JP2005524833A - 分析細胞イメージング用のデバイスおよび方法 - Google Patents

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Abstract

癌腫に罹った患者においては、腫瘍細胞が血液に流出しており、これらの細胞の計数および特徴付けは、腫瘍の"リアルタイム"バイオプシーを得る機会を提供し、疾患の管理を改善し得る。循環する腫瘍細胞の頻度は希有（＜１細胞／ｍｌ）であり、これらの細胞を計数および特徴付けするために十分な感度および特異性を有する技術が必要である。本発明のシステムは、免疫磁気的に富化した細胞の蛍光波形ならびに像に基づく免疫表現型を提供するために開発された。７.５〜３０ｍｌの範囲の血液体積を上皮細胞に関して免疫磁気的に富化する。試料体積を３２０μｌまで減少させ、分析チャンバーに挿入する。チャンバーを磁場に導入すると、免疫磁気的にタグを付した細胞が試料から浮かび上がり（rise out）、チャンバーの観察表面に存在するニッケル線（周期３０μｍ、間隔１５μｍ）の間に整列する。マルチレーザーシステムを用いて、ＤＡＰＩ、フィコエリスリンおよびアロフィコシアニン標識され、磁気的に整列した細胞によって発せられた蛍光を検出する。コンパクトディスク・オプティクスを用いて、チャンバーを運動させつつニッケル線に対するレーザービームのアライメントおよびフォーカスを維持する。チャンバーを１０ｍｍ／秒の速度でスキャンし、チャンバー全体はほぼ５分で分析される。事象から得られた蛍光シグナルは、フローサイトメーターのものに類似する免疫表現型を提供する。蛍光波形は事象の特徴付けを改善し、バックグラウンド、細胞残渣および細胞として分類に加味される。細胞の位置は保持されるので、上皮細胞と免疫表現型的に分類された対象物をさらなる分析のために再アプローチし得る。選択された対象物の明視野像および蛍光像を捕捉して、同定した対象物が腫瘍細胞であることを確認する。

Description

発明の詳細な説明
優先権情報
本願は、２００２年５月３日に出願された米国仮特許出願番号６０／３７７,８６８号に基づく３５ ＵＳＣ§１１９（ｅ）の優先権を主張する。その出願は出典明示して本明細書の一部とみなす。
発明の背景
自動化された画像解析システムを用いて、手動方法における異なる操作者間の細胞分類の主観的なエラーが低減されているが、予備的な細胞富化工程を含まないかかる従来のシステムはいまだ感度を固有的に欠いている。幾つかの自動化された細胞イメージングシステムが記載されており、あるいは細胞解析用に市販されている。Chromavisionによって開発されたシステム、ＡＣＩＳＴＭまたはAutomated Cellular Imaging System（Douglassら, 米国特許第６,１５１,４０５号）は、自動化されたコンピュータ制御の顕微鏡によって観察される、および／またはヘルスケア専門医による視覚検査によって観察されるサイズ、形状、色相および染色強度によって、調製した細胞の検鏡による比色パターン認識を使用している。該システムは、顕微鏡スライドガラス上の細胞の検査を使用し、組織片用に設計された。Applied Imaging Corp.のSlideScanＴＭまたはＭＤＳＴＭシステム（Saundersら, 米国特許第５,４３２,０５４号）は、色、強度、サイズ、パターンおよび形状によって細胞または"対象物"を検出する自動化された情報処理機能を有する顕微鏡およびイメージングシステムにつづいて視覚的に同定および分類すると記載されている。ＡＣＩＳシステムに対して、このシステムは蛍光標識を検出する能力を有し、より高い能力を提供する。しかしながら、これらのおよび他の現在利用可能な方法は、血中の循環する腫瘍細胞のごとき希有な事象を正確に分類し、タイピングするのに十分に感度が高くない。
上皮細胞は正常な環境下では血中に存在しない。上皮由来のガン（癌腫）に罹った患者においては、ガン細胞が血液中に流出し得る。これらの細胞は末梢血液中にはほとんど存在せず、患者によって大きなダイナミックレンジを示す。腫瘍細胞は極めて低頻度（＜１０細胞／ｍＬ）で癌腫患者の血中に存在し得る。フローサイトメトリーおよび／蛍光顕微鏡は、調製した試料を分析するために頻繁に用いられる分析法である。フローサイトメトリーは感度が高くかつ再現性がよいという利点を有しているが、検出した細胞の免疫表現型および形態的特徴を同時に評価する能力は欠いている。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて同定した細胞を免疫表現型的にソーティングし得るが、希有な事象をソーティングすることは極めて困難であり、それを細胞学的評価にとどめている。また、後者のものに必要な熟達レベルは臨床的なアッセイには高い。蛍光顕微鏡は、顕微鏡分析用の試料スライドガラスを調製することと関連してかなりの変動しやすい細胞喪失を生じるという欠点を有する。しかしながら、それは、細胞を悪性腫瘍と一致する特徴を有するとして視覚的に確認し得るという利点を有する。
分析システムは１の細胞ほどの少ない細胞を正確に同定する能力を有していなければならないが、いまだに１０４の細胞ほどの多い細胞しか計数することができない。これらの循環する腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出は、サイズおよび形状のみならず、極めて低または高コピー数で存在し得る細胞骨格タンパク質のごときその抗原発現プロファイルにおける不均一性によってさらに複雑になる。
かくして、本発明は、前記した方法に改良を加えること、ならびに例えば高感度の免疫表現型決定と結合して用いて血中または他の流体中のＣＴＣのごとき、希有な標的種を検出、計数および正確に分類することができる、対象物の自動化されたイメージングの単純かつ効率的な手段および方法を提供することを目的とする。
発明の簡単な説明
本発明は、フォーカスされたレーザービームを通過させつつニッケル線上に整列した細胞を免疫磁気的に区別するセルアナライザーである。１の好ましい具体例において、従来のＣＤプレーヤーの対物レンズを用いて、磁気的に整列した細胞にレーザーダイオードをフォーカスする。ＣＤプレーヤーで使用されているものに類似する光学フォーカスおよびトラッキングシステムを用いて、線に沿ってスキャンした。発せられた蛍光シグナルは光電子増倍管に投射され、それによって測定した。機器システムによって同定された絶対的および相対的な細胞集団は、標準的なフローサイトメーターまたは血液アナライザーを用いて得られた数とよく相関した。
さらなる具体例において、機器システムの特徴を拡大して、免疫蛍光シグナルを測定するためのその感度に基づくことによって、希有な細胞の分析に対する可能性を示した。このことは、関心のある事象を再アプローチする（revisit）能力の付加、ならびにこれらの対象物の明視野および蛍光像を提供することによって行った。
本発明のさらなる具体例には、照明光源を一方にそらせるためのスキャンニングミラーが含まれる。関心のある対象物は照明を通過するので、対象物を横切って"ラスター化された（rastered）"パターンが形成され、それはつづいて検出され、対象物のより詳細な像に変換され、ラスター像を作り出す。
発明の詳細な説明
本明細書中では、当業者によってよく理解される種々の用語を用いる。これらの用語の意図する意味は、認められた意味から逸脱するものではない。
本発明は、Tibbeら（Nature Biotech. 17, 1210-13, 1999）によって記載されているCellTracksＴＭ細胞分析システムのごときシステムへの新規なイメージング能力の適用を許容するデバイスおよび方法を提供する。簡単には、本発明の好ましい具体例において、血液からの磁気的収集および富化の後に、磁気標識した細胞をニッケル（Ｎｉ）の強磁性の線に沿って整列し、コンパクトディスクプレーヤーからのごとき従来の対物レンズによってフォーカスされたレーザーによってスキャンする。細胞は１またはそれを超える蛍光標識で選択的に染色されているため、測定した蛍光発光および強度を用いて細胞型を同定または分類し得る。
末梢血液中の上皮由来腫瘍細胞は極めて希有であるが、ガン患者の血液中には存在し得る。分析の間、生物試料中に存在する事象が予想される特徴を有する上皮細胞であるという確信は、分析ゲートにおける事象の数で減じる。個々の事象に対するさらなるおよび好ましくは独立した情報は、上皮細胞由来腫瘍細胞としての事象の正確な同定を助ける。本明細書中で後記するごとく、上皮細胞は、７.５ｍｌの血液から免疫磁気的に選択され、一連の平行薄層フィルムのニッケル線の間に試料チャンバー中で磁気的に整列される。ＣＤのヘッドはすべてのニッケル線に沿ってスキャンし、線の間の対象物の蛍光シグナルを捕捉する。上皮腫瘍細胞として免疫表現型的に分類された対象物をイメージング用に再アプローチして、同定した対象物が実際に上皮腫瘍細胞または上皮細胞由来の残渣と同定されるかを判定する。
本明細書中で用いる"標的生物基（entity）"なる用語は、生物学的または医学的に関心のある広範な種々の材料をいい、標本中に存在する"非標的"材料から区別し得る。例には、ホルモン、タンパク質、ペプチド、レクチン、オリゴヌクレオチド、薬剤、化学物質、核酸分子（例えば、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）および生物起源の特定の分析物が含まれ、それには細胞、ウイルス、細菌などのごとき生物粒子が含まれる。本発明の好ましい具体例において、母性循環（maternal circulation）中の胎児細胞または循環するガン細胞のごとき希有な細胞を、本発明の装置および方法を用いて非標的細胞および／または他の生物基から効率的に単離し得る。
"生物標本"または"生物試料"なる用語は相互変換可能に使用し得、関心のある生物学的な基（または生物基）を含むことが疑われるヒト試験対象物から採取した、分析すべき少量の部分の流体または組織をいう。生物標本とは、流体部分、細胞部分および可溶性材料を含有する部分をいう。生物標本または生物試料には、限定されるものではないが、末梢血液、組織ホモジネート、乳首吸引物（nipple aspirate）、結腸洗浄液、唾液、気管支（肺胞）洗浄液、胸膜流体、腹膜流体、心膜流体、尿のごとき肉体的流体、およびヒト試験対象から入手可能ないずれかの他の起源の細胞が含まれる。例示的な組織ホモジネートは、乳ガン患者におけるセンチネルリンパ節から得ることができる。生物学的な基とは、先の説明から理解されるごとく、関心のある対象物をいう。
"決定基"なる用語は、いずれか先の標的生物基に参照して用いる場合は、免疫応答を誘導する場合がある巨大分子抗原上に存在する化学的モザイクを広くいう。決定基は"エピトープ"と相互変換可能に使用することもできる。本明細書中で相互変換可能に使用する"生物特異的リガンド"または"生物特異的試薬"は、決定基に特異的に結合し得る。決定基は、特異的結合物質（リガンドまたは試薬のごとき）に対する選択的な結合に関与し、および寄与する標的生物基の部分をいい、その存在は選択的結合が起こるのに必要である。基本的な用語において、決定基は、特異的な結合対反応において、それに対して結合アフィニティーを有する剤、リガンドおよび／または試薬によって認識される標的生物基上の分子接触領域である。
本明細書中で用いる"特異的結合対"なる用語には、抗原−抗体、受容体−ホルモン、受容体−リガンド、アゴニスト−アンタゴニスト、レクチン−炭水化物、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ハイブリダイズ配列、Ｆｃ受容体またはマウスＩｇＧ−プロテインＡ、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチンおよびウイルス−受容体の相互作用が含まれる。
本明細書中で用いる"検出可能な標識"なる語句は、物理的または化学的な手段による直接的または間接的のいずれかのその検出または測定が、試験試料中の標的生物基の存在の指標であるいずれかの物質をいう。有用な検出可能な標識の代表的な例には、限定されるものではないが、以下のものが含まれる：吸光、蛍光、反射率、光散乱、リン光またはルミネセンス特性に基づいて直接的または間接的に検出可能な分子またはイオン；その放射能特性によって検出可能な分子またはイオン；その核磁気共鳴または常磁性特性によって検出可能な分子またはイオン。吸光または蛍光に基づいて間接的に検出可能な分子の群に含まれるのは、例えば、適当な基質を変換させる（例えば、非吸光性のものから吸光性の分子に、または非蛍光のものから蛍光性の分子に）種々の酵素である。分析は、マルチパラメータ・フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡、レーザースキャニング・サイトメトリー、明視野ベースの画像解析、キャピラリー体積測定（capillary volumetry）、スペクトル画像解析、手動の細胞分析、CellSpotter（登録商標）分析、CellTracksＴＭ分析および自動化された細胞分析を含む、多数の一般的に使用されているプラットフォームのいずれかを用いて行い得る。
"〜を実質的に排除する"なる語句は、生物特異的リガンドまたは生物特異的試薬とその対応する標的決定基との間の結合反応の特異性をいう。生物特異的リガンドおよび試薬はその標的決定基に対して特異的な結合活性を有するが、いまだ他の試料成分に対して低レベルの非特異的な結合も示し得る。
本発明のシステムは希有な細胞を同定するために設計された。"希有な細胞"なる用語は、生物標本中に通常存在しないが、感染疾患、慢性疾患、傷害または妊娠のごとき異常な状態の指標として存在し得る細胞と本明細書中では定義する。希有な細胞は、生物標本中に通常存在するが、正常な生物標本中に典型的に存在する細胞よりも数桁低い頻度で存在し得る細胞をいう。本明細書中で用いる検出および計数手法は、出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第６,３６５,３６２号にさらに記載されている。
本発明のシステムのオプティクスには、照射光源およびディテクターが含まれる。例えば、照明手段は狭スペクトルのレーザーまたはＬＥＤとし得る。それは広スペクトルの白色光源とすることもでき、そこでは光が狭いスペクトルのフィルターを通過して望ましい波長を達成する。検出コンポーネントはディテクターエレメントの二次元アレイからなる。かかるディテクターアレイの例には、ＰＭＴおよびＣＣＤが含まれる。しかしながら、当業者であれば、本発明に他の照明手段および検出手段を用い得ることは理解するであろう。
１〜３０ｍＬの範囲の血液体積からの細胞の免疫磁気的選択、分離および染色を含む試料調製プロセスは、本発明のシステムによる試料の分析よりも先行する。細胞は試料チャンバー（出典明示して本明細書の一部とみなす、米国特許第６,１３６,１８２号および米国２００２／０１０９８３８号に記載されている）に移され、出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第５,９８５,１５３号に記載されているごとく、試料チャンバーの内側表面上の９０の平行な１５μｍ幅のニッケル線の間に磁気的に整列させた。ＣＤヘッドは発光手段を用いてすべてのニッケル線に沿って５分未満でスキャンし、検出手段を用いて線の間の対象物の蛍光シグナルを捕捉する。細胞は磁力によってその位置を維持し、それは関心のある細胞に再アプローチする可能性を作り出す。本発明において用いるイメージング技術は、出典明示して本明細書の一部とみなす、一般に所有されるＰＣＴ／ＵＳ０２／００２０３に記載されているものに基づいている。
蛍光プローブの低ノイズ、高シグナルおよび最小限の蛍光発光スペクトルの重複は、希有な細胞検出に必須である。システムは、各々ＤＡＰＩ、ＰＥおよびＡＰＣの励起用の４０５ｎｍ、５３２ｎｍおよび６３５ｎｍのレーザーを備えていた。細胞としての同定した対象物を確認または拒絶するためには、関心のある対象物を再アプローチし、紫色レーザーダイオードを用いて、ＤＡＰＩ染色された核の像を得る（図５Ｄ）。レーザースペックルを克服するために、スキャニング・ミラーを用いて均一な照明を得る。対象物中のＤＮＡの量は、光電子増倍管を用いてＤＡＰＩ発光を測定することによって定量化し得る（図１）。高い消散係数および量子収率ならびにＰＥの大きなストークシフトにより、それは、上皮細胞中の細胞骨格タンパク質を同定するサイトケラチン抗体を標識する蛍光色素として最高の選択となる。５３２ｎｍの光源を選択してＰＥを励起した。それが４８８ｎｍ励起と比較して６倍のＳＮ比上昇を提供するからである。本発明においては、細胞をレーザースポットに曝露する時間はフローサイトメーターと比較して数桁大きく、したがってより多くの光量子を収集することができ、これがシステムの高い感度を説明している。最適とは離れるが、ＰＥは４０５ｎｍのレーザーラインによって励起し得る。しかしながら、異なるスキャン速度で両方の励起原を用いてＳＮ比を比較していない。６３５ｎｍの光源を選択してＡＰＣを励起し、それによってＰＥの励起スペクトルと発光スペクトルとの間のいずれの重複をも回避される。ＣＤ４５−ＡＰＣは、上皮細胞からの富化手法を介して運搬された白血球の識別を許容する。より重要なことは、それが、上皮細胞としてのＣＫ−ＰＥに非特異的に結合する白血球を同定することを回避する。白血球は、血中の上皮由来腫瘍細胞に結合し得る。この現象は、細胞の像と合わせた蛍光シグナルの波形によって無関係な対象物から区別し得る関連するＣＫ＋およびＣＤ４５＋対象物を生じるであろう。
要約において、本発明のシステムにおいて測定した免疫表現型、デジタル化した蛍光シグナルおよび明視野の空間分布および蛍光像により、血中に低頻度で存在する上皮細胞の同定が可能であり、さらに、これらの細胞の無傷、損傷したまたは上皮細胞残渣のごとき細胞のサブ分類が可能となる。この実験においてはカルシノーマセルラインを用いて機器の性能を実証したが、機器は、血中の上皮細胞、母性血液中の胎児細胞、血中または他の流体中の細菌のごとき他の希有な事象の検出を含む種々の細胞分析に用い得る。試料調製方法は、関心のあるいずれかの標的に特異的であるよう修飾し得（磁性溶液選択によって）、細胞の染色はシステム内に確立したレーザー波長およびフィルター選択と和合性でなければならないであろう。
本発明のシステムは、出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第６,１２０,８５６号に記載されているごとく超常磁性鉄溶液（Immunicon, Huntingdon Valley, PA）で標識した６μｍのＤｅｅｐ Ｒｅｄ蛍光ビーズ（Molecular Probes, Eugene, Oregon）を用いて較正した。磁性ビーズは３０００／ｍＬの濃度で使用し、分析する前に試料チャンバー（３２０μｌ）に入れた。
半自動化された試料調製システム（出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許出願番号１０／０８１,９９６号に記載されているCellPrepＴＭ）を用いて血液試料をプロセシングした。簡単には、７.５ｍｌの全血をＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）標識した免疫磁性粒子（前記した磁性溶液）とインキュベートした。ＥｐＣＡＭ抗原は上皮起源の細胞上で発現したが、血液細胞上には発現しなかった。一連のインキュベーション、分離および再懸濁工程は、（出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第６,１３６,１８２号に記載されているごとく）特別に設計した永久マグネット取り付け具の２の極間に保持される（出典明示して本明細書の一部とみなす、米国特許出願第１０／０７４,９００号に記載されているごとく）試料チャンバーに入った３２０μＬの試料を生じる。試料には、フィコエリスリンにコンジュゲートした抗サイトケラチン（ＣＫ−ＰＥ）、アロフィコシアニンにコンジュゲートした抗−ＣＤ４５（ＣＤ４５−ＡＰＣ）、および核酸特異的な色素ＤＡＰＩ（４,６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で蛍光標識された免疫磁気的に選択した細胞が含まれる。抗−サイトケラチンは、上皮起源の細胞に存在する低分子量のケラチン４、６、８、１０、１３および１８を認識する。抗−ＣＤ４５は白血球を同定し、ＤＡＰＩは細胞の核を染色する。
試料チャンバーは、一連の平行な薄層フィルムニッケル線を担持する、ガラスカバースリップが上に結合した成型ポリスチレンハウジング（Metrigraphics, Wilmington, MA）からなる。ガラス上面は光学等級のＵＶ硬化性接着剤(Dymax, Torrington, CT）を用いてチャンバー本体に結合し、かくしてチャンバーキャビティーを形成する。チャンバーの寸法、３０ｍｍ×４ｍｍ×２.７ｍｍは、３２４μＬの内部流体体積を与える。試料は操作者によって流入ポートを通してチャンバーに分配され、仕上げられて空気を封鎖（seal out）し、チャンバーを分析用機器上に置くことが許容される。コンピュータ・シミュレーションを用いて最適なマグネット角度および試料チャンバー表面の距離を決定して、最も均一なフィールドグラジエントを得る。細胞がニッケル線によって示されるフィールドグラジエントの範囲内に存在する場合、それは線の間に牽引され、そこでそれはスキャンするために適所に保持される。図２Ａは試料チャンバーを示し、該チャンバーを２のマグネットの間に保持するマグネットヨーク・アセンブリーを図２Ｂに示す。均一に細胞を分配させるためには、米国特許第６,１３６,１８２号に記載されているごとく、マグネットの最適な角度および２の傾斜した形状のマグネットに対するチャンバーの最適な位置を決定する必要がある。
チャンバー中の磁気標識した細胞の運動をシミュレートするためにコンピュータプログラムを書き起こした。対物レンズは、すべての磁気標識した細胞をチャンバーの上面に運動させるが、マグネットの極への運動を妨害するためであった。チャンバー表面からマグネットの表面までの距離も、３.５ｍｍの作動距離を有するＣＤ対物レンズを用いた観察を許容できるのに十分に短くなくてはならない。図２Ｃはかかるシミュレーションを示す。チャンバーはマグネットのＮ極（Ｎ）およびＳ極（Ｓ）の間に図示され、点線は磁気標識した細胞の軌跡を示す。図２Ｄはチャンバー内の軌跡の拡大図ならびに細胞がニッケル線付近に存在する場合のアライメント軌跡を示す。さらに、磁性取り付け具は、３２０μＬ試料中の非磁性構成物から磁気的に結合した材料を分離することによって試料の富化を提供する。
光学システムは５の機能を提供しなければならない：
１．ニッケル線間のギャップにトラックアライメントを保持する、
２．細胞の面上にフォーカスを維持する、
３および４．整列した細胞の蛍光を励起し、検出する、および
５．選択した細胞をイメージする。
図１は、励起用の３のレーザーおよび種々の蛍光標識からの蛍光シグナルを検出するための４の光電子増倍管を示す。３のレーザービームはダイクロイック・ビームスプリッターによって結合され、ＣＤ対物レンズによってニッケル線の面上にフォーカスされる。各レーザーにはアナモルフィックビーム形成オプティクスが含まれ、細胞の面に縦長のフォーカスされたレーザースポットを作り出す。３のレーザースポットは、図３に示すようにニッケル線に対して垂直な主軸方向を有して間隔をあけて離れている。
ＣＤ対物レンズ用のマグネチック作動支持体は、２の軸に沿って、フォーカス用の軸に沿って、かつ、トラッキング用のニッケル線に対して垂直に対物レンズを運動させることによってアライメントを維持する。ニッケル線からの５３２ｎｍのレーザー反射光は、ＣＤ対物レンズを作動するためのサーボ制御シグナルを提供する、トラッキングおよびフォーカス・ディテクターによって、１／４波長板および偏光ビームスプリッターを通して検出される。システムはスキャンの準備ができたチャンバーを整列し、ＣＤ対物レンズが第１の対のニッケル線上に整列されるように試料を位置させる。ついで、試料は試料チャンバーの長さに沿ってｙ−方向でステッピングモーターによって運動され（０.１μｍ段階サイズ）、一方でＣＤ対物レンズおよびサーボエレクトロニクスは適当なフォーカスおよびトラッキングを維持する。各線の最後に、機器はステッピングモーターによって（０.１μｍ段階サイズ）試料をｘ−方向に次の対の近接するニッケル線に示し、反対の方向でｙ−方向のスキャンを繰り返す。このプロセスは、すべての９０のニッケル線対がスキャンされるまで繰り返す。１０ｍｍ／秒でスキャンに必要な時間は４.５分である。
各細胞がレーザースポットを通過する際に、光電子増倍管によって蛍光を測定する。各光電子増倍管は、ニッケル線の面に対して平行であるフィルターおよびピンホールを通して光を収集する。各ピンホールは、ニッケル線からの反射した光を排除し、選択したレーザーからの蛍光のみを調べる。蛍光シグナル間の最小限のクロストークは、各フィルターおよびピンホールによって提供されるスペクトルおよび空間の分離によって確保される。蛍光シグナルは１６ビットのＡＤコンバータボードによってアナログシグナルに変換される。多重送信されたシグナルは、１０ｍｍ／秒のｙ−方向の速度に対しては２５ｋＨｚのサンプリング頻度でサンプリングする。１２μｍの典型的な直径を有する上皮細胞に関しては、このサンプリング速度は細胞を横断する３０のデータポイントに相当する。
特異的に測定された事象の像を再度アプローチするためには、試料に再位置決定しなければならず、これにはｘ−ｙ座標の位置が必要である。ｙ−方向の位置情報を得るために、ＣＤ対物レンズの下の試料を運動させるステージには、０.８ミクロンの分解度を有する直交エンコーダー（quadrature encoder）（Reneshaw, Gloucestershire, UK）が備わっている。エンコーダー・シグナルは、光電子増倍管シグナルをサンプリングする同じＡＤコンバータボード上に存在するカウンターに接続される。蛍光シグナルおよびｙ−位置情報はスキャンの間に同時に記録される。特異的な事象が記録される別々の線番号およびｘ−方向の位置情報も記録される。要約すると、フォーカスおよびトラックシステムは以下のように操作する：
１．第１の線の起点を見つけ出す；
２．フォーカスおよびトラックをロックする；
３．第１の線をＹ−ステージで５−１０ｍｍ／秒でスキャンする；
４．トラックおよびフォーカスのロックを外す；
５．Ｘ−ステージを次の線まで運動させる；
６．フォーカスおよびトラックをロックする；
７．次の線をスキャンする。
工程４−７は、試料全体がスキャンされるまで各々の線について続ける。合計のスキャンは９０の線×３０ｍｍ／線であり、各試料について２.７ｍのスキャンとなる。
選択した細胞の像はＣＤ対物レンズおよびイメージングオプティクスを用いてＣＣＤアレイでデジタル化される。広帯域光源に関連する追加コスト、低強度および短寿命を回避するために、蛍光イメージングはレーザーで行う。レーザースペックルを回避するために、角度測定したスキャンミラーは、ＣＣＤが発せされた光量子を積分しつつ、細胞全体にわたってレーザースポットをスキャンする。このスキャン技術を用いれば、すべてのかすかな蛍光対象物であっても、優れたＳＮ比および解像度でイメージされる。
実施例１
ニッケル線間隔の決定
循環する腫瘍細胞のサイズおよび形状を評価するために、ガン患者の血液試料をCellPrepＴＭで調製し、蛍光顕微鏡システムによって解析した。種々のガンに罹った８の患者からの１０００を超える循環する上皮細胞を得、細胞直径を測定した。患者内および患者間の循環する上皮細胞は、サイズおよび形状において異質であった。図５は、１１.３μｍの平均直径を有するほぼ５〜３０μｍの範囲の細胞サイズ分布を示している。これは、直径におけるその変動を適応し得る標準線間隔を選択する課題を提出した。ニッケル線がより大きな細胞を適応するように離れている場合、より小さい細胞が同じ横方向の空間を占めたりまたはクラスターを形成して、ｙ−方向でスキャンした場合に単一の事象として見えるという危険性が存在する。間隔が狭すぎると、ニッケル線が大きなパーセントの細胞をおおい隠し、細胞のイメージングを危険に曝すであろう。線に対して基準を選択して、集団の＞９５％について＞８５％が見えるようにした。
これらの基準を用いて１５μｍの線間隔を確立した。１５μｍ幅のニッケルおよび２.７ｍｍの幅のチャンバーでは、合計９０の線がチャンバー表面に存在する。対象物のトレースした蛍光シグナルおよび対象物を再アプローチした後に得た像を解析して、線の間のより小さい、横方向に整列したまたはクラスター形成した事象を同定する。
７.５ｍｌ試料当たり１ないし５０００細胞の範囲の循環している腫瘍細胞（ＣＴＣ）の大きなダイナミックレンジが患者試料において観察された。５７の血液試料からの試料調製手法を通して持ち越された白血球は、平均５２０３および１８５７の中央値の白血球で４２８−１７７１８細胞の範囲であった。チャンバー表面上の９０の線は、細胞を捕捉するための２.７メートルの線状の間隔を提供する。１２μｍの平均腫瘍細胞サイズを想定し、１０％の占有を許容すれば、チャンバーの能力は２２５００の腫瘍細胞であって、捕捉した腫瘍細胞および白血球のダイナミックレンジの十分に範囲内である。
実施例２
システムによる腫瘍細胞分析
前立腺ガン組織培養セルラインからの細胞であるＰＣ３を、５０００のＰＣ３細胞／ｍｌの濃度で用いた。この細胞懸濁液のアリコット（１０−１００μＬ）を７.５ｍｌの正常なドナーの全血試料に打ち込んで、低腫瘍細胞数の血液試料を得た。
ほぼ３００のＰＣ３細胞を７.５ｍｌの血液に打ち込み、前記したようにCellPrepＴＭでプロセシングした。試料を磁場に保持しつつ試料チャンバーに分配する場合、免疫磁気的に標識した細胞は永久マグネットからの磁力によってチャンバーの上部内側表面に牽引される。整列したＰＣ３細胞の明視野像を図３に示す。
図６は試料の分析を示す。図６Ａの二次元ドットプロットは、ＣＫ−ＰＥおよびＣＤ４５−ＡＰＣの蛍光シグナルを示す。ＣＫ−ＰＥで染色されかつＣＤ４５−ＡＰＣを欠いている腫瘍細胞候補（ＰＣ３−細胞）は、ＣＤ４５−ＡＰＣで染色されかつＣＫ−ＰＥを欠いている白血球から明らかに識別し得る。サイトケラチンならびにＣＤ４５で染色される事象は、ＣＤ４５で非特異的に染色される腫瘍細胞、サイトケラチンで非特異的に染色される白血球または残査である。腫瘍細胞に対して典型的な領域中の事象が実際に細胞であることを立証するために、蛍光シグナルの波形を解析する。図６Ｂは腫瘍細胞領域内の事象のうちの１のＣＫ−ＰＥシグナルの波形を示す。事象のサイズは、蛍光シグナルと協力して線に沿ったエンコーダー位置によって得られた２０μｍである。細胞質全体にわたるサイトケラチンの分布は、細胞の核と一致するシグナルの第１の部分の境界を示す。この特定の事象の波形がこれが実際に細胞であることを示す場合、システムはチャンバー中のこの位置に再度移動して対象物の明視野および核の像を得る。試料を試料チャンバーの下方に位置する青色ＬＥＤで照射し、ＣＣＤが対象物の明視野像を獲得する。図６Ｃに示す明視野像は、細胞によって示される典型的な特徴を示す。細胞が実際に核を含むことを立証するために、ＤＡＰＩの核染色の像を得る。スキャンミラー（図１）は、５００Ｈｚの周波数の５ｍｒａｄの傾斜スキャン範囲を有する紫色レーザーの光を対象物の位置にわたって分配し、ＣＣＤカメラで像を撮る。ＤＡＰＩの蛍光像を図６Ｄに示す。核は図６Ｃに示す細胞の輪郭の中に明らかに含まれている。
実施例３
スキャン方法
本発明の機器システムにおいては、細胞をレーザー照射でイメージして、広帯域の光源のさらなる費用、低強度および短寿命を回避する。しかしながら、レーザーの長い可干渉距離およびイメージングシステムにおける光反射は、像におけるコヒーレント雑音およびスペックルに寄与する。また、レーザービームのガウス分布強度プロファイルは対象物の均一な照射を提供しない。コヒーレントな照射とこれらの問題は両方とも、ＣＣＤアレイが光を統合しつつ対象物を横切ってレーザースポットを運動させることによって克服される。曝露の間の光源の運動は、像中のコヒーレント雑音を洗い流す。スキャンミラー、回転式ミラー、エレクトロオプティクスまたは音響光学偏向器またはエレクトロ屈折デバイスのごときいずれの角度のついたスキャン手段を用いて、小さい角度でビームを反射し、対象物面にフォーカスされたレーザースポットの運動を提供し得る。周期的なシグナルでこのデバイスを運転することによって、スポットを対象物全体の前後をスキャンする。
このコンセプトの１の例を図１に示し、これは機器の光学構成を示している。３のレーザーは磁気的に制限された対象物を照射し、４のＰＭＴディテクターは対物レンズの焦点面の各レーザースポットを蛍光が通過する際に、対象物からの蛍光を測定する。３のレーザービームはダイクロイック・ビームスプリッターによって結合され、ＣＤ対物レンズによってニッケル線の面上にフォーカスされる。各レーザーには、アナモルフィックビーム形成オプティクスが含まれ、細胞の面に縦長のフォーカスされたレーザースポットを作り出す。３のレーザースポットはニッケル線に対して垂直な主軸方向を有して間隔をあけて離れている。ＣＤ対物レンズ用の磁性作動支持体は、２の軸に沿って、フォーカス用の光学軸に沿って、およびトラッキング用のニッケル線に垂直に対物レンズを運動させることによってアライメントを維持する。ニッケル線からの５３２ｎｍのレーザー反射は、トラッキングおよびフォーカス・ディテクターによって、１／４波長板および偏光ビームスプリッターを通して検出し、これはＣＤ対物レンズを作動するためのサーボ制御シグナルを提供する。
各細胞がレーザースポット（照明手段）を通過する際に、対応するＰＭＴ（検出手段）が蛍光を測定する。各ＰＭＴはフィルターおよびピンホールを通る光を収集し、これはニッケル線の面にコンジュゲートする。各ピンホールはニッケル線からの反射した光を排除し、選択したレーザーからの蛍光のみを見る。蛍光シグナル間の最小限のクロストークは、各フィルターおよびピンホールによって提供されるスペクトルおよび空間分離によって保証される。
イメージング工程の間に、対象物はレーザースポットに運動し、これはスキャンミラーによって前後にスキャンされる。全傾斜スキャン範囲は、照射領域のサイズおよび対象物の焦点距離に適当である。スキャンミラーは、ビームスプリッターおよび対物レンズを通るレーザービームを対象物面に反射する。対象物からの蛍光または散乱光は、同じ対物レンズおよびビームスプリッターを通ってイメージング用の第２のレンズおよびＣＣＤアレイまで戻る。スキャン周波数は、ＣＣＤアレイの統合時間の間に多くの完全なスキャンを提供するのに十分でなければならない。ミラーが数個の完全スキャンおよび１の不完全スキャンしか通過しない場合、対象物にわたる統合した照明は均一でないであろう。ＣＣＤは完全スキャンの統合数の間に光量子のみ収集すべきであり、あるいは多くの完全スキャンと１の不完全スキャンのみ収集すべきである。ついで、不完全スキャンの寄与は、各ＣＣＤピクセル上の合計統合電流の小さい部分となる。
イメージングスキャンが完了した後に、光学システムはより多くのトラックをスキャンしてＰＭＴディテクターと共に他の蛍光対象物を測定するであろう。したがって、スキャンデバイスの静止位置は、レーザービームおよびニッケル線ギャップとＰＭＴピンホールの元の光学アライメントにシステムを戻さなければならない。図１に示すシステムは、ＰＭＴディテクターに向かうレーザービームおよび蛍光ビームを分割する３バンドフィルターの後にスキャンデバイスおよびＣＣＤアレイを位置することによってこのアライメントを保証している。連続するイメージング・セッションの間のスキャンミラーの静止位置の変動は、レーザースポットおよびニッケル線とピンホールのアライメントに影響しないであろう。
図４は、レーザースキャンの２の構成を示す。機器システムは、ニッケル線に隣接して広がる縦長のレーザースポットを用いて、線間の対象物の蛍光を励起し、線によって反射される光からトラッキングおよびフォーカスサーボ制御シグナルを提供する。図４Ａにおいて、この縦長のレーザースポットはＹ−軸に沿ってスキャンして、ニッケル線の間の拡大した領域を照明する。照明均一性は、レーザースポットの幅よりも大きな距離にわたってスキャンすることによって維持される。レーザースポットの高強度に起因して、非常にかすかな蛍光対象物でさえもこのスキャン技術を用いることによって優れたＳＮ比および解像度でイメージされる。
図４Ｂにおいて、対象物面はレーザーの焦点面の外側に運動して、関心のある領域にわたる照明領域および強度均一性を増大させる。スキャンミラーはこの広いスポットを対象物を横切って前後に運動し、像中のコヒーレント雑音および構造を排除する。図４Ｂにおいてブロードなビームは、ＸまたはＹ方向のいずれかでスキャンした場合大きな領域をカバーする。図４Ａおよび４Ｂの両方において、像中のコヒーレント雑音は、スポットの非常に小さい運動でもって許容し得るレベルまで低下し得る。しかしながら、スポット強度プロファイルの除去は、より大きなスキャン振幅を必要とする。前と同様に、ＣＣＤはミラーの多くのスキャンにわたって統合して、不完全な開始または終止スキャンの影響を低下しなければならない。像均一性を維持するためにスキャン数を減少するにしたがって、すべてのスキャンの合計はスキャンの統合数に近づかなければならない。
イメージングに加えて、スキャン技術は、ＰＭＴディテクターからの蛍光シグナルの解像度も改善し得る。図４Ａのレーザービームは細胞を横切って運動するため、それはいずれかの時点において細胞の大きな部分を照明する。しかしながら、蛍光シグナルは細胞の小構造の詳細を正確に表わすことができない。核染色蛍光シグナルのフーリエスペクトルは、正常細胞と腫瘍細胞との間を識別し得る。高頻度の細胞構造を得るためには、細胞のより小さいコンポーネントの解像を提供するための小さいスポットを用いた細胞の呼びかけ信号が必要である。細胞の中位を通る小さいスポットの単一スキャンは、細胞の小さい部分のみにわたる高頻度の応答を提供するであろう。細胞をＹ方向に運動させつつ、Ｘ方向で小さいレーザースポットをスキャンすることによって、図４Ｃに示すごとく励起するビームのラスターパターンによって細胞のより大きな部分を呼びかける。ラスタースキャンの間にこのスポットを調べる、ＰＭＴからのシグナルのスペクトル分析は、細胞の有害な状態についてのさらなる情報を提供し得る。このシグナルの振幅変動は、細胞のステージ、または核小体またはクロマチン構造の存在も示す。ついで、テレビがビデオシグナルから画像を構成することと同様にして、このシグナルから細胞の蛍光像を構成する。
図１のスキャンミラーを方向付けてＸ方向でレーザースポットをスキャンし、ラスターパターンを得る。光学システムはラスタースキャンの間にフォーカスおよびトラック上でロックされたままでなければならず、トラッキングレーザーのスポットはニッケル線に対してＸ方向で運動してはならない。フォーカスおよびトラックレーザービームは、ラスター運動の間にサーボ制御アライメントを維持するために、スキャンまたは偏向デバイスを通過してはならない。図７に示す構成は、他の静止レーザーがフォーカスおよびトラックサーボにシグナルを提供しつつ、１またはそれを超えるレーザーがＸまたはＹ方向でスキャンすることを許容するであろう。図７において、４０５ｎｍのレーザーのみがスキャンしている。スキャンミラーは、トラッキングレーザーを除くいずれのレーザーの光路に位置して、そのレーザーについての蛍光像を創り出し得る。スキャンレーザースポットを調べるＰＭＴは、対応する励起された色素にラスター蛍光シグナルを創り出すであろう。この構成は、スキャンデバイスを通過するレーザーに対して、図４Ａおよび４Ｂに記載したＣＣＤ像スキャンも適応する。
図８は、ＤＡＰＩで標識したＤＮＡの溶液を入れた試料チャンバーを示す。チャンバーを４０５ｎｍレーザーダイオードで照明する。強度プロファイルは静止レーザーではスペックルが形成され（speckled）て狭いが、スキャンミラーを用いて補正する。これは、８Ａ、静止レーザー像および８Ｂ、対応する強度プロファイルと、８Ｃ、スキャンレーザー像および８Ｄ、その対応する強度プロファイルとの間の差異によって示される。スキャンレーザーはより均一な照明を提供し、スキャンしつつスペックルを平均化することによってスペックル効果を減少する。
実施例４
関心のある対象物の再アプローチ
試料をスキャンおよび分析する際には、機器操作者が再アプローチすることを望むかもしれない検出する対象物が存在する。システムは試料対象物ならびにその位置からデータを得ることができるため、システムは、対象物をさらに分析するために対象物の位置まで簡単に戻り得る。このさらなる分析によって、システムによる対象物の分類を確認することができる。関心のある対象物を再アプローチするために使用するイメージング・サブシステムを図９に示す。再アプローチプロセスは、明視野照明システムを使用して関心のある対象物をさらにイメージする。簡単には、手法は：
１．システムを関心のある位置に戻す；
２．コントラストを向上するために軸から外れて位置するＬＥＤをつける；
３．明視野像をＣＣＤアレイ上に記録する；
４．ミラーがラスタースキャンを開始して、領域の均一なレーザー照明を得る；
５．蛍光像をＣＣＤアレイ上に記録する；および
６．像を偽発色（pseudo color）させ、結合する。
これらの工程は図９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄに見ることができる。９Ｂにおいては明視野像が示されており、そこでは３の関心のある対象物が存在する。これらの図において、中位のものがさらなる分析の対象物である。図９Ｃはスキャンレーザー像を示し、それは核をイメージしている。図９Ｄにおいては、該明視野像とスキャンレーザー像とが結合している。
図１０は腫瘍細胞候補を見出したシステムの分析を示す（１０Ａ）。ついで、さらに分析および確認するためにこの対象物を再アプローチする。図１０Ｂは前記したサブシステムを使用した、対象物の明視野イメージングを示す。ついで、図１０Ｃに示すごとく、スキャンレーザーが核酸について対象物をイメージする。最後に、これらの２の像を結合して、対象物の完全な像を得る。
図１１は明視野イメージング・サブシステムによってイメージした関心のある種々の対象物を示す。異なる対象物を各パネルで標識しており、磁性流体ライン、細胞、および現実の対象物となり得るまたはなり得ない疑わしい領域を指し示している。しかしながら、これらの像を単独で調べることによってのみでは、出典明示して本明細書の一部とみなすＰＣＴ／ＵＳ０２／２６８６１に記載されているごとく、それらを簡単に分類することはできないであろう。次の工程は、これらの各対象物においてスキャンレーザーを使用して、分類に使用するであろうさらなる情報を得るために存在する。本発明において記載するイメージングシステムおよび方法を使用することによって、これらの対象物を分類し、機器操作者が価値ある情報を得るであろう。マルチカラー蛍光強度分析によって、希有な腫瘍細胞候補を同定することができる。蛍光の特性、明視野像およびＤＡＰＩ像の付加によって、
１．単一のインタクトまたは損傷した細胞、
２．残査または細胞断片、
３．細胞クラスターまたは白血球に結合した上皮細胞、および
４．上皮細胞マーカーに非特異的に結合した白血球
にさらに分類することが許容される。
本明細書中に開示する発明の好ましい具体例も、本発明をガン診断に加えて特定の分野および適用に利用することを可能にすると考えられる。当業者であれば、本発明の診断様式が好ましい具体例の前記の記載によって制限されるものではないことは明らかであろう。最後に、前記に示したある種の具体例は詳細な説明を提供しているが、以下の請求の範囲は詳細な説明によって範囲が制限されるものではない。実際、以下の特許請求の範囲から逸脱することなく、種々の修飾をそれに対して作成し得る。
前記の明細書および実施例に特に記載したもの以外のものも実施し得ることは明らかであろう。本発明の膨大な修飾および変形が前記の教示に鑑みて可能であり、したがってそれらも本発明の範囲内に入ることは明らかである。
図１は機器システムの光学レイアウトを図示する。ＤＣＬＰ＝ダイクロイック・ロングパスフィルタ；ＤＣＳＰ＝ダイクロイック・ショートパスフィルタ；ＰＭＴ＝光電子増倍管 図２は試料チャンバーおよびマグネットの設計を示す。パネルＡは試料チャンバーおよび充填後にチャンバーを密閉するためのプラグである。パネルＢは試料チャンバーを定位置に保持し、磁気標識した対象物をチャンバーの上部表面まで運動する磁気取り付け具である。黒色で図示する２の傾斜したマグネットは３ｍｍの空間によって分離されている。マグネットは灰色で図示するスチールによって結合されている。パネルＣはチャンバー中に存在する磁気標識細胞のコンピュータ・シミュレーションである。チャンバー中の点線は、磁気勾配の影響下で表面まで運動する、ランダムに位置する磁気標識細胞の軌跡を表す。パネルＤはパネルＣに示したシミュレーションの拡大図であり、一度チャンバーの表面に近づいた磁気標識細胞の軌跡を図示する。 図３はニッケル線間のＰＣ３細胞アライメントの顕微鏡写真である。３のレーザースポットの相対サイズおよび分布を図中に示す（倍率 ２００×）。 図４はラスターを生じるレーザースキャンの配置を図示する。 図５は循環する腫瘍細胞の細胞サイズの分布を示す。１０３０細胞の腫瘍細胞サイズは、８の癌腫患者の血液において蛍光顕微鏡システムによって同定した。 図６は腫瘍細胞を打ち付けた（spiked with）７.５ｍｌの血液試料の分析の結果を示す。パネルＡはＣＤ４５−ＡＰＣに対するＣＫ−ＰＥの２次元ドットプロットを示し：２９５の腫瘍細胞、１２６の白血球および１１のＣＤ４５＋、ＣＫ＋細胞を試料中で検出した。ほぼ３００細胞の前立腺セルラインＰＣ３を７.５ｍｌの血液に打ち付けた。パネルＢはＣＫ−ＰＥシグナルの獲得した波形を示す。パネルＣは対象物の明視野像を示す。パネルＤはパネルＣ中の対象物の核の像を示す。 図７は細胞トラックシステムの別の光学レイアウトを図示する。ＤＣＬＰ＝ダイクロイック・ロングパスフィルタ；ＤＣＳＰ＝ダイクロイック・ショートパスフィルタ；ＰＭＴ＝光電子増倍管 図８は静止レーザー（Ａ＆Ｂ）およびスキャンレーザー（Ｃ＆Ｄ）のスキャン像および対応する強度プロファイルを示す。 図９はイメージング・サブシステム（Ａ）を図示し、明視野像（Ｂ）およびレーザースキャンしたＤＡＰＩ像（Ｃ＆Ｄ）を示している。 図１０は腫瘍細胞候補を発見したシステム（Ａ）の分析を示す。ついで、システムはこの対象物を再アプローチし、明視野イメージング（Ｂ）、スキャンレーザーイメージング（Ｃ）を行い、像を１に結合する（Ｄ）。 各データポイントを用いて記録されたＹ−ステージのエンコーダー位置を用いて再アプローチした関心のある対象物の明視野像を示す。

Claims (32)

  1. ａ．生物試料を含有する試料チャンバー、
    ｂ．生物試料中に存在する生物基（entity）を照明するための１またはそれを超える照明手段、
    ｃ．生物基を検出およびイメージするための１またはそれを超える検出手段、および
    ｄ．照明の領域を通して試料チャンバーを保持および運動させるための手段を提供するステージ
    を含む、生物試料中に存在する生物基を検出および分析する装置。
  2. 該照明手段が、レーザー照明、ＬＥＤ照明およびフィルターした白色光よりなる群から選択される請求項１記載の装置。
  3. 該検出手段が、二次元ディテクターアレイ、１またはそれを超える光電子増倍管、および１またはそれを超えるＣＣＤカメラよりなる群から選択される請求項１記載の装置。
  4. 少なくとも１の該照明手段が、該生物試料を照明しつつスキャン運動することができる請求項１記載の装置。
  5. 該スキャン運動がラスター像を作り出す請求項４記載の装置。
  6. 該ステージが二次元で該試料チャンバーの位置をトラッキングすることができる請求項１記載の装置。
  7. ａ．生物試料を含有する試料チャンバー、
    ｂ．生物試料中に存在する細胞を照明するための１またはそれを超える照明手段、
    ｃ．該細胞を検出およびイメージするための１またはそれを超える検出手段、および
    ｄ．該試料チャンバーを照明の領域を通して保持および運動するための手段を提供するステージ
    を含む、生物試料中に存在する細胞を検出および分析する装置。
  8. 該照明手段が、レーザー照明、ＬＥＤ照明およびフィルターした白色光よりなる群から選択される請求項７記載の装置。
  9. 該検出手段が、二次元ディテクターアレイ、１またはそれを超える光電子増倍管、および１またはそれを超えるＣＣＤカメラよりなる群から選択される請求項７記載の装置。
  10. 少なくとも１の該照明手段が、該生物試料を照明しつつスキャン運動することができる請求項７記載の装置。
  11. 該スキャン運動がラスター像を作り出す請求項１０記載の装置。
  12. 該ステージが該試料チャンバーの位置を二次元でトラッキングすることができる請求項７記載の装置。
  13. ａ．生物基を含有することが疑われる生物試料を得、
    ｂ．該試料を試料チャンバーに導入し、
    ｃ．該試料を１またはそれを超える照明手段で照明し、
    ｄ．該試料チャンバーを、該照明手段によって作り出される照明された領域を通して運動させ、
    ｅ．１またはそれを超える検出手段を用いて該照明を検出して、検出シグナルを生成し、ついで
    ｆ．該検出シグナルを分析する
    ことを含む、生物試料中に存在する生物基を検出および分析する方法。
  14. 該試料チャンバー運動の位置を二次元でトラッキングする請求項１３記載の方法。
  15. さらに分析するために、位置データを用いて種々の検出シグナルに戻る請求項１４記載の方法。
  16. 該照明手段が、レーザー照明、ＬＥＤ照明、およびフィルターした白色光よりなる群から選択される請求項１３記載の方法。
  17. 該検出手段が二次元ディテクターアレイ、１またはそれを超える光電子増倍管、および１またはそれを超えるＣＣＤカメラよりなる群から選択される請求項１３記載の方法。
  18. 該検出シグナルが該細胞によって発せられる蛍光の量である請求項１３記載の方法。
  19. それによって、該試料チャンバーが該照明された領域を通して運動するにしたがって、該１またはそれを超える照明手段がスキャン運動で運動してラスター化された照明を形成する請求項１３記載の方法。
  20. 該検出シグナルの分析が、該ラスター化された照明から該検出シグナルを再構成して、該生物基の詳細な情報を提供することを含む請求項１９記載の方法。
  21. 該生物試料が、末梢血液、骨髄、ロイコフェレシス、組織ホモジネート、乳首吸引物（nipple aspirate）、結腸洗浄液、唾液、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、胸膜流体、腹膜流体、心膜流体および尿よりなる群から選択される請求項１３記載の方法。
  22. 該生物基が、ホルモン、タンパク質、ペプチド、レクチン、オリゴヌクレオチド、薬剤、化学物質、核酸分子、細胞、ウイルスおよび細菌よりなる群から選択される請求項１３記載の方法。
  23. ａ．生物試料中に存在する細胞を含むことが疑われる生物試料を得、
    ｂ．該試料を試料チャンバーに導入し、
    ｃ．該試料を１またはそれを超える照明手段で照明し、
    ｄ．該試料チャンバーを、該照明手段によって作り出される照明された領域を通して運動させ、
    ｅ．該照明を１またはそれを超える検出手段で検出して検出シグナルを生成し、ついで
    ｆ．該検出シグナルを分析する
    ことを含む、生物試料中に存在する細胞を検出および分析する方法。
  24. 該試料チャンバー運動の位置を二次元でトラッキングする請求項２３記載の方法。
  25. さらに分析するために、位置データを用いて種々の検出シグナルに戻る請求項２４記載の方法。
  26. 該照明手段が、レーザー照明、ＬＥＤ照明およびフィルターした白色光よりなる群から選択される請求項２３記載の方法。
  27. 該検出手段が、二次元ディテクターアレイ、１またはそれを超える光電子増倍管、および１またはそれを超えるＣＣＤカメラよりなる群から選択される請求項２３記載の方法。
  28. 該検出シグナルが該細胞によって発せられる蛍光の量である請求項２３記載の方法。
  29. それによって、該試料チャンバーが該照明された領域を通して運動するにしたがって、該１またはそれを超える照明手段がスキャン運動で運動してラスター化された照明を形成する請求項２３記載の方法。
  30. 該検出シグナルの分析が、該ラスター化された照明から該検出シグナルを再構成して、該細胞の詳細な情報を提供することを含む請求項２９記載の方法。
  31. 該生物試料が、末梢血液、骨髄、ロイコフェレシス、組織ホモジネート、乳首吸引物（nipple aspirate）、結腸洗浄液、唾液、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、胸膜流体、腹膜流体、心膜流体および尿よりなる群から選択される請求項２３記載の方法。
  32. 該細胞が、希有な細胞、胎児細胞、幹細胞、循環する腫瘍細胞、循環する上皮細胞および循環する内皮細胞よりなる群から選択される請求項２３記載の方法。
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