色工程が終了する。染色工程終了後、識別マーク付き生体試料保持部20を図６中矢印Aと反対方向に搬送して固定し、検体１の透過光画像の撮像を行う。透過光画像の撮像は、上述した例と同様にして行うことができる。本例によれば、染色処理を生体試料光学測定装置にて行うことができるため、蛍光画像撮像後に短時間で染色処理後の透過光画像を測定することが可能となる。本例の生体試料光学測定装置によれば、例えばウィルス検査等に際して多量の検体１を短時間に処理することができ、スループット向上に有効である。また、本例の生体試料光学測定装置では、染色液を循環させて再利用することにより、大量の検体１の検査において染色液の使用量を抑制できる。
なお、本例で使用したヘマトキシリン液は以下のような組成となっている。
ヘマトキシリン 5g
蒸留水 700ml
アンモニウム・ミョウバン 50g
ヨウ素酸ナトリウム 0.5g
グリセリン 300ml
また、本例で使用したエオジン・フロキシンＢ液は以下のような組成となっている。
1%エオジン 100ml
エオジンＹ 1g
蒸留水 100ml
1%フロキシンＢ 10ml
フロキシンＢ 1g
蒸留水 100ml
95%アルコール 780ml
氷酢酸 5ml
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
産業上の利用の可能性
以上、詳細に説明したように、本発明に係る生体試料光学測定方法及び生体試料光学測定装置では、生体試料の蛍光又は発光画像と透過光画像とを対応づけて重ね合わせて表示するため、生体試料の所定の部位における蛍光又は発光について正確な位置を検出することができる。

Claims (14)

1. 生体試料の少なくとも一部の蛍光又は発光画像を撮像し、
   上記生体試料の少なくとも一部の透過光画像を撮像し、
   上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像とを、上記生体試料の上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像とを対応づけて重ね合わせて表示する生体試料光学測定方法であって、
   上記透過光画像は、上記蛍光又は発光画像と比較して高解像度であることを特徴とする生体試料光学測定方法。
2. 上記透過光画像の解像度を、上記蛍光又は発光画像の解像度と比較して２〜２０倍とすることを特徴とする請求項１記載の生体試料光学測定方法。
3. 上記蛍光又は発光画像を撮像した後、上記生体試料に染色処理を施し、その後、上記透過光画像を撮像することを特徴とする請求項１記載の生体試料光学測定方法。
4. 上記生体試料を保持する保持部に設けられた光学識別マークを基準にして、上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像とを位置決めして撮像することを特徴とする請求項１記載の生体試料光学測定方法。
5. 生体試料の少なくとも一部を測定した蛍光又は発光画像と当該生体試料の少なくとも一部を測定した透過光画像とを記憶する画像データ記憶機能と、上記蛍光又は発光画像の画像データと上記透過光画像の画像データと演算する演算機能とを備え、上記画像データ記憶機能に記憶した上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像とを、上記演算機能により演算処理した上で、上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像と重ね合わせて表示する生体試料光学測定装置であって、
   上記光学測定手段は、上記透過光画像と比較して上記蛍光又は発光画像を高解像度で撮像することを特徴とする生体試料光学測定装置。
6. 上記蛍光又は発光画像及び上記透過光画像を測定する光学測定手段を備えることを特徴とする請求項５記載の生体試料光学測定装置。
7. 光学識別マークが設けられ、上記生体試料を保持する保持部を備え、上記保持部の光学識別マークを基準として上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像とを位置決めして撮像することを特徴とする請求項５記載の生体試料光学測定装置。
8. 上記光学識別マークは複数のリング状パターンであり、当該光学識別マークの画像データからそれぞれのリング状パターンの中心点座標を取得した後、当該中心点座標を基準点として、上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像とを位置決めして撮像することを特徴とする請求項７記載の生体試料光学測定装置。
9. 上記光学測定手段は、先ず、上記蛍光又は発光画像を撮像し、次いで透過光画像測定のための生体試料の染色処理が実施された後、上記透過光画像を撮像することを特徴とする請求項６記載の生体試料光学測定装置。
10. 上記生体試料に対して染色処理を行う染色処理手段を備えることを特徴とする請求項５記載の生体試料光学測定装置。
11. 蛍光物質又は発光物質が結合した生体試料から蛍光又は発光画像を取得し、染色処理を施した上記生体試料から透過光画像を取得することを特徴とする請求項５記載の生体試料光学測定装置。
12. 生体試料から発せられた蛍光又は発光を検出する蛍光又は発光検出部と、
    上記生体試料に対して光を照射するとともに当該光の照射により当該生体試料を透過した透過光を検出する透過光検出部と、
    上記蛍光又は発光測定部で測定した蛍光又は発光画像及び上記透過光検出部で測定した透過光画像の各画像データを記憶する画像記憶部と、
    上記画像記憶部に記憶された蛍光又は発光画像の画像データ及び透過光画像の画像データを演算する画像データ演算部と、
    上記画像データ演算部で蛍光又は発光画像の画像データ及び透過光画像の画像データを演算し、当該蛍光又は発光画像及び当該透過光画像を重ね合わせて表示する画像表示部とを有し、
    上記蛍光又は発光検出部は、上記生体試料から励起された蛍光を２次元画像情報として入力し、上記透過光検出部は、上記蛍光又は発光検出部に入力した２次元画像情報よりも高解像度の透過光画像情報を入力することを特徴とする生体試料光学測定装置。
13. 上記蛍光又は発光検出部は、上記生体試料に対して光学的ビームを走査しながら照射するとともに当該光学的ビームの照射により当該生体試料から励起された蛍光を検出することを特徴とする請求項１２記載の生体試料光学測定装置。
14. 上記蛍光又は発光検出部は、上記生体試料に対して発光処理を施すことにより発する発光を検出することを特徴とする請求項１２記載の生体試料光学測定装置。

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