JP3924870B2 - 有形成分分析装置及び有形成分分析方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検液中の有形成分を分析するための装置及び方法に関し、特に尿中や血液中に含まれる血球類などの有形成分を画像解析技術を用いて自動分析するための装置及び方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、被検液中の有形成分の分析、例えば尿沈渣成分の分析は、▲１▼尿サンプルを遠心分離する、▲２▼アスピレーター又はピペットを用いて、あるいはデカンテーションによって上澄み液を除去する、▲３▼残った残渣成分のうち一定量をスライドガラスに塗布し、カバーガラスを載せ標本とする、▲４▼顕微鏡にセットし、有形成分（血球類、上皮細胞類、円柱類、微生物類、結晶塩類など）を分類分析する、の各工程からなっている。現在、この作業のすべてを用手によって実施しており、検査技師の大きな負担になっているほか、作業が用手であるので、ばらつきが大きく、また判断には当然個人差があり、正確性にも問題が指摘されていた。
【０００３】
これらの検査作業を自動化する装置として近年、検体の塗布標本を作製せず被検液に染色液を混和した後、懸濁させたままフローセルに流し、物理統計的な方法や光学的な方法などによって分析するフローサイトメーター法により自動分析する方法がある（特開平４−３３７４６０号公報、特開平５−２９６９１５号公報、特開平５−３２２８８５号公報）。
【０００４】
しかしながら、上記のフローサイトメーター法により自動分析する方法では、有形成分は常に流れているためそれぞれに焦点を合わせることは極めて困難であり、焦点は一定の位置に固定されている。また、フローセルはある程度の厚みがある。これらのことより、上記のフローサイトメーター法では焦点が合わされた位置に流れて来た有形成分しか正確に測定できず、更には、該位置から少し離れたところに有形成分が位置した場合は、焦点がずれた分だけぼやけてしまい合焦時とは異なった画像計測結果が得られ誤った判断結果が得られることがある。
【０００５】
また、この方法ではフローセルが固定され、連続使用されるので、前検体分のキャリーオーバがあり、正確性や精密性に問題がある。また、分析精度を上げるため、染色液によって被検液を染色する場合、当然染色液によるフローセルの汚染があり、かつ染色液の成分が蓄積するので、経時的にノイズが増大し、測定精度が低下する危険性がある。さらに物理統計的な計測方法（レーザ光を用いた被検成分の散乱強度測定など）では、顕微鏡観察による画像観察データとかい離を生じ、かい離検体に対して再度顕微鏡画像観察をしなければならないといった課題があった。
【０００６】
さらに、フローセルの汚染を低減させるため、従来用いられていた分析に至適な染色液の濃度を低くした場合、染色度合いが弱くなり分析能が低下することがあった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
以上の実情に鑑み、本発明は、被検液、特に尿中の有形成分分析（尿沈渣分析など）にかかわる作業の全て又は一部を自動化し、キャリーオーバや染色液による汚染の危険性があるフローセルを使用せず、精密性、正確性の高い装置及び方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、有形成分が含まれる被検液を流さずに透光板上に載置し、これを撮像することによって、フローサイトメーター法の欠点を解消し得ることを発見し、上記目的を達成できるに至った。
【０００９】
即ち、本発明の有形成分分析装置は、透光板上の被検液を撮像するための撮像ステージと、被検液中の有形成分の標本像を拡大する手段（以下、「拡大手段」という。）と、標本像を撮像する手段（以下、「撮像手段」という。）と、撮像された画像を処理して各種成分に識別する手段（以下、「識別手段」という。）とを有することを特徴とする。また、上記装置は、被検液が尿の場合に特に有用である。
【００１０】
更に、上記装置においては、撮像手段が標本像の焦点を自動で合わせる機能を有していること、識別手段が、予め設定された視野分の全識別結果から分析結果を算出する機能と、分析結果を出力器から出力する機能とを有していること、当該装置が撮像された画像を処理して各種成分を識別した結果を記憶しておく手段を有すること、或いは当該装置が被検液に成分識別力を助力するための試薬を添加する手段を有することも特徴とする。
【００１１】
また、上記装置においては、識別手段が学習認識機能を有していること、識別手段が有形成分の特徴量の範囲指定を学習させ有形成分の量を算出する機能を有していること、識別手段が有形成分に起因する光学的特徴量に基づいて有形成分の量を算出する機能を有すること、拡大手段が一種以上の倍率を有していること、透光板がスライドガラスであること、或いは透光板が、被検液を被覆する被覆透光板と一体的に形成されたものであることも特徴とする。
【００１２】
本発明の有形成分分析方法は、▲１▼透光板上に被検液を載置する工程と、▲２▼被検液中の有形成分の標本像を拡大する工程と、▲３▼有形成分の標本像の焦点を自動で合せ、有形成分の標本像を撮像する工程と、▲４▼撮像された画像を処理して、各種成分に識別する工程とを少なくとも有することを特徴とする。また、上記分析方法は、被検液が尿の場合に特に有用である。
【００１３】
また、上記分析方法において、予め設定された視野数になるまで、上記▲２▼の工程から▲３▼の工程まで、または上記▲２▼の工程から▲４▼の工程までを、撮像位置を変えて繰り返すこと、或いは上記▲１▼の工程から▲４▼の工程までを全自動で行うことを特徴とする。
【００１４】
更に、上記方法において、被検液中に成分識別を助力するための試薬を添加する工程を有していること、成分識別を助力するための試薬が、Sternheimer-Malbin染色法、Sternheimer 染色法、Prescott-Brodie 染色法、Behre-Muhlberg染色法、SudanIII染色法、Lugol 染色法、hemosiderin 染色法、Papanicolaou染色法、4-chloro-1-naphthol 法、Field 染色法、Quaglino-Flemans法、Kaplow法、佐藤・関谷法、ベルリン青法、ギムザ染色法、ライト染色法、パッペンハイム染色法、コンゴー赤染色法、メチル緑・ピロニン染色法、アルシアン青染色法、ショール染色法、フォイルゲン染色法、オイル赤Ｏ染色法、Brecker 法、ハインツ小体染色法、中性赤・ヤーヌス緑超生体染色法、ブリリアントクレシル青染色法のうち少なくとも一法に用いられている成分の一種類または二種類以上を含有する試薬であること、有形成分に起因する光学的特徴量に基づいて、有形成分の量を算出する工程を有すること、光学的特徴量がＡＴＰ測定用試薬による発光量であること、透光板が被検液を被覆する被覆透光板と一体的に形成されたものであること、透光板がスライドガラスであること、或いは透光板および被覆透光板のうち少なくとも一つの材料がガラス、プラスチック、化学的処理を施したガラスまたは化学的処理を施したプラスチックであることを特徴とする。
【００１５】
【発明実施の形態】
【００１６】
本発明は、体液、例えば尿、血液、血清、血漿、随液、精液、前立腺液、関節液、胸水、腹水、分泌液等の分析や水質検査などに適用することができる。特に、尿、例えば原尿、濃縮尿、遠心分離後の沈渣等の分析に有効に用いられる。
【００１７】
本発明において分析の対象となる有形成分は、被検液中に分散ないし懸濁しているものであれば特に限定されるものではない。例えば被検液が尿の場合では、赤血球（変形赤血球、各種由来赤血球）、白血球、上皮細胞類（扁平上皮細胞、移行上皮細胞、尿細管上皮細胞、円形上皮細胞、尿道円柱上皮細胞、前立腺上皮細胞、精嚢腺上皮細胞、子宮内膜上皮細胞、卵円形脂肪体、細胞質内封入体細胞、多辺形細胞など）、円柱類（硝子円柱、上皮円柱、顆粒円柱、蝋様円柱、脂肪円柱、赤血球円柱、白血球円柱、細胞円柱、硝子白血球円柱、ヘモグロビン円柱、ヘモジリデン円柱、ミオグロビン円柱、アミロイド円柱、蛋白円柱、空胞変形円柱、血小板円柱、細菌円柱、ビリルビン円柱、塩類円柱など）、微生物類（真菌、細菌、脂肪球、原虫、トリコモナス、精子など）、結晶・塩類（尿酸塩、リン酸塩、シュウ酸カルシウム、ビリルビン、シスチン、コレステロール、2,8-ジヒドロキシアデニン結晶など）、その他（核内封入体細胞、脂肪顆粒細胞、大食細胞、異型細胞）等が分析対象となる有形成分として挙げられる。
【００１８】
本発明の装置及び方法においては、透光板上に被検液を載置することを特徴とする。透光板は透光性を有し、被検液を載置可能なものであれば良く、例えば、スライドガラス等が挙げられる。スライドガラスは一回使い切り（ディスポーザブル）であるため、前検体のキャリーオーバや染色剤による汚染の可能性がゼロであり、信頼性の高い測定結果を提供することができる。透光板の材料は、プラスチック（合成樹脂）、ガラスなど透光性を有するものであれば、特に限定されるものではない。なお、プラスチックの場合は、必要に応じて親水性を向上させるための化学的処理を施すのが良い。
【００１９】
透光板に載置された被検液は、被覆透光板で被覆されていても良い。被覆透光板としては、例えばカバーガラスが挙げられる。被覆透光板の材料としては、上記した透光板と同様のものが挙げられるが、特に限定されるものではない。
図１は、被覆透光板となるカバーガラスと、透光板となるスライドガラスとが一体的に形成された、カバーガラス一体型スライドガラス１の斜視図である。図１（ａ）ではスライドガラス部２上に載置されたカバーガラス部３の対向する二辺が接着剤４などで封止され、残りの対向する二辺が開放状態になっている。図１（ｂ）はスライドガラス部２上に載置されたカバーガラス部３の三辺が接着剤４などで封止され、残りの一辺が開放状態になっている。被検液を開放された一辺から分注すると、毛細管現象によりスライドガラス部２とカバーガラス部３との間隙に被検液が注入される。即ち、透光板であるスライドガラス部２に被検液が載置される。このようにカバーガラス一体型スライドガラス１を用いれば、簡単に所定量を正確に注入させることができ、カバーガラスをセットする煩雑な標本作製工程を省力化することができる。
【００２０】
透光板上の被検液を撮像するための撮像ステージは、透光板を載置し得るものであれば良く、特に限定されないが、撮像位置を変更できるように移動可能なものであるのが好ましい。移動は手動で行っても良いが、例えばサーボモータ、ステッピングモータやリニアモータ等を使用して機械的に行うのが好ましい。
【００２１】
撮像手段としては、デジタルカメラ、ＣＣＤカラービデオカメラ等が挙げられる。また、撮像手段には、有形成分の標本像の焦点を自動で合わせる機能（オートフォーカス機能）を付加しておくのが好ましい。拡大手段は、撮像前の標本像を光学的に拡大するものであっても良いし、撮像された標本像の画像をデジタル処理等して拡大するものであっても良い。具体的には、前記カメラに取り付けられるズームレンズや対物レンズ等が挙げられる。
【００２２】
被検液中の有形成分としては、血球類や細菌などの数μｍの大きさのものから、円柱などの数百μｍの大きさのものまでがある。従って、拡大手段の有する拡大倍率は、一種類のみとするよりも、二種類以上とするのが好ましい。この場合、小型の有形成分から大型の有形成分までをより精度よく解析することができる。また、拡大倍率は連続的に変化するものであっても良い。拡大倍率は有形成分に合わせて適宜決定すれば良い。
【００２３】
識別手段は、撮像された画像中の有形成分をその形態等に基づいて分類し、識別するものである。識別手段には、予め設定された視野分の全識別結果から分析結果を算出する機能と、分析結果を出力器から出力する機能とを付加するのが好ましい。なお、ここでいう予め設定された視野分とは、撮像する視野（画像）数のことをいう。また、識別手段には撮像された画像を一旦記憶しておくためのメモリ等を備えておくのが好ましい。
【００２４】
識別手段としては、例えば、上記の識別を行うようにプログラミングされたコンピュータ、論理回路で構成された識別装置等が挙げられる。このうち、識別手段としてコンピュータを用いれば、各工程の動作、画像処理、記憶、計算、出力等すべての制御がソフト上で行えるようになり好ましい。
【００２５】
識別手段は学習機能を有しているのが好ましい。学習認識機能を有することによって、正確性、精密性の高い測定結果が提供される。識別手段は、▲１▼赤、緑、青を明度と色度とに分離する色抽出の範囲指定、▲２▼穴埋め、線分の書き込み、画像の切り離しからなる二値画像処理の範囲指定、▲３▼画像の特徴量（面積、円形度係数、円相当径、周囲長、絶対最大長、フェレ径Ｘ／Ｙ比、最大弦長Ｘ／Ｙ比、短軸長さ／長軸長さ比など）の範囲指定を学習し、識別を行うことができる。
【００２６】
また、識別手段による上記画像処理は、ソフトウェアにより、有形成分の形態に基づいて有形成分を分類分析するため、明らかに形状の違う円柱や扁平上皮などの分類に関しては精度が高いが、小型な腎上皮細胞や赤血球、白血球、細菌などの形態が似かよった場合には、分析能はどうしても低下してしまう。
【００２７】
そこで、本発明の装置においては、被検液に成分識別を助力するための染色剤などの試薬を添加する手段を本発明の装置に更に付加することによって、本発明の方法においては、被検液に成分識別を助力するための染色剤などの試薬を添加する工程を加えることによって、上記の形態の似かよった成分を分類し、分析能を向上させることができる。
【００２８】
試薬は特に限定されないが、一般的に知られているものとしてSternheimer-Malbin染色法（ＳＭ染色法）、Sternheimer 染色法（Ｓ染色法、ＮＳ染色法またはSternheimer 染色法の変法）、Prescott-Brodie 染色法、Behre-Muhlberg染色法（ＢＭ染色法）、SudanIII染色法、Lugol 染色法、hemosiderin 染色法、Papanicolaou染色法、4-chloro-1-naphthol 法、Field 染色法、Quaglino-Flemans法、Kaplow法、佐藤・関谷法、ベルリン青法、ギムザ染色法、ライト染色法、パッペンハイム染色法、コンゴー赤染色法、メチル緑・ピロニン染色法、アルシアン青染色法、ショール染色法、フォイルゲン染色法、オイル赤Ｏ染色法、Brecker 法、ハインツ小体染色法、中性赤・ヤーヌス緑超生体染色法、ブリリアントクレシル青染色法（「臨床検査アトラス１ 尿沈渣」、「臨床検査技術全書３ 血液検査」、「臨床検査法提要」、「染色法のすべて MEDICAL TECHNOLOGY別冊」）等のうち少なくとも一法に用いられている成分の一種類または二種類以上を含有するものが挙げられる。例えば、ある一つの染色法で用いられる複種類の染色剤及び添加剤の中から幾つかの染色剤及び添加剤を選択し、これらを組み合わせて試薬としても良いし、それぞれ別の染色法で用いられている複種類の染色剤を組み合わせて試薬としても良い。
【００２９】
なお、上記染色剤には、染色剤の保存安定性や防腐性能を高めるために、一般的に知られている防腐（抗菌）剤（各種抗生物質、ＥＤＴＡ塩類、ホウ酸、クエン酸、ＮａＮ3 、プロクリン、ベンツイソチアゾロン、ピリチオン、Ｎ−メチルイソチアゾール等）を添加しても良い。また、染色液を至適ｐＨに保つ為に各種緩衝液を添加したり、有形成分の形態を保持するために各種塩類（ＥＤＴＡ塩類、石炭酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ2 、ＡｌＣｌ3 等）、各種糖類（グルコース、フラクトース、ガラクトース、マルトース、キシリトール、ソルビトール）、シクロデキストリン類、グルタルアルデヒドを添加しても良い。更に、測定の妨げとなる不溶性物質を除くために各種界面活性剤や酵素類を添加しても良い。
【００３０】
さらに、形態による分類分析では十分な結果が期待できない場合には、本発明の装置においては、識別手段に、有形成分に起因する光学的特徴量に基づいて有形成分の量を算出する機能を付加するのが、又本発明の方法においては、有形成分に起因する光学的特徴量に基づいて、有形成分の量を算出することが好ましい。
【００３１】
例えば、被検液中の細菌類などの微生物の量を測定する際、分析精度をより向上させることを目的として発光試薬を被検液中に添加することができる。しかし、細菌類はその状態（死菌、生菌）によって染色度合いが異なるため、分析能が低下してしまう。そこで、さらに分析能を向上させるため、微生物がＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を産出することを利用し、被検液中のＡＴＰを測定する工程を加えることによって細菌類の量を正確に測定することができる。ＡＴＰの測定は、ルシフェラーゼ、ルシフェリンなどを含むＡＴＰ試薬を利用し、ＡＴＰ量に応じた発光量（光学的特徴量）を検知することによって行うことができる（化１参照）。
【００３２】
【化１】
【００３３】
また、本発明の装置には、撮像された画像を処理して各種成分に識別した結果を記憶しておく手段（画像記憶装置）が備えられているのが好ましい。記憶しておく手段としては、記憶容量の大きい光磁気ディスク、固定ディスク、デジタルビデオディスク、ＣＤ−Ｒ等の補助記憶装置が挙げられる。本発明の装置に用いられる出力器としては、ＣＲＴディスプレイ、液晶ディスプレイ、プリンタ等の出力装置や上記補助記憶装置が挙げられる。
【００３４】
なお、出力装置としてディスプレイを用いる場合には、メニュー選択によって、測定結果や画像データの他、時刻、現在の装置の状況（各検体の測定状況、各検体又は選択した検体の測定終了予定時刻又は必要残時間、廃液タンクの廃液量、純水タンクの残量、各試薬の残量、洗剤の残量、スライドガラスの残数）等を表示する機能や、選択指定した情報のみを離れた場所から読み取れるように拡大表示する機能を付加しても良い。
【００３５】
本発明の装置においては、識別手段に、分類不可能な有形成分について「その他成分」なる項目に分類する機能、又はその画像を後に呼び出して、技師が直接目視により判断し、その判断結果をデータに付け加えたり修正したりできる機能を付加しても良い。
【００３６】
本発明の装置には、ディスプレイの表示メニューの選択や当該装置の操作をリモコン装置を用いて遠隔操作できる機能を付加しても良い。更に、本発明の装置には、何らかのアクシデントが発生した場合、廃液タンクが満杯になった場合、純水、各試薬、洗剤、スライドガラス等の残りが少なくなった場合等には、画面表示、音又は信号によって警告を発する機能を付加しても良い。
【００３７】
本発明の装置には、緊急の分析に対応するため、分析中の検体の次に緊急検体（緊急の分析を要する検体）を優先して割り込ませる機能、又は分析を一時停止して直ちに緊急検体を分析する機能を付加しても良い。なお、緊急の分析は迅速に行う必要があるため、例えば緊急分析用ボタンを設置し、該ボタンの操作のみで装置に緊急の分析を行わせるようにするのが好ましい。
【００３８】
本発明の方法は、上記した本発明の装置を用いれば容易に行うことができる。即ち、自動で透光板上に被検液を載置する工程が行われ、拡大手段により被検液中の有形成分の標本像を拡大する工程が行われ、撮像手段により有形成分の標本像の焦点を自動で合せ、有形成分の標本像を撮像する工程が行われ、識別手段により撮像された画像を処理して、各種成分に識別する工程が行われる。このように本発明の装置を用いれば、本発明の方法を全自動で行うことができる。
【００３９】
【実施例】
以下、本発明の装置及び方法の実施例を図に基づいて説明するが、本発明の装置及び方法はこの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１
図２は、本発明の有形成分分析装置の一例を示す図であり、尿沈渣成分の分析装置を示す。
図２の例では、透光板としてはスライドガラス５が用いられている。スライドガラス５は、図１（ａ）に示したようにカバーガラスと一体的に形成されて、カバーガラス一体型スライドガラスとなっている。スライドガラス５は撮像ステージとなるＸＹテーブル６上に載置されている。ＸＹテーブル６には駆動源としてステップモータが組み込まれている。ＸＹテーブル６は駆動回路１１からの信号を受けて駆動され、スライドガラス５をＸ座標軸方向及びＹ座標軸方向に自在に移動、停止させて撮像位置を変更する。
【００４１】
撮像手段としては自動焦点機能付きのＣＣＤカメラ１０が用いられている。ＣＣＤカメラ１０には拡大手段として、対物レンズが取り付けられている。
識別手段は、画像処理制御回路１２、画像メモリ１４、特徴抽出回路１５、識別演算回路１６、中央制御部１７および演算回路２２で構成されており、同図では点線で囲まれている。２３は、出力装置として用いられているディスプレイである。１８は各種成分に識別した結果を記憶するための画像記憶装置である。次に、本発明の装置で行われる処理を時系列に説明する。
【００４２】
最初に、被検液となる尿検体をサンプル容器からプローブによって、三本の反応管１９ａ、１９ｂ、１９ｃに必要量分注する。なお、より均一に分注するため、尿検体は分注前に攪拌している。サンプル容器として予めバーコードが貼り付けられた容器を用いるのであれば、バーコード読み取り装置にて、予めバーコードを読み取る。バーコードを使用することによってサンプルの有無、種類、検体番号を読み取れば、以後の処理データおよびサンプルの識別を容易に行える。
次に、染色液を反応管１９ａに必要量注入し、有形成分の染色を行う。約２分後、反応管１９ａから被検液と染色液との反応液を分取し、カバーガラス一体型スライドガラス（スライドガラス５）に注入する。なお、染色反応時間や反応温度は任意に設定している。
【００４３】
次に、被検液を撮像するため、光源となるランプ７から光を照射する。ランプ７から照射された光（点線部）は光軸上を進み、コンデンサレンズ８を通ってスライドガラス５上の被検液上に集光される。被検液中の有形成分の標本像は対物レンズ９により結像位置に形成され、この結像位置の標本像は、ＣＣＤカメラ１０の撮像面上に画像として投影され、光電変換される。
【００４４】
画像処理制御回路１２は、駆動回路１１を制御してＸＹテーブル６の移動又は停止を制御するとともに、ＸＹテーブル６が停止した際に、ＣＣＤカメラ１０に撮像を行わせる。ＣＣＤカメラ１０で得られた画像は、Ａ／Ｄ変換器１３によりデジタル化される。画像処理制御回路１２は、このデジタル化された画像データを画像メモリ１４に格納する。
【００４５】
画像処理制御回路１２は、画像メモリ１４への格納の終了後、さらにＸＹテーブル６を移動させて撮像位置（視野）を変え、上記と同様に撮像、Ａ／Ｄ変換、メモリへの格納を行う。画像処理制御回路１２は、この一連の動作を予め設定された視野数になるまで繰り返し行う。なお、撮像位置を変更するためのＸＹテーブル６の移動は、一視野分の画像解析が終了してから行うように制御しても良い。
【００４６】
次に、画像処理制御回路１２は、画像メモリ１４に格納された画像データを、特徴抽出回路１５へ入力する。特徴抽出回路１５は、画像の特徴量（例えば、有形成分の面積、円形度係数、円相当径、周囲長、絶対最大長、フェレ径Ｘ／Ｙ比、最大弦長Ｘ／Ｙ比、短軸長さ／長軸長さ比など）を一次パラメータとして抽出する。画像処理制御回路１２は、これら一次パラメータ及びこれらの組合せ演算で生じる二次パラメータを識別演算回路１６に入力する。
【００４７】
識別演算回路１６は、ニューラルネットワークを用いて有形成分の分類を行う。ニューラルネットワークは、予め専門家の判断にもとづいて大量のデータを用いて学習を実行し、各ニューロン間の結合係数を最適化するものである。従って、識別演算回路１６は、入力された一次および二次パラメータを用いてニューラルネットワーク演算を行い、対象となる有形成分の自動分類を実施する。なお、ニューラルネットワーク演算の代わりに、識別演算回路１６には統計的学習認識方法を用いた有形成分の自動分類を行わせても良い。
【００４８】
中央制御部１７は、分類結果及び画像データを画像記憶装置１８に記憶させる。本実施例では、画像記憶装置１８として、記憶容量が大きい光磁気ディスクが用いられている。
【００４９】
一方、尿検体中の細菌などの微生物量を測定するために、反応管１９ｂ中にトリクロロ酢酸を添加し、その一部の検体試料を分取してＡＴＰ測定試薬を添加し、発光させる。反応管１９ｃ中にはトリクロロ酢酸を添加せずに、その一部の検体試料をブランクとして分取し、上記と同様にＡＴＰ測定試薬を添加して発光させる。発光はルミノメータ２０により検知する。積算回路２１は、所定時間内にルミノメータ２０にて検知された発光をカウントし、積算する。次に、演算回路２２は、積算回路２１により積算された発光の数（フォトン数）の情報を、予めＡＴＰの標準品によって算出された計算式に基づいてＡＴＰ量に変換して微生物の数を算出し、算出結果を中央制御部１７に入力する。
【００５０】
中央制御部１７は、撮像された画像の各視野ごとの分類結果を全視野分積算し、演算回路２２から入力される微生物の数と共に、予め入力された境界値（有形成分の標準値）に基づいて定性データ（例えば−、±、＋、＋＋、＋＋＋など）に変換し、得られた定性データや画像データをディスプレイやプリンタ等の出力装置２３に出力する。
【００５１】
図４は、本発明の有形成分分析方法の一例を示す工程ブロック図であり、図１に示す装置を使用して分析が行われている。以下、図４を各工程ごとに説明する。
【００５２】
〔尿検体採取工程〕
本工程においては、尿原液２００検体を遠心分離せずに攪拌後、各検体０．７５ｍｌをそれぞれ三本の所定の反応管に分注する。
【００５３】
〔染色工程〕
本工程においては、尿検体を採取した反応管のうちの一本に、Ｓ（Sternheimer ）染色液を０．２５ｍｌ添加し攪拌する。
【００５４】
〔標本作製工程〕
本工程は、透光板上に被検液を載置する工程である。なお、本工程においては、被検液となる染色液を添加した液から０．０１５ｍｌを分取し、カバーガラス一体型スライドガラスの間隙部分に分注し標本を作製している。
【００５５】
〔標本移動工程〕
本工程においては、作製した標本を撮像ステージにセットしている。撮像ステージはセットされた標本を撮像位置まで移動させる。
【００５６】
〔撮像工程〕
本工程は、被検液中の有形成分の標本像を拡大する工程と、拡大された有形成分の標本像の焦点を自動で合せ、有形成分の標本像を撮像する工程とである。本工程においては、最初に、ＣＣＤカメラに取り付けられた対物レンズ（拡大手段）によって標本像を拡大している。次に、撮像ステージにセットされたＣＣＤカメラによって、自動で焦点を合せ、拡大画像を撮像している。
【００５７】
〔画像処理・記憶工程〕
本工程は撮像された画像を処理して各種成分に識別する工程である。本工程においては、最初に、撮像した画像を光磁気ディスクに記憶する。次に、過去のデータを学習認識する機能を有した演算回路等を用いて、この記憶された画像データから尿中有形成分を各種成分に分類し、各種成分ごとに計数する。分類結果及び係数結果は制御計算工程へ伝達される。
なお、上記した撮像工程、画像処理・記憶工程は、撮像ステージを移動させて撮像位置を変更しながら視野数が１００になるまで繰り返し行われる。
【００５８】
〔微生物量分析工程〕
本工程は、有形成分に起因する光学的特徴量に基づいて、有形成分の量を算出する工程である。本工程においては、最初に尿検体採取工程で尿検体を分注した反応管三本のうち一本に、０．４％トリクロロ酢酸を０．７５ｍｌ添加する。残りの一本にはなにも添加せずブランクとする。各反応管から尿検体０．０１ｍｌを分取し、これにＡＴＰ測定試薬〔３０ｍＭグリシルグリシンバッファ（ｐＨ７．８）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１ｍＭ硫酸ルシフェリン、１０Ｕ／ｍｌルシフェラーゼを含有する。〕を０．５ｍｌ添加して発光を生じさせる。この発光をルミノメータを用いて検知し、積算回路等を用いて発光をカウントし、積算する。
【００５９】
次に、予めＡＴＰの標準品によって算出した計算式によって、各検体中のＡＴＰ量を求める。その後、トリクロロ酢酸を添加した検体中のＡＴＰ量と、ブランクとした検体中のＡＴＰ量との差を求め、検体中の微生物起源のＡＴＰ量を算出する。その結果を制御計算工程へ伝達する。図６に尿中ＡＴＰ濃度と菌数との相関図を示す。
【００６０】
〔制御計算工程〕
本工程においては、画像処理・記憶工程および微生物量分析工程の各工程から得られた結果を統合し、ディスプレイやプリンタ等に出力する。表１は、その出力（印字）例を示している。
【００６１】
【表１】
【００６２】
この実施例における画像処理による検査結果の一致率を表２にまとめた。即ち、撮像された各画像を目視して、画像処理により分類分析された成分名（白血球、赤血球など）と一致しているか否かを判断した。
【００６３】
【表２】
【００６４】
実施例２
図３は、本発明の有形成分分析装置の他の例を示す図である。図３の例では、図２の例と異なり、ＡＴＰ測定試薬の添加はなく、よって図１の例で用いられているルミノメータ、積算回路、演算回路は備えられていない。従って、図３の例に示すように、尿検体は反応管１９にのみ必要量が分取されている。それ以外の構成については図２に示した装置と同様である。
【００６５】
図５は、本発明の有形成分分析方法の他の例を示す工程ブロック図であり、図３に示す装置を使用して分析が行われている。以下、図５を各工程ごとに説明する。
【００６６】
〔尿検体採取工程〕
本工程においては、尿原液検体を遠心分離せずに攪拌した後、この検体０．７５ｍｌを反応管に分取する。
【００６７】
〔染色工程〕
本工程においては、尿検体を分注した反応管に、Ｓ（Sternheimer ）染色液を０．２５ｍｌ添加し攪拌する。
【００６８】
〔標本作製工程〕
本工程においては図４の例と同様に、染色液を添加した液から０．０１５ｍｌを分取し、カバーガラス一体型スライドガラスの間隙部分に分注し標本を作製する。
【００６９】
〔標本移動工程〕
本工程においては図４の例と同様に、作製した標本を撮像ステージにセットし、撮像位置まで移動させる。
【００７０】
〔撮像工程〕
本工程においては図４の例と同様に、拡大された有形成分の標本像の焦点を自動で合せ、撮像ステージにセットされたＣＣＤカメラによって拡大画像を撮像している。
【００７１】
〔画像処理・記憶工程〕
本工程においては図４の例と同様に、撮像した画像を記憶し、画像データから尿中有形成分を各種成分に分類し、各種成分ごとに計数している。分類結果及び係数結果は制御計算工程へ伝達される。なお、撮像工程、画像処理・記憶工程は、撮像ステージを移動させて撮像位置を変更しながら視野数が１００になるまで繰り返し行われる。
【００７２】
〔制御計算工程〕
本工程においては画像処理・記憶工程から得られた結果を統合し、ディスプレイやプリンタ等に出力する。表３は、その出力（印字）例を示しており、強拡大視野（ＨＰＦ）における結果が記号で示されている。
【００７３】
【表３】
【００７４】
【発明の効果】
このように本発明の有形成分分析装置及び有形成分分析方法によれば、被検液中の有形成分の分析にかかわる作業が簡素化され、検査技師の負担を低減させることができる。また、測定対象が流体でないため標本像の焦点を容易に合わせることができ、更にフローセルを使用せずに透光板を用いるので、一回使い切り（ディスポーザル）のものを使用することができ、前検体のキャリーオーバや染色液による汚染の可能性がゼロである。即ち、本発明により、精密性、正確性の高い分析結果を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】カバーガラス一体型スライドガラス１の斜視図である。
【図２】本発明の有形成分分析装置の一例を示す図である。
【図３】本発明の有形成分分析装置の他の例を示す図である。
【図４】本発明の有形成分分析方法の一例を示す工程ブロック図である。
【図５】本発明の有形成分分析方法の他の例を示す工程ブロック図である。
【図６】尿中ＡＴＰ濃度と菌数との相関図である。
【符号の説明】
１ カバーガラス一体型スライドガラス
２ スライドガラス部
３ カバーガラス部
４ 接着剤
５ スライドガラス
６ ＸＹテーブル
７ ランプ
８ コンデンサレンズ
９ 対物レンズ
１０ ＣＣＤカメラ
１１ 駆動回路
１２ 画像処理制御回路
１３ Ａ／Ｄ変換器
１４ 画像メモリ
１５ 特徴抽出回路
１６ 識別演算回路
１７ 中央制御部
１８ 画像記憶装置
１９ 反応管
２０ ルミノメータ
２１ 積算回路
２２ 演算回路
２３ 出力装置
【発明の属する技術分野】
本発明は、被検液中の有形成分を分析するための装置及び方法に関し、特に尿中や血液中に含まれる血球類などの有形成分を画像解析技術を用いて自動分析するための装置及び方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、被検液中の有形成分の分析、例えば尿沈渣成分の分析は、▲１▼尿サンプルを遠心分離する、▲２▼アスピレーター又はピペットを用いて、あるいはデカンテーションによって上澄み液を除去する、▲３▼残った残渣成分のうち一定量をスライドガラスに塗布し、カバーガラスを載せ標本とする、▲４▼顕微鏡にセットし、有形成分（血球類、上皮細胞類、円柱類、微生物類、結晶塩類など）を分類分析する、の各工程からなっている。現在、この作業のすべてを用手によって実施しており、検査技師の大きな負担になっているほか、作業が用手であるので、ばらつきが大きく、また判断には当然個人差があり、正確性にも問題が指摘されていた。
【０００３】
これらの検査作業を自動化する装置として近年、検体の塗布標本を作製せず被検液に染色液を混和した後、懸濁させたままフローセルに流し、物理統計的な方法や光学的な方法などによって分析するフローサイトメーター法により自動分析する方法がある（特開平４−３３７４６０号公報、特開平５−２９６９１５号公報、特開平５−３２２８８５号公報）。
【０００４】
しかしながら、上記のフローサイトメーター法により自動分析する方法では、有形成分は常に流れているためそれぞれに焦点を合わせることは極めて困難であり、焦点は一定の位置に固定されている。また、フローセルはある程度の厚みがある。これらのことより、上記のフローサイトメーター法では焦点が合わされた位置に流れて来た有形成分しか正確に測定できず、更には、該位置から少し離れたところに有形成分が位置した場合は、焦点がずれた分だけぼやけてしまい合焦時とは異なった画像計測結果が得られ誤った判断結果が得られることがある。
【０００５】
また、この方法ではフローセルが固定され、連続使用されるので、前検体分のキャリーオーバがあり、正確性や精密性に問題がある。また、分析精度を上げるため、染色液によって被検液を染色する場合、当然染色液によるフローセルの汚染があり、かつ染色液の成分が蓄積するので、経時的にノイズが増大し、測定精度が低下する危険性がある。さらに物理統計的な計測方法（レーザ光を用いた被検成分の散乱強度測定など）では、顕微鏡観察による画像観察データとかい離を生じ、かい離検体に対して再度顕微鏡画像観察をしなければならないといった課題があった。
【０００６】
さらに、フローセルの汚染を低減させるため、従来用いられていた分析に至適な染色液の濃度を低くした場合、染色度合いが弱くなり分析能が低下することがあった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
以上の実情に鑑み、本発明は、被検液、特に尿中の有形成分分析（尿沈渣分析など）にかかわる作業の全て又は一部を自動化し、キャリーオーバや染色液による汚染の危険性があるフローセルを使用せず、精密性、正確性の高い装置及び方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、有形成分が含まれる被検液を流さずに透光板上に載置し、これを撮像することによって、フローサイトメーター法の欠点を解消し得ることを発見し、上記目的を達成できるに至った。
【０００９】
即ち、本発明の有形成分分析装置は、透光板上の被検液を撮像するための撮像ステージと、被検液中の有形成分の標本像を拡大する手段（以下、「拡大手段」という。）と、標本像を撮像する手段（以下、「撮像手段」という。）と、撮像された画像を処理して各種成分に識別する手段（以下、「識別手段」という。）とを有することを特徴とする。また、上記装置は、被検液が尿の場合に特に有用である。
【００１０】
更に、上記装置においては、撮像手段が標本像の焦点を自動で合わせる機能を有していること、識別手段が、予め設定された視野分の全識別結果から分析結果を算出する機能と、分析結果を出力器から出力する機能とを有していること、当該装置が撮像された画像を処理して各種成分を識別した結果を記憶しておく手段を有すること、或いは当該装置が被検液に成分識別力を助力するための試薬を添加する手段を有することも特徴とする。
【００１１】
また、上記装置においては、識別手段が学習認識機能を有していること、識別手段が有形成分の特徴量の範囲指定を学習させ有形成分の量を算出する機能を有していること、識別手段が有形成分に起因する光学的特徴量に基づいて有形成分の量を算出する機能を有すること、拡大手段が一種以上の倍率を有していること、透光板がスライドガラスであること、或いは透光板が、被検液を被覆する被覆透光板と一体的に形成されたものであることも特徴とする。
【００１２】
本発明の有形成分分析方法は、▲１▼透光板上に被検液を載置する工程と、▲２▼被検液中の有形成分の標本像を拡大する工程と、▲３▼有形成分の標本像の焦点を自動で合せ、有形成分の標本像を撮像する工程と、▲４▼撮像された画像を処理して、各種成分に識別する工程とを少なくとも有することを特徴とする。また、上記分析方法は、被検液が尿の場合に特に有用である。
【００１３】
また、上記分析方法において、予め設定された視野数になるまで、上記▲２▼の工程から▲３▼の工程まで、または上記▲２▼の工程から▲４▼の工程までを、撮像位置を変えて繰り返すこと、或いは上記▲１▼の工程から▲４▼の工程までを全自動で行うことを特徴とする。
【００１４】
更に、上記方法において、被検液中に成分識別を助力するための試薬を添加する工程を有していること、成分識別を助力するための試薬が、Sternheimer-Malbin染色法、Sternheimer 染色法、Prescott-Brodie 染色法、Behre-Muhlberg染色法、SudanIII染色法、Lugol 染色法、hemosiderin 染色法、Papanicolaou染色法、4-chloro-1-naphthol 法、Field 染色法、Quaglino-Flemans法、Kaplow法、佐藤・関谷法、ベルリン青法、ギムザ染色法、ライト染色法、パッペンハイム染色法、コンゴー赤染色法、メチル緑・ピロニン染色法、アルシアン青染色法、ショール染色法、フォイルゲン染色法、オイル赤Ｏ染色法、Brecker 法、ハインツ小体染色法、中性赤・ヤーヌス緑超生体染色法、ブリリアントクレシル青染色法のうち少なくとも一法に用いられている成分の一種類または二種類以上を含有する試薬であること、有形成分に起因する光学的特徴量に基づいて、有形成分の量を算出する工程を有すること、光学的特徴量がＡＴＰ測定用試薬による発光量であること、透光板が被検液を被覆する被覆透光板と一体的に形成されたものであること、透光板がスライドガラスであること、或いは透光板および被覆透光板のうち少なくとも一つの材料がガラス、プラスチック、化学的処理を施したガラスまたは化学的処理を施したプラスチックであることを特徴とする。
【００１５】
【発明実施の形態】
【００１６】
本発明は、体液、例えば尿、血液、血清、血漿、随液、精液、前立腺液、関節液、胸水、腹水、分泌液等の分析や水質検査などに適用することができる。特に、尿、例えば原尿、濃縮尿、遠心分離後の沈渣等の分析に有効に用いられる。
【００１７】
本発明において分析の対象となる有形成分は、被検液中に分散ないし懸濁しているものであれば特に限定されるものではない。例えば被検液が尿の場合では、赤血球（変形赤血球、各種由来赤血球）、白血球、上皮細胞類（扁平上皮細胞、移行上皮細胞、尿細管上皮細胞、円形上皮細胞、尿道円柱上皮細胞、前立腺上皮細胞、精嚢腺上皮細胞、子宮内膜上皮細胞、卵円形脂肪体、細胞質内封入体細胞、多辺形細胞など）、円柱類（硝子円柱、上皮円柱、顆粒円柱、蝋様円柱、脂肪円柱、赤血球円柱、白血球円柱、細胞円柱、硝子白血球円柱、ヘモグロビン円柱、ヘモジリデン円柱、ミオグロビン円柱、アミロイド円柱、蛋白円柱、空胞変形円柱、血小板円柱、細菌円柱、ビリルビン円柱、塩類円柱など）、微生物類（真菌、細菌、脂肪球、原虫、トリコモナス、精子など）、結晶・塩類（尿酸塩、リン酸塩、シュウ酸カルシウム、ビリルビン、シスチン、コレステロール、2,8-ジヒドロキシアデニン結晶など）、その他（核内封入体細胞、脂肪顆粒細胞、大食細胞、異型細胞）等が分析対象となる有形成分として挙げられる。
【００１８】
本発明の装置及び方法においては、透光板上に被検液を載置することを特徴とする。透光板は透光性を有し、被検液を載置可能なものであれば良く、例えば、スライドガラス等が挙げられる。スライドガラスは一回使い切り（ディスポーザブル）であるため、前検体のキャリーオーバや染色剤による汚染の可能性がゼロであり、信頼性の高い測定結果を提供することができる。透光板の材料は、プラスチック（合成樹脂）、ガラスなど透光性を有するものであれば、特に限定されるものではない。なお、プラスチックの場合は、必要に応じて親水性を向上させるための化学的処理を施すのが良い。
【００１９】
透光板に載置された被検液は、被覆透光板で被覆されていても良い。被覆透光板としては、例えばカバーガラスが挙げられる。被覆透光板の材料としては、上記した透光板と同様のものが挙げられるが、特に限定されるものではない。
図１は、被覆透光板となるカバーガラスと、透光板となるスライドガラスとが一体的に形成された、カバーガラス一体型スライドガラス１の斜視図である。図１（ａ）ではスライドガラス部２上に載置されたカバーガラス部３の対向する二辺が接着剤４などで封止され、残りの対向する二辺が開放状態になっている。図１（ｂ）はスライドガラス部２上に載置されたカバーガラス部３の三辺が接着剤４などで封止され、残りの一辺が開放状態になっている。被検液を開放された一辺から分注すると、毛細管現象によりスライドガラス部２とカバーガラス部３との間隙に被検液が注入される。即ち、透光板であるスライドガラス部２に被検液が載置される。このようにカバーガラス一体型スライドガラス１を用いれば、簡単に所定量を正確に注入させることができ、カバーガラスをセットする煩雑な標本作製工程を省力化することができる。
【００２０】
透光板上の被検液を撮像するための撮像ステージは、透光板を載置し得るものであれば良く、特に限定されないが、撮像位置を変更できるように移動可能なものであるのが好ましい。移動は手動で行っても良いが、例えばサーボモータ、ステッピングモータやリニアモータ等を使用して機械的に行うのが好ましい。
【００２１】
撮像手段としては、デジタルカメラ、ＣＣＤカラービデオカメラ等が挙げられる。また、撮像手段には、有形成分の標本像の焦点を自動で合わせる機能（オートフォーカス機能）を付加しておくのが好ましい。拡大手段は、撮像前の標本像を光学的に拡大するものであっても良いし、撮像された標本像の画像をデジタル処理等して拡大するものであっても良い。具体的には、前記カメラに取り付けられるズームレンズや対物レンズ等が挙げられる。
【００２２】
被検液中の有形成分としては、血球類や細菌などの数μｍの大きさのものから、円柱などの数百μｍの大きさのものまでがある。従って、拡大手段の有する拡大倍率は、一種類のみとするよりも、二種類以上とするのが好ましい。この場合、小型の有形成分から大型の有形成分までをより精度よく解析することができる。また、拡大倍率は連続的に変化するものであっても良い。拡大倍率は有形成分に合わせて適宜決定すれば良い。
【００２３】
識別手段は、撮像された画像中の有形成分をその形態等に基づいて分類し、識別するものである。識別手段には、予め設定された視野分の全識別結果から分析結果を算出する機能と、分析結果を出力器から出力する機能とを付加するのが好ましい。なお、ここでいう予め設定された視野分とは、撮像する視野（画像）数のことをいう。また、識別手段には撮像された画像を一旦記憶しておくためのメモリ等を備えておくのが好ましい。
【００２４】
識別手段としては、例えば、上記の識別を行うようにプログラミングされたコンピュータ、論理回路で構成された識別装置等が挙げられる。このうち、識別手段としてコンピュータを用いれば、各工程の動作、画像処理、記憶、計算、出力等すべての制御がソフト上で行えるようになり好ましい。
【００２５】
識別手段は学習機能を有しているのが好ましい。学習認識機能を有することによって、正確性、精密性の高い測定結果が提供される。識別手段は、▲１▼赤、緑、青を明度と色度とに分離する色抽出の範囲指定、▲２▼穴埋め、線分の書き込み、画像の切り離しからなる二値画像処理の範囲指定、▲３▼画像の特徴量（面積、円形度係数、円相当径、周囲長、絶対最大長、フェレ径Ｘ／Ｙ比、最大弦長Ｘ／Ｙ比、短軸長さ／長軸長さ比など）の範囲指定を学習し、識別を行うことができる。
【００２６】
また、識別手段による上記画像処理は、ソフトウェアにより、有形成分の形態に基づいて有形成分を分類分析するため、明らかに形状の違う円柱や扁平上皮などの分類に関しては精度が高いが、小型な腎上皮細胞や赤血球、白血球、細菌などの形態が似かよった場合には、分析能はどうしても低下してしまう。
【００２７】
そこで、本発明の装置においては、被検液に成分識別を助力するための染色剤などの試薬を添加する手段を本発明の装置に更に付加することによって、本発明の方法においては、被検液に成分識別を助力するための染色剤などの試薬を添加する工程を加えることによって、上記の形態の似かよった成分を分類し、分析能を向上させることができる。
【００２８】
試薬は特に限定されないが、一般的に知られているものとしてSternheimer-Malbin染色法（ＳＭ染色法）、Sternheimer 染色法（Ｓ染色法、ＮＳ染色法またはSternheimer 染色法の変法）、Prescott-Brodie 染色法、Behre-Muhlberg染色法（ＢＭ染色法）、SudanIII染色法、Lugol 染色法、hemosiderin 染色法、Papanicolaou染色法、4-chloro-1-naphthol 法、Field 染色法、Quaglino-Flemans法、Kaplow法、佐藤・関谷法、ベルリン青法、ギムザ染色法、ライト染色法、パッペンハイム染色法、コンゴー赤染色法、メチル緑・ピロニン染色法、アルシアン青染色法、ショール染色法、フォイルゲン染色法、オイル赤Ｏ染色法、Brecker 法、ハインツ小体染色法、中性赤・ヤーヌス緑超生体染色法、ブリリアントクレシル青染色法（「臨床検査アトラス１ 尿沈渣」、「臨床検査技術全書３ 血液検査」、「臨床検査法提要」、「染色法のすべて MEDICAL TECHNOLOGY別冊」）等のうち少なくとも一法に用いられている成分の一種類または二種類以上を含有するものが挙げられる。例えば、ある一つの染色法で用いられる複種類の染色剤及び添加剤の中から幾つかの染色剤及び添加剤を選択し、これらを組み合わせて試薬としても良いし、それぞれ別の染色法で用いられている複種類の染色剤を組み合わせて試薬としても良い。
【００２９】
なお、上記染色剤には、染色剤の保存安定性や防腐性能を高めるために、一般的に知られている防腐（抗菌）剤（各種抗生物質、ＥＤＴＡ塩類、ホウ酸、クエン酸、ＮａＮ3 、プロクリン、ベンツイソチアゾロン、ピリチオン、Ｎ−メチルイソチアゾール等）を添加しても良い。また、染色液を至適ｐＨに保つ為に各種緩衝液を添加したり、有形成分の形態を保持するために各種塩類（ＥＤＴＡ塩類、石炭酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ2 、ＡｌＣｌ3 等）、各種糖類（グルコース、フラクトース、ガラクトース、マルトース、キシリトール、ソルビトール）、シクロデキストリン類、グルタルアルデヒドを添加しても良い。更に、測定の妨げとなる不溶性物質を除くために各種界面活性剤や酵素類を添加しても良い。
【００３０】
さらに、形態による分類分析では十分な結果が期待できない場合には、本発明の装置においては、識別手段に、有形成分に起因する光学的特徴量に基づいて有形成分の量を算出する機能を付加するのが、又本発明の方法においては、有形成分に起因する光学的特徴量に基づいて、有形成分の量を算出することが好ましい。
【００３１】
例えば、被検液中の細菌類などの微生物の量を測定する際、分析精度をより向上させることを目的として発光試薬を被検液中に添加することができる。しかし、細菌類はその状態（死菌、生菌）によって染色度合いが異なるため、分析能が低下してしまう。そこで、さらに分析能を向上させるため、微生物がＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を産出することを利用し、被検液中のＡＴＰを測定する工程を加えることによって細菌類の量を正確に測定することができる。ＡＴＰの測定は、ルシフェラーゼ、ルシフェリンなどを含むＡＴＰ試薬を利用し、ＡＴＰ量に応じた発光量（光学的特徴量）を検知することによって行うことができる（化１参照）。
【００３２】
【化１】
また、本発明の装置には、撮像された画像を処理して各種成分に識別した結果を記憶しておく手段（画像記憶装置）が備えられているのが好ましい。記憶しておく手段としては、記憶容量の大きい光磁気ディスク、固定ディスク、デジタルビデオディスク、ＣＤ−Ｒ等の補助記憶装置が挙げられる。本発明の装置に用いられる出力器としては、ＣＲＴディスプレイ、液晶ディスプレイ、プリンタ等の出力装置や上記補助記憶装置が挙げられる。
【００３４】
なお、出力装置としてディスプレイを用いる場合には、メニュー選択によって、測定結果や画像データの他、時刻、現在の装置の状況（各検体の測定状況、各検体又は選択した検体の測定終了予定時刻又は必要残時間、廃液タンクの廃液量、純水タンクの残量、各試薬の残量、洗剤の残量、スライドガラスの残数）等を表示する機能や、選択指定した情報のみを離れた場所から読み取れるように拡大表示する機能を付加しても良い。
【００３５】
本発明の装置においては、識別手段に、分類不可能な有形成分について「その他成分」なる項目に分類する機能、又はその画像を後に呼び出して、技師が直接目視により判断し、その判断結果をデータに付け加えたり修正したりできる機能を付加しても良い。
【００３６】
本発明の装置には、ディスプレイの表示メニューの選択や当該装置の操作をリモコン装置を用いて遠隔操作できる機能を付加しても良い。更に、本発明の装置には、何らかのアクシデントが発生した場合、廃液タンクが満杯になった場合、純水、各試薬、洗剤、スライドガラス等の残りが少なくなった場合等には、画面表示、音又は信号によって警告を発する機能を付加しても良い。
【００３７】
本発明の装置には、緊急の分析に対応するため、分析中の検体の次に緊急検体（緊急の分析を要する検体）を優先して割り込ませる機能、又は分析を一時停止して直ちに緊急検体を分析する機能を付加しても良い。なお、緊急の分析は迅速に行う必要があるため、例えば緊急分析用ボタンを設置し、該ボタンの操作のみで装置に緊急の分析を行わせるようにするのが好ましい。
【００３８】
本発明の方法は、上記した本発明の装置を用いれば容易に行うことができる。即ち、自動で透光板上に被検液を載置する工程が行われ、拡大手段により被検液中の有形成分の標本像を拡大する工程が行われ、撮像手段により有形成分の標本像の焦点を自動で合せ、有形成分の標本像を撮像する工程が行われ、識別手段により撮像された画像を処理して、各種成分に識別する工程が行われる。このように本発明の装置を用いれば、本発明の方法を全自動で行うことができる。
【００３９】
【実施例】
以下、本発明の装置及び方法の実施例を図に基づいて説明するが、本発明の装置及び方法はこの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
実施例１
図２は、本発明の有形成分分析装置の一例を示す図であり、尿沈渣成分の分析装置を示す。
図２の例では、透光板としてはスライドガラス５が用いられている。スライドガラス５は、図１（ａ）に示したようにカバーガラスと一体的に形成されて、カバーガラス一体型スライドガラスとなっている。スライドガラス５は撮像ステージとなるＸＹテーブル６上に載置されている。ＸＹテーブル６には駆動源としてステップモータが組み込まれている。ＸＹテーブル６は駆動回路１１からの信号を受けて駆動され、スライドガラス５をＸ座標軸方向及びＹ座標軸方向に自在に移動、停止させて撮像位置を変更する。
【００４１】
撮像手段としては自動焦点機能付きのＣＣＤカメラ１０が用いられている。ＣＣＤカメラ１０には拡大手段として、対物レンズが取り付けられている。
識別手段は、画像処理制御回路１２、画像メモリ１４、特徴抽出回路１５、識別演算回路１６、中央制御部１７および演算回路２２で構成されており、同図では点線で囲まれている。２３は、出力装置として用いられているディスプレイである。１８は各種成分に識別した結果を記憶するための画像記憶装置である。次に、本発明の装置で行われる処理を時系列に説明する。
【００４２】
最初に、被検液となる尿検体をサンプル容器からプローブによって、三本の反応管１９ａ、１９ｂ、１９ｃに必要量分注する。なお、より均一に分注するため、尿検体は分注前に攪拌している。サンプル容器として予めバーコードが貼り付けられた容器を用いるのであれば、バーコード読み取り装置にて、予めバーコードを読み取る。バーコードを使用することによってサンプルの有無、種類、検体番号を読み取れば、以後の処理データおよびサンプルの識別を容易に行える。
次に、染色液を反応管１９ａに必要量注入し、有形成分の染色を行う。約２分後、反応管１９ａから被検液と染色液との反応液を分取し、カバーガラス一体型スライドガラス（スライドガラス５）に注入する。なお、染色反応時間や反応温度は任意に設定している。
【００４３】
次に、被検液を撮像するため、光源となるランプ７から光を照射する。ランプ７から照射された光（点線部）は光軸上を進み、コンデンサレンズ８を通ってスライドガラス５上の被検液上に集光される。被検液中の有形成分の標本像は対物レンズ９により結像位置に形成され、この結像位置の標本像は、ＣＣＤカメラ１０の撮像面上に画像として投影され、光電変換される。
【００４４】
画像処理制御回路１２は、駆動回路１１を制御してＸＹテーブル６の移動又は停止を制御するとともに、ＸＹテーブル６が停止した際に、ＣＣＤカメラ１０に撮像を行わせる。ＣＣＤカメラ１０で得られた画像は、Ａ／Ｄ変換器１３によりデジタル化される。画像処理制御回路１２は、このデジタル化された画像データを画像メモリ１４に格納する。
【００４５】
画像処理制御回路１２は、画像メモリ１４への格納の終了後、さらにＸＹテーブル６を移動させて撮像位置（視野）を変え、上記と同様に撮像、Ａ／Ｄ変換、メモリへの格納を行う。画像処理制御回路１２は、この一連の動作を予め設定された視野数になるまで繰り返し行う。なお、撮像位置を変更するためのＸＹテーブル６の移動は、一視野分の画像解析が終了してから行うように制御しても良い。
【００４６】
次に、画像処理制御回路１２は、画像メモリ１４に格納された画像データを、特徴抽出回路１５へ入力する。特徴抽出回路１５は、画像の特徴量（例えば、有形成分の面積、円形度係数、円相当径、周囲長、絶対最大長、フェレ径Ｘ／Ｙ比、最大弦長Ｘ／Ｙ比、短軸長さ／長軸長さ比など）を一次パラメータとして抽出する。画像処理制御回路１２は、これら一次パラメータ及びこれらの組合せ演算で生じる二次パラメータを識別演算回路１６に入力する。
【００４７】
識別演算回路１６は、ニューラルネットワークを用いて有形成分の分類を行う。ニューラルネットワークは、予め専門家の判断にもとづいて大量のデータを用いて学習を実行し、各ニューロン間の結合係数を最適化するものである。従って、識別演算回路１６は、入力された一次および二次パラメータを用いてニューラルネットワーク演算を行い、対象となる有形成分の自動分類を実施する。なお、ニューラルネットワーク演算の代わりに、識別演算回路１６には統計的学習認識方法を用いた有形成分の自動分類を行わせても良い。
【００４８】
中央制御部１７は、分類結果及び画像データを画像記憶装置１８に記憶させる。本実施例では、画像記憶装置１８として、記憶容量が大きい光磁気ディスクが用いられている。
【００４９】
一方、尿検体中の細菌などの微生物量を測定するために、反応管１９ｂ中にトリクロロ酢酸を添加し、その一部の検体試料を分取してＡＴＰ測定試薬を添加し、発光させる。反応管１９ｃ中にはトリクロロ酢酸を添加せずに、その一部の検体試料をブランクとして分取し、上記と同様にＡＴＰ測定試薬を添加して発光させる。発光はルミノメータ２０により検知する。積算回路２１は、所定時間内にルミノメータ２０にて検知された発光をカウントし、積算する。次に、演算回路２２は、積算回路２１により積算された発光の数（フォトン数）の情報を、予めＡＴＰの標準品によって算出された計算式に基づいてＡＴＰ量に変換して微生物の数を算出し、算出結果を中央制御部１７に入力する。
【００５０】
中央制御部１７は、撮像された画像の各視野ごとの分類結果を全視野分積算し、演算回路２２から入力される微生物の数と共に、予め入力された境界値（有形成分の標準値）に基づいて定性データ（例えば−、±、＋、＋＋、＋＋＋など）に変換し、得られた定性データや画像データをディスプレイやプリンタ等の出力装置２３に出力する。
【００５１】
図４は、本発明の有形成分分析方法の一例を示す工程ブロック図であり、図１に示す装置を使用して分析が行われている。以下、図４を各工程ごとに説明する。
【００５２】
〔尿検体採取工程〕
本工程においては、尿原液２００検体を遠心分離せずに攪拌後、各検体０．７５ｍｌをそれぞれ三本の所定の反応管に分注する。
【００５３】
〔染色工程〕
本工程においては、尿検体を採取した反応管のうちの一本に、Ｓ（Sternheimer ）染色液を０．２５ｍｌ添加し攪拌する。
【００５４】
〔標本作製工程〕
本工程は、透光板上に被検液を載置する工程である。なお、本工程においては、被検液となる染色液を添加した液から０．０１５ｍｌを分取し、カバーガラス一体型スライドガラスの間隙部分に分注し標本を作製している。
【００５５】
〔標本移動工程〕
本工程においては、作製した標本を撮像ステージにセットしている。撮像ステージはセットされた標本を撮像位置まで移動させる。
【００５６】
〔撮像工程〕
本工程は、被検液中の有形成分の標本像を拡大する工程と、拡大された有形成分の標本像の焦点を自動で合せ、有形成分の標本像を撮像する工程とである。本工程においては、最初に、ＣＣＤカメラに取り付けられた対物レンズ（拡大手段）によって標本像を拡大している。次に、撮像ステージにセットされたＣＣＤカメラによって、自動で焦点を合せ、拡大画像を撮像している。
【００５７】
〔画像処理・記憶工程〕
本工程は撮像された画像を処理して各種成分に識別する工程である。本工程においては、最初に、撮像した画像を光磁気ディスクに記憶する。次に、過去のデータを学習認識する機能を有した演算回路等を用いて、この記憶された画像データから尿中有形成分を各種成分に分類し、各種成分ごとに計数する。分類結果及び係数結果は制御計算工程へ伝達される。
なお、上記した撮像工程、画像処理・記憶工程は、撮像ステージを移動させて撮像位置を変更しながら視野数が１００になるまで繰り返し行われる。
【００５８】
〔微生物量分析工程〕
本工程は、有形成分に起因する光学的特徴量に基づいて、有形成分の量を算出する工程である。本工程においては、最初に尿検体採取工程で尿検体を分注した反応管三本のうち一本に、０．４％トリクロロ酢酸を０．７５ｍｌ添加する。残りの一本にはなにも添加せずブランクとする。各反応管から尿検体０．０１ｍｌを分取し、これにＡＴＰ測定試薬〔３０ｍＭグリシルグリシンバッファ（ｐＨ７．８）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１ｍＭ硫酸ルシフェリン、１０Ｕ／ｍｌルシフェラーゼを含有する。〕を０．５ｍｌ添加して発光を生じさせる。この発光をルミノメータを用いて検知し、積算回路等を用いて発光をカウントし、積算する。
【００５９】
次に、予めＡＴＰの標準品によって算出した計算式によって、各検体中のＡＴＰ量を求める。その後、トリクロロ酢酸を添加した検体中のＡＴＰ量と、ブランクとした検体中のＡＴＰ量との差を求め、検体中の微生物起源のＡＴＰ量を算出する。その結果を制御計算工程へ伝達する。図６に尿中ＡＴＰ濃度と菌数との相関図を示す。
【００６０】
〔制御計算工程〕
本工程においては、画像処理・記憶工程および微生物量分析工程の各工程から得られた結果を統合し、ディスプレイやプリンタ等に出力する。表１は、その出力（印字）例を示している。
【００６１】
【表１】
この実施例における画像処理による検査結果の一致率を表２にまとめた。即ち、撮像された各画像を目視して、画像処理により分類分析された成分名（白血球、赤血球など）と一致しているか否かを判断した。
【００６３】
【表２】
実施例２
図３は、本発明の有形成分分析装置の他の例を示す図である。図３の例では、図２の例と異なり、ＡＴＰ測定試薬の添加はなく、よって図１の例で用いられているルミノメータ、積算回路、演算回路は備えられていない。従って、図３の例に示すように、尿検体は反応管１９にのみ必要量が分取されている。それ以外の構成については図２に示した装置と同様である。
【００６５】
図５は、本発明の有形成分分析方法の他の例を示す工程ブロック図であり、図３に示す装置を使用して分析が行われている。以下、図５を各工程ごとに説明する。
【００６６】
〔尿検体採取工程〕
本工程においては、尿原液検体を遠心分離せずに攪拌した後、この検体０．７５ｍｌを反応管に分取する。
【００６７】
〔染色工程〕
本工程においては、尿検体を分注した反応管に、Ｓ（Sternheimer ）染色液を０．２５ｍｌ添加し攪拌する。
【００６８】
〔標本作製工程〕
本工程においては図４の例と同様に、染色液を添加した液から０．０１５ｍｌを分取し、カバーガラス一体型スライドガラスの間隙部分に分注し標本を作製する。
【００６９】
〔標本移動工程〕
本工程においては図４の例と同様に、作製した標本を撮像ステージにセットし、撮像位置まで移動させる。
【００７０】
〔撮像工程〕
本工程においては図４の例と同様に、拡大された有形成分の標本像の焦点を自動で合せ、撮像ステージにセットされたＣＣＤカメラによって拡大画像を撮像している。
【００７１】
〔画像処理・記憶工程〕
本工程においては図４の例と同様に、撮像した画像を記憶し、画像データから尿中有形成分を各種成分に分類し、各種成分ごとに計数している。分類結果及び係数結果は制御計算工程へ伝達される。なお、撮像工程、画像処理・記憶工程は、撮像ステージを移動させて撮像位置を変更しながら視野数が１００になるまで繰り返し行われる。
【００７２】
〔制御計算工程〕
本工程においては画像処理・記憶工程から得られた結果を統合し、ディスプレイやプリンタ等に出力する。表３は、その出力（印字）例を示しており、強拡大視野（ＨＰＦ）における結果が記号で示されている。
【００７３】
【表３】
【発明の効果】
このように本発明の有形成分分析装置及び有形成分分析方法によれば、被検液中の有形成分の分析にかかわる作業が簡素化され、検査技師の負担を低減させることができる。また、測定対象が流体でないため標本像の焦点を容易に合わせることができ、更にフローセルを使用せずに透光板を用いるので、一回使い切り（ディスポーザル）のものを使用することができ、前検体のキャリーオーバや染色液による汚染の可能性がゼロである。即ち、本発明により、精密性、正確性の高い分析結果を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】カバーガラス一体型スライドガラス１の斜視図である。
【図２】本発明の有形成分分析装置の一例を示す図である。
【図３】本発明の有形成分分析装置の他の例を示す図である。
【図４】本発明の有形成分分析方法の一例を示す工程ブロック図である。
【図５】本発明の有形成分分析方法の他の例を示す工程ブロック図である。
【図６】尿中ＡＴＰ濃度と菌数との相関図である。
【符号の説明】
１ カバーガラス一体型スライドガラス
２ スライドガラス部
３ カバーガラス部
４ 接着剤
５ スライドガラス
６ ＸＹテーブル
７ ランプ
８ コンデンサレンズ
９ 対物レンズ
１０ ＣＣＤカメラ
１１ 駆動回路
１２ 画像処理制御回路
１３ Ａ／Ｄ変換器
１４ 画像メモリ
１５ 特徴抽出回路
１６ 識別演算回路
１７ 中央制御部
１８ 画像記憶装置
１９ 反応管
２０ ルミノメータ
２１ 積算回路
２２ 演算回路
２３ 出力装置
Claims (21)
- サンプル容器中の原尿被検液を攪拌する手段と、攪拌した原尿被検液を分注する手段と、原尿被検液と混合するための染色液を添加する手段と、原尿被検液と染色液の混合液を被覆透光板一体型透光板の間隙部分に分注する手段と、透光板上の原尿被検液を撮像するための撮像ステージと、原尿被検液中の有形成分の標本像を拡大する手段と、有形成分の標本像の焦点を自動で合わせる機能を有し、当該像を撮像する手段と、撮像された画像を処理して各種成分に識別する手段とを有する有形成分分析装置。
- 有形成分が、赤血球、白血球、上皮細胞類および円柱類よりなる群から選択されたいずれかである請求項１記載の有形成分分析装置。
- 上皮細胞類をさらに扁平上皮細胞、移行上皮細胞、尿細管上皮細胞、円形上皮細胞、尿道円柱上皮細胞、前立腺上皮細胞、精嚢腺上皮細胞、子宮内膜上皮細胞、卵円形脂肪体、細胞質内封入体細胞および多辺形細胞よりなる群から選択された１つ以上を含む細胞に分類する請求項２記載の有形成分分析装置。
- 円柱類を硝子円柱、上皮円柱、顆粒円柱、蝋様円柱、脂肪円柱、赤血球円柱、白血球円柱、細胞円柱、硝子白血球円柱、ヘモグロビン円柱、ヘモジリデン円柱、ミオグロビン円柱、アミロイド円柱、蛋白円柱、空胞変形円柱、血小板円柱、細菌円柱、ビリルビン円柱および塩類円柱よりなる群から選択された１つ以上を含む細胞に分類する請求項２記載の有形成分分析装置。
- 撮像された画像を処理して各種成分に識別した結果を記憶しておく手段を有している請求項１記載の有形成分分析装置。
- 上記識別する手段が、予め設定された視野分の全識別結果から分析結果を算出する機能と、分析結果を出力器から出力する機能とを有している請求項１記載の有形成分分析装置。
- 上記識別する手段が学習認識機能を有する請求項１記載の有形成分分析装置。
- 上記識別する手段が有形成分の特徴量の範囲指定を学習し、識別するものである請求項１記載の有形成分分析装置。
- 上記識別する手段が有形成分に起因する光学的特徴量に基づいて、有形成分の量を算出する機能を有している請求項１記載の有形成分分析装置。
- 上記拡大する手段が二種類以上の拡大倍率を有している請求項１記載の有形成分分析装置。
- 上記透光板および被覆透光板の材料が、プラスチックである請求項１記載の有形成分分析装置。
- (1)サンプル容器中の原尿被検液を攪拌する工程と、(2)攪拌した原尿被検液を分注する工程と、(3)原尿被検液と混合するための染色液を添加する工程と、(4)原尿被検液と染色液の混合液を被覆透光板一体型透光板の間隙部分に分注する工程と、(5)被覆透光板一体型透光板を撮像ステージに載置する工程と、(6)原尿被検液中の有形成分の標本像を拡大する工程と、(7)有形成分の標本像の焦点を自動で合せ、有形成分の標本像を撮像する工程と、(8)撮像された画像を処理して、各種成分に識別する工程とを少なくとも有することを特徴とする有形成分分析方法。
- 有形成分が、赤血球、白血球、上皮細胞類および円柱類よりなる群から選択されたいずれかである請求項１２記載の有形成分分析方法。
- 上皮細胞類をさらに扁平上皮細胞、移行上皮細胞、尿細管上皮細胞、円形上皮細胞、尿道円柱上皮細胞、前立腺上皮細胞、精嚢腺上皮細胞、子宮内膜上皮細胞、卵円形脂肪体、細胞質内封入体細胞および多辺形細胞よりなる群から選択された１つ以上を含む細胞に分類する請求項１３記載の有形成分分析方法。
- 円柱類を硝子円柱、上皮円柱、顆粒円柱、蝋様円柱、脂肪円柱、赤血球円柱、白血球円柱、細胞円柱、硝子白血球円柱、ヘモグロビン円柱、ヘモジリデン円柱、ミオグロビン円柱、アミロイド円柱、蛋白円柱、空胞変形円柱、血小板円柱、細菌円柱、ビリルビン円柱および塩類円柱よりなる群から選択された１つ以上を含む細胞に分類する請求項１３記載の有形成分分析方法。
- 予め設定された視野数になるまで、上記(6)の工程から上記(7)の工程まで、または上記(6)の工程から(8)の工程までを、撮像位置を変えて繰り返すことを特徴とする請求項１２記載の有形成分分析方法。
- 上記(1)の工程から(8)の工程までを全自動で行うことを特徴とする請求項１２記載の有形成分分析方法。
- 染色液が、Sternheimer-Malbin染色法、Sternheimer 染色法、Prescott-Brodie 染色法、Behre-Muhlberg染色法、SudanIII染色法、Lugol 染色法、hemosiderin 染色法、Papanicolaou染色法、4-chloro-1-naphthol 法、Field 染色法、Quaglino-Flemans法、Kaplow法、佐藤・関谷法、ベルリン青法、ギムザ染色法、ライト染色法、パッペンハイム染色法、コンゴー赤染色法、メチル緑・ピロニン染色法、アルシアン青染色法、ショール染色法、フォイルゲン染色法、オイル赤Ｏ染色法、Brecker 法、ハインツ小体染色法、中性赤・ヤーヌス緑超生体染色法、ブリリアントクレシル青染色法のうち少なくとも一法に用いられている成分の一種類または二種類以上を含有する試薬である請求項１２記載の有形成分分析方法。
- 有形成分に起因する光学的特徴量に基づいて、有形成分の量を算出する工程を有する請求項１２記載の有形成分分析方法。
- 光学的特徴量がＡＴＰ測定用試薬による発光量である請求項１９記載の有形成分分析方法。
- 透光板および被覆透光板のうち少なくとも一つの材料が、ガラス、プラスチック、化学的処理を施したガラスまたは化学的処理を施したプラスチックである請求項１２記載の有形成分分析方法。
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