JP2007271484A - 細胞成分分析装置の感度を向上する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、被検液中の有形成分を分析するための装置及び方法に関し、特に尿中に含まれる血球類などの有形成分を画像解析技術を用いて自動分析するための装置及び方法に関する。
【解決手段】体液を被検液とし、被検液を染色する工程と、透光板上もしくはフローセル中にて染色された被検液を撮像または蛍光強度、散乱光を測定する工程、および撮像された画像または蛍光強度、散乱光を処理して細胞成分を識別するための手段を有することを特徴とする有形成分分析装置において、被検液の分析量を増大して感度を向上する方法。
【解決手段】体液を被検液とし、被検液を染色する工程と、透光板上もしくはフローセル中にて染色された被検液を撮像または蛍光強度、散乱光を測定する工程、および撮像された画像または蛍光強度、散乱光を処理して細胞成分を識別するための手段を有することを特徴とする有形成分分析装置において、被検液の分析量を増大して感度を向上する方法。
Description
本発明は、被検液中の有形成分を分析するための装置及び方法に関し、特に尿中に含まれる血球類などの有形成分を画像解析技術を用いて自動分析するための装置及び方法に関する。
従来、尿中の有形成分の分析、例えば尿沈渣成分の分析は、(1)尿サンプルを遠心分離する、(2)アスピレーター又はピペットを用いて、あるいはデカンテーションによって上澄み液を除去する、(3)残った残渣成分のうち一定量をスライドガラスに塗布し、カバーガラスを載せ標本とする、(4)顕微鏡にセットし、有形成分(赤血球、白血球、上皮細胞、円柱、微生物、結晶塩など)を分類分析することにより行われている。通常、これらの工程は全て人手によって行われているため、検査技師の大きな負担になっている。また、検査結果のバラツキが大きく、また判断には当然個人差があり、正確性に問題がある(特許文献1〜3参照)。
これらの問題点を解決するため、近年、検体の塗布標本を作製せず被検液に染色液を混和した後、懸濁させたままフローセルに流し、物理統計的な方法や光学的ななどによって自動分析する方法がある。
しかしながら、前記のフローサイトメーター法など自動分析する方法では、有形成分を遠心濃縮する工程が省力されているため、希少成分の検出には不十分となる問題がある。
特開平4−337460号公報
特開平5−296915号公報
特開平5−322885号公報
これらの問題点を解決するため、近年、検体の塗布標本を作製せず被検液に染色液を混和した後、懸濁させたままフローセルに流し、物理統計的な方法や光学的ななどによって自動分析する方法がある。
しかしながら、前記のフローサイトメーター法など自動分析する方法では、有形成分を遠心濃縮する工程が省力されているため、希少成分の検出には不十分となる問題がある。
本発明は、被検液、特に尿中の有形成分分析の検出力を向上し、精密性、正確性の高い装置及び方法を提供することを目的とする。
本発明者らは鋭意検討した結果、被検液中の有形成分を撮像する工程において、広角視野を撮像する低倍率レンズ使用すること、もしくは撮像箇所を増加することよって、上記目的を達成できるに至った。
即ち、本発明の有形成分分析装置は、投光板上もしくはフローセル中の被検液を撮像するための手段および撮像された画像を処理して細胞成分を識別するための手段を有することを特徴とする。また、本発明の有形成分分析装置は、透光板上もしくはフローセル中の被検液を撮像するための撮像ステージと、被検液中の有形成分の標本像を拡大する手段(以下、「拡大手段」という。)と、標本像を撮像する手段(以下、「撮像手段」という。)と、撮像された画像を処理して各種成分に識別する手段(以下、「識別手段」という。)とを有することを特徴とする。また、上記装置は、被検液が髄液の場合に特に有用である。
更に、上記装置においては、撮像手段が標本像の焦点を自動で合わせる機能を有していること、識別手段が、予め設定された視野分の全識別結果から分析結果を算出する機能と、分析結果を出力器から出力する機能とを有していること、当該装置が撮像された画像を処理して各種成分を識別した結果を記憶しておく手段を有すること、或いは当該装置が被検液に成分識別力を助力するための試薬を添加する手段を有することも特徴とする。
また、上記装置においては、識別手段が学習認識機能を有していること、識別手段が有形成分の特徴量の範囲指定を学習させ有形成分の量を算出する機能を有していること、拡大手段が一種以上の倍率を有していること、透光板がスライドガラスであること、或いは透光板が、被検液を被覆する被覆透光板と一体的に形成されたものであることも特徴とする。
本発明の有形成分分析方法は、(1)透光板上もしくはフローセル中に被検液を載置する工程と、(2)被検液中の有形成分の標本像を拡大する工程と、(3)有形成分の標本像の焦点を自動で合せ、有形成分の標本像を撮像する工程と、(4)撮像された画像を処理して、各種成分に識別する工程とを有することを特徴とする。また、上記分析方法は、被検液が尿の場合に特に有用である。
また、上記分析方法において、予め設定された視野数になるまで、上記(2)の工程から(3)の工程まで、または上記(2)の工程から(4)の工程までを、撮像位置を変えて繰り返すこと、或いは上記(1)の工程から(4)の工程までを全自動で行うことを特徴とする。
更に、上記方法において、被検液中に成分識別を助力するための試薬を添加する工程を有していること、成分識別を助力するための試薬が、Sternheimer-Malbin染色法、Sternheimer 染色法、Prescott-Brodie染色法、Behre-Muhlberg染色法、SudanIII染色法、Lugol 染色法、hemosiderin 染色法、Papanicolaou染色法、4-chloro-1-naphthol 法、Field 染色法、Quaglino-Flemans法、Kaplow法、佐藤・関谷法、ベルリン青法、ギムザ染色法、メイ・ギムザ染色法、ライト染色法、パッペンハイム染色法、コンゴー赤染色法、メチル緑・ピロニン染色法、アルシアン青染色法、ショール染色法、フォイルゲン染色法、オイル赤O染色法、Brecker 法、ハインツ小体染色法、中性赤・ヤーヌス緑超生体染色法、ブリリアントクレシル青染色法のうち少なくとも一法に用いられている成分の一種類また
は二種類以上を含有する試薬であること、透光板が被検液を被覆する被覆透光板と一体
的に形成されたものであること、透光板がスライドガラスであること、或いは透光板および被覆透光板のうち少なくとも一つの材料がガラス、プラスチック、化学的処理を施したガラスまたは化学的処理を施したプラスチックであることを特徴とする。
更に、上記装置においては、撮像手段が標本像の焦点を自動で合わせる機能を有していること、識別手段が、予め設定された視野分の全識別結果から分析結果を算出する機能と、分析結果を出力器から出力する機能とを有していること、当該装置が撮像された画像を処理して各種成分を識別した結果を記憶しておく手段を有すること、或いは当該装置が被検液に成分識別力を助力するための試薬を添加する手段を有することも特徴とする。
また、上記装置においては、識別手段が学習認識機能を有していること、識別手段が有形成分の特徴量の範囲指定を学習させ有形成分の量を算出する機能を有していること、拡大手段が一種以上の倍率を有していること、透光板がスライドガラスであること、或いは透光板が、被検液を被覆する被覆透光板と一体的に形成されたものであることも特徴とする。
本発明の有形成分分析方法は、(1)透光板上もしくはフローセル中に被検液を載置する工程と、(2)被検液中の有形成分の標本像を拡大する工程と、(3)有形成分の標本像の焦点を自動で合せ、有形成分の標本像を撮像する工程と、(4)撮像された画像を処理して、各種成分に識別する工程とを有することを特徴とする。また、上記分析方法は、被検液が尿の場合に特に有用である。
また、上記分析方法において、予め設定された視野数になるまで、上記(2)の工程から(3)の工程まで、または上記(2)の工程から(4)の工程までを、撮像位置を変えて繰り返すこと、或いは上記(1)の工程から(4)の工程までを全自動で行うことを特徴とする。
更に、上記方法において、被検液中に成分識別を助力するための試薬を添加する工程を有していること、成分識別を助力するための試薬が、Sternheimer-Malbin染色法、Sternheimer 染色法、Prescott-Brodie染色法、Behre-Muhlberg染色法、SudanIII染色法、Lugol 染色法、hemosiderin 染色法、Papanicolaou染色法、4-chloro-1-naphthol 法、Field 染色法、Quaglino-Flemans法、Kaplow法、佐藤・関谷法、ベルリン青法、ギムザ染色法、メイ・ギムザ染色法、ライト染色法、パッペンハイム染色法、コンゴー赤染色法、メチル緑・ピロニン染色法、アルシアン青染色法、ショール染色法、フォイルゲン染色法、オイル赤O染色法、Brecker 法、ハインツ小体染色法、中性赤・ヤーヌス緑超生体染色法、ブリリアントクレシル青染色法のうち少なくとも一法に用いられている成分の一種類また
は二種類以上を含有する試薬であること、透光板が被検液を被覆する被覆透光板と一体
的に形成されたものであること、透光板がスライドガラスであること、或いは透光板および被覆透光板のうち少なくとも一つの材料がガラス、プラスチック、化学的処理を施したガラスまたは化学的処理を施したプラスチックであることを特徴とする。
本発明の方法によれば、被検液中の有形成分分類にかかわる感度が向上し、分析装置の性能を向上させることができる。
本発明は、体液、例えば尿、血液、血清、血漿、随液、精液、前立腺液、関節液、胸水、腹水、分泌液等の分析や水質検査などに適用することができる。
本発明において分析の対象となる有形成分は、被検液中に分散ないし懸濁しているものであれば特に限定されるものではない。例えば被検液が尿の場合では、赤血球(変形赤血球、各種由来赤血球)、白血球(濃染細胞、淡染細胞、輝細胞)、上皮細胞類(扁平上皮細胞、移行上皮細胞、尿細管上皮細胞、円形上皮細胞、尿道円柱上皮細胞、前立腺上皮細胞、精嚢腺上皮細胞、子宮内膜上皮細胞、卵円形脂肪体、細胞質内封入体細胞、多辺形細胞など)、円柱類(硝子円柱、上皮円柱、顆粒円柱、蝋様円柱、脂肪円柱、赤血球円柱、白血球円柱、細胞円柱、硝子白血球円柱、ヘモグロビン円柱、ヘモジリデン円柱、ミオグロビン円柱、アミロイド円柱、蛋白円柱、空胞変形円柱、血小板円柱、細菌円柱、ビリルビン円柱、塩類円柱など)、微生物類(真菌、細菌、原虫、精子など)、結晶・塩類(尿酸塩、リン酸塩、シュウ酸カルシウム、ビリルビン、シスチン、コレステロール、2,8-ジヒドロキシアデニン結晶など)、その他(核内封入体細胞、脂肪顆粒細胞、大食細胞、異型細胞)などが分析の対象となる有形成分として挙げられる。
本発明の装置及び方法においては、透光板上もしくはフローセル中に被検液を載置することを特徴とする。好ましくは透光板を用いる。透光板は透光性を有し、被検液を載置可能なものであれば良く、例えば、スライドガラス等が挙げられる。スライドガラスは一回使い切り(ディスポーザブル)であるため、前検体のキャリーオーバや染色剤による汚染の可能性がゼロであり、信頼性の高い測定結果を提供することができる。透光板の材料は、プラスチック(合成樹脂)、ガラスなど透光性を有するものであれば、特に限定されるものではない。なお、プラスチックの場合は、必要に応じて親水性を向上させるための化学的処理を施すのが良い。
透光板に載置された被検液は、被覆透光板で被覆されていても良い。被覆透光板としては、例えばカバーガラスが挙げられる。被覆透光板の材料としては、上記した透光板と同様のものが挙げられるが、特に限定されるものではない。図1は、被覆透光板となるカバーガラスと、透光板となるスライドガラスとが一体的に形成された、カバーガラス一体型スライドガラス1の斜視図である。図1(a)ではスライドガラス部2上に載置されたカバーガラス部3の対向する二辺が接着剤4などで封止され、残りの対向する二辺が開放状態になっている。図1(b)はスライドガラス部2上に載置されたカバーガラス部3の三辺が接着剤4などで封止され、残りの一辺が開放状態になっている。被検液を開放された一辺から分注すると、毛細管現象によりスライドガラス部2とカバーガラス部3との間隙に被検液が注入される。即ち、透光板であるスライドガラス部2に被検液が載置される。このようにカバーガラス一体型スライドガラス1を用いれば、簡単に所定量を正確に注入させることができ、カバーガラスをセットする煩雑な標本作製工程を省力化することができる。
透光板上の被検液を撮像するための撮像ステージは、透光板を載置し得るものであれば良く、特に限定されないが、撮像位置を変更できるように移動可能なものであるのが好ましい。移動は手動で行っても良いが、例えばサーボモータ、ステッピングモータやリニアモータ等を使用して機械的に行うのが好ましい。
撮像手段としては、デジタルカメラ、CCDカラービデオカメラ等が挙げられる。また、撮像手段には、有形成分の標本像の焦点を自動で合わせる機能(オートフォーカス機能)を付加しておくのが好ましい。拡大手段は、撮像前の標本像を光学的に拡大するものであっても良いし、撮像された標本像の画像をデジタル処理等して拡大するものであっても良い。具体的には、前記カメラに取り付けられるズームレンズや対物レンズ等が挙げられる。
識別手段は、撮像された画像中の有形成分をその形態等に基づいて分類し、識別するものである。識別手段には、予め設定された視野分の全識別結果から分析結果を算出する機能と、分析結果を出力器から出力する機能とを付加するのが好ましい。なお、ここでいう予め設定された視野分とは、撮像する視野(画像)数のことをいう。また、識別手段には撮像された画像を一旦記憶しておくためのメモリ等を備えておくのが好ましい。
識別手段としては、例えば、上記の識別を行うようにプログラミングされたコンピュータ、論理回路で構成された識別装置等が挙げられる。このうち、識別手段としてコンピュータを用いれば、各工程の動作、画像処理、記憶、計算、出力等すべての制御がソフト上で行えるようになり好ましい。
識別手段は学習機能を有しているのが好ましい。学習認識機能を有することによって、正確性、精密性の高い測定結果が提供される。識別手段は、(1)赤、緑、青を明度と色度とに分離する色抽出の範囲指定、(2)穴埋め、線分の書き込み、画像の切り離しからなる二値画像処理の範囲指定、(3)画像の特徴量(面積、円形度係数、円相当径、周囲長、絶対最大長、フェレ径X/Y比、最大弦長X/Y比、短軸長さ/長軸長さ比など)の範囲指定を学習し、識別を行うことができる。
また、識別手段による上記画像処理は、ソフトウェアにより、有形成分の形態に基づいて有形成分を分類分析するため、明らかに形状の違う組織球や好中球などの分類に関しては精度が高いが、リンパ球と単球などの形態が似かよった場合には、分析能はどうしても低下してしまう。
そこで、本発明の装置においては、被検液に成分識別を助力するための染色剤などの試薬を添加する手段を本発明の装置に更に付加することによって、本発明の方法においては、被検液に成分識別を助力するための染色剤などの試薬を添加する工程を加えることによって、上記の形態の似かよった成分を分類し、分析能を向上させることができる。
試薬は特に限定されないが、一般的に知られているものとして、ギムザ染色法、メイ・ギムザ染色法、Sternheimer-Malbin染色法(SM染色法)、Sternheimer 染色法(S染色法、NS染色法またはSternheimer 染色法の変法)、Prescott-Brodie 染色法、Behre-Muhlberg染色法(BM染色法)、SudanIII染色法、Lugol 染色法、hemosiderin 染色法、Papanicolaou染色法、4-chloro-1-naphthol 法、Field 染色法、Quaglino-Flemans法、Kaplow法、佐藤・関谷法、ベルリン青法、ライト染色法、パッペンハイム染色法、コンゴー赤染色法、メチル緑・ピロニン染色法、アルシアン青染色法、ショール染色法、フォイルゲン染色法、オイル赤O染色法、Brecker 法、ハインツ小体染色法、中性赤・ヤーヌス緑超生体染色法、ブリリアントクレシル青染色法(「臨床検査技術全書3 血液検査」、「臨床検査法提要」、「染色法のすべて MEDICALTECHNOLOGY別冊」)等のうち少なくとも一法に用いられている成分の一種類または二種類以上を含有するものが挙げられる。例えば、ある一つの染色法で用いられる複種類の染色剤及び添加剤の中から幾つかの染色剤及び添加剤を選択し、これらを組み合わせて試薬としても良いし、それぞれ別の染色法で用いられている複種類の染色剤を組み合わせて試薬としても良い。
なお、上記染色剤には、染色剤の保存安定性や防腐性能を高めるために、一般的に知られている防腐(抗菌)剤(各種抗生物質、EDTA塩類、ホウ酸、クエン酸、NaN3 、プロクリン、ベンツイソチアゾロン、ピリチオン、N−メチルイソチアゾール等)を添加しても良い。また、染色液を至適pHに保つ為に各種緩衝液を添加したり、有形成分の形態を保持するために各種塩類(EDTA塩類、石炭酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、NaCl、KCl、CaCl2 、AlCl3 等)、各種糖類(グルコース、フラクトース、ガラクトース、マルトース、キシリトール、ソルビトール)、シクロデキストリン類、グルタルアルデヒドを添加しても良い。更に、測定の妨げとなる不溶性物質を除くために各種界面活性剤や酵素類を添加しても良い。
また、本発明の装置には、撮像された画像を処理して各種成分に識別した結果を記憶しておく手段(画像記憶装置)が備えられているのが好ましい。記憶しておく手段としては、記憶容量の大きい光磁気ディスク、固定ディスク、デジタルビデオディスク、CD−R等の補助記憶装置が挙げられる。本発明の装置に用いられる出力器としては、CRTディスプレイ、液晶ディスプレイ、プリンタ等の出力装置や上記補助記憶装置が挙げられる。
なお、出力装置としてディスプレイを用いる場合には、メニュー選択によって、測定結果や画像データの他、時刻、現在の装置の状況(各検体の測定状況、各検体又は選択した検体の測定終了予定時刻又は必要残時間、廃液タンクの廃液量、純水タンクの残量、各試薬の残量、洗剤の残量、スライドガラスの残数)等を表示する機能や、選択指定した情報のみを離れた場所から読み取れるように拡大表示する機能を付加しても良い。
本発明の装置においては、識別手段に、分類不可能な有形成分について「その他成分」なる項目に分類する機能、又はその画像を後に呼び出して、技師が直接目視により判断し、その判断結果をデータに付け加えたり修正したりできる機能を付加しても良い。
本発明の装置には、ディスプレイの表示メニューの選択や当該装置の操作をリモコン装置を用いて遠隔操作できる機能を付加しても良い。更に、本発明の装置には、何らかのアクシデントが発生した場合、廃液タンクが満杯になった場合、純水、各試薬、洗剤、スライドガラス等の残りが少なくなった場合等には、画面表示、音又は信号によって警告を発する機能を付加しても良い。
本発明の装置には、緊急の分析に対応するため、分析中の検体の次に緊急検体(緊急の分析を要する検体)を優先して割り込ませる機能、又は分析を一時停止して直ちに緊急検体を分析する機能を付加しても良い。なお、緊急の分析は迅速に行う必要があるため、例えば緊急分析用ボタンを設置し、該ボタンの操作のみで装置に緊急の分析を行わせるようにするのが好ましい。
本発明の方法は、上記した本発明の装置を用いれば容易に行うことができる。即ち、自動で透光板上に被検液を載置する工程が行われ、拡大手段により被検液中の有形成分の標本像を拡大する工程が行われ、撮像手段により有形成分の標本像の焦点を自動で合せ、有形成分の標本像を撮像する工程が行われ、識別手段により撮像された画像を処理して、各種成分に識別する工程が行われる。
以下、本発明の装置及び方法の実施例を図に基づいて説明するが、本発明の装置及び方法はこの実施例に限定されるものではない。
実施例1
[尿検体採取工程]
尿原液200検体を遠心分離せずに攪拌後、各0.75mlをそれぞれ所定の反応管に分注する。
[染色工程]
尿検体を分注した反応管に、S(Sternheimer)染色液0.25ml添加し攪拌する。
[撮像工程]
染色液と混合した尿検体はフローセル中を流れ、撮像領域に到達する。撮像領域の前面にセットされたCCDカメラによって、10倍率対物レンズと20倍率対物レンズに相当する拡大画像を100視野撮像する。
[画像処理・記憶工程]
撮像した画像を光磁気ディスクまたは固定ディスクに記憶する。撮像した画像を、学習認識機能を用い尿中有形成分を各種成分に分類、計数し、結果を制御計算工程へ伝達する。また、画像を記憶後、被検液が移動し、再び焦点工程、撮像工程、記憶工程へと進み、この繰り返しを100視野になるまで実施する。
[制御計算工程・出力工程]
画像処理・記憶工程から得られた結果をディスプレイやプリンタにアウトプットする。
表1に、その出力(印字)例を示し、強拡大視野(HPF)における結果が記号で示されている。
実施例1
[尿検体採取工程]
尿原液200検体を遠心分離せずに攪拌後、各0.75mlをそれぞれ所定の反応管に分注する。
[染色工程]
尿検体を分注した反応管に、S(Sternheimer)染色液0.25ml添加し攪拌する。
[撮像工程]
染色液と混合した尿検体はフローセル中を流れ、撮像領域に到達する。撮像領域の前面にセットされたCCDカメラによって、10倍率対物レンズと20倍率対物レンズに相当する拡大画像を100視野撮像する。
[画像処理・記憶工程]
撮像した画像を光磁気ディスクまたは固定ディスクに記憶する。撮像した画像を、学習認識機能を用い尿中有形成分を各種成分に分類、計数し、結果を制御計算工程へ伝達する。また、画像を記憶後、被検液が移動し、再び焦点工程、撮像工程、記憶工程へと進み、この繰り返しを100視野になるまで実施する。
[制御計算工程・出力工程]
画像処理・記憶工程から得られた結果をディスプレイやプリンタにアウトプットする。
表1に、その出力(印字)例を示し、強拡大視野(HPF)における結果が記号で示されている。
この実施例における画像処理による検査結果の感度比較を表2にまとめた。対照比較として遠心濃縮して観察する測定を行った。その結果を表2にまとめた。
実施例2
上記実施例1と同様な工程で尿検体を分析し、赤血球、白血球の検査結果について、測定単位ごとの詳細な結果を解析した。
上記実施例1と同様な工程で尿検体を分析し、赤血球、白血球の検査結果について、測定単位ごとの詳細な結果を解析した。
この実施例における画像処理による検査結果の感度比較を表3と表4にまとめた。対照比較として遠心濃縮して観察する測定を行った。
本発明は、体液、例えば尿、血液、血清、血漿、随液、精液、前立腺液、関節液、胸水、腹水、分泌液等の分析や水質検査などに適用することができる。
Claims (3)
- 体液を被検液とし、被検液を染色する工程と、透光板上もしくはフローセル中にて染色された被検液を撮像または蛍光強度、散乱光を測定する工程、および撮像された画像または蛍光強度、散乱光を処理して細胞成分を識別するための手段を有することを特徴とする有形成分分析装置において、被検液の分析量を増大して感度を向上する方法。
- 上記被検液の分析量を増大する手段として、被検液の分析に広角視野を撮像するレンズを用いる請求項1記載の方法。
- 上記被検液の分析量を増大する手段として、撮像箇所を増やす請求項1記載の方法。
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